005769 Область, к которой относится изобретение

005769
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к мутантам IL-18, имеющим повышенную биологическую активность по сравнению с белком дикого типа.
Предпосылки создания изобретения
В 1989 г. была описана стимулированная эндотоксином сывороточная активность, которая индуцировала интерферон-γ (IFN-γ), полученный из клеток мышиной селезенки (Nakamura et al., 1989). Эта сывороточная активность действовала не как прямой индуктор IFN-γ, а как ко-стимулятор совместно с IL-2,
IFN-α/β, TNF или с митогенами. В попытке выделить активность из мышиной сыворотки, после ее стимуляции эндотоксином, был обнаружен явно гомогенный белок размером 50-55 кДа (Nakamura et al.,
1993). Поскольку другие цитокины могут действовать как ко-стимуляторы для продуцирования IFN-γ, то
было сделано предположение, что отсутствие нейтрализующих антител против IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 или
TNF, направленных на нейтрализацию сывороточной активности, может служить отличительным фактором. В 1995 г. те же самые ученые продемонстрировали, что индуцированный эндотоксином костимулятор продуцирования IFN-γ присутствует в экстрактах печени, полученных от мышей, подвергнутых предтрансплантационной обработке P.acnes (Okamura et al., 1995). В указанной модели популяция
макрофагов в печени (клетки Купфера) увеличивалась, и у этих мышей низкая доза бактериального липополисахарида (ЛПС), которая была нелетальной у мышей, не подвергнутых предтрансплантационной
обработке, становилась летальной. Фактор, названный IFN-γ-индуцирующим фактором (IGIF), а позже
названный интерлейкином-18 (IL-18), был очищен до гомогенности из 1200 г мышиной печени, обработанной P.acnes. Для клонирования мышиной кДНК IL-18 были использованы вырожденные олигонуклеотиды, полученные, исходя из аминокислотных последовательностей очищенного IL-18 (Okamura et al.,
1995). Матричные РНК для IL-18 и интерлейкина-12 (IL-12) легко детектировались в активированных
макрофагах. Сам IL-18 не индуцирует IFN-γ, а действует, главным образом, как ко-стимулятор вместе с
митогенами или IL-12. Человеческая кДНК-последовательность для IL-18 была описана в 1996 (фиг. 1А,
SEQ ID NO:1).
Интерлейкин IL-18 и белки семейства IL-1 имеют общие структурные элементы (Nakamura et al.,
1993; Okamura et al., 1995; Ushio et al., 1996; Bazan et al., 1996). В отличие от большинства других цитокинов, которые имеют структуру, состоящую из четырех спиральных участков, соединенных тяжами, IL18 и IL-1β имеют β-складчатую структуру (Tsutsui et al., 1996). Аналогично IL-lβ, IL-18 синтезируется
как биологически неактивный предшественник (пpo-IL-18), у которого отсутствует сигнальный пептид
(Ushio et al., 1996). Предшественники IL-1β и IL-18 расщепляются каспазой 1 (IL-1β-конвертирующим
ферментом или ICE), который расщепляет эти предшественники за остатком аспарагиновой кислоты в
положении Р1. Образующиеся в результате зрелые цитокины легко высвобождаются из клетки (Ghayur et
al., 1997 & Gu et al., 1997).
IL-18 является ко-стимулятором для продуцирования цитокинов (IFN-γ, IL-2 и гранулоцитарногомакрофагального колониестимулирующего фактора) Т-клетками-хелперами типа I (Thl) (Kohnoet et al.,
1997), а также ко-стимулятором опосредованной лигандом FAS цитотоксичности клеточных клонов мышиных клеток-киллеров (Tsutsui et al., 1996).
Thl-лимфоциты участвуют в иммунных ответах против опухолей (Seki et al., 2000). Thl-ответы
включают секрецию цитокинов IL-2, IL-12, IL-18 и IFN-γ, а также генерирование специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, распознающих специфические опухолевые антигены. Thl-ответ также является жизненно важным фактором защиты хозяина от многих микроорганизмов. Однако, Thl-ответ может
быть также ассоциирован с нежелательными эффектами, такими как развитие некоторых аутоиммунных
заболеваний, воспаление и отторжение трансплантированного органа.
Попытки экспрессировать зрелую форму IL-18 в E.coli с использованием вектора, кодирующего
зрелый белок, не привели к получению полностью активного цитокина. Эффективная экспрессионная
система для генерирования полностью биологически активного человеческого IL-18 была разработана
для терапевтических целей, например, для лечения злокачественных опухолей или любых состояний,
при которых желательно индуцирование IFN-γ (WO 00/61768). В этой системе сайт расщепления предшественника IL-18 каспазой-1 был заменен на сайт фактора Ха (ICE/Ха), и вектор, кодирующий предшественник ICE/Xa-IL-18, был использован для трансформации E.coli. После экспрессии этого предшественника IL-18 в E.coli зрелый IL-18 был генерирован путем отщепления фактора Ха in vitro. Этот зрелый
IL-18, генерированный путем расщепления фактором Ха, был полностью активным.
Белки, связывающиеся с цитокинами (растворимые цитокиновые рецепторы), обычно представляют
собой внеклеточные лиганд-связывающие домены их соответствующих цитокиновых рецепторов клеточной поверхности. Они продуцируются либо посредством альтернативного сплайсинга, либо посредством протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Эти растворимые рецепторы
были описаны ранее, например, растворимые рецепторы IL-6 и IFN-γ (Novick et al., 1989), TNF (Engelmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990), IL-1 и IL-4 (Maliszewski et al., 1990), IFN-α/β (Novick et al., 1994;
Novick et al., 1992). Один связывающийся с цитокином белок, названный остеопротегерином (OPG, также известный как фактор ингибирования остеокластов, OCIF), член семейства TNFR/Fas, является, оче-1-
005769
видно, первым примером растворимого рецептора, который существует только как секретированный
белок (Anderson et al., 1997; Simonet et al., 1997; Yasuda et al., 1998).
Белок, связывающийся с IL-18 (IL-18BP), был аффинно очищен из мочи на колонке с IL-18 (Novick
et al., 1999). IL-18BP предотвращает IL-18-стимулируемое индуцирование IFN-γ и IL-8, активацию NF-kB
in vitro и индуцирование IFN in vivo. IL-18BP представляет собой растворимый циркулирующий белок,
который конститутивно экспрессируется в селезенке и принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов. Наиболее часто встречающаяся изоформа IL-18BP, изоформа сплайсированного варианта, имеет
высокую аффинность по отношению к IL-18 с высокой скоростью ассоциации и низкой скоростью диссоциации, и константу диссоциации (Kd), равную приблизительно 400 пМ (Kim et al., 1999).
Остатки, участвующие во взаимодействии IL-18 с IL-18BP, были описаны с использованием компьютерного моделирования (Kim et al., 1999) и на основе взаимодействия IL-1 с IL-1R типа 1 (Vigers et
al., 1997). Было предположено, что в модели для IL-18, связывающегося с IL-18BP, остаток Glu в положении 42 и остаток Lys в положении 89 связываются с Lys-130 и Glu-114 в IL-18BP, соответственно (Kim
et al., 1999).
IL-18 постоянно присутствует во многих клетках (Puren et al., 1999) и в кровотоке здоровых людей
(Urushihara et al., 2000). Высокая степень аффинности IL-18BP по отношению к IL-18, а также высокая
концентрация IL-18BP, обнаруживаемая в кровотоке (в 20-кратном избытке по сравнению с IL-18), представляет собой уникальную ситуацию в биологии цитокинов. Поэтому большинство, если не все, молекулы IL-18, присутствующие в кровотоке, связываются с IL-18BP. Циркулирующий IL-18BP, который
конкурирует с клеточно-поверхностными рецепторами для IL-18, может действовать как природная противовоспалительная и иммуносупрессорная молекула.
Вирусные агенты, кодирующие IL-l8BP-подобные белки, например вирусные белки МС53 и МС54
M.contagiosum, обладают значительной гомологией с IL-18BP млекопитающих (Novick et al., 1999). Белки МС53 и МС54 M.contagiosum обладают способностью связываться с человеческим IL-18 и нейтрализовать его способность, аналогично механизму действия IL-18B (Xiang & Moss, 1999). Белок р13 поксвируса Ectromelia, который является гомологичным IL-18BP, связывается с человеческим IL-18 и ингибирует его активность in vitro. У мышей, инфицированных р13-делеционным вирусным мутантом, обнаруживались пониженные уровни инфекционности (Born et al., 2000). Поэтому, очевидно, что степень инфекционности коррелирует с присутствием IL-18BP.
Высокие уровни циркулирующего IL-18BP могут обеспечивать природную защиту против неконтролируемого Thl-ответа на инфекцию и развития аутоиммунных заболеваний. Однако, IL-18 стимулирует Thl-ответ, который является важным фактором защиты хозяина против опухолей. Поэтому IL-18BP
может вызвать у хозяина неспособность продуцировать цитотоксические Т-клетки, направленные против
опухолевых клеток. Действительно, очевидно, что у мышей IL-18 стимулирует защиту хозяина против
опухолей. Так, например, у сингенных мышей клетки мышиной карциномы молочной железы, экспрессирующие мышиный IL-12 или мышиный IL-18, были менее онкогенными и образовывали опухоли более медленно, чем контрольные неэкспрессирующие клетки (Coughlin et al., 1998). Исследования по нейтрализации антителами выявили, что для достижения противоопухолевого эффекта необходимо присутствие IFN-γ. В другом исследовании системное введение IL-18 экспериментальным животным с меланомой В16, экспрессирующей В7-1 (CD80), приводило к резкому ингибированию образования меланомы,
опухолевого роста и к значительному повышению уровня выживаемости (Cho et al., 2000).
Цитокины были использованы в качестве адъюванта для повышения эффективности иммунотерапии рака. Так, например, IL-2 вводили в почечно-клеточную карциному или меланому (Gollob et al.,
2000). В большинстве случаев, одними из важных последствий лечения цитокинами являются их тяжелые системные токсикологические профили. Использование цитокинов, экспрессируемых самими опухолевыми или дендритными клетками пациента, является логическим решением этой проблемы. Однако
даже при местном использовании IL-18 в качестве адъюванта в иммунотерапии опухолей еще сохраняется способность конститутивных уровней IL-18BP нейтрализовать IL-18 в локальном окружении, а следовательно, его эффективность значительно снижается.
Использование немиелоабляционных аллогенных трансплантатов, так называемых минитрансплантатов для лечения лейкозов и солидных опухолей является значительно более успешным для
усиления реакций "трансплантат против лейкоза" и "трансплантат против опухоли" (Slavin S., 2000;
Slavin et al., 2000). Два исследования, в которых были использованы аллогенные стволовые клетки периферической крови (Childs et al., 2000) или дендритные клетки (Kugler et al., 2000) для лечения пациентов
с метастазами почечно-клеточной карциномы, имели заметный успех. Хотя необходимо продолжить и
подтвердить эти исследования, однако идея об использовании реакции "трансплантат против опухоли"
для противораковой иммунотерапии находит все большее признание (Slavin, 2000). Поскольку, очевидно, что в успешной терапии определенную роль играет IL-18, то еще больший успех может быть достигнут путем предотвращения нейтрализующего действия IL-18BP.
Мутанты IL-18 (IFN-γ, индицирующий фактор) описаны в ЕР0845530. Описанные мутанты IL-18
представляют собой молекулы, в которых 1, 2, 3 или все 4 цистеиновых остатка в IL-18 (фиг. 1В) были
-2-
005769
заменены сериновыми или аланиновыми остатками. Эти мутанты содержали интактную консенсусную
последовательность (фиг. 1В). Все выделенные мутанты обладали более высокой стабильностью, чем IL18 дикого типа. Степень стабильности мутантов прямо пропорциональна числу замененных остатков Cys
в данной молекуле. В ЕР0845530 ничего не указывается о способности IL-18BP к нейтрализации этих
мутантов.
Поэтому, генерирование и терапевтическое использование полностью активных мутантов IL-18, не
связывающихся с IL-18BP или связывающихся с IL-18BP с низкой аффинностью, может дать очень хороший эффект.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к мутантному полипептиду IL-18, включающему мутации в одном или нескольких аминокислотных остатках, которые участвуют в его взаимодействии с белком, связывающимся с IL-18. Более конкретно, такими мутациями являются замены, предпочтительно, неконсервативные замены, добавления или делеции. Остатки, мутированные в указанном полипептиде, могут
быть выбраны из Glu-42, Ile-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132, Pro-143, Met-149 и Leu-189, а
предпочтительно, Glu-42 и Lys-89.
В одном из вариантов осуществления изобретения, Glu-42 или Lys-89, или оба Glu-42 и Lys-89 заменены неполярной аминокислотой, предпочтительно аланином.
Кроме того, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей указанный полипептид, а предпочтительно к ДНК, кодирующей полипептид, выбранный из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5,
SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ДНК, кодирующую полипептиды
SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, присоединяют к сигнальному пептиду, предпочтительно к
сигнальному пептиду чГР. Кроме того, настоящее изобретение также относится к вектору, включающему
указанную ДНК, способному экспрессировать полипептид, кодируемый указанной ДНК, в подходящей
клетке-хозяине, например, в прокариотической или в эукариотической клетке-хозяине.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанный полипептид и предназначенным для лечения заболеваний, которые могут предупреждаться или
ослабляться Thl-ответами, а предпочтительно для лечения вирусного заболевания или рака.
Краткое описание графического материала
На фиг. 1А показана нуклеотидная последовательность, кодирующая предшественник IL-18 дикого
типа, и локализация праймеров, используемых для конструирования различных мутантных белков IL-18.
Широкая стрелка указывает на начало последовательности, кодирующей зрелый белок IL-18.
На фиг. 1В показана аминокислотная последовательность зрелого IL-18. Консенсусная последовательность различных видов IL-18 заключена в белые рамки. Цистидины подчеркнуты. Темными рамками
очерчены остатки, мутированные в IL-18 настоящего изобретения.
На фиг. 2 схематически показаны мутанты IL-18 настоящего изобретения. His-6 указывает на присутствие шести гистидинов, присоединенных в N-конце профрагмента предшественника IL-18. Стрелка
указывает на сайт ICE-расщепления, замененный сайтом расщепления фактора Ха (х). WT означает зрелый IL-18 дикого типа. Е42А означает мутацию с заменой Glu 42 на Ala, K89A означает мутацию с заменой Lys 89 на Ala, a E42A/K89A означает двойную мутацию. Исходя из предшественника/x/WT были
генерированы три мутанта IL-18 (E42A, К89А и Е42А+К89А) посредством двухстадийной ПЦР.
На фиг. 3А показано индуцирование IFN-γ в клетках NKO с помощью IL-18 дикого типа и мутантного белка в концентрациях, представленных по оси х на фиг. 3В, и в присутствии IL-12 (0,5 нг/мл).
На фиг. 3В показано индуцирование IFN-γ в клетках МКПК с помощью IL-18 дикого типа и мутантного белка в концентрациях, представленных по оси х и в присутствии IL-12 (1,0 нг/мл).
На фиг. 4А показано влияние IL-18BP на индуцирование IFN-γ человеческим IL-18 дикого типа и
мутантным белком в клетках NKO. Мутанты и IL-18 дикого типа (30 нг/мл) были предварительно инкубированы с IL-18BP при концентрациях, показанных по оси х (на фиг. 3В), в течение 1 ч при комнатной
температуре и добавлены к клеткам NKO, стимулированным IL-12 (0, 5 мг/мл).
На фиг. 4В показано влияние IL-18BP на индуцирование IFN человеческим IL-18 дикого типа и мутантным белком в клетках МКПК. Мутанты и IL-18 дикого типа (30 нг/мл) были предварительно инкубированы с IL-18BP при концентрациях, показанных по оси х, в течение 1 ч при комнатной температуре
и добавлены к клеткам МКПК, стимулированным IL-12 (1,0 мг/мл).
На фиг. 5 показано индуцирование IL-8 под действием IL-18 дикого типа и мутантного белка.
МКПК инкубировали с IL-18 дикого типа или с мутантом (30 нг/мл). Полимиксин В (1 г/мл) смешивали с
IL-18 в течение 30 мин, а затем добавляли к МКПК. Через 24 ч супернатанты удаляли и анализировали
концентрацию IL-18 с помощью ЭХЛ (пример 9) . Проиллюстрирован один из трех экспериментов.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к мутанту IL-18 или к его активному фрагменту или мутеину,
или к любому другому белку или его пептидному производному (IL-18M), которое, по сравнению с белком дикого типа (IL-18 WT), является менее чувствительным к нейтрализации под действием IL-18BP.
-3-
005769
Более конкретно, для генерирования активного мутанта IL-18, который является менее чувствительным к
нейтрализации под действием IL-18BP, одна или несколько аминокислот, предпочтительно не более чем
30, а более предпочтительно до 10 аминокислот IL-18 дикого типа могут быть заменены другими аминокислотами или элиминированы, либо может быть добавлена одна или несколько аминокислот, предпочтительно не более чем 30, а более предпочтительно до 10 аминокислот. Аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами; причем предпочтительными заменами являются неконсервативные замены. Более конкретно, указанные мутации могут быть нацелены на остатки, которые, как предполагается, участвуют в связывании с IL-18BP, такие как Glu-42, Ile-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132,
Pro-143, Met-149 и Leu-189, а предпочтительно, Glu-42 и/или Lys-89 (Kim et al., 1999).
IL-18M может быть продуцирован в эукариотических или прокариотических экспрессионных системах, внутри клетки или в периплазматическом пространстве, либо он может быть секретирован в среду. Продуцированный IL-18M может быть выделен в растворимой или нерастворимой форме (в форме
телец включения).
Вектор, содержащий кДНК предшественника IL-18M, может быть использован для экспрессии
"правильно" собранного предшественника IL-18M в прокариотических системах. Затем, после ICEрасщепления in vitro, может быть генерирован зрелый полностью активный белок. Последовательность
ICE в предшественнике IL-18M может быть заменена последовательностью, кодирующей сайт специфического расщепления протеазой, предпочтительно, фактором Ха.
Для эукариотической экспрессии и секреции может быть использован экспрессирующий вектор,
кодирующий эффективный сигнальный пептид, а предпочтительно сигнальный пептид человеческого
гормона роста (чГР), присоединенный к кДНК зрелого IL-18M.
Родительская кДНК IL-18M, используемая для конструирования мутантов, может быть выбрана из
кДНК мыши или человека.
Для облегчения очистки IL-18M может быть помечен в эпитопе, предпочтительно гистидином. Рекомбинантный IL-18M может быть очищен стандартными или аффинными методами. Мониторинг количества продуцируемого IL-18M может быть осуществлен с помощью специфического ELISA.
IL-18M может быть использован в фармацевтической композиции для лечения заболеваний, которые могут предупреждаться или ослабляться путем индуцирования Thl-ответов, а более конкретно, путем обработки IL-18, например, для лечения инфекций, вызываемых микроорганизмами, или рака. Преимущество использования этого мутанта вместо варианта белка дикого типа, заключается в его устойчивости или резистентности к нейтрализации под действием IL-18BP.
Более конкретно, IL-18M может быть введен системно или местно в качестве адъюванта при противоопухолевой иммунотерапии, направленной против опухолевых антигенов.
Опухолевые клетки пациента могут быть выделены и генетически модифицированы для секреции
IL-18M, после чего они могут быть снова трансплантированы тому же самому пациенту в целях местной
вакцинации (Coughlin et al., 1998). Слияние модифицированных опухолевых клеток, экспрессирующих
IL-18M, с аллогенными дендритными клетками (антигенпрезентирующими клетками) может быть осуществлено для дополнительного повышения опухолевой антигенности, а следовательно, и противоопухолевого ответа.
IL-18M может быть введен в качестве адъюванта при ДНК-вакцинации (Tuting et al., 1998). Этот
способ аналогичен описанному ранее способу использования цитокинов IL-12 и IFN. В этом случае,
чрезкожная вакцинация опухолевым антигеном может быть осуществлена с использованием "пистолета"
для выстреливания генов. Таким образом трансфекция дендритных клеток, присутствующих в коже, может быть осуществлена с использованием ДНК, кодирующей как опухолевый антиген, так и IL-18M.
Альтернативно, дендритные клетки могут быть сконструированы ex vivo с последующим адоптивным
переносом.
IL-18M может быть использован в качестве адъюванта в противоопухолевой терапии, проводимой
посредством трансплантации. В этих целях, раковым пациентам могут быть трансплантированы аллогенные стволовые клетки. Для усиления реакции "трансплантат против опухоли", индуцированной путем
трансплантации аллогенных клеток, IL-18M может быть введен системно или местно, а предпочтительно
путем экспрессии IL-18M в генетически модифицированных сингенных дендритных клетках или в опухолевых клетках, взятых у пациента.
При этом, следует отметить, что хотя настоящее изобретение описано на конкретных предпочтительных вариантах его осуществления, однако приведенное выше описание, а также иллюстрирующие
его примеры не ограничивают объема изобретения. Для каждого специалиста очевидно, что настоящее
изобретение может включать и другие аспекты, преимущества и модификации, не выходящие за рамки
объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструирование векторов для экспрессии гибридного белка "рroIL-18WТ-гистидиновая
метка", расщепляемого фактором Ха.
Для генерирования "правильно" собранного IL-18 в E.coli, сайт расщепления ферментом ICE в
предшественнике IL-18 заменяли на сайт расщепления фактором Ха. В результате этого, расщепление
-4-
005769
предшественника IL-18 фактором Xа in vitro приводило к генерированию активного белка (WO
00/61768).
кДНК-последовательность, кодирующую предшественник человеческого IL-18 (proIL18, банк генов, регистрационный номер D49950, фиг. 1) и используемую для генерирования экспрессионной плазмиды, выделяли как описано в литературе (Ghayur et al., 1997).
Замену сайта расщепления для ICE сайтом расщепления для Ха осуществляли с использованием 2
ПЦР-реакций (см. праймеры, используемые на фиг. 1). ПЦР-реакция 1: про-фрагмент кДНК IL-18 генерировали с использованием смыслового праймера (Prl), содержащего EcoRI-сайт, расположенный выше
(в положении апстрим) ОРС, 5'-ATATGAATTCATGGCTGCTGAACCAGTAG (SEQ ID NO:11), и обратного праймера (Рr2), сконструированного для введения ICE-сайта (33-LESD-36), в котором 6 нуклеотидов были заменены так, чтобы они кодировали сайт фактора Ха (33-IEGR-36), 5'AAAGTAACGTCCTTCGATGTTTTC (SEQ ID NO:12). Амплифицированный ДНК-фрагмент, кодирующий зрелый IL-18, генерировали с использованием смыслового праймера (Рr3), комплементарного Рr2,
5'-GAAAACATCGAAGGACGTTACTTT (SEQ ID NO:13), и обратного праймера (Рr4), содержащего
BamHI-сайт, расположенный ниже (в положении даунстрим) кодирующей последовательности IL-18, 5'ATATGGATCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGTG (SEQ ID NO:14). Про-фрагмент размером 108 п.н. и
ДНК зрелого IL-18 размером 474 п.н., выделяли путем электрофореза в 1% агарозе и элюировали с помощью системы гель-экстракции (GIBCO/BRL).
ПЦР-реакция 2: два ДНК-фрагмента, полученные в ПЦР-реакции 1, смешивали в отношении 1:1 и
использовали вместе с праймерами Prl и Рr4 для генерирования кДНК полноразмерного человеческого
IL-18, в которой сайт ICE заменен сайтом фактора Ха (ICE/Ха).
кДНК пpo-IL-18 (ICE/Xa) лигировали в плазмиду BlueScript (Stratagene) с помощью рестрикционных EcoRI- и BamHI-сайтов (GIBCO/BRL). Эта плазмида служила для подтверждения последовательности. Предсказанная кодируемая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:2. Для
экспрессии в E.coli, ДНК-вставку, кодирующую IL-18, снова лигировали в вектор pPROEX HTa
(GIBCO/BRL) с использованием EcoRI- и XbaI-сайтов (присутствующих в BlueScript). В этом векторе
полученный белок был присоединен своим N-концом к гистидиновой метке.
Пример 2. Конструирование мутантов Е42А, К89А и Е42А/К89А-мутантов.
Мутации в IL-18 были созданы в остатках, которые, как предполагается, имеют важное значение
для связывания с ингибитором IL-18BP (Kim et al., 2000). Были генерированы три мутанта: Е42А, К89А и
Е42А/К89А. Эти мутации были созданы посредством двух ПЦР-реакций, как описано в примере 1, с использованием праймеров и матриц, описанных ниже (праймеры показаны на фиг. 2).
Мутант Е42А
ПЦР-реакция 1: Для получения мутанта Е42А была использована пара праймеров: пара А - праймер
Prl (пример 1) и обратный праймер (Pr5) 5'-TAA TTT AGA TGC AAG CTT GCC (SEQ ID N0:15), кодирующий аланин вместо глутаминовой кислоты (Е42), и пара В - смысловой праймер (Рr6) 5'-GGC AAG
CTT GCA TCT AAA TTA (SEQ ID NO:16), кодирующий аланин вместо глутаминовой кислоты (GAA →
GCA), и обратный праймер Рr4 (пример 1), с использованием пpo-IL-18 (ICE/Xa) в качестве матрицы в
ПЦР-реакции.
ПЦР-реакция 2: Два фрагмента, полученные в ПЦР-реакциях 1, использовали в качестве матриц для
второй ПЦР-реакции, осуществляемой с помощью праймеров Prl и Рr4.
Мутант К89А
ПЦР-реакция 1: Для получения мутанта К89А была использована пара праймеров: пара А - праймер
Prl (пример 1) и обратный праймер (Pr7) 5'-CTG GCT АТС TGC ATA CAT ACT (SEQ ID NO:17), кодирующий аланин вместо лизина (К89), и пара В смысловой праймер (Pr8) 5'-AGT ATG TAT GCA GAT
AGC CAG (SEQ ID NO:18), кодирующий аланин вместо лизина (AAA→ GCA), и обратный праймер Рr4
(пример 1), с использованием пpo-IL-18 (ICE/Xa) в качестве матрицы для первой ПЦР-реакции.
ПЦР-реакция 2: Два фрагмента, полученные в ПЦР-реакции 1, служили в качестве матриц для второй ПЦР-реакции, осуществляемой с использованием праймеров Prl и Рr4.
Мутант Е42А/К89А
Для получения двойной мутации Е42А/К89А использовали такой же праймер, как и для получения
мутации Е42А, а кДНК мутанта К89 использовали в качестве матрицы в этой реакции.
Каждый из трех мутированных генов IL-18 лигировали в вектор BlueScript для подтверждения последовательности. Предсказанные аминокислотные последовательности для мутантов предшественника
IL-18: Е42А, К89А и Е42А/К89А показаны в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, соответственно.
Для экспрессии в E.coli, каждую из трех ДНК-вставок для IL-18 снова лигировали в вектор pPROEX HTa
(GIBCO/BRL) с использованием EсоRI- и XbaI-сайтов. Полученный белок был присоединен своим Nконцом к гистидину (фиг. 1).
Пример 3.
Экспрессия и очистка белка. Предшественники мутантов IL-18 были экспрессированы в E.coli и
подвергнуты аффинной очистке с помощью гистидиновой метки, и соответствующие зрелые молекулы
-5-
005769
генерировали путем протеолитического расщепления фактором Ха.
Каждую из четырех плазмид pPROEX HTu/IL-18 (дикого типа и три мутанта) вводили в компетентные клетки E.coli штамма DHQ (GIBCO/BRL) и экспрессировали, как описано в литературе (11). Ночная
культура, 25 мл, служила в качестве инокулята для 450 мл культуры LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и ее культивировали до клеточной плотности OD600=0,6-l. Экспрессию белка индуцировали путем обработки изопропилтиогалактозидом (IPTG 0,3 мМ), и инкубирование продолжали при 37°С в течение 3 ч при встряхивании. Культивированные бактериальные клетки собирали центрифугированием
(5000 х g в течение 15 мин при 4°С) и осадок суспендировали в 30 мл буфера Талона (50 мМ NaH2PO4/20
мМ Трис-НСl/100 мМ NaCl, pH 8) . Клетки лизировали путем обработки ультразвуком (импульсы 2⋅30 с)
на льду. Растворимый белок получали центрифугированием (4000 х g в течение 30 мин при 4°С) и наносили на 3 мл миниколонку Талона (Clontech). Затем колонку Талона промывали 30 объемами слоя и
элюировали 6 мл 100 мМ имидазола в буфере Талона. Элюент диализовали против буфера, содержащего
фактор Ха (20 мМ Трис-НСl/150 мМ NaCl/2 мМ CsCl2) при 4°С в течение 20 ч. 0,2 мл аффинно очищенного на колонке Талона гибрида про-IL-18 с меткой His х 6 на N-конце инкубировали с 4 мкг фермента
фактора Ха (New England Biolabs) в течение 4 ч при комнатной температуре в присутствии 2 мМ фенилметилсульфонилфторида (GIBCO/BRL). Мониторинг количества продуцированного IL-18 осуществляли
с помощью специфического ELISA (R&D Systems). Аминокислотные последовательности, предсказанные для зрелого IL-18 дикого типа и мутантов Е42А, К89А и Е42А/К89А, показаны в последовательностях SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, соответственно.
Пример 4.
Оценка мутантов белка IL-18: E42A, К89А и Е42А/К89А с помощью Вестерн-блот-анализа. Очищенные мутанты IL-18 подвергали Вестерн-блот-анализу с использованием поликлонального антитела и
моноклонального антитела против зрелого IL-18.
Равные количества аффинно-очищенного на колонке Талона (после расщепления фактором Ха)
предшественника IL-18 дикого типа и его мутантных форм, подвергали электрофорезу в ПАГ с ДСН (10
% акриламид) в восстанавливающих условиях. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, а
затем инкубировали с "первыми" антителами (кроличьим поликлональным антителом против человеческого IL-18 или клоном моноклонального антитела 8-31-4 (IgG2a), которое было продуцировано против
рекомбинантной зрелой формы человеческого IL-18 (Puren et al., 1999) и которое также распознавало
предшественник IL-18). После 24-часового инкубирования добавляли соответствующее "второе" антитело, козий антимышиный или ослиный антикроличий иммуноглобулин IgG, конъюгированный с пероксидазой (Jackson Immuno Research), и визуализировали с помощью ЭХЛ (New England Nuclear Life Science
Products).
Окрашивание пpo-IL-18 поликлональным кроличьим антителом против человеческого IL-18 было
одинаково интенсивным для IL-18 дикого типа и для каждого из его трех мутантов. Аналогичным образом, сигналы, полученные с использованием зрелых форм IL-18 дикого типа, IL-18 и каждого из его трех
мутантов с использованием поликлональной антисыворотки, имели одинаковую интенсивность. Кажущаяся молекулярная масса указывала на то, что различные формы IL-18 имели ожидаемый размер. В
противоположность этому, при использовании моноклонального антитела, два мутанта К89А и
Е42А/К89А имели более интенсивную окраску, чем белок дикого типа и мутант Е42А, в результате чего
было сделано предположение, что аффинность моноклонального антитела по отношению к этим мутантам является более высокой. Эти результаты дают основание предположить, что мутанты К89А и
Е42А/К89А могут иметь другую конформацию, что приводит к более высокой аффинности.
Пример 5.
Оценка биологической активности мутантов белка IL-18: Е42А, К89А и Е42А/К89А. Очищенные
зрелые формы IL-18/ICE/Xa анализировали на ко-индуцирование IFN-γ в человеческих природных клетках-киллерах (NKO, описанных в примере 8), в МКПК (описанных в примере 7) и на индуцирование IL-8
в МКПК.
IL-18 не индуцирует IFN-γ в этих клетках, в отличие от IL-12 (или IL-15), и использовался как костимулятор. Низкие концентрации IL-12 (1-2 нг/мл IL-12 (PreproTech Rocky Hill, NJ)) индуцируют небольшое количество IFN-γ, однако, обработка IL-12 вместе с IL-18 приводила к значительному увеличению продуцирования IFN-γ. Мониторинг продуцирования IFN-γ в клетке проводили как описано в примере 9. Было обнаружено, что индуцирование IFN-γ в клетках NKO под действием IL-18 дикого типа
(ICE/Ха) и IL-12 было сравнимо с индуцированием IFN-γ рекомбинантным зрелым человеческим IL-18,
образованным в результате ICE-процессинга пpo-IL-18 (Gu et al., 1997) и IL-12. Эти результаты показали,
что IL-18 имеет "правильную" сборку в E.coli и "правильно" процессируется фактором Ха.
Для теста на активность мутированного IL-18 индукцию продуцирования IFN-γ путем стимуляции
мутантным IL-18 или IL-18 дикого типа вместе с IL-12 анализировали в клетках NKO (статистические
анализы описаны в примере 10). Как показано на фиг. 3А, IL-18 дикого типа является активным в качестве индуктора IFN-γ, при его использовании, начиная с концентрации 7,5 нг/мл с постепенным ее увеличением до 60 нг/мл (самой высокой тестируемой концентрации). Каждая из трех мутированных форм IL-6-
005769
18 обладала биологической активностью, которая была выше, чем активность IL-18 дикого типа в этих
клетках. Так, например, белок с одной мутацией Е42А был в два раза более активным, чем форма дикого
типа при каждой тестируемой концентрации. Белок с одной мутацией К89А был в четыре раза более активным, чем форма дикого типа при концентрации 7,5 нг/мл. IL-18 с двойной мутацией Е42А/К89А был
наиболее активным. Как показано на фиг. 3А, мутированный IL-18, E42A индуцировал 600 пг/мл IFN-γ,
при этом максимальная активность наблюдалась при предварительной обработке 60 нг/мл IL-18 дикого
типа в концентрации 30 нг/мл, мутанта К89А в концентрации 15 нг/мл и двойного мутанта, в концентрации 7,5 нг/мл. Таким образом, мутанты Е42А, К89А и двойной мутант были в 2, 4 и 8 раз более активными, чем белок дикого типа, соответственно.
Аналогичные результаты наблюдались при тестировании продуцирования IFN-γ в свежевыделенных человеческих МКПК (пример 7). В этих клетках, ко-стимуляция IL-12 и IL-18 приводила к продуцированию IFN-γ, но ни один из двух цитокинов, взятых отдельно, не мог индуцировать IFN-γ. Двойной
мутант Е42А/К89А был самым активным (фиг. 3В).
Эти результаты показали, что замена двух заряженных аминокислот Glu42 и/или Lys89 остатками
Ala, соответственно, приводит к увеличению биологической активности IL-18.
Известно, что IL-18 индуцирует IL-8 в СD14+-клетках в препаратах МКПК (описанных в примере
7). Хотя в этих клетках, IL-18 индуцирует продуцирование IL-8 без помощи ко-стимулятора IL-12, однако, для индуцирования IL-8 требуются более высокие концентрации IL-18, чем для индуцирования IFN-γ.
Поэтому был проведен тест на индуцирование IL-8 под действием IL-18 дикого типа и мутантную стимуляцию МКПК. Мониторинг продуцирования IL-8 проводили в клеточных средах путем специфического анализа, описанного в примере 9. На фиг. 4 показано, что хотя действие двух одиночных мутаций на
индуцирование IL-8 было сравнимым с действием белка дикого типа, однако двойной мутант IL-18 обнаруживал гораздо более высокий уровень индуцирования IL-8 (в 3,5 раз), чем форма дикого типа.
Эти результаты показали, что двойной мутант Е42А/К89А обладает самой высокой биологической
активностью.
Пример 6.
Нейтрализация мутантов IL-18 под действием IL-18BP. Мутации были созданы в остатках, которые,
как предполагается, играют важную роль в связывании IL-18 с ингибитором IL-18BP. Поэтому был проведен специфический анализ на способность IL-18ВР нейтрализовать биологическую активность IL-18,
например, продуцирование IFN-γ (пример 8).
Различные концентрации IL-18BP (изоформа "а" клеток СНО, продуцировала рекомбинантный his
6-меченный человеческий IL-18ВР (поставляемый из Interpharm Laboratories, Ness Ziona, Israel Kim et al.,
2000)) предварительно инкубировали с IL-18 дикого типа или с его мутантными формами (конечная концентрация 30 нг/мл), а затем добавляли к клеточным культурам.
Как показано на фиг. 4А, 50% ингибирующая концентрация IL-18ВР для ко-индуцирования IFN-γ
под действием IL-18 дикого типа, из клеток NKO, составляла приблизительно 15 нг/мл (что позволяет
предположить, что при концентрации IL-18BP 3,7 нг/мл ингибирования не происходит, и эта величина
представляет 100% активность). Одиночная мутация Е42А приводит к аналогичной зависимости "доза ингибирующая концентрация IL-18BP".
Однако при инкубировании мутанта К89А с IL-18BP его способность действовать в качестве коиндуктора IFN-γ в клетках NKO нейтрализуется в меньшей степени (фиг. 5А). Статистически значимое
снижение активности могло наблюдаться только при концентрации 120 нг/мл. В противоположность
этому, IL-18BP был неспособен нейтрализовать двойной мутант IL-18, E42A/K89A.
Как показано на фиг. 4В, при тестировании в клетках МКПК вместо клеток NKO IL-18 оказался более чувствительным к нейтрализации под действием IL-18BP. Количество IL-18BP, необходимое для
нейтрализации IL-18 дикого типа, составляло 3,7 нг/мл, то есть наименьшую из тестируемых концентраций. IL-18 с одной мутацией Е42А ведет себя аналогично IL-18 дикого типа, и как было установлено из
наблюдений, низкие концентрации IL-18BP нейтрализовали его биологическую активность в МКПК. В
противоположность этому, мутант с одной мутацией К89А был нейтрализован при концентрации 120
нг/мл. Аналогично результатам, полученным для IL-18ВР-нейтрализации мутантов IL-18 в клетках NKO,
IL-18BP оказывал лишь незначительное воздействие на двойной мутант Е42А/К89А в клетках МКПК.
Эти результаты показали, что мутант Е89А и двойной мутант Е42А/К89А был меньше подвержен
воздействию природного ингибитора IL-18BP.
Пример 7. Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и
индуцирование IFN-γ.
Остаточные лейкоциты после тромбафереза здоровых людей-доноров, вымывали из пробирок для
взятия крови и подвергали центрифугированию на аппарате Histopaque. МКПК отсасывали с внутренней
поверхности сосудов, три раза промывали в апирогенном физиологическом растворе (Baxter Health Care,
Mundelein, IL) и ресуспендировали при плотности 5 х 106 клеток на мл в среде RPMI 1640, в которую
было добавлено 10% FBS (GIBCO/BRL Grand Island, NY). Клетки культивировали в плоскодонных 96луночных планшетах (Becton Dickinson), содержащих только среду RPMI 1640 (контроль), различные
-7-
005769
концентрации рекомбинантного человеческого IL-18 и IL-18 дикого типа (ICE/Ха) или три мутанта, в
присутствии 1 нг/мл IL-12. В некоторых экспериментах препараты IL-18 сначала были смешаны с полимиксином В (1 мкг/мл, Sigma), а затем добавлены к клеткам. Клетки инкубировали в течение 16-20 ч при
37°С в атмосфере воздуха с повышенной влажностью и с 5% СО2, а затем супернатант культуры собирали для оценки уровня IFN-γ.
Пример 8. Индуцирование IFN-γ в клеточной линии NKO.
Исходную родительскую клеточную линию NK92 получали от Hans Klingerman (Gong et al., 1994).
Человеческая клеточная линия NKO, используемая в настоящих исследованиях, представляла собой субклон этой клеточной линии. Клетки NKO поддерживали в среде RPMI 1640, в которую были добавлены
10% FBS, 50 пг/мл IL-2 (R&D Systems) и 200 пг/мл IL-15 (Pepro Tech). Для анализов клетки NKO суспендировали при концентрации 0,5 х 106 клеток на мл в среде RPMI 1640 и стимулировали (в 0,2 мл-объемах
в 96-луночных планшетах) 0,5 нг/мл IL-12 (Prepro Tech Rocky Hill, NJ) и различными концентрациями
рекомбинантного человеческого IL-18 дикого типа, IL-18 (ICE/Ха) или мутантов IL-18, E42A, К89А и
Е42А/К89А. После выдерживания в течение 16-20 ч при 37°С в атмосфере воздуха с повышенной влажностью и с 5% СО2, супернатант культуры собирали для оценки уровней IFN-γ.
Пример 9. Анализ цитокинов.
Для измерения IFN-γ (13) и IL-8 (12) в среде для культивирования клеток использовали метод электрохемилюминесценции в жидкой фазе (ЭХЛ). Уровень ЭХЛ определяли с использованием анализатора
Origen Analyzer (Igen, Gaithersburg, MD). Предел детекции IFN-γ и IL-8 составлял 62 пг/мл и 40 пг/мл,
соответственно.
Пример 10. Статистический анализ.
Данные выражали как среднее ± стандартная ошибка средней. Значения для групп сравнивали с
помощью анализа ANOVA с использованием наименьшей значимой разности по Фишеру. Статистическая значимость была приемлемой в 95% доверительном интервале. ANOVA и корреляционный анализ
осуществляли с использованием пакетов статистических программ STATVIEW 512 + (Brain Power, Calabasas, CA).
Пример 11. Продуцирование зрелых мутантов IL-18 в клетках СНО.
Для экспрессии и секреции мутантов IL-18 в клетках СНО ДНК-последовательность, кодирующую
зрелый белок дикого типа и мутантный IL-18BP, лигировали с последовательностью ДНК сигнального
пептида человеческого гормона роста (чГР) с помощью двух ПЦР-реакций, аналогичных реакциям, описанным в примере 1. Матрица для первой ПЦР-реакции амплификации каждого мутанта IL-18 представляла собой соответствующую конструкцию, описанную в примере 2 и полученную с использованием
смыслового праймера (Рr9), содержащего перекрывающиеся последовательности IL-18 и сигнального
пептида чГР, и обратных праймеров (Рr10), кодирующих последние 12 нуклеотидов IL-18, стоп-кодон и
сайт для рестриктирующего фермента. Для амплификации сигнального пептида гормона роста, плазмиду
pXGH использовали в качестве матрицы со смысловым праймером (Pr11), содержащим сайт для рестриктирующего фермента и первые 12 нуклеотидов сигнального пептида чГР, и с обратным праймером
(Рr12), содержащим перекрывающиеся последовательности сигнального пептида и зрелого белка IL-18.
Матрицы для второй ПЦР-реакции, осуществляемой в целях амплификации фрагмента, кодирующего
сигнальный пептид чГР, присоединенный к зрелой последовательности IL-18, представляли собой очищенные амплифицированные фрагменты, полученные в первой ПЦР-реакции, и праймеры Рr10 и Pr11,
содержащие рестрикционные сайты. Этот гибридный фрагмент очищали, гидролизовали соответствующими рестриктирующими ферментами и клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающего.
Указанные плазмиды использовали для трансфекции клеток СНО (DHFR-) вместе с плазмидой, содержащей мышиный ген DHFR в качестве генного маркера. Резистентные клетки выделяли на селективной среде и анализировали на продуцирование IL-18 с помощью анализа ELISA.
Стабильно трансфецированные клетки подвергали нескольким циклам генной амплификации с возрастающими концентрациями МТХ. По окончании процесса амплификации генов, клоны выделяли посредством лимитирующего разведения. После субклонирования, клон, который обнаруживал высокую
специфическую продуктивность и более высокую стабильность продуцирования, отбирали для дальнейшего продуцирования.
Библиография
1. Anderson D.M., Maraskovsky E., Billingsley W.L., Dougall W.C., Tometsko M.E., Roux E.R., Teepe,
M.C., DuBose R..F, Cosman D., Galibert, L. (1997) "A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance
T-cell growth and dendritic-cell function." Nature, 390, 175-179.
2. Bazan, J. F., Timans, J. C. and Kaselein, R. A. (1996) "A newly defined interleukin-1?" Nature 379, 591.
3. Born T.L., Morrison L.A., Esteban D.J., VandenBos T., Thebeau L.G., Chen N., Spriggs M.K., Sims
J.E., Buller R.M. (2000) "A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18, and inhibits NK cell response."
J Immunol 164, 3246-54.
4. Childs R., Chernoff A., Contentin N., Bahceci E., Schrump D., Lritman S., Read EJ., Tisdale J., Dunbar
C., Linehan W.M., Young N.S., Barrett A.J. (2000) "Regression of metastatic renal-cell carcinoma after non-8-
005769
myeloablative allogeneic peripheral-blood stem-cell transplantation." N Engl JMed 343, 750-8.
5. Cho D., Kim T.G., Lee W., Hwang Y.I., Cho H.I., Han H., Kwon, O., Kim, D., Park, H., Houh, D. (2000)
"Interleukin-18 and the costimulatory molecule B7-1 have a synergistic anti-tumor effect on murine melanoma; implication of combined immunotherapy for poorly immunogenic malignancy" J Invest Dermatol , 114, 928-34.
6. Coughlin C.M., Salhany, K.E., Wysocka M., Aruga E., Kurzawa H., Chang, A.E., Hunter C.A., Fox
J.C., Trinchieri G. and Lee, W.M. (1998) "Interleukin-12 and interleukin-18 synergistically induce murinc tumor
regression which involves inhibition of angiogenesis." J Clin Invest Mar, 101, 1441-52.
7. Engelmann H., Aderka D., Rubinstein M., Rotman D. and Wallach D. (1989)" A tumor necrosis factorbinding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity" J.
Biol. Chem. 264, 11974-11980.
8. Engelmann, H., Novick, D. and Wallach, D. (1990) two tumor necrosis factor-binding proteins purified
from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors." J. Biol. Chem. 265, 1531-1536.
9. Ghayur Т., Banerjee S., Hugunin M., Butler D., Herzog L., Carter A., Quintal L.. Sekut L., Talanian, R.,
Paskind M., Wong W., Kamen R., Tracey D., and Allen H. (1997) "Caspase-1 processes IFN-gamma-inducing
factor and regulates LPS-induced IFN-gamma production." Nature 386, 619-623.
10. Gollob J.A., Mier J.W., Veenstra K.. McDermott D.F., Clancy D.. Clancy M., Atkins M.B. (2000) "Phase I
trial of twice-weekly intravenous interleukin 12 in patients with metastatic renal cell cancer or malignant melanoma:
ability to maintain IFN-gamma induction is associated with clinical response." Clin Cancer Res, 5, 1678-92.
11. Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. (1994) "Characterization of a human cell line (NK-92) with
phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells." Leukemia 8:652.
12. Gu Y., Kuida K., Tsutsui H., Ku G., Hsiao K., Fleming M.A., Hayashi, N., Higashino K., Okamura H.,
Nakanishi K., Kurimoto M., Tanimoto Т., Flavell R.A., Sato V., Harding M.W., Livingston D.J., and Su M.S.
(1997) "Activation of interferon-gamma inducing factor mediated by interleukin-1 beta converting enzyme."
Science 275, 206-209
13. Kim S.H., Eisenstein M., Reznikov L., Fantuzzi G., Novick D., Rubinstein M. and Dinarello C.A.
(2000) "Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit EL18." Proc Natl Acad Sci USA, 97, 1190-5.
14. Kohno K., J. Kataoka T. Ohtsuki, Y. Suemoto I. Okamoto M. Usui M. Ikeda, and M. Kurimoto. (1997)
"IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Thl but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12." J. Immunol. 158:1541-1550.
15. Kugler A., Stuhler G., Walden P., Zoller G., Zobywalski A., Brossart P., Trefzer U., Ullrich S., Muller
C.A., Becker V., Gross A J., Hemmerlein В., Kanz L., Muller G.A., Ringert R.H.( 2000) " Regression of human
metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids." Nat Med,3, 332-6.
16. Nakamura K., Okamura H., Wada M., Nagata K. and Tamura T. (1989). "Endotoxin-induced serum
factor that stimulates gamma interferon production." Infect. Immun., 57, 590-5 issn: 0019-9567.
17. Nakamura K., Okamura H., Nagata K., Komatsu T. and Tamura T. (1993) "Purification of a factor
which provides a costimulatory signal for gamma interferon production." Infect. Immun., 61, 64-70
18. Novick D., Engelmann H., Wallach D. and Rubinstein M. (1989) "Soluble cytokine receptors are present in normal human urine." J. Exp. Med. 170, 1409-14.
19. Novick D., Cohen B. and Rubinstein M. (1992) "Soluble Interferon-alpha Receptor Molecules Are Present in Body Fluids." FEBS Lett, 314, 445-8.
20. Novick D., Cohen B. and Rubinstein M. (1994) "The Human Interferon alpha/beta Receptor - Characterization and Molecular Cloning." Cell 77, 391-400.
21. Novick D., Kim S., Fantuzzi G., Reznikov L.L., Dinarello C.A. and Rubinstein, M. (1999) "Interleukin-18 Binding Protein: A Novel Modulator of the Thl Cytokine Response. Immunity 10, 127,36.
22. Okamura H., Tsutsui H., Komatsu T., Yutsudo M., Hakura A., Tanimoto T., Torigoe K-, Okura T., Nukada Y., Hattori K., Akita K., Namba M., Tanabe F., Konishi K., Fukuda S., and Kurimoto M. (1995) "Cloning
of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells." Nature, 378, 88-91.
23. Puren A.J., Fantuzzi G., Dinarello C.A. (1999 ) "Gene expression, synthesis, and secretion of interleukin 18 and interleukin 1beta are differentially regulated in human blood mononuclear cells and mouse spleen
cells." Proc Natl Acad Sci USA, 96, 2256-61.
24. Seki S, Habu Y., Kawamura T., Takeda K., Dobashi H., Ohkawa T., Hiraide H. (2000) " The liver as a
crucial organ in the first line of host defense: the roles of Kupffer cells, natural killer (NK) cells and NKl.l Ag+
T cells in T helper 1 immune responses." Immunol Rev, 174, 35-46.
25. Simonet W.S., Lacey D.L., Dunstan C.R. Kelley M., Chang M.S., Luthy R., Nguyen H.Q., Wooden S.,
Bennett L., Boone T., Shimamoto G., DeRose M., Elliott R., Colombero A., Tan H.L., Trail G., Sullivan J.,
Davy E., Bucay N., Renshaw-Gegg L., Hughes T.M., Hill D., Pattison W., Campbell P., Boyle W.J.
(1997)."Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density." Cell, 89, 309-19.
26. Slavin S. (2000) "Immunotherapy of cancer with alloreactive lymphocytes." N Engl J Med, 343, 802-3.
27. Slavin S., Or, R., Prighozina T., Gurevitch O., Aker M., Panighari S., Shapira M., Nagle A. (2000)
"Immunotherapy of hematologic malignancies and metastatic solid tumors in experimental animals and man"
-9-
005769
Bone Marrow Transplant Suppl, 2:S54-7.
28. Tsutsui H., K. Nakanishi K. Matsui K. Higashino H. Okamura Y. Miyazawa and K. Kaneda. (1996)
"IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligand-mediated cytotoxic activity of murine natural killer cell
clones." J. Immunol, 157,3967-73 issn: 0022-1767.
29. Tuting T., Wilson C.C., Martin D.M., Kasamon Y.L., Rowles J., Ma D.I., Slingluff C.L., Wagner S.N.,
van der Bruggen P., Baar J., Lotze M.T., Storkus WJ. (1998) "Autologous human monocyte-derived dendritic
cells genetically modified to express melanoma antigens elicit primary cytotoxic T cell responses in vitro: enhancement by cotransfection of genes encoding the Thl-biasing cytokines IL-12 and IFN-alpha." J Immunol,
160, 1139-47.
30. Urushihara N., Iwagaki H., Yagi T., Kohka H., Kobashi K., Morimoto Y., Yoshino T., Tanimoto T.,
Kurimoto M., Tanaka N. (2000) "Elevation of serum interleukin-18 levels and activation of Kupffer cells in biliary atresia." J Pediatr Surg, 35, 446-9.
31. Ushio S., Namba M., Okura T., Hattori K., Nukada Y., Akita K., Tanabe F., Konishi K., Micallef M.,
Fujii M., Torigoe K., Tanimoto T., Fukuda S., Ikeda M., Okamura H., and Kurimoto M. (1996) J. Immunol.,
156, 4274-9.
32. Vigers G.P., Anderson L.J., Caffes P., Brandhuber BJ. (1997) "Crystal structure of the type-I interleukin-1 receptor complexed with interleukin-1 beta." Nature, 386, 190-4.
33. Xiang Y. and Moss B.( 1999)" IL-18 binding and inhibition of interferon gamma induction by human
poxvirus-encoded proteins." Proc Natl Acad Sci USA, 96, 11537-42.
34. Yasuda H., Shima N., Nakagawa N., Mochizuki S.I., Yano K., Fujise N., Sato Y., Goto M., Yamaguchi
K., Kuriyama M., Kanno Т., Murakami A., Tsuda E., Morinaga,Т., Higashio K.. (1998)" Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro." Endocrinology. 139, 1329-37.
Работы, цитируемые выше и по всему описанию изобретения, во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Мутантный полипептид IL-18, включающий мутации в одном или нескольких аминокислотных
остатках, которые участвуют в его взаимодействии с IL-18-связывающим белком.
2. Полипептид по п.1, где указанными мутациями являются замены, добавления или делеции.
3. Полипептид по п.2, где указанными заменами являются неконсервативные замены.
4. Полипептид по любому из пп.1, 2 или 3, где указанные мутации присутствуют в остатке, выбранном из группы, состоящей из Glu-42, Ile-85, Met-87, Lys-89, Met-96, Asp-130, Lys-132, Pro-143, Met-149 и
Leu-189.
5. Полипептид по п.4, где указанные мутации присутствуют в остатке, выбранном из группы, состоящей из Glu-42 и Lys-89.
6. Полипептид по п.5, где указанная мутация присутствует в остатке Glu-42.
7. Полипептид по п.5, где указанная мутация присутствует в остатке Lys-89.
8. Полипептид по п.5, где указанная мутация присутствует в остатке Glu-42 и остатке Lys-89.
9. Полипептид по п.6, где остаток Glu-42 заменен неполярной аминокислотой.
10. Полипептид по п.9, где Glu-42 заменен остатком Ala.
11. Полипептид по п.7, где остаток Lys-89 заменен неполярной аминокислотой.
12. Полипептид по п.11, где Lys-89 заменен остатком Ala.
13. Полипептид по п.8, где оба остатка Glu-42 и Lys-89 заменены неполярной аминокислотой.
14. Полипептид по п.13, где оба остатка Glu-42 и Lys-89 заменены остатком Ala.
15. Выделенная ДНК, кодирующая полипептид по любому из пп.1-14.
16. ДНК по п.15, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID
NO:3.
17. ДНК по п.15, кодирующая полипептид, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.
18. ДНК по п.15, кодирующая полипептид, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.
19. ДНК по п.15, кодирующая полипептид, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.
20. ДНК по п.15, кодирующая полипептид, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.
21. ДНК по п.15, кодирующая полипептид, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.
22. ДНК по любому из пп.15, 19, 20 и 21, которая дополнительно включает последовательность
нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид.
23. ДНК по п.22, где указанным сигнальным пептидом является сигнальный пептид гормона роста.
- 10 -
005769
24. Вектор, включающий ДНК по любому из пп.15-23, где указанный вектор способен экспрессировать полипептид, кодируемый указанной ДНК в соответствующей клетке-хозяине.
25. Вектор по п.24, где указанной клеткой-хозяином является прокариотическая клетка.
26. Вектор по п.25, где указанная ДНК кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из
SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5.
27. Вектор по п.24, где указанной клеткой-хозяином является эукариотическая клетка.
28. Вектор по п.27, где указанная ДНК кодирует полипептид, выбранный из группы, состоящей из
SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.
29. Вектор по п.27, включающий ДНК по п.22 или 23.
30. Вектор по п.28, где указанная ДНК лигирована с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид человеческого гормона роста человека.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель, предназначенная для лечения заболеваний, предупреждение или ослабление
которых опосредуется Thl-ответами.
32. Фармацевтическая композиция по п.31, предназначенная для лечения рака.
33. Фармацевтическая композиция по п.31, предназначенная для лечения вирусных заболеваний.
Список последовательностей
- 11 -
005769
- 12 -
005769
- 13 -
005769
- 14 -
005769
- 15 -
005769
- 16 -
005769
- 17 -
005769
- 18 -
005769
- 19 -
005769
- 20 -
005769
- 21 -
005769
- 22 -
005769
Фиг. 1А
Фиг. 1B
- 23 -
005769
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 24 -
005769
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 25 -