008667 Настоящее изобретение относится к применению цитокина,... связывающий белок и ингибировать активность второго цитокина, причем второй цитокин является...

008667
Настоящее изобретение относится к применению цитокина, способного связывать IL-18связывающий белок и ингибировать активность второго цитокина, причем второй цитокин является членом семейства IL-1.
Уровень техники
В 1989 г. было описано сывороточное активное вещество, индуцированное эндотоксином, которое
индуцировало интерферон-γ (IFN-γ), полученный из клеток селезенки мыши (Nakamura et al., 1989). Данное сывороточное активное вещество не действовало как агент, впрямую индуцирующий IFN-γ, но скорее как стимулятор, действующий совместно с IL-12, IFN-α/β, TNF или митогенами. Попытка выделить
данную активность из сыворотки мыши после воздействия эндотоксина выявила по-видимому гомогенный белок массой 50-55 кДа (Nakamura et al., 1993). Поскольку другие цитокины могут действовать как
совместные стимуляторы выработки IFN-γ, неспособность нейтрализующих антител против IL-1, IL-4,
IL-5, IL-6 или TNF нейтрализовать указанную сывороточную активность предполагала, что это является
другим фактором. В 1995 г. те же исследователи показали, что индуцированный эндотоксином совместный стимулятор выработки IFN-γ присутствует в экстрактах печени мышей, предварительно подвергнутых воздействию P.acnes (Okamura et al., 1995). На данной модели популяция макрофагов печени (купферовских клеток) расширяется, и для данных мышей низкая доза бактериального липополисахарида (LPS),
которая для мышей, не подвергавшихся предварительному воздействию, не является летальной, становится летальной. Фактор, названный IFN-γ-индуцирующим фактором (IGIF) и позднее обозначенный как
интерлейкин-18 (IL-18), был выделен в гомогенном состоянии из 1200 г печени мышей, подвергшихся
воздействию P.acnes. Вырожденные олигонуклеотиды, полученные из аминокислотных последовательностей выделенного IL-18, использовали для клонирования мышиной кДНК IL-18 (Okamura et al., 1995).
Матричные РНК для IL-18 и интерлейкина-12 (IL-12) легко обнаруживаются в активированных макрофагах. IL-18 сам по себе не индуцирует IFN-γ, но действует, главным образом, как совместный с митогенами или IL-12 стимулятор. В 1996 г. было сообщение о последовательности человеческой ДНК для IL-18.
Интерлейкин IL-18 имеет общие структурные черты с семейством белков IL-1 (Nakamura et al.,
1993, Okamura et al., 1995, Ushio et al., 1996 и Bazan et al., 1996). В отличие от большинства других цитокинов, которые обладают четырехспиральной пучковой структурой, IL-18 и IL-1β имеют целиком βскладчатую пластинчатую структуру (Tsutsui et al., 1996). Подобно IL-1β, IL-18 синтезируется как биологически не активный предшественник (proIL-18), не имеющий сигнального пептида (Ushio et al., 1996).
Предшественники IL-1β и IL-18 расщепляются каспазой-1 (IL-1β-превращающим ферментом или ICE),
которая расщепляет предшественники после остатка аспарагиновой кислоты на позиции Р1. Образованные зрелые цитокины легко высвобождаются из клетки (Ghayur et al., 1997, и Gu et al., 1997).
IL-18 представляет собой совместный стимулятор выработки цитокинов (IFN-γ, IL-2 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора) клетками Т-хелперного типа I (Th1) (Kohno et
al., 1997), а также совместный стимулятор FAS-лигандопосредованной цитотоксичности клонов натуральных мышиных клеток-киллеров (Tsutsui et al., 1996).
Лимфоциты Th1 участвуют в иммунных ответах против опухолей (Seki et al., 2000). Th1 ответы
включают секрецию цитокинов IL-2, IL-12, IL-18 и IFN-γ, а также дегенерацию специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов, распознающих конкретные опухолевые антигены. Th1 ответ является также жизненно важным оружием для защиты организма-хозяина от многих микроорганизмов. Однако Th1 ответ
также может быть связан с нежелательными эффектами, такими как развитие нескольких аутоиммунных
заболеваний, воспаления и отторжения трансплантированного органа.
Цитокинсвязывающие белки (растворимые цитокиновые рецепторы) обычно представляют собой
внеклеточные лигандсвязывающие домены соответствующих им цитокиновых рецепторов клеточной
поверхности. Они вырабатываются как путем альтернативного сплайсинга, так и путем протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Указанные растворимые рецепторы были описаны
ранее: например, растворимые рецепторы IL-6 и IFN-γ (Novick et al., 1989), TNF (Engelmann et al., 1989, и
Engelmann et al., 1990), IL-1 и IL-4 (Maliszewski et al., 1990), IFN-α/β (Novick et al., 1994, Novick et al.,
1992). Один цитокин-связывающий белок, названный остеопротегерином (OPG, известный также как
фактор, ингибирующий остеокласты - OCIF), член семейства TNFR/Fas, по-видимому, является первым
примером растворимого рецептора, который существует только как секретированный белок (Anderson et
al., 1997, Simonet et al., 1997, Yasuda et al., 1998).
Интерлейкин-18-связывающий белок (IL-18BP) был выделен по сродству на колонке с IL-18 из мочи (Novick et al., 1999). IL-18BP отменяет вызываемую IL-18 индукцию IFN-γ и IL-8, активацию NF-kB in
vitro и индукцию IFN-γ in vivo. IL-18BP представляет собой растворимый циркулирующий белок, который конститутивно экспрессируется в селезенке, и принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов.
Наиболее широко распространенная изоформа IL-18ВР, сплайсированная вариантная изоформа а, обладает высоким сродством с IL-18 с быстрой скоростью включения и медленной скоростью выключения и
константой диссоциации (Kd) приблизительно 400 пМ (Kim et al., 1999).
Остатки, участвующие по взаимодействии IL-18 и IL-18BP, были описаны посредством использования компьютерного моделирования (Kim et al., 1999) и основаны на взаимодействии IL-1β и IL-1R типа
-1-
008667
I (Vigers et al., 1997). На модели связывания IL-18 с IL-18BP остаток Glu (E) на позиции 42 и остаток Lys
(K) на позиции 89 IL-18, как предполагали, связываются с Lys-130 и Glu-114 в IL-18BP, соответственно
(Kim et al., 1999).
IL-18BP конститутивно присутствует во многих клетках (Puren et al., 1999) и циркулирует у здоровых людей (Urushihara et al., 2000). Высокое сродство IL-18BP с IL-18, а также высокая концентрация IL18BP, обнаруженная в циркуляции (молярное превышение в 20 раз по сравнению с IL-18), представляют
уникальную ситуацию в биологии цитокинов. Таким образом, было высказано предположение, что
большинство, если не все, молекул IL-18 в циркуляции связаны с IL-18BP. Циркулирующий IL-18BP,
который конкурирует с рецепторами клеточной поверхности для IL-18, может действовать как природная противовоспалительная и иммунодепрессантная молекула.
Вирусные агенты кодируют IL-18ВР-подобные белки, например, вирусные белки М.contagiosum
MC53 и МС54 обладают значительной гомологичностью с IL-18BP млекопитающих (Novick et al., 1999).
Белки М.contagiosum MC53 и МС54 обладают способностью связывать и нейтрализовать человеческий
IL-18, сходной с указанной способностью IL-18BP (Xiang и Moss, 1999). Белок поксвируса эктромелии
р13, который является гомологичным с IL-18BP, связывает человеческий IL-18 и ингибирует его активность in vitro. У мышей, инфицированных делеционным мутантным вирусом р13, наблюдались пониженные уровни инфекционности (Born et al., 2000). Таким образом, степень инфекционности, как представляется, коррелирует с присутствием вирусного IL-18BP.
Высокие уровни циркулирующего IL-18BP могут являться природной защитой против избыточных
Th1-ответов на инфекцию и развития аутоиммунных заболеваний.
Цитокины семейства IL-1, включая IL-8, обладают рядом противовоспалительных и иммунорегулирующих свойств во время первичного и вторичного ответа на инфекцию (Dinarello, 1996 и Nakanishi,
2001). Шесть новых членов генного семейства интерлейкина-1 (IL-1) были открыты в результате изучения базы данных экспрессируемых меченых последовательностей (Barton, 2000, Busfield, 2000, Debets,
20001, Kumar, 2000, Lin, 2001, Mulero, 1999, Pan, 2001 и Smith, 2000). Указанные белки имеют общий (βполый профиль, состоящий из 12 нитей, и значительную аминокислотную гомологичность с антагонистом рецепторов IL-1 (IL-1Ra), IL-1β и IL-18. Указанные новые члены семейства IL-1 получены от общего предка, как и IL-1 и IL-18 (Nicklin, 2002, Taylor, 2002). За исключением IL-18, каждый находится на
одной и той же области человеческой хромосомы 2 (Nicklin, 2002, Mulero, 2000, Taylor, 2002 и Busfield,
2000). Биологическая функция данных гомологов IL-1 до настоящего времени неизвестна. Было описано
пять различных сплайсированных вариантов нового гомолога IL-1 IL-IH4 (IL-IF7a-e) (Busfield, 2000,
Kumar, 2000, Pan, 2001, Smith, 2000, Taylor, 2002). Первая описанная изоформа, IL-IF7a, имеет уникальный N-конец, состояний из экзона 3 гена IL-1 F7, который отсутствует в других сплайсированных вариантах гена. Короткие изоформы IL-IF7c, IL-IF7d и IL-IF7e не имеют экзона 4,2 или обоих, соответственно. Только IL-IF7b и с, содержащие экзон 1 и 2, экспрессируют N-концевой продомен, который имеет
потенциальный сайт (сайты) расщепления каспазой-1 (ICE) (Kumar, 2002). Помимо указанных сплайсированных вариантов, в IL-1F7b существуют аминокислотные полиморфизмы (V31G и А42Т), основанные
на мутациях двух пар нуклеотидов в экзоне 2 (Kumar, 2002, Pan, 2001). Несмотря на изучение обширной
базы данных и секвенирование локуса гена IL-1, мышиный гомолог IL-1 H4 до сих пор не обнаружен. IL1F7b имеет значительную гомологичность последовательности с IL-18. Отличительным признаком активности IL-18 является его способность индуцировать IFN-γ в Т-клетках или натуральных киллерах
(NK) в присутствии IL-2, IL-12 или IL-15 в качестве совместного стимулятора. Активность IL-18 опосредуется комплексом IL-18R, состоящим IL-18Rα, заканчивающимся лигандсвязывающей цепью (Torigoe,
1997), и IL-18β, заканчивающимся сигнальной цепью (3 (Born, 1998, Kim, 2001). После связывания с цепью IL-18Rα и образования гетерокомплекса с цепью IL-18Rβ, IL-18 индуцирует активацию киназы, связанной с рецептором IL-1, и фактора 6, связанного с рецептором TNF (TRAF-6). Указанные активированные киназы в конечном итоге приводят к транслокации ядерного фактора κ-В (NF-κВ) (Matsumoto,
Robinson). IL-1F7b, как сообщается, связывается с IL-18Rα, по результатам исследования рецепторов
pulldown assay (Pan, 2001) или исследований связывания с использованием компьютерного чипа
(BiaCore®) (Mulero, 2000). Достоверное, но низкоаффинное связывание Kd=130 мМ наблюдалось только
для зрелой формы IL-1F7b, без пропептида, предполагающего биологическую связь с процессингом IL1F7b со стороны ICE (Kumar, 2002). Несмотря на связывание с IL-18Rα, не было показано активности,
подобной IL-18, или антагонистической активности как предшественника, так и зрелого IL-1F7b (Pan,
2001, Kumar, 2002).
Было высказано предположение о том, что интерлейкин IL-18 участвует в развитии патогенности
при хронических воспалительных заболеваниях, включая эндотоксиновый шок, гепатит и аутоиммунный
диабет (Kahiwamura и Okamura, 1998). Дальнейшие указания на возможную роль IL-18 в развитии повреждения печени были получены из экспериментов, опубликованных Tsuij et al. (Tsuij et al., 1999), которые показали повышенный уровень IL-18 при индуцированном липополисахаридами остром повреждении печени у мышей. Однако механизм многофункционального фактора IL-18 при развитии повреждения печени до сих пор не освещен.
-2-
008667
Поражение или повреждение печени может иметь разнообразные причины. Это может происходить
из-за вирусных или бактериальных инфекций, злоупотребления алкоголем, иммунных расстройств или,
например, злокачественной опухоли.
Вирусные гепатиты, вызванные вирусом гепатита В и вирусом гепатита С, например, представляет
собой плохо поддающиеся лечению заболевания, которые поражают большое количество людей во всем
мире. Количество известных вирусов гепатита постоянно растет. Помимо вирусов гепатита В и С, по
меньшей мере четыре других вируса, вызывающих вирусный гепатит, были открыты к настоящему времени, называемые вирусами гепатита A, D, Е и G.
Алкогольное заболевание печени представляет собой другое широко распространенное заболевание
печени, связанное с хроническим употреблением алкоголя. Иммунный гепатит представляет собой редкое аутоиммунное заболевание, которое плохо поддается лечению. Повреждение печени включает также
поражение желчных протоков. Первичный билиарный цирроз (РВС) представляет собой аутоиммунное
заболевание печени, которое характеризуется деструкцией внутрипеченочных желчных протоков.
Несколько исследований показали, что повреждение печени при таких заболеваниях, как алкогольный гепатит, цирроз печени, вирусный гепатит и первичный билиарный цирроз, связано с ответами со
стороны Клеток Т-хелперов-1 (Th1). В одном исследовании была разработана новая модель повреждения
печени на мышах путем нацеливания содержащих овальбумин липосом в печень с последующим адоптивным переносом овальбумин-специфичных клеток Th1. Комбинированное воздействие на мышей содержащими овальбумин липосомами и переносом клеток Thl вызывало повышение активности сывороточных трансаминаз, которое наблюдалось параллельно с повышением сывороточных уровней IFN-γ.
Резким контрастом являлось то, что перенос овальбумин-специфичных клеток Th2 приводил к повышению уровней IL-4, но не индуцировал повреждения печени. Повреждение печени блокировалось антителами против IFN-γ и антителами против фактора некроза опухолей (TNF)-α. Указанные факты свидетельствуют о том, что клетки Th1 являются главными эффекторными клетками при остром повреждении
печени (Nishimura и Ohta, 1999). В другой серии исследований было показано, что у мышей с чрезмерной
экспрессией IFN-γ наблюдается спонтанный гепатит, при отсутствии какого бы то ни было патогена или
любого другого раздражителя (Okamoto et al., 1998).
Другое исследование включало изучение ответов Th1 при первичном билиарном циррозе (РВС).
РВС представляет собой аутоиммунное заболевание печени, характеризующееся деструкцией внутрипеченочных желчных протоков. Обычно полагают, что клеточные иммунные механизмы, особенно вовлекающие Т-клетки, приводят к повреждению желчных протоков. Относительная сила ответов Th1 и Th2,
как предположили недавно, является важным фактором патофизиологии различных аутоиммунных заболеваний. В данном исследовании баланс субпопуляций при РВС оценивали путем выявления цитокинов,
специфичных для двух субпопуляций Т-клеток, т.е., IFN-γ для клеток Th1 и IL-4 для клеток Th2. Клетки,
положительные по матричной РНК (мРНК) IFN-γ и IL-4, подсчитывали в срезах печени от 18 пациентов
с РВС и 35 контролей заболевания, включая хронический активный гепатит С, внепеченочную билиарную обструкцию и нормальную печень, с использованием неизотопной гибридизации и иммуногистохимического анализа in situ. Мононуклеарные клетки, экспрессирующие мРНК IFN-γ и IL-4, были агрегированы в воспаленных портальных путях печени с РВС, но редко присутствовали в срезах печени при
внепеченочной билиарной обструкции, алкогольном фиброзе или нормальной печени. Клетки, положительные по мРНК IFN-γ и IL-4, в печени с РВС выявляли в достоверно более высоких количествах, чем в
контрольной печени (Р<0,01). Кроме того, экспрессия мРНК IFN-γ выявлялась чаще, чем экспрессия IL-4
в печени с РВС, и уровни экспрессии мРНК IFN-γ тесно коррелировал со степенью портальной воспалительной активности. Клетки, положительные по мРНК IFN-γ выявляли, главным образом, вокруг поврежденных желчных протоков, которые были окружены лимфоидными агрегатами. Данные показывают,
что клетки Th1 являются наиболее распространенной субпопуляцией Т-клеток в лимфоидных инфильтратах при РВС (Harada et al., 1997).
Цитокиновый профиль для распознавания вирусных антигенов, как полагают, оказывает выраженное влияние на разрешение вирусных инфекций и вирусный клиренс. В одном исследовании изучали,
играет ли роль дисбаланс цитокинов, ориентированный в сторону ответа типа Th2, при хроническом гепатите В. Цитокиновые профили мононуклеарных клеток периферической крови, связанные с хроническим гепатитом В, анализировали с помощью RT-PCR. После стимуляции поверхностным антигеном
гепатита В (HbsAg) экспрессию IFN-γ, IL-2, IL-4 и IL-10 выявляли у 41, 8, 41 и 50% пациентов, соответственно. Среди указанных цитокинов экспрессия Th1 цитокина IFN-γ была связана с высокими уровнями
сывороточных АСТ/АЛТ (аспартатаминотрансферазы/аланинаминотренсферазы) которые являются типичными маркерами повреждения печени. Не было выявлено защитного эффекта в отношении гепатитов, вызываемого цитокинами типа Th2. В заключение, выработка цитокина Th1, IFN-γ, HbsAgреактивными клетками была связана с повреждением гепатоцитов при хроническом гепатите В (Lee et
al., 1999). Высокие уровни лиганда FAS и его рецептора (CD95) были выявлены в печени пациентов с
гепатитом В (Luo et al., 1997). Лиганд FAS считают одним из главных цитотоксических агентов, который
приводит к апоптозу гепатоцитов.
-3-
008667
В другом исследовании идентифицировали факторы, связанные с прогрессированием повреждения
печени у 30 пациентов, положительных по вирусу гепатита С/РНК (HCV/RNA), с хроническим гепатитом. Некротическое/воспалительное и структурное повреждение оценивали с использованием шкалы
Ishak. Активированные печеночные звездчатые клетки (HSC) визуализировали иммуногистохимическим
анализом на гладкомышечный α-актин (α-SMA) и определяли их количество морфометрически.
HCV/RNA в плазме крови оценивали с использованием методики конкурентной RT-PCR. Для того, чтобы изучить тип иммунного ответа, участвующего в прогрессировании повреждения печени, IFN-γположительные клетки (как экспрессия Thl-подобного ответа) оценивали с использованием иммуногистохимического анализа, определяли их количество морфометрически. Было установлено, что HSC обнаруживали, главным образом, вблизи от областей лобулярного некроза/воспаления или от выстилки
фиброзных перегородок. Паренхима, положительная по α-SMA и сириусу красному, коррелировала достоверно с суммой баллов по некрозу/воспалению и структурному повреждению. IFN-γ-положительные
клетки выявляли в перипортальных областях, связанных с воспалительными инфильтратами, и они достоверно коррелировали со структурным повреждением. Таким образом, было сделано заключение о том,
что активация HSC и прогрессирование повреждения печени связаны с Th1-подобным ответом (Baroni et
al., 1999). Подобно случаю с гепатитом В, FAS лиганд и его рецептор были обнаружены в печени и сыворотке крови пациентов с гепатитом С (Hiramatsu et al., 1994; Okazaki et al., 1996; Lio et al., 1998).
Цитокины Th1 и другие маркеры Th1, как было установлено, связаны с алкогольным гепатитом и
циррозом печени. Воспалительные раздражители и перекисное окисление липидов активируют нуклеарный фактор κВ (NF-κВ) и повышают выработку провоспалительных цитокинов и хемокинов. В одном
исследовании оценивали взаимоотношения между патологическим повреждением печени, эндотоксемией, перекисным окислением липидов и активацией NF-κВ и дисбалансом между про- и противовоспалительными цитокинами. Крысам (5 на группу) давали этанол и корм, содержавший насыщенный жир,
пальмовое масло, кукурузное масло или рыбий жир через желудочный зонд. У контрольных мышей этанол изокалорически заменяла декстроза. Выполняли патологоанатомический анализ и осуществляли определение эндотоксина, перекисного окисления липидов, NF-κВ и уровни матричной РНК (мРНК) провоспалительных цитокинов (TNF-α, 1L-1β, IFN-γ и IL-12), С-С хемокинов (регуляцию после активации,
нормальную экспрессию и секрецию Т-клетками [RANTES], моноцитарный хемотаксический белок
[МСР]-1, макрофагальный воспалительный белок [MIP]-1-α), C-X-C хемокинов (индуцированный цитокинами нейтрофильный хемоаттрактант [CINC], MIP-2, IP-10 и эпителиальный нейтрофилактивирующий белок [ENA]-78) и противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-4 и IL-13). Активация
NF-κВ и повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов С-С и С-Х-С хемокинов наблюдалась у
крыс, имеющих некротически-воспалительное повреждение (рыбий жир-этанол и кукурузное маслоэтанол). В данных группах также наблюдались самые высокие уровни эндотоксина и перекисного окисления липидов. Уровни мРНК IL-10 и IL-4 были ниже в группе с воспалительным повреждением печени.
Таким образом, активация NF-κВ наблюдается в присутствии провоспалительных раздражителей и приводит к повышению экспрессии Th1 провоспалительных цитокинов и хемокинов (Naji et al., 1999). FAS
лиганд и его рецептор также повышены при алкогольных заболеваниях печени, что вновь наводит на
мысль о том, что цитокины Th1 участвуют в аутоиммунных процессах, индуцированных при алкогольном гепатите (Galle et al., 1995; Taieb et al., 1998; Fiore et al., 1999).
TNF-α также возникал как распространенный путь при патогенезе связанного в алкоголем некрозавоспаления печени. Повышенные уровни печеночного и сывороточного TNF были зафиксированы документально у экспериментальных животных с алкогольным заболеванием печени и при алкогольном заболевании печени у человека. Было высказано предположение о том, что указанная дисрегуляция метаболизма TNF играет роль во многих метаболических осложнениях и повреждении печени при алкогольном заболевании печени (Grove et al., 1997; McClain and Cohen, 1989). Например, в одном исследовании
было установлено, что пациенты с алкогольным гепатитом имеют более высокие уровни TNF-α (в среднем 26,3 нг/л; 95% CI, от 21,7 до 30,9), чем у нормальных субъектов (6,4 нг/л; CI, от 5,4 до 7,4). Пациенты, которые впоследствии умирали, имели более высокий уровень TNF-α (34,7 нг/л; CI, от 27,8 до 41,6),
чем те, которые выживали (16,6 нг/л; CI, от 14,0 до 19,2). У пациентов с алкогольным гепатитом уровни
TNF-α положительно коррелировали с сывороточным билирубином (r=0,74; Р=0,0009) и с сывороточным
креатинином (r=0,81; Р=0,0003). Пациенты с алкогольным гепатитом имели более высокие уровни TNF-α
по сравнению с пациентами с неактивным алкогольным циррозом (11,1 нг/л; CI, от 8,9 до 13,3) и с лицами, злоупотребляющими алкоголем, без заболевания печени (6,4 нг/л; CI, от 5,0 до 7,8). Пациенты с нарушенной функцией почек имели более низкие уровни TNF-α (14,1 нг/л; CI, от 5,4 до 22,8), чем у пациентов с алкогольным гепатитом. Таким образом, было сделано заключение о том, что повышение TNF-α
при алкогольном гепатите наиболее выражено в тяжелых случаях, что наводит на мысль о том, что TNFα играет роль в патогенезе (Bird et al., 1990).
TNF опосредует многие биологические действия эндотоксина. Недавние исследования показали,
что введение TNF может вызывать повреждение печени и что TNF может опосредовать летальность ге-4-
008667
патотоксина галактозамина. Одним из наиболее мощных индукторов TNF является эндотоксин. Поскольку у пациентов с алкогольным заболеванием печени часто наблюдается эндотоксемия, и поскольку
многие клинические проявления алкогольного гепатита представляют собой известные биологические
действия TNF, его активность оценивали у пациентов с алкогольным гепатитом. Базальное и стимулированное липополисахаридами высвобождение TNF из моноцитов периферической крови, главного источника выработки TNF, определяли у 16 пациентов с алкогольным гепатитом и у 16 здоровых добровольцев. У восьми из 16 пациентов с алкогольным гепатитом и только у двух из 16 здоровых добровольцев
имелась поддающаяся выявлению спонтанная активность TNF (р менее 0,05). После стимуляции липополисахаридами средне высвобождение TNF из моноцитов пациентов с алкогольным гепатитом достоверно возрастало более чем в два раза по сравнению со здоровыми контролями (25,3 ± -3,7 против 10,9 ±
-2,4 единицы на мл, р менее 0,005). Таким образом, было сделано заключение о том, что моноциты от
пациентов с алкогольным гепатитом имели достоверно повышенное спонтанное и стимулированное липополисахаридами высвобождение TNF по сравнению с моноцитами от здоровых добровольцев (McClain
and Cohen, 1989).
Липополисахарид(LPS)-связывающий белок (LBP) и CD14 играют ключевую промежуточную роль
в активации клеток эндотоксином. Было высказано предположение о том, что полученный из кишечника
LPS участвует в прогрессировании патологического повреждения печени при алкогольном заболевании
печени. Было показано, что крысы, которым давали через желудочный зонд этанол в масле в течение 4
недель, имели повышенные уровни CD14 и LBP в купферовских клетках и гепатоцитах, соответственно.
Экспрессия мРНК CD14 была также повышена в немиелоидных клетках. Повышенная экспрессия LBP и
CD14 быстро повышает LPS-индуцированную экспрессию различных провоспалительных цитокинов и
коррелирует с присутствием патологического повреждения печени при алкогольном повреждении печени (Su et al., 1998; Lukkari et al., 1999).
Артрит представляет собой заболевание, включающее воспаление суставов. В суставах наблюдается распухание, ригидность, болезненность, покраснение или гипертермия. Симптомы могут сопровождаться снижением массы тела, лихорадкой или слабостью. В случае, когда указанные симптомы длятся
более двух недель, причиной может являться воспалительный артрит, например, ревматоидный артрит.
Воспаление суставов также может вызывать инфекция, которая может приводить к септическому артриту. Весьма распространенным типом артрита является дегенеративное заболевание суставов (остеоартрит).
Лекарственными средствами, которые наиболее часто назначают при артрите и родственных состояниях, являются нестероидные противовоспалительные средства (НПВС - NSAID). НПВС включают
аспирин и аспириноподобные лекарственные средства. Они уменьшают воспаление, которое является
причиной боли в суставах, ригидности и распухания суставов. Однако НПВС представляют собой неспецифические лекарственные средства, имеющие ряд побочных эффектов, включая желудочное кровотечение (Страница в интернете по артриту отделения ортопедии Вашингтонского университета, Frederick
Matsen (председатель), www.orthop.washington.edu). Помимо НПВС, Celebrex™, ингибитор циклоокигеназы (СОХ-2), используется для облегчение признаков и симптомов остеоартрита и ревматоидного артрита у взрослых людей. Он также показан для лечения пациентов с врожденным семейным аденоматозным полипозом.
В WO 01/00229 описана комбинация антагонистов фактора некроза опухолей (TNF) и ингибиторов
СОХ-2 для лечения воспаления.
Антагонисты TNF используются также для лечения артрита. Антагонисты TNF описаны, например,
в WO 9103553.
Исследования показывают, что интерлейкин IL-18 играет провоспалительную роль в метаболизме
суставов. Olee et al. (1999) показали, что IL-18 вырабатывается хондроцитами суставов и индуцирует
провоспалительный и катаболический ответы. мРНК IL-18 была индуцирована IL-1β в хондроцитах.
Хондроциты вырабатывали предшественник IL-18, и в ответ на стимуляцию IL-1 секретировали зрелую
форму IL-18. Изучение влияния IL-18 на хондроциты далее показало, что он ингибирует TGF-βиндуцированную пролиферацию и повышает выработку оксида азота. IL-18 стимулировал экспрессию
нескольких генов в нормальных хондроцитах суставов человека, включая индуцируемую синтазу оксида
азота, индуцируемую циклооксигеназу, IL-6 и стромелизин. Экспрессия генов была связана с синтезом
соответствующих белков. Воздействие IL-18 на нормальный суставной хрящ человека повышало высвобождение гликозаминогликанов. Указанные открытия идентифицировали IL-18 как цитокин, который
регулирует ответы хондроцитов и вносит свой вклад в деградацию хряща.
Локализация интерлейкин-β-превращающего фермента (ICE)/каспазы-1 в остеоартритических тканях человека и его роль в созревании интерлейкина-1β и интерлейкина-18 была показана Saha et al.
(1999). Saha et al. изучали экспрессию и выработку каспазы-1 в нормальном и остеоартритическом (ОА)
хряще и синовиальной оболочке человека, количественно определяли уровень ICE в ОА хондроцитах и
изучали взаимоотношения между топографическим распределением ICE, интерлейкина-1β (IL-1β) и IL18, а также апоптозом хондроцитов. Эксперименты, выполненные в данном исследовании, показали, что
-5-
008667
ICE экспрессируется и синтезируется как в синовиальной оболочке, так и в хряще человека; при этом
количество клеток, окрашивающихся положительно в ОА ткани достоверно выше, чем в нормальной
ткани. Выработка ICE была преимущественно локализована в поверхностном и верхнем промежуточном
слоях суставного хряща. Выработка зрелого 1L-1бета в экплантатах и хондроцитах ОА хряща была полностью блокирована воздействием специфичного ингибитора ICE, который также выраженно уменьшал
количество IL-18-положительных клеток. Взаимоотношения между активным IL-1β и ICE наводят на
мысль о том, что ICE может способствовать прогрессированию ОА путем активации данного провоспалительного цитокина, и что IL-18 может играть роль в патологии хряща.
Gracie et al. (1999) предположили провоспалительную роль IL-18 при ревматоидном артрите. Gracie
et al. выявили мРНК и белок IL-18 в синовиальных тканях при ревматоидном артрите в достоверно более
высоких уровнях, чем у остеоартритических контролей. Было показано также, что комбинация IL-12 или
IL-15 с IL-18 индуцирует выработку IFN-γ синовиальными тканями in vitro. Кроме того, введение IL-18
мышам, иммунизированным коллагеном/неполным адъювантом Фрейнда, облегчало развитие эрозивного воспалительного артрита, что наводит мысль о том, что IL-18 может обладать провоспалительными
свойствами in vivo.
Однако к настоящему времени, не считая химических соединений, только блокада TNF-α и IL-1β
путем использования растворимых рецепторов или моноклональных антител, как было показано, уменьшает индуцированный коллагеном артрит у мышей (CIA, который представляет собой модель ревматоидного артрита на мышах) (Williams et al., 1994), и, таким образом, она была предложена в качестве способа лечения ревматоидного артрита.
Термин "хронические или идиопатические воспалительные заболевания кишечника" охватывают по
меньшей мере два состояния: болезнь Крона и язвенный колит. Оба они являются заболеваниями желудочно-кишечного тракта, причем болезнь Крона наиболее часто поражает тонкий кишечник. В случае,
когда она также вовлекает толстый кишечник, дифференциальный диагноз с язвенным колитом (см. ниже) может быть проблематичным.
Хроническое воспаление и изъязвление при болезни Крона обычно начинается тонкокишечной непроходимостью или болями в животе, которые могут имитировать острый аппендицит; другие проявления могут относиться к ее осложнениям. Течение заболевания является хроническим, и, несмотря на лечение, могут наступать обострения и ремиссии. Начало заболевания обычно приходится на начало
взрослой жизни; около половины всех случаев начинается между 20 и 30 годами и 90% - между 10 и 40
годами. Мужчины заболевают несколько чаще, чем женщины.
Исследование под микроскопом отражает общую картину. Воспаление не является непрерывным:
оно наблюдается фокусами или участками. Скопление лимфоцитов и плазматических клеток наблюдаются, главным образом, в слизистой оболочке и подслизистом слое, но обычно поражаются все слои
(трансмуральное воспаление). Классическим микроскопическим признаком болезни Крона является наличие гранулярных клеток, окруженных скоплением лимфоцитов. Распространенность идиопатических
воспалительных заболеваний кишечника значительно подвержена географическим вариациям. Указанные заболевания намного чаще встречаются в северной Европе и Соединенных Штатах, чем в странах
южной Европы, Африки, Южной Америки и Азии, хотя растущая урбанизация и благосостояние населения приводит к большей распространенности заболевания в областях южной Европы и Японии (General
and Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3-е издание, JCE Underwood, Ed.).
При болезни Крона клинически различают две главные группы: первую, включающую пациентов,
чье заболевание переходит в длительную ремиссию в течение трех лет после начала, и вторую, включающую пациентов с заболеванием, персистирующим свыше трех лет.
Какой бы ни была причина заболевания, имеются сведения о персистенции и патологической активации Т-клеток и макрофагов при болезни Крона, с повышенной выработкой провоспалительных цитокинов, в частности, интерлейкинов (IL) 1, 2, 6 и 8, интерферона (IFN)-γ и фактора некроза опухолей
(TNF)α. Болезнь Крона характеризуется продолжительным (хроническим) воспалением, сопровождающимся фиброзом. Процесс пролиферации фибробластов и отложения коллагена может опосредоваться
трансформирующим фактором роста (β, который обладает определенными противовоспалительными
свойствами, а именно, рекруитментом фибробластов, синтезом матрикса и понижающей регуляцией клеток воспаления, но, вероятно, в процессе участвует множество других медиаторов.
Язвенный колит представляет собой неспецифическое воспалительное заболевание толстого кишечника, которое обычно начинается в прямой кишке и распространяется проксимально на различном
протяжении. В отличие от болезни Крона, язвенный колит ограничивается толстым кишечником.
Все больше данных свидетельствуют о том, что язвенный колит является следствием измененной
аутоиммунной реактивности, но поражение слизистой оболочки также может возникать вследствие патологической активации Т-клеток и непрямого повреждения, вызываемого цитокинами, протеиназами и
реакционноспособными кислородными метаболитами из макрофагов и нейтрофилов. Данный последний
механизм повреждения эпителия толстого кишечника получил название повреждения "невинного свидетеля". Свидетельством в пользу аутоиммунного механизма является присутствие аутореактивных Т-6-
008667
лимфоцитов и аутоантител, направленных против эпителиальных и эндотелиальных клеток толстой
кишки, а также антинейтрофильных цитоплазматических аутоантител (ANCA). Однако не следует думать, что язвенный колит является аутоиммунным заболеванием, при котором поражение слизистой оболочки является прямым следствием иммунной реакции на аутоантиген (General and Systematic Pathology,
см. выше).
Что касается лечения болезни Крона, большинство людей сначала лечат лекарственными средствами, содержащими мезаламин, вещество, которое помогает бороться с воспалением. Пациентов, которым
оно не помогает или которые его не переносят, можно перевести на другие лекарственные средства, содержащие мезаламин, обычно известные как 5-ASA агенты. Возможные побочные эффекты препаратов
мезаламина включают тошноту, рвоту, изжогу, диарею и головную боль.
Некоторые пациенты для борьбы с воспалением принимают кортикостероиды. Указанные лекарственные средства являются наиболее эффективными для лечения активной болезни Крона, но они могут
вызывать серьезные побочные эффекты, включая повышенную чувствительность к инфекции.
Лекарственные средства, которые подавляют иммунную систему, также можно использовать для
лечения болезни Крона. Чаще всего назначают 6-меркаптопурин и родственное лекарственное средство,
азатиоприн. Иммунодепрессантные агенты действуют путем блокирования иммунной реакции, которая
вносит свой вклад в воспаление. Указанные лекарственные средства могут вызывать такие побочные
эффекты как тошнота, рвота и диарея, и могут снижать сопротивляемость организма по отношению к
инфекции. В случае, когда пациентов лечат комбинацией кортикостероидов и иммунодепрессантных
лекарственных средств, дозу кортикостероидов можно в конечном итоге снизить. Некоторые исследования предполагают, что иммунодепрессантные лекарственные средства могут повысить эффективность
кортикостероидов.
Администрация по пищевым продуктам и лекарственным средствам США разрешила использование лекарственного средства инфликсимаб для лечения умеренной и тяжелой болезни Крона, которая не
поддается стандартной медикаментозной терапии (мезаламиновым веществам, кортикостероидам, иммунодепрессантным агентам), и для лечения открытых, дренирующихся свищей. Инфликсимаб, первое лекарственное средство, разрешенное для использования конкретно при болезни Крона, представляет собой моноклональное антитело против фактора некроза опухолей (TNF). Анти-TNF удаляет TNF из кровотока до того, как он достигает кишечника, предотвращая, таким образом, воспаление.
Антибиотики используют для лечения избыточного размножения бактерий в тонком кишечнике,
вызванного стриктурой, свищами или перенесенными оперативными вмешательствами. По поводу данной распространенной проблемы врач может назначить один или более из следующих антибиотиков:
ампициллин, сульфонамид, цефалоспорин, тетрациклин или метронидазол.
Диарея и схваткообразные боли в животе часто облегчаются, когда исчезает воспаление, но может
потребоваться дополнительное медикаментозное лечение. Можно использовать несколько агентов против диареи, включая дифеноксилат, лоперамид и кодеин. Пациентов, которые обезвожены вследствие
диареи, обычно лечат жидкостями и электролитами.
Все еще остается потребность в эффективном лекарственном средстве для лечения и/или профилактики воспалительных заболеваний кишечника, в частности, болезни Крона (CD) и язвенного колита
(UC), которое имеет уменьшенные побочные эффекты или, в идеале, не имеет побочных эффектов.
Как гистологические, так и иммунологические исследования показывают, что клеточноопосредованный иммунитет и активация Т-клеток являются главными признаками CD. Исследования на
людях и экспериментальных моделях предполагают, что при CD локальный иммунный ответ представляет собой преимущественно ответ Тh1 типа (Desreumaux et al., 1997) и что локально высвобожденные
цитокины, такие как IFN-γ, IL-1β и TNF-α, вносят свой вклад в развитие и распространение воспалительного ответа (Reimund et al., 1996).
Цитокин IL-18 играет важную роль в Th1-опосредованном иммунном ответе совместно с цитокинов
IL-12 путем стимуляции секреции IFN-γ, усиления цитотоксичности клеток натуральных киллеров и
стимуляции дифференцировки клеток Th1 (Uschito et al., 1996).
IL-18 действует совместно с IL-12, IL-2, антигенами, митогенами и, возможно, другими факторами,
индуцируя выработку IFN-γ. IL-18 также увеличивает выработку GM-CSF и IL-2, потенцирует анти-СD3
индуцированную пролиферацию Т-клеток и повышает Fas-опосредованное уничтожение клеток натуральных киллеров. Зрелый IL-18 производится из его предшественника с участием IL-1β-превращающего фермента (ICE, каспазы-1). Рецептор IL-18 состоит по меньшей мере из двух компонентов, которые
действуют совместно при связывании лиганда. Сайты связывания с IL-18 высокой и низкой аффинности
были обнаружены в стимулированных мышиным IL-12 Т-клетках (Okamoto et al., 1998), предполагающие рецепторный комплекс, состоящий из множества цепей. К настоящему времени идентифицированы
две рецепторные субъединицы, оба принадлежащие к семейству рецепторов IL-1 (Okamoto et al., 1999). В
сигнальной трансдукции IL-18 участвует активация NF-κВ (Matsumoto et al., 1997).
Недавно было высказано предположение, что IL-18 принимает некоторое участие при воспалительных заболеваниях кишечника (Pizarro et al., 1999; Monteleone et al., 1999).
-7-
008667
Pizarro et al. (1999) описали экспрессию и локализацию IL-18 в образцах толстого кишечника и изолированных популяциях клеток слизистой оболочки от пациентов с болезнью Крона. Используя полуколичественный протокол RT-PCR, количество транскриптов мРНК IL-18, как было установлено, возрастает в только что выделенных эпителиальных клетках кишечника и мононуклеарных клетках lamina propria
при CD, по сравнению с пациентами с язвенным колитом и с контрольными пациентами, не имеющими
воспаления. Транскрипты мРНК IL-18 наблюдались в большем количестве в эпителиальных клетках кишечника по сравнению с мононуклеарными клетками lamina propria. Иммуногистохимический анализ
хирургически резецированных тканей толстого кишечника показал локализацию IL-18 как в мононуклеарных клетках lamina propria (особенно, в макрофагах и дендритных клетках), так и в эпителиальных
клетках кишечника. Анализ вестерн-блот показал, что полосу 18,3 кДа, соответствующую как рекомбинантному, так и зрелому человеческому белку IL-18, обнаруживали преимущественно в биоптатах слизистой оболочки при CD по сравнению с UC; вторую полосу 24 кДа, соответствующую неактивному
предшественнику IL-18, обнаруживали в невоспаленных участках биоптатов как при CD, так и при UC, и
она была единственной формой, которую находили у контролей, не имевших воспаления.
Monteleone et al. (1999) подтвердили указанные данные. Цельную ткань слизистой оболочки кишки
и мононуклеарные клетки lamina propria от 12 пациентов с болезнью Крона и 9 пациентов с язвенным
колитом и от 15 контролей с невоспалительными заболеваниями кишечника подвергали анализу на
предмет IL-18 с использованием полуколичественной RT-PCR и анализа вестерн-блот. Транскрипты для
IL-18 обнаружили во всех анализировавшихся образцах. Однако повышенное скопление мРНК IL-18 было выявлено в образцах как слизистой оболочки, так и мононуклеарных клеток lamina propria при болезни Крона, по сравнению с язвенным колитом и контролями. При болезни Крона транскрипты для IL-18
наблюдались в большем количестве в образцах слизистой оболочки, взятых из пораженных областей.
Полосу 18 кДа, соответствующую зрелому IL-18, обнаруживали преимущественно в образцах слизистой
оболочки при болезни Крона. В образцах слизистой оболочки контролей без IBD IL-18 присутствовал в
виде полипептида 24 кДа. Постоянно активная субъединица (р20) IL-1β-превращающего фермента (ICE)
экспрессировалась в образцах как при CD, так и при UC, в то время как в слизистой оболочке толстой
кишки контролей без IBD ICE синтезировался только в виде предшественника (р45).
Ohta et al. в 2001 г. показали, что экспрессия IL-18 возрастает в коже, пораженной псориазом, по
сравнению с экспрессией в нормальной коже. Их данные показывают, что IL-18, полученный из кератиноцитов, участвует в развитии Th1 ответа в псориатических поражениях и что его биологическая активность, как оказалось, строго регулируется при воспалении кожи.
На нескольких моделях экспериментальных животных было показано, что антитела, которые нейтрализуют эндогенный IL-18, уменьшают тяжесть заболевания. Летальность, связанная с эндотоксином,
предотвращается при использовании анти-IL-18. Даже на моделях, которые являются независимыми от
интерферона-γ, нейтрализация IL-18 пролонгирует выживание. Анти-IL-18 также защищают печень от
клеточного повреждения, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками. На моделях
метастазов меланомы в печень блокада IL-18 снижает адгезию злокачественных клеток путем предотвращения повышающей регуляции IL-18 в отношении экспрессии молекулы адгезии-1 эндотелия сосудов. IL-18 и IL-12 действуют синергически в отношении стимуляции выработки IFN-γ I-клетками и клетками натуральными киллерами, но нейтрализация IL-18 предотвращает индукцию IFN-гамма. IL-18, подобно нескольким цитокинам, можно использовать для усиления защиты хозяина против опухолей у
мышей, механизм, которые наиболее часто является зависимым от IFN-гамма. Тем не менее, именно
провоспалительные свойства IL-18, вероятно, вносят свой вклад в усиление защиты хозяина. На моделях
артрита, повреждения легких или воспалительного заболевания кишечника нейтрализация IL-18 выявляет важную роль данного цитокина в опосредовании воспаления (Dinarello, 2000).
Опубликованные данные свидетельствуют, что IL-18 может играть патологическую роль в воспалительных заболеваниях ЦНС. Как было показано, нейтрализация IL-18 защищает экспериментальных животных от повреждения головного мозга (Yatsiv et al., 2002), ишемического повреждения (Mallat et al.,
2002), сердечной дисфункции (Raeburn, 2002) и неврита (Yu et al., 2002).
Однако имеются свидетельства, что IL-18 способствует защите хозяина от опухолей у мышей. Например, у сингенных мышей клетки мышиной карциномы молочной железы, экспрессирующие мышиный IL-12 или мышиный IL-18, были менее онкогенными и образовывали опухоли более медленно, чем
контрольные, не экспрессирующие, клетки (Coughlin et al., 1998). Исследования по нейтрализации антител показали, что противоопухолевые эффекты требуют наличия IFN-γ. В исследовании, проведенном
Tasaki, наблюдался защитный иммунитет, индуцированный в клетках мышиной карциномы толстого
кишечника, посредством экспрессии интерлейкина-18. Клетки рака толстого кишечника, трансдуцированные векторами, кодирующими ген IL-18, не могли образовывать подкожных опухолей после введения
иммунокомпетентным мышам, и становились резистентными к инокулированным нетрансдуцированным
клеткам рака толстого кишечника. Иммуногистохимический анализ показал, что количество кровеносных сосудов в опухолях толстого кишечника с клетками, трансдуцированными векторами IL-18, значительно уменьшалось. Утрата онкогенности трансдуцированными IL-18 клетками толстого кишечника не
-8-
008667
наблюдалась у иммуноскомпрометированных мышей. Таким образом, IL-18, секретированный из опухолевых клеток, действует как адъювант, поскольку он стимулирует Т-хелперные клетки типа I индуцировать противоопухолевый ответ (Tasaki et al., 2000).
Было высказано предположение, что IFN-α проявляет свое противовоспалительное действие in vivo
у пациентов с хроническим гепатитом С, помимо прочего, посредством индукции IL-18BP (Kaser et al.,
2002).
В предыдущей работе было установлено, что по сравнению со здоровыми лицами, уровни IL-18BP
были значительно повышены при многих заболеваниях, таких как сепсис (Novick, 2001), острая реакция
трансплантат против хозяина (Zecchina, 2001), болезнь Крона (Corbaz, 2002). Однако также было установлено, что у данных пациентов уровни IL-18 в циркуляции являются очень высокими и, следовательно, уровни IL-18BP, присутствующие в циркуляции могут быть недостаточными для полной нейтрализации IL-18.
Таким образом, существует потребность в обеспечении средств для лечения и/или профилактики
заболеваний, при которых в их патогенезе участвует цитокин из семейства IL-1, такой как IL-18.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению цитокина-1, предпочтительно, из семейства IL-1,
более предпочтительно, IL-lF7b, или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с IL-18BP или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом, и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2
является членом семейства IL-1, предпочтительно, IL-18; для производства лекарственного средства для
лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
Более конкретно, цитокин-1 ингибирует активность цитокина-2 путем связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Таким образом, цитокин-1 можно применять для лечения или профилактики
воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита,
повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга,
ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита, или для лечения или профилактики образования метастазов. Если это желательно, лекарственное средство по настоящему изобретению может дополнительно содержать IL-18BP или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.
Вместо белка цитокина-1, можно использовать вектор, кодирующий указанный цитокин-1, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или
утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
Указанные выше белок (белки) и/или векторы по настоящему изобретению можно вводить системно, подкожно и/или внутримышечно.
Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору для эндогенной генной активации цитокина-1, предпочтительно, из семейства IL-1, более предпочтительно, IL-1F7b, способного связываться с IL18BP или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом, и способного
ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства IL-1, предпочтительно, IL-18;
для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2. Более конкретно, цитокин-1 ингибирует активность цитокина-2 путем
связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению цитокина-1 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, таких как
летальность, связанная с эндотоксином (сепсис), повреждение печени, индуцированное токсинами или
активированными Т-клетками, или гепатит С, артрит, повреждение легких, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, повреждение головного мозга, ишемическое повреждение, дисфункция сердца и
неврит, или для лечения или профилактики образования метастазов. Если это желательно, лекарственное
средство по настоящему изобретению может дополнительно содержать IL-18BP или его мутеин, слитый
белок, функциональное производное или фрагмент.
Вектор для эндогенной генной активации по настоящему изобретению можно вводить системно,
подкожно и/или внутримышечно.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению ингибитора цитокина-1, предпочтительно, из семейства IL-1, более предпочтительно, IL-1F7b, или его изоформы, мутеина, слитого
белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с IL-18BP или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом, и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 язляется членом семейства IL-1, предпочтительно, IL-18; для лечения или
профилактики заболевания, которое предотвращается или облегчается индуцированием указанного рецептора цитокина-2. Более конкретно, изобретение относится к применению ингибитора цитокина-1 по
настоящему изобретению для лечения или профилактики вирусного заболевания или для лечения или
профилактики злокачественной опухоли.
Ингибиторы цитокина-1 включают, например, антитела, бессмысленную нуклеиновую кислоту,
-9-
008667
PHKi или растворимый рецептор цитокина-2 или его фрагмент, способный связываться с цитокином-1.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования рецептора цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства IL-1, предпочтительно, IL-18; у пациента, который в этом нуждается,
включающему введение терапевтически эффективного количества цитокина-1, предпочтительно, IL1F7b, или его изоформы, мутеина, слитого белка или фрагмента, способного связываться с IL-18BP или
его изоформой, мутеином, слитым белком, или фрагментом. Более конкретно, цитокин-1 ингибирует
активность цитокина-2 путем связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Более конкретно,
изобретение относится к применению цитокина-1 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких,
псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита, или для лечения или профилактики образования метастазов.
Если это желательно, IL-18BP или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное
или фрагмент можно вводить совместно с цитокином-1. Цитокин-1 по настоящему изобретению можно
вводить системно, подкожно и/или внутримышечно.
Альтернативно, способ по настоящему изобретению включает введение векторов, кодирующих
указанный цитокин-1.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибитора рецептора цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства IL-1, предпочтительно, IL-18; у пациента, который в этом нуждается,
включающему введение терапевтически эффективного количества вектора для генной активации цитокина-1, предпочтительно, IL-1F7b, или его изоформы, мутеина, слитого белка или фрагмента, способного
связываться с IL-18BP или его изоформой, мутеином, слитым белком или фрагментом. Более конкретно,
цитокин-1 ингибирует активность цитокина-2 путем связывания с сигнальной цепью рецептора цитокина-2. Циокина-1 можно применять для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, таких
как летальность, связанная с эндотоксином (сепсис), повреждение печени, индуцированное токсинами
или активированными Т-клетками, или гепатит С, артрит, повреждение легких, псориаз, воспалительное
заболевание кишечника, повреждение головного мозга, ишемическое повреждение, дисфункция сердца и
неврит, или для лечения или профилактики образования метастазов. Если это желательно, IL-18BP или
его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент можно вводить совместно с цитокином-1. Вектор для генной активации по настоящему изобретению можно вводить системно, подкожно
и/или внутримышечно.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ингибирования цитокина-1, предпочтительно, из семейства IL-1, более предпочтительно, IL-1F7b, или его изоформы, мутеина, слитого белка,
функционального производного или фрагмента, способного связываться с IL-18BP или его изоформой,
мутеином, слитым белком или фрагментом и способного ингибировать активность цитокина-2; цитокин2 является членом семейства IL-1, предпочтительно, IL-18; для лечения или профилактики заболевания,
которое предотвращается или облегчается индуцированием указанного рецептора цитокина-2. Более конкретно, способ по настоящему изобретению включает ингибитор цитокина-1 для лечения или профилактики вирусного заболевания или для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1. Сходство последовательностей человеческого IL-18 и IL-IF7b.
Показаны человеческий IL-18 (№ в каталоге D49950) и человеческий IL-IF7b (№ в каталоге
AF200496). Линейное строение было создано с использованием системы Expert Protein Analysis System
(ExPasy®) с дополнительной доводкой вручную.
Аминокислотная идентичность IL-18 с IL-IF7b составляет 28%, а сходство - 55%. Подчеркнутые
аминокислоты представляют сайт расщепления ICE в IL-18 и прогнозируемый сайт расщепления в ILIF7b.
Фиг. 2 показывает, что IL-IF7b ни стимулирует, ни ингибирует выработку IFN-γ, индуцированную
IL-18.
Фиг. 2А. На человеческие клетки NKO, культуры цельной человеческой крови, РВМС (стимулированные совместно с IL-12 (1 нг/мл) и клетки KG-1 (стимулированные совместно с TNF-α (10 нг/мл) воздействовали 100 нг/мл рекомбинантного IL-IF7b (предшественника и зрелой формы) или IL-18. Через 18
ч (48 ч для KG-1) определяли IFN-γ в надосадочной жидкости. Результаты показаны как среднее ± СОС
трем независимым экспериментам.
Фиг. 2В. Индукция IL-18 (20 нг/мл) клеток NK в присутствии IL-12 (1 нг/мл) и повышение концентраций предшественника и зрелой формы IL-IF7b. Данные представляют среднее ± СОС трем независимым экспериментам.
Фиг. 3А и 3В показывают перекрестное сшивание IL-IF7b и внеклеточного домена 3 IL-18Rα.
Фиг. 3А. Восстановительный SDS-PAGE IL-IF7b, поперечно сшитого с IL-18Rα: D3. После блоттинга на нитроцеллюлозе поперечно сшитые белки визуализировали моноклональным mAb антителом
против IL-18Rα.
- 10 -
008667
Фиг. 3В. Образование трехкомпонентного комплекса IL-18Rα- и β-ECD в присутствии IL-18, но не
IL-IF7b, после химического поперечного сшивания. После вестерн-блоттинга комплексы визуализировали меченным анти-his6 моноклональным антителом против меченного his6 IL-18Rβ.
Фиг. 4А и 4В показывают перекрестное сшивание IL-IF7b и IL-18BP.
Фиг. 4А. Выявление поперечно сшитых белков (1,5 мкг каждого) с помощью анализа вестерн-блот с
использованием кроличьей анти-IL-18ВР сыворотки.
Фиг. 4В. Иммунопреципитация поперечно сшитых белков (10 мкг каждого) с помощью mAb против
IL-18BP. Полосы поперечно сшитых IL-IF7b/IL-18BP и контроля (IL-18BP ± BS3, поперечно сшивающий
агент) окрашивали с использованием кроличьей анти-IL-1F7b сыворотки. Комплекс IL-18/IL-18BP выявляли с использованием кроличьей анти-IL-18 сыворотки.
Фиг. 5А и 5В показывают, что IL-IF7b усиливает способность IL-18BP ингибировать индуцированное IL-18 высвобождение IFN-γ клетками NKO.
Зрелый IL-IF7b 250 нг/мл (А, 0=9) (фиг. 5А) или предшественник IL-IF7b (фиг. 5В) 250 нг/мл (В,
0=8), IL-18 (25 нг/мл) и разведение IL-18BP в RPMI/FCS 10% инкубировали в 96-луночных микротитрационных планшетах в течение 1 ч до добавления клеток NKO (0,5 х 10б/мл) и IL-12 1 нг/мл. После 16 ч
инкубации с клетками надосадочную жидкость собирали и измеряли IFN-γ. Величины выражали как
процентную долю IFN-γ, выработанного клетками NKO, стимулированными IL-18 25 нг/мл плюс IL-12 1
нг/мл, в отсутствии IL-IF7b или IL-18BP. Статистический анализ осуществляли с использование парного
t-критерия Стьюдента (*** величина р < 0,001).
Фиг. 6 показывает экспрессию IL-IF7b в трансфектированных RAW264.7.
После стабильной трансфекции лизаты отдельных клонов (5 х 106 клеток) разделяли с помощью
SDS-PAGE и анализировали на экспрессию IL-IF7b с использованием анализа вестерн-блот. Кроличья
анти-IL-1F7b сыворотка (разведение 1:500) специфичным образом окрашивала IL-IF7b-положительные
клоны.
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к применению цитокина-1 (например, IL-1F7b), способного связываться с
IL-18BP или его изоформой, мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом
и способного ингибировать рецептор цитокина-2; цитокин-2 является членом семейства IL-1 (например,
IL-18R); для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое
вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2. В настоящем описании
термины "ингибирование рецептора цитокина-2" и "ингибирование активности цитокина-2" являются
взаимозаменяемыми. Таким образом, изобретение относится к применению цитокина-1, способного связываться с IL-18BP или его изоформой, мутеином, слитым белком, функциональным производным или
фрагментом и способного ингибировать активность цитокина-2, представляющего собой цитокин-2, являющийся членом семейства цитокинов IL-1. Изобретение основано на открытии того факта, что IL1F7b, как было показано, усиливает ингибирование активности IL-18 с помощью IL-18BP. Было установлено, что IL-1F7b связывается с IL-18BP, а комплекс ингибирует активацию IL-18R с помощью IL-18,
возможно, с привлечением сигнальной цепи IL-18R (т.е., IL-18Rβ).
Цитокин-1, согласно настоящему изобретению, может, предпочтительно, являться членом семейства IL-1, таким как IL-1F7b, IL-18, IL-1 и IL-1Ra. Согласно настоящему изобретению, цитокин-1 и цитокин-2 являются двумя различными цитокинами. Например, выбирают следующие комбинации цитокина1 и цитокина-2: IL-1F7b (цитокин-1) и IL-18 (цитокин-2), IL-1F7b (цитокин-1) и IL-1 (цитокин-2), IL-18
(цитокин-1) и IL-1 (цитокин-2), IL-1 (цитокин-1) и IL-18 (цитокин-2), IL-1F7b (цитокин-1) и IL-1Ra (цитокин-2), IL-1Ra (цитокин-1) и IL-18 (цитокин-2) и IL-18 (цитокин-1) и IL-1Ra (цитокин-2).
IL-1F7b (называемый также IL-1H4) был открыт недавно как новый член растущего семейства белков, имеющий гомологичность последовательности с IL-1 α/β, IL-1Ra и IL-18 (семейство IL-1). Хотя IL1F7b связывается с одной из субъединиц рецептора IL-18, единицей IL-18Ra, указанное связывание не
имеет результатом агонистическую или антагонистическую функцию IL-18. В соответствии с настоящим
изобретением, используя химическое поперечное сшивание, IL-1F7b связывается с IL-18Ra, но в отличие
от IL-18, IL-1F7b не привлекает цепь IL-18Rβ для образования функционально активного трехкомпонентного комплекса.
Последовательности IL-1F7b и IL-18 сравнивали, и было установлено, что белки имеют две общие
консервативные аминокислоты, т.е., аминокислоты Е35 и K124 в IL-1F7b и Е42 и K89 в IL-18. Остатки
Е42 и K89 в IL-18 являются важными как для активности, так и для ингибирования IL-18, поскольку они
участвуют в связывании с IL-18Rα (активация) и с IL-18BP (ингибирование).
Помимо этого, заявители установили с помощью экспериментов по поперечному сшиванию, что IL1F7b связывается с IL-18BP и что аналогично с IL-18, IL-1F7b может связываться с IL-18BP через те же
два остатка консервативных аминокислот, которые являются важными для связывания с IL-18Rα (т.е.,
аминокислоты Е35 и K124). Таким образом, после образования IL-1F7b комплекса с IL-18BP, IL-1F7b,
возможно, более не способен связываться с IL-18Rα. Было установлено, что IL-1F7b не только связывается с IL-18BP, но и повышает его активность, т.е., усиливает ингибирование активности IL-18. Данная
- 11 -
008667
активность была обнаружена как у предшественника, так и у зрелого белка IL-1F7b. Поскольку IL-1F7b в
комплексе с IL-18BP не способен связываться с IL-18Rα, ингибирование активности IL-18, возможно,
вызывается связыванием указанного комплекса с сигнальной цепью IL-18Rβ. Таким образом, β-цепь может быть привлечена в комплекс, что лишает β-цепь возможности формировать функциональный рецепторный комплекс с IL-18Rα и IL-18.
Таким образом, изобретение охватывает ингибирование передачи сигнала через рецептор цитокина2; цитокин-2 является членом семейства IL-1; другим цитокином (цитокином-1) или его изоформой, мутеином, аллельным вариантом или фрагментом, способным связываться с IL-18BP или его изоформой,
мутеином, аллельным вариантом или фрагментом.
Иммуногистохимические исследования по локализации показали присутствие IL-1F7b в популяции
моноцитов, что подтверждает роль IL-1F7b как натурального экспрессируемого модулятора биологической активности IL-18.
Используемый в настоящем документе термин "мутеины" относится к аналогам цитокина-1, таким
как IL-1F7b, в которых один или более аминокислотных остатков цитокина-1, например, IL-1F7b, заменены на другие аминокислотные остатки или опущены, или один или более аминокислотных остатков
добавлены к IL-1F7b, без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с
IL-1F7b. Более конкретно, один или более аминокислотных остатков IL-1F7b, но не более 30, предпочтительно не более 20, более предпочтительно не более 10, наиболее предпочтительно один или два аминокислотных остатка могут быть заменены на другие аминокислотные остатки или отсутствовать или могут быть добавлены. Указанные мутеины получают с использованием известных методик синтеза и/или
сайт-направленного мутагенеза или с использованием любой другой подходящей для данной цели методики.
Мутеины в соответствии с настоящим изобретением включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизируется с ДНК или РНК, которая кодирует цитокин-1,
такой как IL-1F7b, в соответствии с настоящим изобретением, при строгих условиях. Термин "строгие
условия" относится к условиям гибридизации и последующего отмывания, которые специалистами
обычно относятся к "строгим". См. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§ 6.3 и 6.4 (1987, 1992) и Sambrook et al., supra. Без ограничения, примеры строгих условий
включают условия отмывания при 12-20°С, ниже рассчитанной Тм изучаемого гибрида, в, например, 2 х
SSC и 0,5% SDS в течение 5 мин, 2 х SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин, 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 37°С в
течение 30-60 мин, а затем, 0,1 х SSC и 0,5% SDS при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисты в данной
области понимают, что строгие условия также зависят от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (таких как 10-40 нуклеотидов) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если используются смешанные зонды, предпочтительно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо
SSC. См. Ausubel, supra.
Любой подобный мутеин предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, достаточно
дупликативную последовательности цитокина-1, такого как IL-1F7b, таким образом, чтобы он обладал
активностью, практически аналогичной активности IL-1F7b. Одной активностью IL-1F7b является его
способность связываться с IL-18BP. Таким образом, можно определить, обладает ли любой данный мутеин практически такой же активностью как у IL-1F7b, посредством рутинного экспериментирования,
включающего подвергание указанного мутеина, например, простому конкурентному сандвич-анализу
для того, чтобы определить, связывается ли он с соответствующим образом меченным IL-18BP или нет,
такому как радиоиммуноанализ или анализ ELISA.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения любой подобный мутеин
обладает по меньшей мере 40% идентичностью или гомологичностью с аминокислотной последовательностью IL-1F7b. Более предпочтительно, он обладает по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по
меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью или гомологичностью с указанной аминокислотной последовательностью.
Мутеины цитокина-1, такого как IL-1F7b, которые можно использовать в соответствии с настоящим
изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают ограниченный ряд практически соответствующих последовательностей как замещающие пептиды или полинуклеотиды, которые может
получить обычным способом специалист, без излишнего экспериментирования, на основе идей и руководства, представленных в настоящем документе.
Предпочтительные изменения для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением представляют собой изменения, которые известны как "консервативные" замены. Консервативные аминокислотные замены цитокина-1, такого как IL-1F7b, могут включать синонимические аминокислоты в пределах
группы, которая имеет достаточно сходные физико-химические свойства, таким образом, что замена между членами группы будет сохранять биологическую функцию молекулы (Grantham, 1974). Понятно, что
врезки и делеции аминокислот также могут быть произведены в указанных выше последовательностях
без изменения их функции, особенно, если врезки или делеции затрагивают только малое количество
аминокислот, например, меньше тридцати и, предпочтительно, меньше десяти, и не удаляют или пере- 12 -
008667
мещают аминокислоты, которые являются ключевыми для функциональной комформации, например,
остатки цистеина. Белки и мутеины, полученные в результате подобных делеций и/или врезок, входят в
объем настоящего изобретения.
Предпочтительно, группы синонимических аминокислот являются теми, которые определены в
табл. 1. Более предпочтительно группы синонимических аминокислот являются теми, которые определены в табл. 2; и наиболее предпочтительно группы синонимических аминокислот являются теми, которые
определены в табл. 3.
Таблица 1. Предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота
Синонимическая группа
Таблица 2. Более предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота
Синонимическая группа
- 13 -
008667
Таблица 3. Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот
Аминокислота Синонимическая группа
Примеры осуществления аминокислотных замен в белках, которые можно использовать для получения мутеинов цитокина-1, таких как полипептиды или белки IL-1F7b, для использования в настоящем
изобретении включают любые известные стадии методов, такие как представленные в патентах США 4
959 314, 4 588 585 и 4 737 462, выданных Mark et al.; 5 116 943, выданном Koths et al.; 4 965 195, выданном Namen et al.; 4 87 9 111, выданном Chong et al., и 5 017 691, выданном Lee et al.; и лизин-замещенные
белки, представленные в патенте США № 4 904 584 (Shaw et al.).
Термин "слитый белок" относится к полипептиду, включая цитокин-1, предпочтительно IL-1F7b,
или его мутеину или фрагменту, слитому с другим белком, который, например, более продолжительно
существует в жидкостях организма. IL-1F7b, таким образом, может быть слит с другим белком, полипептидом и т.п., например, иммуноглобулином или его фрагментом.
"Функциональные производные", как используется в настоящем документе, относятся к производным цитокина-1, предпочтительно IL-1F7b, и его мутеинам и слитым белкам, которые можно получить
из функциональных групп, которые присутствуют как боковые цепи на остатках или N- или С-концевых
группах, с использованием известных специалистам методик, и включены в настоящее изобретение, если
только они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активность белка, которая
является практически аналогичной активности IL-1F7b, и не придают токсических свойств содержащим
их композициям.
Указанные производные могут, например, включать полиэтиленгликолевые боковые цепи, которые
могут маскировать антигенные сайты и продлевать существование цитокина-1, предпочтительно IL1F7b, в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп путем взаимодействия с аммиаком или с первичными или
вторичными аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными частями (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными
группами) или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, остатков серина
или треонина), образованные с ацильными частями.
Под "фрагментами" цитокина-1, предпочтительно IL-1F7b или его мутеинов и слитых белков в настоящем изобретении подразумевают любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы в отдельности или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, присоединенными с ним, например, остатками сахара или фосфата, или агрегаты белковой молекулы или сами
остатки сахара, при условии, что указанная фракция обладает практически аналогичной активностью с
IL-1F7b, такой как связывание с IL-18BP и ингибирование рецептора цитокина-2.
- 14 -
008667
Настоящее изобретение относится также к цитокину-1, предпочтительно, изоформам IL-1F7b, мутеинам, слитым белкам, функциональным производным, активным фракциям или их производным с циклическими перестановками. Указанные изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные сохраняют биологическую активность цитокина-1, в частности, связывание с IL-18BP и, предпочтительно, усиление ингибирования цитокина-2. Например, мутеины IL-1F7b сохраняют способность
связываться с IL-18BP и, предпочтительно, усиливать ингибирование IL-18. Мутеины сохраняют аминокислоту, участвующую в связывании цитокина-1 с IL-18BP. Например, в случае IL-1F7b мутеины сохраняют аминокислоты Е35 и K124. В идеале указанные мутеины обладают повышенной биологической
активностью по сравнению с немодифицированным цитокином-1. Предпочтительные активные фракции
обладают активностью, которая превосходит активность цитокина-1 или которая имеет дополнительные
преимущества, такие как более высокая стабильность или более низкая токсичность или иммуногенность, или их легче производить в больших количествах или легче очищать.
Цитокин-1, предпочтительно IL-1F7b, можно использовать в фармацевтической композиции для
лечения или профилактики воспалительных заболеваний или образования метастазов, которые вызываются или утяжеляются цитокином-2, предпочтительно IL-18. Было установлено, что при нескольких воспалительных заболеваниях уровень циркулирующего IL-18BP у пациентов является высоким, однако
концентрация IL-18BP может быть недостаточной для полной нейтрализации высоких концентраций IL18, обнаруживаемых в циркуляции у данных пациентов. Таким образом, введение цитокина-1, предпочтительно, IL-1F7b, указанным пациентам, имеющим уже повышенный уровень IL-18BP, может помочь
полностью ингибировать действие 11-18.
Альтернативно, IL-1F7b и IL-18BP можно вводить пациентам совместно для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса),
повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С,
артрита, повреждения легких, псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита, или для лечения или профилактики
образования метастазов.
Поскольку было установлено, что IL-1F7b не только связывается с IL-18BP, но также повышает его
активность (ингибирование активности IL-18), совместное введение IL-1F7b с IL-18BP может иметь преимущества, если желательно введение IL-18ВР в более низких количествах.
Цитокин-1, предпочтительно IL-1F7b, вводят подходящим путем, в зависимости от заболевания.
Так, его можно вводить, например, местно, системно, подкожно и внутримышечно.
Нейтрализация IL-18 у экспериментальных животных выявила важную роль указанного цитокина в
опосредовании воспаления (Interleukin-18, a proinflammatory cytokine. Dinarello С.А. Eur. Cytokine Netw.
2000 Sep.; 11(3): 483-6). Таким образом, настоящее изобретение относится к применению цитокина-1 или
экспрессирующего вектора, включающего кодирующую последовательность цитокина-1, предпочтительно, IL-1F7b, для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики воспаления.
Таким образом, цитокин-1, предпочтительно IL-1F7b, можно вводить для лечения или профилактики
воспалительных заболеваний, при которых известно, что IL-18 участвует в их патогенезе, таких как летальность, связанная с эндотоксином (сепсис), повреждение печени, индуцированное токсинами или активированными Т-клетками, или гепатит С, артрит, повреждение легких, псориаз, воспалительное заболевание кишечника, повреждение головного мозга, ишемическое повреждение, дисфункция сердца и
неврит.
Настоящее изобретение относится также к применению экспрессирующего вектора для изготовления лекарственного средства для профилактики образования метастазов, поскольку блокада IL-18 снижает адгезию злокачественных клеток путем предотвращения повышающей регуляции IL-18 в отношении
экспрессии молекулы адгезии-1 эндотелия сосудов. Таким образом, рассматривается подход генной терапии с целью доставки цитокина-1 к сайту, где он требуется. Для того, чтобы лечить заболевания, вектор генной терапии, включающий последовательность цитокина-1 (например, IL-1F7b), можно инъецировать непосредственно в пораженную ткань, что позволяет избежать проблем, связанных с системным
введением векторов генной терапии, таких как разведение вектора, достижение и нацеливание на клетки
или ткани-мишени или побочные эффекты. Альтернативно, экспрессирующий вектор, включающий кодирующую последовательность цитокина-1 по настоящему изобретению, можно вводить с помощью
внутримышечной инъекции.
Цитокин-1, предпочтительно IL-1F7b, и его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные
производные или активные фракции, как описано выше, являются предпочтительными активными ингредиентами фармацевтических композиций. IL-18BP и его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные или активные фракции, как описано выше, могут быть дополнительно включены в качестве активного ингредиента в фармацевтические композиции.
Определение "фармацевтически приемлемый" включает любой носитель, который не мешает эффективности биологической активности активного ингредиента и не является токсичным для хозяина,
которому его вводят. Например, для парентерального введения активный белок (белки) можно изготавливать в виде стандартной лекарственной формы для инъекций, в таких носителях как физиологический
- 15 -
008667
раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.
Активные ингредиенты фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно вводить
индивидууму различными путями. Пути введения включают внутрикожный, чрескожный (например, в
композициях с замедленным высвобождением), внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный
(системный), подкожный, пероральный, интракраниальный, эпидуральный, местный и интраназальный
пути. Можно использовать любой другой терапевтически эффективный путь введения, например, всасывание через эпителиальные или эндотелиальные ткани, или с помощью генной терапии, при которой пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активный агент (например, посредством вектора), что вызывает экспрессию и секрецию активного агента in vivo. Кроме того, белок (белки) по настоящему изобретению можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные агенты, наполнители, носители и разбавители.
Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) активный белок (белки) можно изготавливать в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного
порошка, совместно с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и вспомогательными агентами, которые поддерживают
изотоничность (например, маннитом) или химическую стабильность (например, консервантами и буферными агентами). Композицию стерилизуют с помощью обычных технологий.
Биологическую доступность активного белка (белков) по настоящему изобретению можно также
улучшить с помощью процедур конъюгации, которые увеличивают полупериод существования молекулы в организме человека, например, связывая молекулу с полиэтиленгликолем, как описано в патентной
заявке РСТ WO 92/13095.
Цитокин-1, предпочтительно IL-1F7b, или его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные
производные или активные фракции, как описано выше, можно использовать для ингибирования активности цитокина-2 у пациентов, страдающих воспалительными заболеваниями, такими как сепсис, повреждение печени, индуцированное токсинами или активированными Т-клетками, артрит, повреждение легких, псориаз или воспалительное заболевание кишечника. Цитокин-1 по настоящему изобретению или
его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные или активные фракции, как описано выше, можно также использовать для профилактики образования метастазов, поскольку блокада IL18 снижает адгезию злокачественных клеток, путем предотвращения повышающей регуляции IL-18 в
отношении экспрессии молекулы адгезии-1 эндотелия сосудов. Указанные выше способы включают введение терапевтически эффективного количества цитокина-1, например, IL-1F7b, пациенту, который в
этом нуждается, цитокин-1 можно вводить совместно с IL-18BP или его изоформами, мутеинами, слитыми белками, функциональными производными или активными фракциями, как описано выше.
Терапевтически эффективные количества активного белка (белков) будут зависеть от многих факторов, включая тип мутеина, аффинность мутеина по отношению к IL-18BP, любая остаточная цитотоксическая активность, присущая мутантам, путь введения, клиническое состояние пациента.
"Терапевтически эффективное количество" означает такое количество циттокина-1, такого как IL1F7b, которое после введения приводит к повышению ингибирующей активности IL-18BP или его изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных или активных фракций, как описано выше, в отношении IL-18. Вводимая индивидууму доза, однократная или множественная, может варьировать в зависимости от ряда факторов, включая путь введения, состояние и характеристики пациента (пол,
возраст, масса тела, здоровье, размер), распространение симптомов, сопутствующее лечение, частота
лечения и желаемый эффект. Подбор и манипуляции с установленными пределами доз находятся в компетенции специалистов, как и in vitro и in vivo методы определения активности цитокина-1.
Применение вектора для индуцирования и/или повышения эндогенной выработки цитокина-1,
предпочтительно, IL-1F7b, в клетке, обычно не экспрессирующей цитокин-1 или экспрессирующей недостаточные количества цитокина-1, также входит в объем настоящего изобретения. Вектор может
включать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, для которых желательна экспрессия цитокина. Данные регуляторные последовательности включают промоторы или энхансеры.
Регуляторную последовательность затем вводят в соответствующий локус генома путем гомологичной рекомбинации, оперативно связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого требуется индуцировать или повысить. Данную технологию обычно называют "эндогенной генной активацией" (EGA), и она описана, например, в WO 91/09955.
Специалисту будет понятно, что возможно также прекратить экспрессию цитокина-1 с помощью
тех же самых методик, например, введением элемента отрицательной регуляции, такого как молчащий
элемент, в локус гена цитокина-1, что приводит к понижающей регуляции или предотвращению экспрессии цитокина-1. Специалисту будет понятно, что подобная понижающая регуляция или введение молчащего элемента в цитокин-1 оказывает такое же действие как использование ингибитора цитокина-1 с
целью профилактики и/или лечения заболевания.
Таким образом, в случае, когда желательно уменьшение эффекта IL-18, такого как воспалительные
заболевания, или для ингибирования образования метастазов, будет желательным повышение количества
или активности цитокина-1, например, IL-1F7b, в клетке. IL-18BP можно вводить совместно с цитоки- 16 -
008667
ном-1, например, IL-1F7b, для лечения субъекта, который в этом нуждается.
Однако уменьшение количества или активности цитокина-1, например, будет желательным в ситуациях, когда требуется усиление эффекта IL-18, например, для лечения/профилактики опухоли или для
лечения или профилактики вирусного заболевания. Таким образом, использование цитокина-1 и, предпочтительно, IL-1F7b, в качестве мишени также входит в объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Влияние IL-1F7b на стимуляцию выработки IFN-γ.
На основании описанного связывания IL-1F7b с цепью IL-18Rα (Pan, 2001, Kumar, 2002), были
спланированы эксперименты для того, чтобы установить, стимулирует ли IL-1F7b, подобно IL-18, после
связывания с рецептором IL-18α, выработку IFN-γ в клетках. Молекула полной длины (предшественник
IL-1F7b) или зрелая молекула (зрелый IL-1F7b), использующие Е21 в качестве N-конца в предсказанном
сайте расщепления ICE (см. фиг. 1), использовалась в следующих экспериментах. Человеческие клетки
NKO (Kim, 2000), культуры цельной человеческой крови, мононуклеарные клетки человеческой крови
(РВМС) (совместно стимулированные IL-12 от Preprotech в дозе 1 нг/мл) (получение РВМС см. в примере 8) или клетки KG-1 (совместно стимулированные TNF-α в дозе 10 нг/мл) (линию получали из АТСС
Rockville, MD) стимулировали 100 нг/мл рекомбинантного IL-1F7b (предшественником или зрелой формой из примера 5) или IL-18. IFN-γ определяли (с помощью электрохемилюминесценции в жидкой фазе
(ECL) в Puren, 1998) в кондиционированной среде клеток через 18 часов после стимуляции (48 часов для
KG-1). В то время как IL-18 выражено стимулировал выработку IFN-y (фиг. 2А), ни предшественник, ни
зрелая форма IL-1F7b не стимулировали никакой выработки IFN-γ в указанных клетках.
Таким образом, в отличие от IL-18, связывание IL-1F7b с цепью IL-18Rα не запускает выработку
IFN-γ, т.е., связывание IL-1F7b с цепью IL-18Rα не привлекает цепь IL-18Rβ и, таким образом, не образуется функционально активный трехкомпонентный комплекс.
Были выполнены эксперименты для того, чтобы установить, действует ли IL-1F7b как антагонист
IL-18, предотвращающий связывание IL-18 с цепью IL-18Rα и, следовательно, ингибирующий его биологическую активность и выработку IFN-γ. Линию человеческих клеток NK стимулировали IL-18 (20
нг/мл) в присутствии IL-12 (1 нг/мл), с возрастающими концентрациями предшественника и зрелого IL1F7b, и мониторировали выработанный IFN-γ. Полученные результаты не показали ингибирования предшественником или зрелым IL-1F7b индуцированного IL-18 IFN-γ, даже когда IL-1F7b использовали в
концентрации, до 40 раз превышающей концентрацию IL-18 (фиг. 2В) или когда IL-1F7b предварительно
инкубировали в течение длительного периода времени с испытуемыми клетками до добавления IL-18.
Сходные результаты были получены для человеческих РВМС (данные не представлены).
Данные результаты показывают, что IL-1F7b ни стимулирует, ни ингибирует выработку IFN-γ, индуцированную IL-18.
Пример 2. Изучение связывания IL-1F7b с рецептором IL-18.
Имеется сообщение о том, что IL-18 связывается с IL-18Rα через третий внеклеточный домен (IL18Rα: D3) (Azam, 2002). Для того, чтобы изучить связывание IL-1F7b с IL-18Rα, третий внеклеточный
домен CD3 IL-18Rα индивидуально экспрессировали в E.coli в виде меченного his6 белка и выделяли с
использованием аффинной хроматографии Talon. Затем IL-1F7b инкубировали с указанным очищенным
IL-18Rα: D3 и осуществляли поперечное сшивание химическим путем (пример 7). Как показано на фиг.
3А, SDS-PAGE и анализ вестерн-блот выявили комплекс 43 кДа, соответствующий поперечно сшитым
IL-1F7b и IL-18Rα: D3. Поперечное сшивание с IL-18Rα наблюдалось как с предшественником, так и со
зрелым IL-1F7b. Указанные результаты предполагают, что IL-18Rα: D3 является принципиально важным
для связывания с IL-1F7b, тот же самый домен, который, как было показано ранее, является важным для
связывания с IL-18.
После связывания IL-18 с IL-18Rα привлекается IL-18Rβ и образуется активный трехкомпонентный
комплекс: IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ. Таким образом, следующий эксперимент был разработан для того,
чтобы проверить, запускает ли связывание IL-18Rα с IL-1F7b, подобно IL-18, образование трехкомпонентного комплекса IL-1F7b/IL-18Rα/IL-18Rβ. Внеклеточные домены IL-18Rα и IL-18Rβ вырабатывались в клетках Cos для того, чтобы гарантировать правильную посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование (Azam, 2002). После инкубации и химического поперечного сшивания IL-18,
IL-18Rα и IL-18Rβ высокомолекулярный комплекс, состоящий из IL-18Rα, IL-18Rβ и IL-18, наблюдался
при использовании анализа SDS-PAGE поперечно сшитых белков (фиг. 3В). Однако, в отличие от IL-18,
когда предшественник или зрелый IL-1F7b инкубировали с IL-18Rα и IL-18Rβ, указанный трехкомпонентный комплекс не наблюдался (фиг. 3В).
Таким образом, данные результаты показывают, что активный трехкомпонентный комплекс не образуется после связывания IL-1F7b с IL-18Rα, т.е. IL-18Rβ не привлекается.
Пример 3. Связывание IL-1F7b с IL-18BP.
Сравнивали аминокислотную последовательность IL-18 и IL-1F7b. Как показано на фиг. 1, IL-1F7b
имеет две общие аминокислоты с IL-18, которые в последнем являются консервативными, Е42 и K89.
- 17 -
008667
Как было показано, Е42 и К89 играют ключевую роль для активности IL-18 и для связывания с IL-18BP
(Novick, 1999). Таким образом, на основании сходности последовательностей IL-1F7b и IL-18 изучали
возможность связывания IL-1F7b с IL-18BP.
IL-1F7b (предшественник или зрелую форму, 1,5 мкг) или IL-18 (1,5 мкг) инкубировали в присутствии или в отсутствии IL-18ВР и воздействовали поперечно сшивающим реагентом BS3 (пример 7). Изготавливали две контрольные группы, содержавшие только белок IL-18BP; одну контрольную группу инкубировали в присутствии, а другую - в отсутствии поперечно сшивающего реагента BS3. Белки растворяли на 10% SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и проводили блоттинг на нитроцеллюлозе. Белки выявляли в блотах с помощью поликлональных антител, специфичных в отношении IL-1F7b или IL18. Результаты, суммированные на фиг. 4А, показывают новые полосы, которые выявляются только в
группах, содержащих, помимо IL-18BP, предшественник IL-1F7b, зрелый IL-1F7b или IL-18, но не в контрольных группах. В блотах идентифицировали новую полосу приблизительно 66 кДа, которая содержит
предшественник IL-1F7b, связанный с IL-18BP, и новую полосу приблизительно 64 кДа, которая содержит зрелый IL-1F7b, связанный с IL-18BP (фиг. 4А).
Помимо этого, осуществляли исследования иммунопреципитации с IL-1F7b (10 мкг) или IL-18 (10
мкг), инкубированными в присутствии или отсутствии IL-18BP (10 мкг) и поперечно сшитыми. Белки,
связанные и поперечно сшитые с IL-18BP, подвергали совместной иммунопреципитации с использованием моноклональных антител, специфичных в отношении IL-18BP. Иммунные комплексы растворяли
на SDS-PAGE и проводили блоттинг на нитроцеллюлозе. Блоты проявляли антителами, специфичными в
отношении IL-1F7b или IL-18.
Наблюдали те же полосы 64 и 66 кДа в исследованиях совместной преципитации с IL-18BP (фиг.
4В) . Данные поперечно сшитые полосы 64 и 66 кДа отражают комплексы зрелый IL-1F7b/IL-18ВР и
предшественник IL-1F7b/IL-18BP, соответственно. Данные результаты подтверждают, что IL-1F7b связывается с IL-18BP.
Пример 4. Влияние IL-1F7b на ингибирование активности IL-18, опосредованной IL-18BP.
В свете открытия того факта, что IL-1F7b связывается с IL-18ВР (см. предыдущий пример), возможно, через тот же домен, с которым связывается IL-18, изучали влияние IL-1F7b на ингибирование
активности IL-18, опосредованной IL-18BP. Рабочая гипотеза заключалась в том, что IL-1F7b может конкурировать с IL-18 за связывание с IL-18BP, и, следовательно, IL-18 будет в меньшей степени нейтрализован IL-18BP в присутствии IL-1F7b.
Зрелый IL-1F7b 250 нг/мл или предшественник IL-1F7b 250 нг/мл инкубировали с IL-18 (25 нг/мл) и
возрастающими концентрациями IL-18BP (1,56 - 50 нг/мл) на 96-луночных микротитрационных планшетах в течение 1 ч и добавляли вместе с IL-12 (1 нг/мл) к клеткам NKO (0,5 х 10б/мл). После 16 ч инкубации надосадочную жидкость собирали и мониторировали IFN-γ (с помощью электрохемилюминесценции
в жидкой фазе (ECL) в ref Puren 1998).
Результаты показывают, что, в противоположность гипотезе, при низкой концентрации IL-18BP
присутствие IL-1F7b повышает способность IL-18BP ингибировать IFN-γ, индуцированный IL-18 (фиг.
5А и В). При 6,25 нг/мл IL-18BP и в присутствии зрелого IL-1F7b активность IL-18 уменьшается с 76 до
55% (21% дополнительное снижение активности). При 3,12 нг/мл IL-18BP и в присутствии зрелого IL1F7b активность IL-18 уменьшается с 59 до 40% (19% дополнительное снижение активности). Предшественник IL-1F7b в данном исследовании был менее активным, чем зрелый IL-1F7b (фиг. 5В). Данный эффект IL-1F7b имел высокую воспроизводимость и наблюдался только при низкой концентрации IL-18BP.
Сходные результаты были получены при использовании РВМС (данные не представлены).
Пример 5. Локализация IL-1F7b.
IgG, специфичные в отношении IL-1F7b, были получены из поликлональной кроличьей анти-IL1F7b сыворотки и использованы для изучения экспрессии IL-1F7b в человеческих РВМС. Специфичность кроличьей анти-IL-1F7b сыворотки и препарата IgG изучали двумя различными способами, с использованием трансфекции RA W264.7 клеток макрофагов кДНК IL-1F7b. Сначала IL-1F7b антисыворотка специфично распознавала IL-1F7b в лизате IL-1F7b трансфектированных клеток RA W264.7 (фиг.
6). Затем, с помощью конфокальной цифровой микроскопии очищенные по сродству aнти-IL-1F7b IgG
распознавали экспрессию IL-1F7b в трансфектированных RA W264.7, но не в имитирующих контрольных клетках (не показано). Свежевыделенные человеческие РВМС (пример 8) окрашивали против IL1F7b с помощью очищенных по сродству поликлональных кроличьих IgG против человеческого IL-1F7b
в концентрации 1 мкг/мл. С помощью конфокального лазерного микроскопа получали суммарную картину моноцитов человеческой крови, экспрессирующих IL-1F7b. Наблюдалась экспрессия IL-1F7b как в
цитоплазме, локализованной на внутренней поверхности плазматической мембраны, так и в ядре (не показано). Окрашивания в популяции лимфоцитов не наблюдалось.
Пример 6. Экспрессия и выделение белк.
Следующие олигонуклеотидные праймеры использовали для клонирования кДНК IL-1F7b из библиотеки селезенки человека (Clontech®HL0011B, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA): смысловой
праймер 5'GTTGAGTAATAAACTCAACG (SEQ ID NO: 1), обратный праймер 5'GTTCAATGGGGCA
- 18 -
008667
GTTTC (SEQ ID NO: 2) (специфичный для клона AF2004 96 (GenBank®) (Kumar, 2000). КДНК IL-1F7b
реамплифицировали с использованием второй пары праймеров, с вводом сайтов расщепления для EcoRI
на конце 5' и XbaI на конце 3' (смысловой праймер 5'-ATATGAATTCATGTCCTlTGTGGGGGAG (SEQ
ID NO: 3); обратный праймер 5'-TATATCTAGAAGTTTCCTAATCGCTGACC (SEQ ID NO: 4). Используя
ТА-клонирование, кДНК IL-1F7b переносили в pGEM-T Easy® (Promega Corp. Medison, WI), согласно
инструкциям производителя, и верифицировали корректную последовательность. КДНК IL-1F7b затем
лигировали в pPROEXTMHTa (Gibco-BRL) для бактериальной экспрессии, с использованием сайта
EcoRI и XbaI. Вектор pPROEXTMHTa содержит N-концевую метку Hisx6 для аффинной очистки экспрессированного белка. Плазмиду pPROEXTMHTa/IL-IH4 трансформировали в компетентный штамм
E.coli DH5a (Gibco-BRL). Инкубированную в течение ночи культуру (10 мл) добавляли к 200 мл среды
LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивали до достижения плотности 0,6-1 ОП600.
Экспрессию белка индуцировали добавлением изопропилтиогалактозида (0,3 мМ) и инкубацией
при 37°С при встряхивании в течение 3 ч. Бактерии собирали центрифугированием (5000 х g в течение
15 мин при 4°С) и центрифужный осадок суспендировали в 25 мл буфера Talon (50 мМ NaH2PO4, 10 мМ
Tris-HCl 100 мМ NaCl, pH 8). Клетки лизировали ультразвуком (4 х 10-секундных серии) на льду, с последующим центрифугированием (4000 х g в течение 30 мин при 4°С. IL-1F7b получали из телец включения путем обработки мочевиной 8М. Надосадочную жидкость после обработки мочевиной осветляли
центрифугированием, диализировали против буфера Talon и помещали на 2 мл колонку мини-Talon. Колонку промывали 30-кратными объемами буфера Talon, а затем элюировали 5 мл 100 мМ имидазола в
буфере Talon. Элюент, содержавший очищенный по сродству IL-1F7b, отделяли с использованием препаративной SDS-PAGE. Гель окрашивали с использованием Coomassie Blue® (Bio-Rad Laboratories Inc.,
Hercules, CA) и вырезали полосу, содержавшую IL-IH4. Гель, содержавший IL-1F7b, использовали для
получения поликлональных сывороток от кроликов, согласно стандартным протоколам (Rockland Inc.
Gilbertsville, АР). Полная длина (предшественник) и зрелый IL-1F7b (N-конец Е21), использованные в
биологических анализах и для исследований по поперечному сшиванию, вырабатывались в E.coli, как
описано ранее (Kumar, 2002).
Пример 7. Поперечное сшивание белков.
Очищенные белки смешивали в 30 мкл PBS и инкубировали в течение 2 ч на льду. Затем BS3
(Бис(сульфосукцининидил)суберат) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL) добавляли до конечной концентрации 1 мМ и смесь инкубировали в течение 1 ч при КТ. Реакцию гасили добавлением Tris-CI, pH
7,4 (конечная концентрация 20 мМ). После кипячения в течение 5 мин белки разделяли с использованием
10% SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и проводили блоттинг на нитроцеллюлозе. Поперечно
сшитые белки выявляли с помощью кроличьей антисыворотки против человеческого IL-18BP, IL-1F7b
или IL-18 в разведении 1:500.
Пример 8. Выделение РВМС.
РВМС выделяли из остаточных лейкоцитов, лишенных тромбоцитов, или из гепаринизированной
крови здоровых доноров. Лейкоциты, лишенные тромбоцитов, или цельную кровь разбавляли 1:1 физиологическим раствором и помещали на градиенты Ficoll-Histopaque® (Sigma), как описано ранее (Kim,
2001). После центрифугирования клетки на разделе слоев собирали, промывали три раза в физиологическом растворе и ресуспендировали в RPMI. Изолированные РВМС держали на льду до начала исследования.
Список литературы
Ссылки, приведенные ниже и включенные в заявку, включены в настоящий документ в качестве
ссылок.
1. Anderson, D.M., Maraskovsky, E., Billingsley, W.L., Dougall, W.C., Tometsko, M.E., Roux, E.R.,
Teepe, M.C., DuBose, R..F, Cosman, D. , Galibert, L. (1997) "A. homologue of the TNF receptor and its ligand
enhance T-cell growth and dendritic-cell function." Nature, 390, 175-179.
2. Azam, Т., Novick, D., Bufler, P., Reznikov, L. L., Yoon, D. Y., Rubinstein, M. DinarellO, С A. & Kim,
S. H. (2002) J Immunol submitted.
3. Barton, J. L., Herbst, R., Bosisio, D., Higgins, L. & Nicklin, M. J. (2000) Eur J Immunol 30, 3299-308.
4. Busfield, S. J., Comrack, С A., Yu, G., Chickering, T. W., Smutko, J. S., Zhou, H., Leiby, K. R., Holmgren, L. M., Gearing, D. P. & Pan, Y. (2000) Genomics 66, 213-6.
5. Bazan, J. F., Timans, J. С and Kaselein, R. A. (1996) "A newly defined interleukin-1?" Nature 379, 591.
6. Born, T.L., Morrison, L.A., Esteban, D.J., VandenBos, Т., Thebeau, L.G., Chen, N., Spriggs, M..K.,
Sims, J.E., Buller, R.M. (2000) "A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18, and inhibits NK cell response." J Immunol 164, 3246-54.
7. Corbaz et al.: J Immunol 2002 Apr 1; 168(7):3608-16).
8. Coughlin, C.M., Salhany, K.E., Wysocka, M., Aruga, E., Kurzawa, H., Chang, A.E., Hunter, C.A., Fox,
J.C., Trinchieri, G. and Lee, W.M. (1998) "Interleukin-12 and interleukin-18 synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis." J Clin Invest Mar, 101, 1441-52.
9. Debets, R., Timans, J. C, Homey, В., Zurawski, S., Sana, T. R., La, S., Wagner, J., Edwards, G., Clifford, Т., Menon, S., Bazan, J. F. & Kastelein, R. A. (2001) J Immunol 167, 1440-6.
- 19 -
008667
10. Desreumaux, P., Brandt, E., Gambiez, L., Emilie, D., Geboes, K., Klein, O., Ectors, N., Cortot, A.,
Capron, M., Colombel, J.F. (1997) Gastroenterology 113, 118-26.
11. Dinarello, С. А. (1996) BloodS7, 2095-147.
12. Dinarello "Interleukin-18, a proinflammatory cytokine." Eur Cytokine Nerw 2000 Sep; lL(3):483-6.
13. Engelmann, H., Aderka, D., Rubinstein, M., Rotman, D. and Wallach. D. (1989)" A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity"
J. Biol. Chem. 264, 11974-11980.
14. Engelmann, H., Novick, D. and Wallach, D. (1990) "Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors." J. Biol. Chem. 265, 1531-1536.
15. Ghayur, Т., Banerjee, S., Hugunin, M., Butler, D., Herzog, L., Carter, A., Quintal, L., Sekut, L., Talanian, R., Paskind, M., Wong, W., Kamen, R., Tracey, D., and Allen, H. (1997) "Caspase-1 processes IFNgamma-inducing factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production." Nature 386, 619-623.
16. Gong, J. H., Maki, G., Klingemarm, H. G. (1994) "Characterization of a human cell line (NK-92) with
phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells." Leukemia 8:652.
17. Gu, Y., Kuida, K., Tsutsui, H., Ku, G., Hsiao, K., Fleming, M. A., Hayashi, N.fHigashino, K., Okamura, H., Nakanishi, K.; Kurimoto, M., Tanimoto, Т., Flavell, R. A., Sato, V., Harding, M. W., Livingston, D. J.,
and Su, M. S. (1997) "Activation of interferon-gamma inducing factor mediated by interleukin-1beta converting
enzyme." Science 275, 206-209.
18. Kaser A., Novick D., Rubinstein M., Siegmund B., Enrich B., Koch R.O., Vogel W., Kim S.H., Dinarwello C.A., and Tilg H. Clin Exp Immunol 2002 Aug; 129 (2) :332-8.
19. Kim, S.H., Eisenstein, M., Reznikov, L., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M. and Dinarello,
C.A.(2000)" Structural requirements of six naturally occurring isoforrhs of the IL-18 binding protein to inhibit
IL-18". Proc Natl Acad Sci USA 97, 1190-5.
20. Kohno, K.,J. Kataoka, T.Ohtsuki, Y.Suemoto, I. Okamoto, M. Usui, M. Ikeda, and M. Kurimoto.
(1997) "IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th2 cells
and exerts its effect independently of IL-12". J. Immunol. 158:1541-1550.
21. Kumar, S., McDonnell, P. C, Lehr, R., Tiemey, L., Tzimas, M. N., Griswold, D. E. Capper, E. A., TalSinger, R., Wells, G. L, Doyle, M. L. & Young, P. R. (2000) J. Biol. Chern. 275,10308-14.
22. Lin, H., Ho, A. S., Haley-Vicente, D., Zhang, J., Bernal-Fussell, J., Pace, A. M., Hansen, D., Schweighofer, K., Mize, N. K. & Ford, J. E. (2001) J Bioi Chem 276, 20597-602.
23. Mallat, Silvestre J., Le Ricoussanne S., Lecomte-Raclet L., Corbaz A., Clergue M., Duriez M.,
Barateau V., Akira S., Tedgui A., Tobelem G., Chvatchko Y. and Levy B. I. (2002) Ore Res. 91 (5), 441-8.
24. Matsumoto, S., Tsuji-Takayamu, K., Aizawa, Y., Koide, K., Takeuchi, M., Ohta, Т., Kurimoto, M.
(1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 454-7.
25. Monteleone, G., Trapasso, F., Parrello, Т., Biancone, L., Stella, A., Juliano, R., Luzza, F., Fusco,.A.,
Pallone, F. (1999) J. Immunol. 163, 143-7.
26. Mulero, J. J., Pace, A. M., Nelken, S. Т., Loeb, D. В., Correa, T. R., Drrnanac, R. & Ford, J, E. (1999)
Biochem Biophys Res Commun 263, 702-6.
27. Nakanishi, K., Yoshimoto, Т., Tsutsui, H. & Okamura, H. (2001) Annu Rev Immuno 119, 423-74.
28. Nakamura, K., Okamura, H., Wada, M., Nagata, K. and Tamura, T. (1989). "Endotoxin-induced serum
factor that stimulates gamma interferon production." Infect-Immun 57, 590-5 issn: 0019-9567.
29. Nakamura, K., Okamura, H., Nagata, K., Komatsu, T. and Tamura, T. (1993) "Purification of a factor
which provides a costimulatory signal for gamma interferon production." Infect. Immun. 61, 64-70.
30. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D. and Rubinstein. M. (1989) "Soluble cytokine receptors are
present in normal human urine." J. Exp. Med. 170, 1409-14.
31. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M. (1992) "Soluble Interferon-alpha Receptor Molecules Are
Present in Body Fluids." FEBS Lett 314, 445-8.
32. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M. (1994) "The Human Interferon alpha/beta ReceptorCharacterization and Molecular Cloning." Cell 77,391- 400.
33. Novick, D., Kim,S., Fantuzzi, G., Reznikov, L.L., Dinarello, C.A. and Rubinstein, M. (1999) "Interleukin-18 Binding Protein: A Novel Modulator of the Th1 Cytokine Response. Immunity 10, 127,36.
34. Novick, D., Schwartsburd, В., Pinkus, R., Suisse, D., Belzer, I., Sthoeger, Z., Keane, W. F., Chvatchko,
Y., Kim, S. H., Fantuzzi, G., Dinarello, С A. & Rubinstein, M. (2001) Cytokine 14, 334-42.
35. Ohta Y., Hamada Y., Katsuoka K. Arch Dermatol Res 2001 Jul; 293(7):334-42.
36. Okamura, H., Tsutsui, H., Komatsu, Т., Yutsudo, M., Hakura, A., Tanimoto, Т., Torigoe, K., Okura, Т.,
Nukada, Y., Hattori, K., Akita, K., Namba, M. , Tanabe, F., Konishi, K. , Fukuda, S., and Kurimoto, M. (1995)
"Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells." Nature 378, 88-91.
37. Pan, G., Risser, P., Mao, W., Baldwin, D. Т., Zhong, A. W., Filvaroff, E., Yansura, D., Lewis, L., Eigenbrot, C., Henzel, W. J. & Vandlen, R. (200 I) Cytokine 13, 1-7.
38. Pizarro, T.T., Michie, M.H., Bentz, M. , Woraratanadharm, J., Smith, M.F., Foley, E., Moskaluk, C.A.,
Bickston, S.J., Cominelli, F. (1999) J. Immunol. 162, 6829-35.
- 20 -
008667
39. Puren, A. J., Fantuzzi, G., Gu, Y., Su, M. S. & Dinarello, С. А. (1998) J Clin Invest 101, 711-21.
40. Puren, A. J., Razeghi, P., Fantuzzi, G. & Dinarello, С. А. (1998) J. Infect Dis 178,1830-4.
41. Puren, A.J., Fantuzzi, G., Dinarello, C.A. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96,2256-61.
42. Raeburn, C.D., Dinarello, C.A., Zimmerman, M.A., Calkins, C.M., Pomerantz, B.J., McIntyre, R.C. Jr,
Harken, A.H. and Meng, X. (2002) AM J PHYSIOL HEART CIRC PHYSIOL 283(2), H650-7.
43. Reimund, J.M., Wittersheim, C., Dumont, S., Muller, C.D., Kermey, J.S., Baumann, R., Poindron, P.,
Duclos, B. (1996) Gut 39, 684-9.
44. Seki S, Habu Y., Kawamura Т., Takeda K., Dobashi H., Ohkawa Т., Hiraide H. (2000) "The liver as a
crucial organ in the first line of host defense: the roles of Kupffer cells, natural killer (NK) cells and NK1.1 Ag+
T cells in T helper 1 immune responses." Immunol Rev 174,35-46.
45. Simonet W.S., Lacey D.L., Dunstan C.R., Kelley, M., Chang M.S., Luthy R., Nguyen H.Q., Woode S.,
Bennett L., Boone Т., Shimamoto G., DeRose M., Elliott R., Colombero A., Tan, H.L., Trail G., Sullivan J.,
Davy E., Bucay N., Renshaw-Gegg, L., Hughes T.M., Hill D., Pattison W., Campbell P., Boyle WJ. (1997)."
Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density". Cell, 89, 309-19.
46. Smith, D.E., Renshaw, B.R., Ketchem, R.R., Kubin, M., Garka, K.E. & Sims, J. E. (2000) J. Biol Chem
275, 1169-75.
47. Tasaki et al. (2000) Cancer Gene Ther (2):247-54. Tsutsui, H., K. Nakanishi, K. Matsui, K. Higashino,
H. Okamura, Y. Miyazawa, and K. Kaneda. (1996) "IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligandmediated cytotoxic activity of murine natural killer cell clones". J. Immunol. 157,3967-73 issn: 0022-1767.
48. Urushihara, N., Iwagaki, H., Yagi, Т., Kohka, H., Kobashi, K., Morimoto, Y., Yoshino, Т., Tanimoto,
Т., Kurimoto, M., Tanaka, N. (2000) "Elevation of serum interleukin-18 levels and activation of Kupffer cells in
biliary atresia." J Pediatr Surg 35,446-9.
49. Ushio, S., Namba, M., Okura, Т., Hattori, K., Nukada, Y., Akita, K., Tanabe, F., Konishi, K., Micallef,
M., Fujii, M., Torigoe, K., Tanimoto, Т., Fukuda, S., Ikeda, M., Okamura, H., and Kurimoto, M. (1996) J. Immunol. 156, 4274-9
50. Vigers, G.P., Anderson, L.J., Gaffes, P., Brandhuber, B.J. (1997) "Crystal structure of the type-I interleukin-1 receptor complexed with interleukin-1 beta." Nature 386,190-4.
51. Xiang, Y. and Moss, B.(1999)" IL-18 binding and inhibition of interferon gamma induction by human
poxvirus-encoded proteins." Proc Natl Acad Sci USA 96,11537-42.
52. Yasuda, H., Shima, N., Nakagawa, N., Mochizuki,, S.I., Yano, K., Fujise, N., Sato, Y., Goto, M., Yamaguchi, K., Kuriyama, M., Kanno, Т., Murakami, A., Tsuda, E., Morinaga, Т., Higashio, K. (1998) "Identity of
osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro." Endocrinology, 139, 1329-37.
53. Yatsiv I., Morganti-Kossmann M.C., Perez D., Dinarello C.A., Novick D., Rubinstein M., Otto V.I.,
Rancan M., Kossmann T., Redaelli C.A., Trentz O., Shohami E., and Stahel P.F. J. Cereb Blood Metab 2002
Aug; 22 (8):971-8.
54. Yu S., Chen 2, Mix E., Zhu S.W., Winbald B., Ljunggren H.G., Zhu J. J. Neuropathol Exp Neurol
2002; 61 (7):614-22.
55. Zecchina et al., J. Hematother Stem Cell Res 2001.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение цитокина-1 или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с IL-18BP или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства IL-1, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора
цитокина-2.
2. Применение по п.1, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству IL-1.
3. Применение по п.2, в котором цитокин-1 представляет собой IL-1F7b.
4. Применение по любому из пп.1-3, в котором рецептор цитокина-2 представляет собой IL-18R.
5. Применение по любому из пп.1-4, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание
цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
6. Применение по любому из пп.1-5 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний,
выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного
токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких, псориаза,
воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения,
дисфункции сердца и неврита.
7. Применение по любому из пп.1-5 для профилактики образования метастазов.
8. Применение по любому из пп.1-7, в котором лекарственное средство дополнительно содержит
IL-18BP или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.
9. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором цитокин-1 вводят системно, подкож- 21 -
008667
но и/или внутримышечно.
10. Применение вектора, содержащего кодирующую последовательность цитокина-1 или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться
с IL-18BP или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства IL-1, для производства лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания, которое вызывается или
утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
11. Применение по п.10, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству IL-1.
12. Применение по п.11, в котором цитокин-1 представляет собой IL-1F7b.
13. Применение по любому из пп.10-12, в котором рецептор цитокина-2 представляет собой IL-18R.
14. Применение по любому из пп.10-13, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
15. Применение по любому из пп.10-14 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких,
псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита.
16. Применение по любому из пп.10-14 для профилактики образования метастазов.
17. Применение по любому из пп.10-16, в котором лекарственное средство дополнительно содержит IL-18BP или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.
18. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором вектор, кодирующий цитокин-1,
вводят системно, подкожно и/или внутримышечно.
19. Применение вектора для эндогенной генной активации цитокина-1, способного связываться с
IL-18BP или его мутеином, слитым белком, функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства IL-1, для лечения
или профилактики заболевания, которое вызывается или утяжеляется индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
20. Применение по п.19, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству IL-1.
21. Применение по п.20, в котором цитокин-1 представляет собой IL-1F7b.
22. Применение по любому из пп.19-21, в котором рецептор цитокина-2 представляет собой IL-18R.
23. Применение по любому из пп.19-22, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
24. Применение по любому из пп.19-23 для лечения или профилактики воспалительных заболеваний, выбранных из летальности, связанной с эндотоксином (сепсиса), повреждения печени, индуцированного токсинами или активированными Т-клетками, или гепатита С, артрита, повреждения легких,
псориаза, воспалительного заболевания кишечника, повреждения головного мозга, ишемического повреждения, дисфункции сердца и неврита.
25. Применение по любому из пп.19-24 для профилактики образования метастазов.
26. Применение по любому из пп.19-25, в котором лекарственное средство дополнительно содержит IL-18BP или его мутеин, слитый белок, функциональное производное или фрагмент.
27. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором вектор, кодирующий цитокин-1,
вводят системно, подкожно и/или внутримышечно.
28. Применение ингибитора цитокина-1 или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или фрагмента, способного связываться с IL-18BP или его мутеином, слитым белком,
функциональным производным или фрагментом и способного ингибировать рецептор цитокина-2, причем цитокин-2 является членом семейства IL-1, для лечения или профилактики заболевания, которое
предотвращается или облегчается индуцированием указанного рецептора цитокина-2.
29. Применение ингибитора цитокина-1 по п.28, в котором цитокин-1 принадлежит к семейству IL-1.
30. Применение ингибитора цитокина-1 по п.29, в котором цитокин-1 представляет собой IL-1F7b.
31. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-30, в котором рецептор цитокина-2
представляет собой IL-18R.
32. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-31, в котором в ингибировании цитокином-1 участвует связывание цитокина-1 с сигнальной цепью рецептора цитокина-2.
33. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-32 для лечения или профилактики вирусного заболевания.
34. Применение ингибитора цитокина-1 по любому из пп.28-32 для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
- 22 -
008667
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
- 23 -
008667
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 24 -