Холодова М.В. 1.86 мб. pdf

Молекулярно-генетические
исследования в зоопарках
Холодова М.В.
Кабинет методов молекулярной
диагностики
ИПЭЭ РАН
Применение молекулярно-генетических методов
помогает исследовать скрытые стороны
популяций диких животных, оценить потенциальную
жизнеспособность
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ РАБОТЫ
•
Постановка проблемы и выбор адекватных молекулярных
маркеров
• Сбор образцов, необходимых для решения проблемы
• Выделение ДНК
• Проведение ПЦР (амплификация)
• Визуализация результатов ПЦР, очистка ПЦР-продукта
• Секвенирование – определение нуклеотидных
последовательностей в исследуемых участках генома или
фрагментный анализ – описание аллелей
• Статистический анализ
ОБРАЗЦЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ
АНАЛИЗА ДНК
• Кровь
• Кусочки мышц и др. тканей
• Кусочки сухих шкур
• Шерсть, волосы
• Перья
• Кости, зубы, рога
• Экскременты
• Слюна, моча и т.п.
СПОСОБЫ КОНСЕРВАЦИИ
• Высушивание, в т.ч. в силикогеле
• Фиксация в этаноле и др. консервантах
Области применения молекулярных
данных
• Систематика и филогения
• Филогеография и изучение внутривидовой
структуры
• Оценка генетического разнообразия
• Сохранение редких видов и таксонов
• Этология
• Эпидемиология
• Фаунистика
• Изучение микроэволюционных процессов
• Популяционная экология
• Палеонтология и др.
Основные молекулярно-генетические
методы, основанные на ПЦР (полимеразной
цепной реакции)
• Определение нуклеотидных
последовательностей различных участков
ядерной и митохондриальной ДНК
• Анализ паттернов распределения фрагментов
ДНК разной длины (аллелей), полученных с
помощью различных методов фрагментного
анализа
#1 GCAGACACCTCTCTCGCCTTCGCC
#2 GCAGACACCTCTCTCGCCTTCGCC
#3 GCAGACACTTCACTGGCCTTCTCC
#4 GCAGACACTTCACTGGCCTTCTCC
Методы «фрагментного анализа» ДНК помогают
исследовать отцовскую и материнскую линии
наследования, генотипировать особей
• Микросателлиты
• AFLP –(amplified fragment length polymorphism markers) и
др.
•
Нуклеотидные последовательности ДНК отвечают
важнейшим требованиям, необходимым для изучения
изменчивости и темпов эволюции (по Дж. Г.Симпсону,
1948), представляя собой единичные, общие для разных
групп признаки, поддающиеся выражению в сравнимых
единицах.
• Различия нуклеотидных последовательностей
гомологичных участков ДНК отражает степень
и относительное время дивергенции таксонов
#1 GCAGACACCTCTCTCGCCTTCGCC
#2 GCAGACACCTCTCTCGCCTTCGCC
#3 GCAGACACTTCACTGGCCTTCTCC
#4 GCAGACACTTCACTGGCCTTCTCC
«Молекулярные часы»
Генетические дистанции (нуклеотидные) между
популяциями и отдельными гаплотипами могут
использоваться для расчета времени их дивергенции,
если известен коэффициент скорости мутаций по
исследованному фрагменту ДНК для данного вида.
Наиболее точные данные могут быть получены с
помощью анализа палеонтологического материала
известного возраста.
Пример:
Изучение ископаемых образцов
пингвина Адели (Pygoscelis adeliae)
показало, что коэф. скорости
мутирования был занижен в 2-7 раз
(Lambert et al., 2004)
Задачи, решаемые в зоопарках
молекулярными методами
• Определение систематического статуса
животных (подвидового, популяционного);
• Выявление сохранившихся ex situ уникальных
генетических линий;
• Выявление гибридов;
• Оценка уровня генетического разнообразия на
уровне особей и групп особей;
• Определение родственных отношений между
особями;
• Определение пола у птиц и др.
Систематика и филогения
•
•
Маркеры ДНК позволяют отличить гомологии от аналогий;
Выявить степень генетической изоляции/родства между
таксонами
Молекулярная филогеография
(«внутривидовая систематика»)
•Изучает принципы и процессы, управляющие географическим
распределением генеалогических линий (Avise, 2000).
•Позволяет уточнить популяционно-генетическую структуру видов;
выявить степень родства и генетической уникальности популяций;
особенности эволюционной истории популяций и видов и др.
Разработка маркеров для определения подвидов
леопарда (Panthera pardus) из природы и зоопарков
мтДНК (NADH5) и микросателлиты (11 локусов)
Рис. 1. Распределение особей леопардов, исходя из данных по длинам аллелей
микросателлитных локусов. По вертикали доля аллелей микросателлитных
локусов того или иного подвида леопардов, в скобках принадлежность к группе:
1. P.p.saxicolor, 2. леопарды неизвестного происхождения, 3. P.p. orientalis.
Использованы образы из музеев и зоопарков
Джейран
Gazella subgutturosa
мтДНК
Показано близкое родство
между популяциями Узбекистана
и Туркменистана и их генетические
различия с джейранами
Азербайджана.
Генетически близки популяции
Азербайджана и Ирана.
Медианная сеть гаплотипов джейранов,
(D-петля мтДНК, 985 п.н.)
B - Бадхыз Туркмения,
o – Огурчинский Туркмения,
az –Ширванская степь Азербайджан,
без букв и с буквой с – Бухарский питомник
(экоцентр “Джейран’’) Узбекистан.
Дендрограмма сходства гаплотипов мтДНК
кабарги (Moschus moschiferus) северной группы подвидов (NJ)
SH11
76
96
SH12(2)
Сахалинская
SH3(2)
SA-KSA2
69
Дальневосточная
SA-SA1
82
SA-z3(5)
B-CH42
B-KI1
A-KA1
A-K7
S-S1
62
A-KA2
A-K8
54
A-K10
B-CH24
Идентичные гаплотипы
отмечены у животных
из локальных
группировок
Сибирская
B-40
M-KM
B-AK11
67
58
T-T5
T-T3
B-K01(2)
YA-YA1
B-K2(4)
B-K02
MR
0.05
Дендрограммы филогенетических отношений гаплотипов
(D-петля мтДНК) пятнистых оленей Приморского края РФ и
Китая
DV1(34)
76
88
100
DV6(1)
AB378366.1C.n.hortulorumCN1(7)
DV2(1)
DV23(1)
AB279722C.n.taiouanus4Twn1(4)
NJ
AB378377C.n.kopschiCN18
61
98
AB378373.1C.n.sichuanicusCN9(4)
DV16(2)
99
77
74
DV21(19)
41DV(4)
AF291880C.n.dybowskii
FJ969444C.e.songaricus
0.01
C.n.dybowskii?
C.n.hortilorum
Оседлые виды с высокой
территориальностью
• Четко проявляются генетические различия
между региональными группировками и
популяциями.
• В изолированных внутрипопуляционных
группировках отмечен низкий уровень
изменчивости.
• Гаплотипы контрольного региона мтДНК
могут использоваться в качестве маркеров
географического происхождения образцов.
Номадные виды
• Генетические различия между животными из
разных популяций выражены слабо.
• Сходные или идентичные гаплотипы с разной
частотой встречаются в различных
популяциях
Соотношение внутри- (Dx) и межпопуляционной (DA)
изменчивости у оседлых и мигрирующих видов
Оседлые виды с высокой
степенью территориальности
Мигрирующие виды
Saiga t. tatarica
2
9%
Rangifer tarandus
Capreolus capreolus* Moschus moschiferus
1
16%
2
35%
1
91%
Dx/DA > 1
1
41%
1
65%
2
59%
2
84%
Dx/DA < 1
У оседлых видов доля межпопуляционной вариабельности в
общей генетической изменчивости превышает долю
внутрипопуляционной.
У мигрирующих видов – обратное соотношение.
Генетическое разнообразие
обусловливает жизнеспособность особей,
популяций и видов, широту их адаптивных
возможностей.
Некоторые генетические маркеры, связанные
с жизнеспособностью:
-Гены главного комплекса гистосовместимости (MHC),
Связанные с формированием иммунного ответа;
-Гены PrP, обусловливающие устойчивость к прионным
Заболеваниям (Deer Chronic wasting disease и т.п.)
Связь гетерозиготности (черный), выживаемости молодняка (розовый)
и доли самцов среди новорожденных (белый) в экспериментальной
группировке
кабарги (n=134 отела) (по Приходько, 2003)
Для поддержания генетической вариабельности у оседлых высоко
территориальных видов жвачных необходимо сохранять
«экологические мосты» между отдельными внутрипопуляционными
группировками (парцеллами)
ИНБРИДИНГ
«Устойчивость к инбридингу» неодинакова
у разных видов (Ralls et al., 1988)
На основании результатов генетического
анализа разрабатываются оптимальные
схемы разведения редких видов, позволяющие
сохранять генетическое разнообразие,
снизить инбридинг и избежать последствий
инбредной депрессии
Ученые (Smithsonian Nat. Zoo Park) (CCEG Center for
Conservation and Evolutionary Genetics Smithsonian Inst)
разработали такую систему для тамаринов, в течение
20 лет разводимых в зоопарках.
Утрата генетического разнообразия медленнее происходит
у видов с более высокими темпами размножения
Характеристики скорости размножения и генетического разнообразия
(по гипервариабельному фрагменту мт ДНК) у разных видов копытных
Виды
π, %
Возраст
начала
разножения ♀ (>50
%)
Яловость ♀, %
1 год
Ср.
Max
2,3-8
45-90
4–15
43
2
года
>2
лет
Сайгак
3.7
Дзерен
5,3
Овцебык
0,15–1,3
+
Лось
европейский
0,8
+
Косуля евр.
1,28–1,38
+–
Пампасный
олень
1,1–2,5
+
Кабарга
2,7
+
+
80
+
1–4
+
7-18
>30
Vernesi et al., 2002; Банников и др.,1961; Соколов, Жирнов, 1998; Филонов, 1983;
Приходько, 2003; Данилкин, 1999, 2005; Groves, 1997; MacPhee et al., 2005; Gonzales et al.,1998
Селективная элиминация самцов в популяциях полигамных видов
вызывает эффект «скрытого бутылочного горлышка»
Изменение эффективной численности (Ne) популяции европейских сайгаков
при уменьшении доли взрослых самцов
Ne = 4NmNf/(Nm+Nf) (Wright,1938)
Годы
N, тыс.
♂, %
Ne, тыс.
1980-90
146.2
14,3
71,62
2002-03
15 (12)
1,0
0.59 (0,48)
15 (12)
3,0
1,75 (1,40)
При снижении учетной численности в 10-12 раз,
Ne уменьшилась от 40-50 до 120-150 раз.
Анализ ДНК в этологии
• Анализ родственных связей, в т.ч.
между родителями и потомством;
• Выявление
наличия
обособленных
внутрипопуляционных группировок.
• Характер спаривания и особенности
формирования пар.
• Доля участия ♀ и ♂
в выращивании
молодняка и поддержании генетического
разнообразия популяции.
• Наличие гнездового паразитизма.
Основные методы: микросателлиты, AFLP и т.п.
«Дополнительное отцовство»
(extra-pair paternity)
у социально моногамных видов птиц
• Составляет от 0% до 80 % .
• Внутривидовой анализ показал,
что самки стремятся спариваться
с «чужими» самцами для
улучшения генетической
структуры молодняка.
• Генетическое разнообразие было
выше в популяциях птиц с более
высоким уровнем
«дополнительного отцовства»
Межвидовая гибридизация
Признаки
Одинаковые мтДНК гаплотипы у близких видов в природе:
-У малого снежного гуся (Chen caerulescens caerulescens) и у гуся Росса (Chen
rossi) (Avise et al., 1992; Weckstein et al., 2002),
- в аллопатричных популяциях двух видов уток (Anas platyrhynchos) и
(A. rubripes) (Avise et al., 1990) и др.
- у сусликов (Ермаков, Формозов, Титов, Сурин)
- У диких козлов (Звычайная)
- У рыжих и красных полевок (Потапов и др., Абрамсон и др.)
- У пятнистого и благородного оленей
Возможная интерпретация:
• Межвидовая гибридизация
• Сохранение предкового генотипа у обоих видов
•
При интерпретации необходимо учитывать экологические и этологические
особенности видов и дополнительно использовать маркеры ядерной ДНК
Межвидовая гибридизация в формировании генофондов куньих
У лесной куницы (Martes martes), соболя (M. zibellina) и кидаса на Урале
выявлены общие гаплотипы по фрагменту КР и гена цитохрома b мтДНК
Медианная сеть гаплотипов по
гену цитохрома b мтДНК
лесной куницы, соболя и кидаса
(С.Пищулина)
Видовая и индивидуальная идентификация особей
с помощью анализа ДНК (микросателлиты),
выделенной из экскрементов
Уссурийские тигры – индивидуальная
идентификация
Куньи на С.-З. Европейской части России
И на Урале – видовая идентификация
Молекулярная диагностика
заболеваний
- Использование
различных тест-систем для
диагностики инфекций и инвазий с использованием
метода ПЦР;
-Выявление генетической предрасположенности
к заболеваниям.
«Frozen Zoo» - создание криобанков тканей и
клеточных культур разных видов и внутривидовых
таксонов
Изучение генетики региональных группировок горилл в
природе и в зоопарках – сохранение генетически
различных форм и тестирование животных на
принадлежность к различным популяциям
(Зоопарк Сан-Диего, США).
Спасибо за внимание!