На правах рукописи Катаев Александр Станиславович АНАЛИЗ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО СОСТАВА ПРЕПАРАТА
реклама
На правах рукописи Катаев Александр Станиславович АНАЛИЗ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО СОСТАВА ПРЕПАРАТА ЦЕРЕБРОЛИЗИН И ЕГО ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ЭЛЕМЕНТНЫЙ ГОМЕОСТАЗ МОЗГА КРЫС ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ВВЕДЕНИЯ 14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2009 Работа выполнена в Государственного образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Громова Ольга Алексеевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович Арзамасцев Евгений Вениаминович Ведущая организация – Государственное учреждение Научноисследовательский институт фармакологии Российской академии медицинских наук Защита диссертации состоится «12» октября 2009 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при Российском государственном медицинском университете (адрес: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета (адрес: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1) Автореферат разослан «18» августа 2009 г. Учёный секретарь диссертационного совета Д.м.н., профессор 4 П.Х .Джанашия ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность Чрезвычайно высокая распространенность цереброваскулярной патологии, инсульта по всему миру и, в частности, в России, привлекает значительный интерес к поискам препаратов, защищающим нейроны от воздействия ишемии. Нейропротективные и нейротрофические препараты открыли новые пути в увеличении потенциала выживаемости и реабилитации даже для тех больных, кто поступал позже трехчасового критического окна от начала цереброваскулярного инцидента (Скворцова В.И. с соавт., 2008, Яхно Н.Н. с соавт., 2008; Гусев Е.И. с соавт., 2009, Максимова М.И. с соавт., 2009). В неврологической практике, наряду с синтетическими нейропротекторами, применяются лекарства, полученные из природного сырья растительного или животного происхождения. Наиболее известны и широко используемы цитофлавин и билобил (производимые из растительных биофлавоноидов); актовегин и кортексин (полученные, соответственно, из коры головного мозга телят и свиней) и церебролизин, производимый на основе экстракта коры головного мозга свиней до шестимесячного возраста. Церебролизин - наиболее известный и широко используемый препарат природного происхождения, обладающий нейропротекторными, антиоксидантными и нейротрофическими эффектами. Так как препарат практически целиком состоит из низкомолекулярных фракций, он относительно легко преодолевает гематоэнцефалический барьер и доходит непосредственно до нервных клеток. В этом заключается отличие церебролизина от экспериментального использования факторов роста нервов таких как NGF (англ. “nerve growth factor”, фактор роста нервов), BDNF (англ. “brain derived nerve factor”, фактор роста нейронов мозга) и др. (Fumagalli F, 2008), крупные молекулы которых не могут преодолеть гематоэнцефалический барьер (Sugrra Y. et al., 1993) и, как следствие, обладают крайне ограниченным терапевтическим потенциалом. В тоже время, высокотехнологичный и щадящий процесс производства церебролизина предохраняет нейротрофические свойства экстракта от деградации (Windisch M. et al., 1993; Satou T. et al., 2000). Однако, несмотря на значительное количество клинических исследований, подверждающих нейротрофическую и нейропротекторную активности церебролизина, отдельные механизмы его действия не были известны. Ситуация значительно изменилась лишь в последние годы, когда появились новые данные указывающие на влияния церебролизина на антиоксидантный эффект, нейротрофическую активность, гомеостаз микроэлементов, антиапоптотический эффект, увеличение уровня белка МАР2, нормализацию обмена нейротрансмиттеров (Sugrra Y. et al., 1993; Tatebayashi Y., 2000; Громова О.А., Панасенко О.И. 2001). 5 Несмотря на значительный прогресс в понимании физиологических эффектов церебролизина, существует ряд насущных вопросов касающихся реального состава препарата и наиболее эффективного способа его введения: 1. Изучение состава олигопептидов в препарате; 2. Тестирование препарата на остаточные фракции липидов и жирных кислот; 3. Влияние на уровни металлотионеинов; 4. Выбор наиболее рационального способа введения препарата в целях получения максимального эффекта его действия. Таким образом, дальнейшее углубленное изучение состава и фармакологических свойств препарата церебролизин является актуальной исследовательской проблемой, решение которой позволит значительно глубже понять механизм действия препарата и расширить область его применения. Цель работы Выделить из состава церебролизина пептидные и липидные фракции, идентифицировать их компоненты, изучить влияние препарата на элементный состав и уровни металлотионеинов головного мозга крыс при различных путях введения. Основные задачи исследования 1. Выделить пептидную фракцию церебролизина; 2. Определить молекулярные массы пептидов, выделенных из церебролизина; 3. Провести сиквенирование выделенных из церебролизина пептидов, идентифицировать их по библиотекам белков; 4. Произвести экстракцию фракций фосфолипидов и жирных кислот церебролизина и определить фосфолипидный и жирнокислотный состав препарата; 5. Изучить влияние церебролизина на элементный состав головного мозга у крыс. 6. Изучить эффективность различных способов введения препарата церебролизин. 7. Изучить влияние церебролизина на уровни экспрессии иРНК металлотионеинов 1 и 2 в головном мозге крыс. Научная новизна Получены новые сведения о молекулярных массах пептидов церебролизина и определены аминокислотные последовательности основных пептидов. Впервые получены данные о липидном составе препарата церебролизин. Изучено влияние препарата церебролизин на элементный состав головного мозга крыс в зависимости от способа его введения. Показана эффективность интраназального введения церебролизина. Установлено, что церебролизин стимулирует экспрессию иРНК металлотионеинов. 6 Практическая ценность работы В значительной мере дополнены сведения о пептидном, липидном и жирнокислотном составе церебролизина. Доказана способность церебролизина эффективно влиять на элементный состав головного мозга крыс при интраназальном и внутрибрюшинном способах введения. Установлено, что интраназальное введение церебролизина приводит к более высокому нейропротективному воздействию при экспериментальной хронической ишемии мозга у крыс. Положения выносимые на защиту 1. Церебролизин состоит из пептидов, масса которых не превышает 10000 Да, что обусловливает высокую проницаемость препарата через ГЭБ. 2. Установлено, что церебролизин содержит биологически активные пептиды глутатион, тиролиберин и энкефалин-подобные пептиды. 3. Установлено наличие в препарате жирных кислот с концентрациями не более 50 мкг/мл. 4. В составе церебролизина имеются несколько классов фосфолипидов с концентрациями порядка 100 мкг/л. 5. Церебролизин способствует накоплению микроэлементов в определенных структурах головного мозга крыс. 6. Интенсивность накопления микроэлементов зависит от метода введения церебролизина. 7. Применение церебролизина, на модели экспериментальной ишемии хронической мозга у крыс, увеличивает экспрессию иРНК металлотионеинов 1 и 2 в 16.2 и 16.5 раз, соответственно, что в 2.1 и 2.3 раза выше по сравнению с группой контроля. Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на научнопрактических конференциях ГОУ ВПО ИвГМА Росздрава (Иваново, 20062008), межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Иваново, 2006). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками, содержит 14 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы, включающей 56 отечественных и 89 зарубежных источников. 7 ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ (в т. ч., две работы в журналах рекомендованных ВАК и три статьи в международных журналах). Материалы диссертации доложены на научнопрактических конференциях «Рациональная фармакотерапия в педиатрии», Москва, 2003; конгресс педиаторов России, Москва, 2005; международном конгрессе «Профессия и здоровье», Москва, 2005, V международном научнопрактическом конгрессе «Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация», Москва, 2006; симпозиумах в рамках XI, XII, XIIIV Российских национальных конгрессов «Человек и лекарство», Москва, 2004, 2005, 2006, 2007; 5 Российском конгрессе неврологов, Ярославль, 2006; на Национальном конгрессе неврологов Украины «Инсульт», Киев, 2006; Научно-практической конференции кардиологов, терапевтов и неврологов Украины, Судак, 2007; а также на научно-практических конференциях ИвГМА и ИвГУ, научных обществах фармакологов и клинических фармакологов, физиологов и патофизиологов 2006-2009. Основные теоритические положения диссертации используются на лекциях и семинарах, проводимых на кафедре фармакологии и клинической фармакологии ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развытию» для студентов и аспирантов кафедры. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные. Работа выполнена на 123 беспородных взрослых белых крысах-самцах массой 240-300 г, полученных из питомника «Белый мох» Московской области. Группы животных были распределены по видам исследования и содержались в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP) и приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Обследуемые крысы были разделены на группы, представленные в табл.1. Таблица 1 Распределение крыс по экспериментальным группам в зависимости от сочетания и режимов введения препаратов. Группа Доза и путь назначения церебролизина Доза и путь назначения другого агента 1 - - 10 суток 2 - дH2O, 3 мл/г, и/н, 1 раз в сут 10 суток 8 Длительность курса 3 - 0.12 М ZnSO4, 3 мл/г, и/н, 1 раз в сут 10 суток 4 3 мл/г, в/б, 1 раз в сут. - 10 суток 5 3 мл/г, и/н, 1 раз в сут. 0.12 М ZnSO4, л/г, и/н, 1 раз в сут 10 суток, одновременный курс 0.12 М ZnSO4, л/г, и/н, 1 раз в сут Последовательныйку рс ZnSO4 10 сутс последующим затем церебролизина -10 сут 6 3 мл/г, и/н, 1 раз в сут. Примечание: в/б – внутрибрюшинный способ введения препарата: и/н – интраназальный способ введения препарата. Методы исследования неврологического статуса. У всех животных проводили оценку неврологического дефицита, двигательной активности и мышечной силы. Оценку двигательных нарушений - по шкале Combs и D’Alecy (1987), а оценку исследовательского поведения - в тесте «норковый рефлекс». Оценка мышечной силы животных осуществлялась на основе теста подвешивания на горизонтальной проволоке. Спонтанная исследовательская активность была исследована посредством т.н. «доски с отверстиями» устройства для изучения спонтанной исследовательской деятельности мелких лабораторных животных в незнакомом пространстве (Boissier J.R. et al, 1964). Определение содержания микроэлементов в мозге у крыс. В условиях обезболивания из полости черепа животных извлекался головной мозг для определения содержания в нем МЭ по методике Буреш Я. с соавт. (1991). Брались образцы тканей мозга из пяти областей: лобной, височной, теменной долей, мозжечка, промежуточного мозга и обонятельной луковицы. Образцы приготовлялись для микроволновой системы подготовки проб MD2000 фирмы CEM (США) в соответствии со стандартным протоколом для данной системы. Полученные растворы анализировались на массспектрометре с ионизацией в индуктивно-связанной плазме «VG Plasma Quad PQ2 Turbo» (Англия). Этот метод признан наиболее точным и производительным. Он даёт возможность анализировать количественно почти все элементы, отражённые в таблице Д.И. Менделеева даже в следовых количествах. Экспериментальное моделирование ишемии головного мозга. Ишемическое состояние головного мозга крыс достигалось посредством одномоментной двухсторонней окклюзии общих сонных артерий. Данный метод является наиболее простым способом моделирования ишемического повреждения ткани головного мозга у лабораторных животных. Метод широко используется в отечественных и зарубежных лабораториях. К 9 достоинствам данного метода можно отнести несомненную простоту выполнения (Багметов М.Н., 2006). Хотя нельзя назвать эту модель глобальной ишемией мозга, при которой величина снижения мозгового кровотока должна быть в пределах 1-3% (Р.С. Мирзоян с соавт., 2005; Lipton P., 1999), избранная модель ишемии головного мозга позволяет оценить начальные дегенеративные изменения в ткани органа. Определение пептидной фракции церебролизина. Для выделения и последующей очистки препарата от мембранной фракции и фосфолипидов использовался модифицированный метод Брокерхоффа-Даусона-Хюбшера – мягкое щелочное дезацилирование фосфолипидов (Кейтс М., 1975). Далее проводили обессоливание пептидов на мини-колонке при помощи центрифугирования (Дарбре А., 1989). Затем, проводили хромотографическое разделение компонентов церебролизин-2 на высокоэффективном жидкостном хромотографе Agilent 1100. Молекулярную массу пептидов и белков определяли методом MALDI-TOF (масс-спектрометр Bruker Reflex IV, 2002). Определение N-концевой аминокислотной последовательности проводили на приборе Protein/Peptide Sequencer (модель 477А, фирма «Applied Biosystems», США). Исследование уровней металлотионеинов. Общую РНК, обогащенную иРНК, выделяли из ткани коры крыс одноэтапным методом (Chan, 1989) с помощью готовых для использования реагентов (RNA STAT60, Tel Test B, Friendswood TX, USA), включавших фенол и гуанидин тиоцианат в монофазном растворе. Методику RT-PCR в реальном масштабе времени проводили по известной методике (Dixon, 2002) с помощью GeneAmp 5700 термосайклера (Applied Biosystems, USA) в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР реакции проводили в трех повторах в 96луночном планшете. Пороговую флюоресценцию во всех случаях определяли исходя из средней флюоресценции от всех образцов для циклов 3-15. Статистическая обработка результатов. В работе использовались методы статистической обработки из пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. В основном, методы непараметрической статистики для сравнения нескольких независимых групп: непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с последующим попарным сравнением групп по критерию Манна-Уитни, для зависимых групп; критерий Вилкоксона, для сравнения долей; критерий кси-квадрат для оценки связи двух показателей; критерий ранговой корреляции Спирмана. Для контроля результатов применялись аналогичные параметрические критерии – Стьюдента, Пирсона, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующей проверкой различия средних по критериям Шеффе и Дункана. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Определение неврологического статуса экспериментальных животных. При моделировании двухсторонней хронической окклюзии общих сонных артерий у всех животных отмечались определенные 10 изменения со стороны их неврологического статуса. У 3 крыс (7%) после перевязки артерий наступил летальный исход, 7 животных впали в коматозное состояние (17%), из них 1 животное погибло. Все 6 животных, находящихся в коме, вышли из этого состояния через 3-5 суток. У остальных крыс (76%) наблюдались неврологические изменения которые фиксировались на основе шкалы МсGrow. После введения церебролизина проводилось наблюдение за животными с позиции выявления динамики их неврологического статуса, оценки двигательной активности, мышечной силы и исследовательского поведения. На 30 сутки у 31 крысы (~74%) отмечалась положительная динамика в отношении неврологического статуса. У животных в группах после лечения церебролизином была отмечена активизация движений, уменьшение птоза и полуптоза и пареза конечностей. Очень заметно изменилась исследовательская активность животных после возникновения ишемического состояния головного мозга. До создания ишемии, все животные проявляли исследовательскую активность, которая после создания окклюзии сохранилась только у 8 (19%) животных. В течение 1 месяца терапии этот показатель у животных постепенно увеличивался и на 30 сутки был свойственен 23 животным (60,53%). Проведение описанных тестов на 37 сутки эксперимента не дали какихлибо координальных изменений показателей, что свидетельствует, как можно предполагать, о том, что эффективность действия церебролизина максимально проявляется в 1 месяц. Пептидная фракция церебролизина. В основе выполнения этого фрагмента работы был метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Возможности этого метода впервые позволили выявить трехмерное хроматографическое распределение компонентов церебролизина (Рис.1). 11 Рис.1 Трехмерный спектр компонентов церебролизина (FPF-1070) фирмы «EBEVE» Австрия), на базе ВЭЖХ с использованием FLD детектора. Разделение препарата свидетельствует о том, что церебролизин-2 содержит три группы соединений, которые условно можно обозначить как гидрофильные (время удержания (RT)<5 минут), нейтральные (RT от 5 до 20 минут) и липофильные (RT>20 минут). Молекулярная масса пептидов церебролизина. Метод MALDI-TOF не позволяет определить количественное содержание пептидов. Однако, просматривается определенная закономерность: с увеличением номера фракции, растут молекулярные массы пептидов. По данным MALDI-TOF, церебролизин содержит множество различных типов пептидов. Анализ спектров молекулярных весов изученных образцов препарата свидетельствует об очень сложном многокомпонентном его составе. Подавляющее большинство пептидов имели молекулярную массу менее 7000 Да (Рис.2) 2000 12 10 4000 6000 2536.7+H 1485.0+H 1297.4+H 1070.4+H 4829.8+H Data Av erage 5393.4+H 5804.4+H 8 6 2000 2000 4000 4000 6000 6000 Рис.2 Верхний и средний спектры пептидной части препарата церебролизин-2 Сигналов выше 10 000 Да не обнаружено. При анализе кривой в целом можно сказать, что максимально устойчивые сигналы церебролизин дает в районе до 5000 Да. Менее устойчивые сигналы - в диапазоне 5000-7000 Да. Таким образом, проведенный анализ достоверно подтверждает наличие в церебролизине в основном легких пептидов с массой 2000-5000 Да (2552.3, 4215.5 и т.д.). Сиквенс выделенных фракций пептидов. Исследования показали, что в очищенном церебролизине присутствуют более 100 олигопептидов и мотивов белков с массой в основном до 6000-7000 дальтон. При дальнейшем изучении состава препарата вновь была произведена еще более активная суперочистка и сгущение образцов для повторного сиквенса. Это позволило провести аккумуляцию основных пептидных пиков по молекулярным весам малыми шагами и установить наличие определенных пептидов. Основным результатом данной части исследования явилось нахождение в составе 12 препарата следующих пептидов: тиролиберина (Glu-His-Pro), глутатиона (Gly-Cys-Glu), а также повторяющихся характерных сочетаний аминокислот (мотивов) коллагена (Gly-Pro-Hyp) и энкефалино-подобного пептида (TyrGly-Gly-Phe). В церебролизине идентифицирован трипептид тиролиберин с последовательностью аминокислот Glu-His-Pro, антагонист опиоидной активности. Основная функция олигопептида как антагониста опиоидной активности ― усиление выделения тиротропина передней долей гипофиза, а также стимуляция ростового гормона, кортикотропина (Гомазков О.А., 2001, Одинак М.М., Цыган Н.В., 2005; Monga V, 2008). Из церебролизина выделен трипептид глутатион (аминокислотная последовательность Gly-Cys-Glu), который является одним из самых сильных биологических антиоксидантом. Глутатион – широко распространенный олигопептид организма человека, присутствет во всех тканевых образованиях, в надпочечниках, эритроцитах, цереброспинальной жидкости, мозге, хрусталике глаза. Наиболее важная функция – участие в окислительно-восстановительных реакциях; используется как восстановителя. Одна из важнейших функция глутатиона в организме – поддержка ключевых белков организма и аскорбиновой кислоты в восстановленном состоянии. Выделенный пептидный мотив энкефалина с последовательностью аминокислот Tyr-Gly-Gly-Phе относится к пептидам с широким диапазоном действия в центральном и периферическом отделах нервной системы. Доказана способность энкефалинов вместе с другими пептидами регулировать болевую чувствительность, мотивацию удовлетворения, адаптационные процессы (Rohliff C., 2001). Энкефалиновый мотив при соединении с лейцином - это лейцин-энкефалин H- Tyr-Gly-Gly-Phе-Leu-OH, при соединении с метионином - метионин- энкефалин H- Tyr-Gly-Gly-PhеMet-OH. Лейцин-энкефалин участвует в регуляции многочисленных соматических функций, в контроле поведенческих реакций (Громова О.А., 2004, Северин Е,С., 2005, Rohliff C., 2001). Оба этих пептида имеют высокое сродство с - и -рецепторами морфинового (опиоидного) типа. Многие пациенты получающие церебролизин, отмечают появление ярких цветных сновидений, косвенно свидетельствующие о воздействии эндорфинов и энкефалинов и их мотивов на кору головного мозга осуществляещееся, наиболее вероятно, через опиоидные рецепторы (Громова, Гупало, Торшин, 2008). Обнаруженный в церебролизине устойчивый коллагено-подобный пептидный мотив Gly-Pro-Hyp может использоваться для реконструкции поврежденных и для синтеза новых опорных коллагеновых и других белков. Жирнокислотный состав церебролизина. При определении жирокислотного состава методом газо-жидкостной хроматографии, позволившей получить хроматограмму церебролизина (рис.3). 13 Рис.3 Хроматограмма церебролизина. В конечном итоге, в церебролизине и в стандарте были определены следующие жирные кислоты: миристоиловая, пальмитионовая, мальмитолеиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, арахидоновая. Их концентрация на единицу объема различна, что отражено в табл. 2. Таблица 2 Жирнокислотный состав церебролизина. Жирные кислоты, идентифицированные в церебролизине и их концентрация при р <0,05. Концентрация, мкг/мл № Описание образца (n=10) 1 20,5+2,14 Миристоиловая кислота (С:14:0) 2 25,0+1,21 Пальмитиновая кислота (С:16:0) 3 5,6+0,76 Пальмитолеиновая кислота (C:16:1) 4 45,0+0,13 Стеариновая кислота (C:18:0) 5 3,5+0,12 Олеиновая кислота (C:18:1) 6 1,5+0,09 Линолевая кислота (С:18:2) 7 1,1+0,06 Арахидоновая кислота (С:20:4) Происхождение жирных кислот может быть обусловлено присутствием фосфолипидов или триглицеридов. Данные количества жирных кислот соответствуют примерно 150 мкг фосфолипидов или примерно 100 мкг триглицеридов в 1 мл препарата или их смеси. Логично предположить, что неиндентифицированные фракции соответствуют триглицеридам. Это предположение косвенно подтверждается данными газовой хроматографии, согласно которым в 1 мл церебролизина, как было определено, может содержаться до 100 мкг триглицеридов. Максимальными значениями в фосфолипидном спектре церебролизина представлена стеариновая, C:18:0 (45,0 мкг/мл) и пальмитиновая кислоты, С:16:0 (25 мкг/мл). В значимых количествах в церебролизине обнаружена миристоиловая кислота (20,5 мкг/мл). Эта кислота участвует в сигнальном 14 взаимодействии: изучается ее влияние на способность к связыванию ионов Са2+ с мембраной дисков сетчатки, где она удлиняет время жизни фотовозбужденного родопсина. Фосфолипидные мицеллы с гидрофобным миристоиловым фрагментом принимают участие в избирательном транспорте белков в мембранах комплекса Гольджи. Линолевая кислота присутствует в церебролизине в небольших количествах (3,5 мкг/мл); она предохраняет от окисления жирорастворимые витамины A, D, E и K, имеет транспортные роли. Содержание фосфолипидов в церебролизине. Проведенное исследование показало, что в церебролизине при растворении его в ~0.6 мL фосфатном буфере содержится 12 мкМ фосфора в виде веществ, экстрагирующихся из препарата смесью метанол-хлороформ (1/2), что соответствует ~9,4 мкг фосфолипидов. Фосфолипидный состав церебролизина, изученный методом тонкослойной хроматографии показал, что в экстракте из препарата церебролизин достоверно идентифицируются мозгоспецифичные фосфолипиды, относящиеся, в том числе, и к сфингомиелинанам: диацилфосфоэтаноламины (фосфатидилэтаноламины, кефалины), диацилфосфосерин (фосфатидилсерин, фосфосерин). Имеются следовые количества тристеарат глицерина, а также ряд неиндентифицированных фракций. Исходя из интенсивности окрашивания, суммарное количество вещества, экстрагировавшегося из 1 мл образца и разделившегося на тонкослойной хроматографии, соответствует ~110 мкг фосфолипидов, но анализ фосфора в экстракте препарата выявил ~9,4 мкг фосфолипидов. В использованной системе растворителей, триглицериды с различным жирнокислотным составом, как в тестовых системах, так и в церебролизине, распределились по всей пластине (тристеарат глицерина – внизу, триолеат глицерина–наверху (рис.4). Рис. 4 Тонкослойная хроматография экстракта из 1 мл церебролизина. 15 Было определено, что церебролизин содержит следующие классы фосфолипидов: диацилфосфоэтаноламин, диацилфосфосерин, а также тристеарат глицерина. Концентрация фосфолипидов составляет ~10 мкг/мл. Можно предположить, что неиндентифицированные фракции соответствуют триглицеридам. Это предположение косвенно подтверждается данными газовой хроматографии, согласно которым в 1 мл церебролизина может содержаться до 100 мкг триглицеридов. По полученным данным, их содержание в исследуемом аппарате достоверно соответствует 97 мкг/мл триглицеридов. Исследования позволили установить присутствие в препарате фосфолипидов и, предположительно, ганглиозидов. Ганглиозиды широко представлены в плазматической мембране нейронов и максимально концентрируются в области синапсов, обеспечивая синаптическую пластичность. Протективная роль церебролизина: микроэлементы. Изучение эффектов церебролизина осуществлялось на основе неврологического тестирования, влияния препарата на содержание микроэлементов и уровни экспрессии иРНК металлотионеинов 1 и 2 в головном мозге крыс при введении препарата в условиях очаговой ишемии головного мозга. Влияние церебролизина на МЭ состав головного мозга животных изучался при интраназальном и внутрибрюшинном введении препарата. Исследование позволило отметить интересный феномен аккумуляции цинка в обонятельных луковицах, гипоталамусе и лобной коре у крыс получавших церебролизин, особенно при интраназальном введении. Интраназальное введение сульфата цинка привело к накоплению цинка в обонятельной луковице. Интраназальное назначение 0,12 М раствора цинка сульфата (10 дневный курс) с последующим десятидневным курсом интраназального введения церебролизина приводило к статистически значимому трёхкратному возрастанию количества цинка в лобной коре и гипоталамусе и к 4-кратному увеличению содержания цинка в обонятельной луковице ( Рис.5). * - достоверно значимое различие между показателями (р<0,05) 1200 * 1000 800 600 400 * 200 0 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа Рис. 5 Содержание цинка в обонятельной луковице у крыс. 16 Внутрибрюшинное назначение церебролизина вызывало почти полуторное увеличение содержания цинка в лобной коре и гипоталамусе. Более выраженное накопление цинка при последовательном назначении цинка и церебролизина может определяться стимуляцией цинктранспортных белков в мозге (предположительно, металлотионеинов и/или специфических цинк-транспортеров). Цинк важен для синтеза и внутримолекулярной стабилизации эндорфинов, гипоталамических рилизинг-факторов, нейроактивной субстанции Р, нейропептида Y. Содержание лития в гипоталамусе и обонятельной луковице было достоверно выше у животных, получавших терапию церебролизином (261,6+5,44 мкг/кг - в обонятельной луковице; 1534,2+12,31 мкг/кг – в гипоталамусе). Литий является нейромодулирующим элементом, способствующим выживанию клеток в условиях ишемии. Содержание марганца увеличивалось в 2,5-раза в обонятельной луковице и в 1,2-раза в гипоталамусе. Марганец присутствует в составе пируваткиназы и в рибосомальном синтезе нейроспецифических белков и миелиновых липопротеидных комплексов. Содержание селена увеличивалось в 1,2 раза в коре лобной доли мозга, в 3,8-раза в обонятельной луковице и в 1,8-раза в гипоталамусе. Наблюдаемое увеличение содержания селена в обонятельной луковице, гипоталамусе и лобной коре при назначении церебролизина отражает, вероятно, антиоксидантные и нейропротективные эффекты церебролизина. Микроэлементы чрезвычайно важны и для анти-оксидантного действия церебролиина: Se-цистеин формирует активные центры глутатионпероксидазы и тиоредоксинредуктазы; Zn и Mn металлсодержащие кластеры в супероксиддисмутазы. Таким образом, введение церебролизина в организм подопытных животных увеличивает содержание нейроактивных микроэлементов цинка, лития, марганца и селена в тканях головного мозга. Степень накопления этих микроэлементов в разных отделах мозга зависит от способа введения церебролизина. Наиболее эффективным для накопления микроэлементов в обонятельной луковице являлось интраназальное введение препарата. Установленное в настоящем исследовании избирательное накопление цинка, марганца, селена и лития в различных отделах мозга может выступать важным компонентом фармакодинамики церебролизина. Протективная роль церебролизина: металлотионеины. Применение препарата церебролизин оказывало значительное влияние на уровни экспрессии иРНК металл-транспортных белков металлотионеинов. В коре крыс подвергавшихся хронической ишемии, уровень иРНК МТ-1, определявшихся с помощью количественной полимеразной цепной реакции увеличился в 8 раз, а МТ-2 в 7,8 раз. В то же время, применение церебролизина на той же модели и в тех же условиях увеличило экспрессию иРНК металлотионеинов 1 и 2 в 16.2 и 16.5 раз, соответственно. Металлотионеины представляют собой эффективный метод защиты клеток 17 от АФК и, следовательно, оказывают значительное влияние на выживаемость клеток (Park J.D., 2001; West A.K. et al, 2008). Увеличение уровней металлотионеина оказывает положительное влияние на функционирование головного мозга через замедление кальциевого каскада эксайтотоксичности и элиминации свободных радикалов. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что церебролизин индуцирует экспрессию иРНК МТ-1 и МТ-2, что способствует нейропротекторному действию препарата. ВЫВОДЫ 1. Пептидная фракция церебролизина состоит из пептидов массой до 10000 Да, при этом основная масса пептидов находится в диапазоне 20005000 Да. 2. В пептидной фракции церебролизина идентифицированы мотивы тиролиберина, энкефалина, глутатиона и коллагена. 3. Церебролизин содержит фосфолипиды из класса сфингмомиелинов: фосфотидилсерин и фосфотидилэтаноламин, а также тристеарат глицерина в количестве около 10 мкг/мл, а также триглицериды в количестве около 97 мкг/мл. Определены следующие жирные кислоты: стеариновая (~45,0 мкг/мл), миристоиловая, пальмитиновая (~25,0 мкг/мл), пальмитолеиновая (~5,6 мкг/мл), олеиновая (~3,5 мкг/мл), линолевая (~1,5 мкг/мл) и арахидоновая (~1,1 мкг/мл). 4. Церебролизин способствует значительному накоплению лития в гипоталамусе и, в несколько меньшей степени, в обонятельных луковицах у крыс; умеренному накоплению селена в обонятельных луковицах, гипоталамусе и лобной коре; ведёт к возрастанию содержания цинка и марганца в лобной коре, гипоталамусе и в обонятельных луковицах. 5. Интраназальный способ введения церебролизина приводит к большей, в сравнении с внутрибрюшинным введением, компенсации неврологического дефицита. 6. Применение церебролизина, на модели экспериментальной хронической ишемии мозга у крыс, увеличивает экспрессию иРНК металлотионеинов 1 и 2 в 16.2 и 16.5 раз, соответственно, что в 2.1 и 2.3 раза выше по сравнению с группой контроля. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Основные теоретические положения диссертации могут быть использованы на лекциях и практических занятиях, проводимых на кафедрах фармакологии и клинической фармакологии в государственных образовательных учреждениях высшего профессионального образования. Возможно применение результатов исследования в экпериментальной медицине для разработки средств доставки элементов и пептидов в мозг, а так же для реконструкции поврежденных и синтеза новых опорных коллагеновых и других белков. Кроме того, данные о составе оригинального церебролизина 18 могут применяться для отличия от фальсификата препарата в деятельности Роспотребнадзора, правоохранительных органов и учреждениях судебномедицинской экспертизы. 19 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Kataev A.S., Kudrin A.V., Gromova O.A.. Trace element status of the brain in rats following cerebrolysin administration // Journal of Trace Elements in Biology and Medicine, - 2003, Vol,19, №5, P.43-47. 2. Катаев А.С., Громова О.А., Кудрин А.В., Волков А.Ю.. Изменение микроэлементного гомеостаза в некоторых отделах головного мозга у крыс при назначении препарата Магне В6 // Неврология и психиатрия им. С.С.Корсакова, 2003, - №5, 47-49. 3. Катаев А.С., Громова О.А., Кудрин А.В., Волков А.Ю.. Изменение содержания цинка в головном мозге крыс при интраназальном введении церебролизина // Неврология и психиатрия им. С.С. Корсакова - 2004, №1, С 63-64. 4. Громова О.А., Катаев А.С., Третьяков В.Е., Машковский С.А., Гусев Е.И., Валькова В.А., Никонов А.А., Глибин А.И.. Олигопептидная мембранная фракция церебролизина// Неврология и психиатрия им. С.С. Корсакова - 2006, №3, С 93-98. 5. Sotnikova NY, Gromova, OA, Kataev А.S.. Trace element status of the brain in rats following cerebrolysin administration // Journal of Trace Elements in Biology and Medicine, 2004, Vol.21,N3, P.3-5. 6. Громова О.А., Катаев А.С., Сотникова Н.Ю., Кудрин А.В.. Протективная роль церебролтзин-индуцированной продукции металлотионеинов-1 и -2 в ответ на развитие церебральной очаговой ишемии у крыс // Журнал Цитокины и воспаление, 2005, №1, 47-49. 7. Gromova ОА, Kataev А.S., Sotnikova NYu, Kudrin, A.V.. Аntioxidant properties of cerebrolysin // Rus. J. Of Immunology//2004, №1, Р. 16-19. 8. Громова О.А., Гусев Е.И., Никонов А.А., Катаев А.С.. Витаминная активность препарата церебролизин // Cудинииi захворювання головного мозку, журнал Украiнськоi асоцiацi боротьби з iнсультом, 2006, №3, с. 50-57. 9. Катаев А.С., Громова О.А., Красных Л.П., Гусев Е.И., Никонов А.А.. Витаминный состав церебролизина. // сб. трудов Съезд неврологов Ярославль, 2006, 29 мая- 2 июня. 10. Катаев А.С.. Влияние интраназального введения церебролизина и сульфата цинка на распределение кобальта в головном мозге крыс. // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2006», 2006 г.. 20
