ЭФФЕКТИВНОСТЬ УЗКОПОЛОСНОГО (311 НМ) СРЕДНЕВОЛНОВОГО СПЕКТРА УЛЬТРАФИОЛЕТА В ЛЕЧЕНИИ
реклама
На правах рукописи ГОРЯЧЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭФФЕКТИВНОСТЬ УЗКОПОЛОСНОГО (311 НМ) СРЕДНЕВОЛНОВОГО СПЕКТРА УЛЬТРАФИОЛЕТА В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ (КЛИНИЧЕСКИЙ, ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ И ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ) (14.01.10 – кожные и венерические болезни) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2010 2 Работа выполнена в отделении клинической дерматологии Федерального государственного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи». Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Владимир Алексеевич Самсонов Кандидат медицинских наук, доцент Оксана Рахимовна Катунина Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Юрий Валентинович Сергеев Доктор медицинских наук, профессор Валентина Павловна Быкова Ведущее научное учреждение: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва. Защита диссертации состоится «____» ____________ 2010 года на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 при Федеральном государственном учреждении «Государственный научный центр дерматовенерологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу: 107076, г.Москва, ул.Короленко, д.3, стр.6. С диссертацией можно Росмедтехнологий». ознакомиться в библиотеке ФГУ «ГНЦД Автореферат разослан «____» _____________2010г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Атопический дерматит является одним из наиболее социально значимых дерматозов, что определяется его широким распространением, как в детском возрасте, так и среди трудоспособного населения (им страдает от 5 до 40% населения во всем мире), недостаточной изученностью патогенеза и резистентностью к используемым в настоящее время методам лечения (Самсонов В.А., 1984; Скрипкин Ю.К. и соавт., 1999; Кочергин Н.Г., 2001; Потекаев Н.С. и соавт., 2002; Сергеев Ю.В. и соавт., 2002; Кубанова А.А. и соавт., 2005; Hijnen D.J. et al., 2005; Yoon H. et al., 2007). Большинство отечественных и зарубежных исследователей ведущее место в развитии этого дерматоза отводят иммунным факторам (Leung D.Y.M., 1997; Караулов А.В. и соавт., 2002; Сергеев Ю.В. и соавт., 2002; Clayton T.H. et al., 2007). На это звено патогенеза атопического дерматита и направлены современные методы лечения. Однако длительное применение системных глюкокортикостероидов, иммуносупрессантов, биологических модуляторов иммунного ответа и других средств может вызывать побочные эффекты. В настоящее время широкое применение в лечении атопического дерматита и других дерматозов нашли различные спектры ультрафиолета, в частности, узкополосный с длиной волны 311 нм (Владимиров В.В., 2006; Ferguson J., 2006; Kuhl J.T., 2006; Bhavani Meduri N. et al., 2007; Mutou Y. et al., 2007; Jung E.J. et al., 2008). В литературе продемонстрировано положительное влияние ультрафиолетовых лучей указанного спектра на различные звенья патогенеза атопического дерматита. В нашей стране метод практически не изучался (Богадельникова А.Е. и соавт., 2006; Бакулев А.Л. и соавт., 2007; Амозова И.В. и соавт., 2007). Однако данные об отдаленных результатах лечения в литературе отсутствуют. Согласно современным представлениям, эффекторные иммунокомпетентные клетки формируют воспалительные инфильтраты в очагах поражения, что определяет выраженность клинической картины 4 (Taskapan M.O. et al., 2000; Сергеев Ю.В. и соавт., 2002; Воронина В.Р. и соавт., 2003; Ярилин А.А., 2006). В зарубежной литературе отсутствует единство мнений о доминировании в составе воспалительного инфильтрата кожи больных атопическим дерматитом кожно-ассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+) или Т-лимфоцитов, экспрессирующих кожный лифоцитарный антиген (CLA) (Von Andrian U.H. et al., 2000; Taskapan M.O. et al., 2000; Colantonio L. et al., 2002; Blanca M. et al., 2003; Kupper T.S. et al., 2004). В нашей стране эта проблема не изучалась. Одним из ведущих механизмов поддержания клеточного гомеостаза в организме является апоптоз – генетически детерминированная гибель клеток (Ярилин А.А., 1996; Петрова С.В., 2000; Блохин Д.Ю., 2009). В норме апоптоз определяет баланс жизненно важных процессов, происходящих в различных органах и системах организма, в том числе и в коже (Ashkenazi A., 1998; Петрова С.В., 2000; Дранник Г.Н., 2003; Рукша Т.Г., 2007; Хайрутдинов В.Р. и соавт., 2009). Нам не удалось обнаружить отечественных работ, в которых изменения клеток воспалительного инфильтрата в коже больных атопическим дерматитом под действием узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета изучались бы с позиций апоптоза. Все изложенное определило цель и задачи нашей работы. Цель исследования: Оценить эффективность узкополосной (311 нм) средневолновой ультрафиолетовой терапии больных атопическим дерматитом с учетом клинических и гистологических показателей, провести клинико- иммуноморфологический анализ содержания ключевых эффекторных клеток воспалительного инфильтрата и уровня экспрессии маркеров апоптоза в коже больных атопическим дерматитом под действием узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета. 5 Задачи исследования: 1. Определить эффективность узкополосной (311 нм) фототерапии 44 больных с тяжелым и средне-тяжелым течением атопического дерматита с учетом ближайших и отдаленных сроков наблюдения. 2. Оценить эффективность узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета на основе анализа биоптатов кожи 17 больных атопическим дерматитом до и после лечения с учетом динамики гистологической картины. 3. Определить содержание в коже этих больных до и после лечения количество кожно-ассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+), Т- лимфоцитов с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA+), молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) и маркера пролиферации клеток (Ki-67) иммуноморфологическим методом. Оценить их патогенетическую значимость. 4. Изучить характер изменений экспрессии проапоптотических (Fas, FasL) и антиапоптотических (Bcl-2) рецепторов в коже больных атопическим дерматитом до и после лечения узкополосным (311 нм) спектром ультрафиолета иммуноморфологическим методом. 5. В биоптатах кожи контрольной группы 10 здоровых добровольцев провести следующие исследования: а) определить содержание в коже тучных клеток гистологическим методом; б) иммуноморфологическим методом с применением соответствующих моноклональных антител определить в коже здоровых лиц содержание вышеперечисленных антигенных детерминант: CD45RO, CLA, ICAM-1, Ki67, Fas, FasL, bcl-2. Научная новизна. Установлена высокая терапевтическая эффективность узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета у больных атопическим дерматитом с 6 тяжелым и средне-тяжелым течением с учетом не только ближайших, но и отдаленных сроков наблюдения. Эффективность изучаемого метода лечения доказана на основе положительной динамики гистологической картины, в том числе содержания тучных клеток в очагах поражения, что свидетельствует о противовоспалительном действии изучаемого метода лечения на кожу больных атопическим дерматитом. Иммуногистохимическим методом выявлено преобладание в коже больных кожно-ассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+) над Т- лимфоцитами с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA+). Была также обнаружена субпопуляций значительная пролиферативная Т-лимфоцитов в активность воспалительном указанных инфильтрате дермы. Показана значимость изучаемых показателей в развитии иммунного воспаления при атопическом дерматите и возможность их использования в качестве объективного критерия эффективности проводимого лечения. При иммуногистохимическом исследовании экспрессии про- (Fas, FasL) и антиапоптотических (Bcl-2) рецепторов в коже больных выявлено значительное снижение апоптоза. При этом установлена прямая корреляционная связь между высоким содержанием кожно-ассоциированных Т-лимфоцитов в дерме и повышенной антиапоптотической активностью этих клеток. Установленный факт указывает на тесную взаимосвязь иммунного воспаления и системы апоптоза в коже больных атопическим дерматитом. Практическая значимость. На основании анализа ближайших и отдаленных результатов узкополосной (311 нм) средневолновой ультрафиолетовой терапии 44 больных атопическим дерматитом установлена высокая эффективность этого метода в лечении пациентов с тяжелым и средне-тяжелым течением дерматоза. Полученный более выраженный клинический результат при 7 увеличении общей курсовой дозы облучения позволяет рекомендовать проведение более продолжительных курсов фототерапии указанного спектра. Установленная взаимосвязь иммунного воспаления и апоптоза клеток воспалительного инфильтрата в коже больных атопическим дерматитом может быть аргументом в пользу проведения предварительного тестирования больных на предмет выявления генов, ответственных за чувствительность или резистентность к ультрафиолету или использования комбинированного лечения, включающего узкополосную (311 нм) фототерапию и биологические модуляторы иммунного ответа, направленно ингибирующие антиапоптотическую активность или индуцирующие апоптоз в коже больных атопическим дерматитом. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Высокая терапевтическая эффективность узкополосной (311 нм) средневолновой ультрафиолетовой терапии больных с тяжелым и средне-тяжелым течением атопического дерматита подтверждена ближайшими и отдаленными результатами клинических исследований. 2. Узкополосная (311 нм) фототерапия приводит к нормализации гистологической картины в коже больных атопическим дерматитом, включая содержание тучных клеток, что свидетельствует о её противовоспалительном действии. 3. Количество кожно-ассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+) достоверно выше количества Т-лимфоцитов с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA+). Указанные субпопуляции Тлимфоцитов участвуют в формировании клеточного инфильтрата кожи, что определяет выраженность клинической симптоматики атопического дерматита. 4. Выявленные изменения процесса апоптоза клеток воспалительного инфильтрата и их взаимосвязь с показателями иммунного воспаления 8 в коже больных могут быть аргументом в пользу разработки новых современных средств терапевтической коррекции атопического дерматита, направленно индуцирующих апоптоз. Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в учебном процессе ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», кафедры дерматовенерологии и клинической иммунологии ФУВ ГОУВПО РГМУ Росздрава, в работе физиотерапевтического и лечебно- диагностического отделений клиники кожных и венерических болезней ГОУ ВПО Саратовского ГМУ Росздрава. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научно-практической 21.11.2008г.; конференции Всероссийском ФГУ обществе «ГНЦД Росмедтехнологий» дерматовенерологов им. А.И. Поспелова 15.10.2009г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 147 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы и глав, содержащих изложение материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического указателя. Материалы диссертации иллюстрированы 19 таблицами, 41 рисунками и фотографиями. Указатель литературы включает 260 источников, из них 114 отечественных и 146 зарубежных. 9 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Под наблюдением находилось 44 больных с тяжелым и средне-тяжелым течением атопического дерматита в возрасте от 18 до 48 лет: 18 (40,9%) мужчин и 26 (59,1%) женщин. Всем больным проводилось клинико-лабораторное обследование, включавшее – проведение тщательного изучения данных анамнеза (первые признаки и особенности течения заболевания, провоцирующие факторы, наследственность, заболевания, аллергоанамнез, методы ранее перенесенные проводимой и терапии), сопутствующие динамические исследования общих анализов крови и мочи и биохимических анализов крови, по показаниям – консультации других специалистов. Степень тяжести кожного процесса оценивалась с использованием индекса SCORAD (Severity Scoring of Atopic Dermatitis). Все больные впервые получали фототерапию узкополосного спектра 311 нм. Процедуры ультрафиолетовой терапии проводили на ультрафиолетовой установке «Waldman UV-7001 K», оснащенной 20 лампами F85/W - TL 01 (длина волн 310-315 нм с максимальной эмиссией на длине волны 311 нм). Начальная доза облучения составляла 0,05-0,1 Дж/см2, в последующем дозу увеличивали в зависимости от переносимости каждую процедуру или через процедуру на 0,05-0,1 Дж/см2. Максимальная разовая доза облучения составила 1,6 Дж/см2. Процедуры проводили с режимом 4 раза в неделю. Количество процедур на курс колебалось от 10 до 37. Общая курсовая доза облучения варьировала от 2,85 до 27,85 Дж/см2 (11,8 + 1,05). В зависимости от курсового количества процедур все больные были разделены на 2 подгруппы. Первую подгруппу составили 21 пациент (47,7%), которым проводили не более 19 процедур фототерапии. Во вторую подгруппу были включены 23 пациента (52,3%), получившие на курс от 20 до 37 процедур ультрафиолетовой терапии. Индекс SCORAD до лечения в первой подгруппе был в пределах от 53,6 до 92,9 баллов (74,7 + 2,961), во 10 второй – от 56,4 до 100 баллов (74,9 + 2,553). Общая курсовая доза облучения в первой подгруппе была от 2,85 до 12,1 Дж/см2 (7,1+1,354), во второй - от 7 до 27,85 Дж/см2 (15,1+1,254) (р<0,001). Эффективность терапии оценивали после окончания курса лечения, основываясь на динамике индекса SCORAD. За клиническое выздоровление принимали уменьшение индекса SCORAD более чем на 90%, за значительное улучшение – снижение индекса SCORAD на 70-90%, за улучшение снижение индекса SCORAD на 10-69%, отсутствие эффекта констатировали при динамике индекса SCORAD менее 10%. Отдаленные клинические результаты терапии изучали на протяжении от полутора до четырех лет при повторных визитах больных. На момент осмотра оценивали субъективные жалобы больного (степень выраженности кожного зуда, нарушение сна, связанное с зудом), распространенность и характер кожных высыпаний, особенности течения заболевания после проведенного курса узкополосной (311 нм) фототерапии (частота и продолжительность обострений в год, длительность периодов ремиссии). У 17 пациентов из общей группы было проведено патогистологическое исследование. До начала проведения исследования все больные были информированы и подписали добровольное согласие на медицинское вмешательство. Забор биоптатов кожи осуществляли до и после лечения под местной анестезией 2% раствором лидокаина. Контрольную группу составили 10 здоровых добровольцев, не имеющих клинических признаков заболеваний кожи, у которых также были взяты биоптаты кожи. Обследуемые больные и здоровые лица группы сравнения статистически не отличались по полу и возрасту. Биоптаты подвергали стандартной гистологической обработке, заливали в парафин. Часть парафиновых срезов толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и толуидиновым синим. 11 Изучение содержания и распределения кожно-ассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+), Т-лимфоцитов с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA+), молекул межклеточной адгезии (ICAM-1), маркеров клеточной пролиферации (Ki-67) и апоптоза (Fas, FasL, Bcl-2) в структурах кожи проводилось иммуногистохимическим моноклональных антител к методом соответствующим с использованием антигенам: CLA (BD Biosciences-Pharmingen, США), CD54 (ICAM-1) (Visionbiosystems novocastra, Великобритания), CD45RO, Ki-67, Fas, FasL, Bcl-2 (Novocastra laboratories Ltd, Великобритания). Постановку иммуногистохимической реакции осуществляли на парафиновых срезах согласно протоколам, прилагаемым к используемым антителам. Высокотемпературная антигенная демаскировка проводилась путем кипячения в цитратном буфере (рН – 6,0) в СВЧ-печи при максимальной мощности 900 Вт тремя циклами по 5 минут с 1-минутными перерывами. После остывания препараты промывали в растворе ТРИСбуфера (рН – 7,54-7,58), обрабатывали 0,3% раствором перекиси водорода на метаноле (1:1) для предотвращения эндогенной пероксидазной активности. Для визуализации реакции использовали проявляющую систему Novocastra Peroxidase Detection System («Leica Microsystems», Великобритания). После завершения иммуногистохимической контрастирование биоптатов реакции гематоксилином осуществляли Майера. фоновое Препараты исследовали с помощью светового микроскопа Leica DM4000B (Германия). Подсчет количества тучных клеток в препаратах, окрашенных толуидиновым синим, и клеток с иммунопероксидазной меткой в иммуногистохимических препаратах проводили из расчета на 100 клеток инфильтрата в дерме и на 100 кератиноцитов базального слоя в эпидермисе. Содержание клеток оценивали в 5 полях зрения, затем рассчитывали среднее значение. Экспрессию молекул межклеточной адгезии ICAM-1 (CD54) в эпидермисе выражали в баллах: 0 баллов – отсутствие экспрессии, 1 балл – слабая, 2 балла – умеренная, 3 балла – выраженная экспрессия. Изображение документировали цифровой камерой Leica DFC320 (Германия). 12 Статистический анализ статистического пакета данных поводился с применением (Statsoft, Inc., США). Для анализа Statistica 6.1 признаков в динамике (парных сравнений связанных групп) использовался ранговый знаковый тест Вилкоксона. Сравнение несвязанных групп по количественным признакам проводилось с применением теста Манна-Уитни, по качественным признакам – теста Хи-квадрат. Оценка корреляционных связей выполнялась Спирмена. При на основе проверке коэффициента гипотез различия ранговой считали корреляции статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследований. Ближайшие клинические результаты. После курса лечения с применением узкополосной (311 нм) фототерапии клиническое выздоровление было достигнуто у 10 (22,7%) больных, значительное улучшение – у 16 (36,4%) больных, улучшение – у 15 (34,1%) больных, положительный эффект от лечения отсутствовал у 3 (6,8%) больных. Среднее значение индекса SCORAD снизилось с 74,7+1,897 до 23,8+2,859 баллов (в среднем, на 69,7%; р < 0,001). Изучение клинической эффективности узкополосной (311 нм) фототерапии в подгруппах показало следующие результаты. Клиническое выздоровление и значительное улучшение было достигнуто у 19 (82,6%) больных второй подгруппы, в то время как в первой подгруппе только у 7 (33,3%) пациентов (χ2=7,4; р<0,005). Улучшение наблюдали у 4 (17,4%) больных второй и у 11 (52,4%) больных первой подгруппы (χ2=7,3; р<0,005) (Таблица 1). Среднее значение индекса SCORAD после лечения в первой подгруппе снизилось с 74,7+2,961 до 28,7+4,668 баллов (р<0,005), во второй – с 74,9+2,553 до 19,1+3,336 балов (р<0,001). Динамика индекса SCORAD составила 63,3% и 75,3% соответственно (Таблица 1), следовательно, снижение степени тяжести кожного процесса с учетом индекса SCORAD у 13 больных второй подгруппы было более выражено (75,3%) по сравнению с больными первой подгруппы (63,3%) (р<0,005). Таблица 1. Различия клинической эффективности терапии больных атопическим дерматитом в зависимости от курсовой дозы облучения. Количество процедур на I подгруппа II подгруппа менее 19 20-37 7,1+1,4 Дж/см2 15,1+1,3 Дж/см2 7 (33,3%) больных 19 (82,6%) больных 11 (52,4%) больных 4 (17,4%) больных 63,3% 75,3% курс Общая курсовая доза облучения (m+M) Клиническое выздоровление +значительное улучшение Улучшение Динамика индекса SCORAD В процессе лечения у больных отмечались нежелательные эффекты в виде: умеренной эритемы 8 (18,2%) больных, временного усиления зуда у 10 (22,7%), сухости кожи у 12 (27,3%) больных. Эти явления разрешались после короткого перерыва в лечении (1-3 дня) и последующего уменьшения дозы облучения. Отдаленные клинические результаты. Двадцать восемь больных (63,6%) находились под нашим наблюдением в течение четырех лет. Все пациенты отмечали улучшение течения атопического дерматита, что выражалось в сокращении частоты и продолжительности обострений, удлинении ремиссии. Длительность периодов ремиссии до лечения была в среднем, 2,3+0,9. После курса узкополосной (311 нм) средневолновой ультрафиолетовой терапии продолжительность клинической ремиссии у наблюдавшихся больных увеличилась на 2 и более месяца и, в среднем, составила 6,7+1,087 месяцев 14 (р<0,001). Все больные указывали на улучшение общего самочувствия, уменьшение интенсивности эмоционального проведенного кожного состояния. лечения При зуда, улучшение психо- наступлении обострения после интенсивность и выраженность клинических проявлений заболевания были менее выражены, уменьшилась площадь высыпаний. Ни у одного из этих 28 пациентов клинически, при осмотрах, не было обнаружено ни новообразований кожи, ни ее предраковых изменений. Результаты гистологического исследования. При гистологическом исследовании биоптатов кожи до лечения были выявлены изменения, соответствующие периоду обострения атопического дерматита: акантоз, ортокератотический гиперкератоз, спонгиотические очаги в шиповатом слое эпидермиса, просветы сосудов дермы были несколько расширены, преимущественно вокруг сосудов сосочкового слоя присутствовали полиморфноклеточные инфильтраты из лимфоцитов, гистиоцитов, единичных эозинофилов и тканевых базофилов. Среднее количество тучных клеток в препаратах, окрашенных толуидиновым синим, до лечения составило 9,7+0,7 на 100 клеток инфильтрата, что было достоверно выше, чем в группе здоровых лиц: 2,4+0,1 (р<0,001). Из них дегранулированные тучные клетки определялись в количестве 2,2+0,3, тучных клеток без признаков дегрануляции было 7,6+0,6 на 100 клеток инфильтрата. После окончания курса узкополосной (311 ультрафиолетовой терапии наблюдалась положительная морфологических изменений: толщина нм) эпидермиса средневолновой динамика значительно уменьшилась, у отдельных пациентов с неполным регрессом высыпаний сохранялся умеренный акантоз, в сосочковом слое дермы выявлялись скудные гистио-лимфоцитарные инфильтраты. Эндотелий сосудов дермы был менее отечен, просветы капилляров не расширены. Среднее количество тучных клеток в коже больных после фототерапии достоверно снизилось до 7,5+0,6; р<0,01. Количество дегранулированных тучных клеток составило 15 2,3+0,3, количество клеток без признаков дегрануляции 5,2+0,6. Статистический анализ динамики содержания дегранулированных тучных клеток после узкополосной (311 нм) фототерапии не выявил статистически достоверных различий с исходными показателями (р>0,1). Нами было проведено исследование с целью выявления возможного повреждающего действия узкополосной (311 нм) фототерапии на клеточные структуры эпидермиса и дермы. Ни в одном из изучаемых биоптатов кожи, взятых у больных атопическим дерматитом после окончания курса фототерапии, признаков деструктивного действия узкополосного спектра ультрафиолета на кожу больных атопическим дерматитом обнаружено не было. Результаты иммуногистохимического исследования. Изменение количества иммунокомпетентных клеток в очагах поражения больных атопическим дерматитом. У больных атопическим дерматитом до начала лечения кожно-ассоциированные Т-клетки памяти (CD45RO+) и Т-лимфоциты с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA) преобладали в составе периваскулярных инфильтратов. Количество кожноассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+) составило 66,7+4,2, активированных Т-лимфоцитов с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA) было 19,3+1,4 на 100 клеток инфильтрата. В эпидермисе обнаруживались лишь единичные клетки в базальном слое, количество CD45RO+ было 0,3+0,06, CLA+ 4,3+1,2 клеток на 100 кератиноцитов базального слоя (Таблица 2). Суммарное (эпидермис+дерма) содержание в коже больных атопическим дерматитом до лечения кожно-ассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+) составило 66,9+4,2, Т-лимфоцитов с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA) - 23,6+2,3 клеток, что более чем в 6 и 5 раз соответственно превосходит аналогичные показатели в коже здоровых (p<0,001). При этом количество CD45RO+Т-лимфоцитов в коже больных более чем 1,5 раза превосходит количество CLA+Т-лимфоцитов. Проведенный сравнительный 16 анализ показал, что количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор хоминга в кожу (CLA) составляло всего 30% от общего числа кожноассоциированных Т-лимфоцитов. Таблица 2. Содержание популяций клеток в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев и больных атопическим дерматитом, получавших курс узкополосной (311 нм) фототерапии, (M+m). Больные Больные АтД до АтД после добро- лечения лечения вольцы (n = 15), (n = 15), (n = 10), клетки клетки Популяци Здоровые и клеток p p1 p2 клетки Эпидермис CD45RO 0 0,28+0,06 0,04+ 0,03 <0,001 <0,001 <0,01 CLA 0,14+0,09 4,3+1,2 2,4+0,5 <0,001 <0,01 <0,001 Ki-67 6,1+0,55 53,0+7,6 26,2+4,7 <0,001 <0,01 <0,001 Периваскулярные инфильтраты дермы CD45RO 10,8+0,4 66,7+4,2 40,5+3,4 <0,001 <0,001 <0,001 CLA 4,52+ 0,35 19,3+1,4 14,3+1,3 <0,001 <0,01 <0,001 Ki-67 0,68+0,21 13,6+2,8 9,7+2,3 <0,001 <0,05 <0,001 Примечание. p – уровень статистической значимости при сравнении изучаемых показателей у здоровых и больных атопическим дерматитом до лечения; p1 – уровень статистической значимости при сравнении показателей у больных атопическим дерматитом до и после лечения; p2 - уровень статистической значимости при сравнении изучаемых показателей у здоровых и больных атопическим дерматитом после лечения. Экспрессия молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) как в эпидермисе, так и в дерме здоровых либо отсутствовала, либо была слабо выражена и 17 составила от 0 до 1 балла. В дерме обнаруживались единичные ICAM1+клетки. У 8 больных атопическим дерматитом до начала лечения отмечалась слабая (1 балл), у 7 - умеренная (2 балла) экспрессия молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) в эпидермисе. Основная часть окрашенных ICAM-1 клеток располагалась в периваскулярных инфильтратах дермы. Количество позитивных ICAM-1-клеток в дерме до лечения составило 11,8+0,8. Уровень экспрессии маркера клеточной пролиферации (Ki-67) коже больных в период обострения был высоким, как в эпидермисе, так и дерме, и значительно преобладал, по сравнению с кожей здоровых: в эпидермисе 53,0+7,6 клеток, в дерме 13,6+2,8 клеток (p<0,001). При этом отмечалась прямая корреляционная зависимость между экспрессией рецепторов пролиферации клеток (Ki-67) и содержанием в коже кожно-ассоциированных Т-лимфоцитов (CD45RO+ и CLA+) (коэффициент корреляции (r) между Ki67+ и CD45RO+клетками составил 0,5, между Ki-67+ и CLA+ клетками – 0,7). Выявленное в работе иммуноморфологическим методом превалирование в коже больных атопическим дерматитом кожно-ассоциированных Тлимфоцитов (CD45RO+) над Т-лимфоцитами, экспрессирующими рецептор хоминга в кожу (CLA), а также наличие пролиферирующих форм Тлимфоцитов, может быть использовано для проведения селективной, дополнительной к основному лечению, терапевтической коррекции указанных изменений. После лечения с применением узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета нами было выявлено достоверное снижение всех исследуемых показателей в обоих компартментах кожи (Таблица 2), что свидетельствует об их патогенетической значимости при атопическом дерматите. Однако остающиеся после лечения сравнительно высокие уровни экспрессии изучаемых в работе антигенных детерминант, несмотря на выраженный терапевтический эффект, по-видимому, указывают на необходимость 18 проведения более продолжительных курсов узкополосной (311 нм) фототерапии. Состояние апоптоза клеток воспалительного инфильтрата кожи больных атопическим дермаитом. При иммуногистохимическом анализе кожи больных атопическим дерматитом до лечения было выявлено, что проапоптогенные маркеры (Fas и FasL) в эпидермисе не обнаруживались, а в дерме содержание Fas+клеток составило 3,7+1,2, FasL+ - 9,8+1,7 клеток, что было достоверно выше, чем в коже здоровых (p<0,01; p<0,001 соответственно). Антиапоптогенный маркер (Bcl-2) в большом количестве выявлялся как в эпидермисе, так и в дерме больных. Содержание Bcl-2 в эпидермисе составило 7,8+0,7 клеток, в дерме – 32,5+2,5 клеток (p<0,001) (Таблица 3). Иммуногистохимическое исследование кожи здоровых добровольцев показало преобладание уровня экспрессии маркеров апоптоза (Fas, FasL, Bcl2) в ее дермальной части, в эпидермисе обнаруживались лишь единичные окрашенные клетки: количество клеток с проапоптогенными маркерами (Fas и FasL) в эпидермисе составило 0,12+0,005 и 0,36+0,008, в дерме 0,9+0,08 и 2,4+0,02 клеток соответственно; окрашенные клетки, несущие антиапоптогенный маркер (Bcl-2) в эпидермисе здоровых отсутствовали, а дерме их количество составило 2,3+0,45 клеток (Таблица 3). Выявленный в коже больных высокий уровень экспрессии маркера антиапоптогенной активности клеток (Bcl-2), превосходящий уровень экспрессии маркера проапоптогенной активности (Fas) в 9 раз, указывает на смещение равновесия в системе программируемой клеточной гибели в сторону подавления апоптоза. При этом была выявлена прямая корреляционная связь между антиапоптогенным маркером Bcl-2 и кожноассоциированными Т-лимфоцитами (CD45RO+) (r=0,7). Установленный факт указывает на тесную взаимосвязь показателей иммунного воспаления и апоптоза. 19 Таблица 3. Экспрессия маркеров апоптоза в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев и больных атопическим дерматитом, получавших курс узкополосной (311 нм) фототерапии, (M+m). Здоровые Больные Больные Популяци добро- АтД до АтД после и клеток вольцы лечения лечения (n = 10), (n = 15), (n = 15), клетки клетки клетки p p1 p2 Эпидермис Fas 0,12+0,005 0 0 <0,001 <0,01 <0,001 FasL 0,36+0,008 0 0 <0,001 - <0,001 Bcl-2 0 7,8+0,7 6,7+0,6 <0,001 >0,1 <0,001 Периваскулярные инфильтраты дермы Fas 0,9+0,08 3,7+1,2 1,7+0,5 <0,01 >0,05 <0,001 FasL 2,4+0,02 9,8+1,7 8,0+1,3 <0,001 >0,1 <0,01 Bcl-2 2,3+0,45 32,5+2,5 28,6+4,6 <0,001 >0,05 <0,001 Примечание. p – уровень статистической значимости при сравнении изучаемых показателей у здоровых и больных атопическим дерматитом до лечения; p1 – уровень статистической значимости при сравнении показателей у больных атопическим дерматитом до и после лечения; p2 - уровень статистической значимости при сравнении изучаемых показателей у здоровых и больных атопическим дерматитом после лечения. Статистический анализ динамики маркеров апоптоза в коже больных атопическим дерматитом после лечения не выявил достоверных различий показателей. Проапоптогенные маркеры (Fas и FasL) в эпидермисе отсутствовали, количество Fas+клеток в дерме составило 1,7+0,5 (р>0,05), FasL – 8,0+1,3 (р>0,1). Содержание антиапоптогенных маркеров (Bcl-2) 20 недостоверно снизилось в эпидермисе до 6,7+0,6 клеток (р>0,1), в дерме – до 28,6+4,6 клеток (р>0,05) (Таблица 3). Данное обстоятельство может указывать на отсутствие явного проапоптогенного, индуцирующего апоптоз, действия узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета на кожу больных атопическим дерматитом. Таким образом, с учетом не только ближайших, но и отдаленных результатов, установлена высокая эффективность узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета в лечении больных, как с тяжелым, так и среднетяжелым течением атопического дерматита. Применение гистологического метода исследования позволило доказать противовоспалительное действие узкополосной (311 нм) фототерапии на кожу обследованных больных. Выявленное в работе иммуноморфологическим методом превалирование в коже больных атопическим дерматитом кожно-ассоциированных Тлимфоцитов (CD45RO+) над Т-лимфоцитами, экспрессирующими рецептор хоминга в кожу (CLA), а также наличие пролиферирующих форм Тлимфоцитов, может быть использовано для проведения селективной, дополнительной к основному лечению, терапевтической коррекции указанных изменений. Остающееся после окончания лечения сравнительно высокое содержание в коже больных ключевых эффекторных клеток воспалительного инфильтрата в дерме, включая экспрессию маркеров апоптоза, вероятно, может свидетельствовать о целесообразности интенсификации узкополосной (311 нм) фототерапии с целью оптимизации конечных результатов лечения с учетом иммуногистохимических данных. ВЫВОДЫ 1. Установлена высокая терапевтическая эффективность узкополосной (311 нм) фототерапии больных атопическим дерматитом с тяжелым и 21 средне-тяжелым течением с учетом ближайших и отдаленных результатов лечения при увеличении длительности периодов ремиссии в среднем на 4,5 месяцев. 2. Выявленное выраженное нормализующее влияние узкополосной (311 нм) фототерапии на патологически измененные клеточные структуры дермы и эпидермиса, включая и содержание тучных клеток, свидетельствует о противовоспалительном действии узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета на кожу больных атопическим дерматитом. Ни у одного из наблюдаемых нами на протяжении от полутора до четырех лет пациентов ни клинически, ни гистологически не было обнаружено ни деструктивного, ни малигнизирующего действия узкополосной (311 нм) средневолновой фототерапии на кожу больных атопическим дерматитом. 3. У больных с тяжелым и средне-тяжелым течением атопического дерматита в стадии обострения иммуногистохимическим методом установлено статистически достоверное увеличение (р<0,001) в коже кожно-ассоциированных Т-клеток памяти (CD45RO+), Т-лимфоцитов с кожным лимфоцитарным антигеном (CLA+), молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) и маркера клеточной пролиферации (Ki-67) по сравнению с кожей здоровых лиц. Выявленная взаимосвязь изучаемых показателей с тяжестью клинических проявлений на фоне выраженного терапевтического эффекта указывает на их патогенетическую значимость при атопическом дерматите и может рассматриваться как критерий эффективности проводимой терапии. 4. В биоптатах кожи больных с тяжелым и средне-тяжелым течением атопического дерматита выявлено достоверное увеличение (p<0,001) уровня экспрессии рецепторов антиапоптотической активности (Bcl-2) кожно-ассоциированных Т-лимфоцитов, в 9 раз превосходящее обнаруженное достоверное увеличение (p<0,001) уровня экспрессии 22 рецепторов проапоптотической активности (Fas, FasL), что свидетельствует о выраженном снижении апоптоза Т-лимфоцитов в воспалительном инфильтрате кожи больных атопическим дерматитом. Высокое содержание воспалительном кожно-ассоциированных инфильтрате дермы на Т-лимфоцитов фоне в повышенной антиапоптотической активности с учетом установленной между ними прямой корреляционной связи (r=0,7) свидетельствует о тесной взаимосвязи иммунного воспаления с системой апоптоза в коже этих больных. После лечения не отмечено сколько-нибудь выраженных изменений содержания в коже больных атопическим дерматитом изучаемых маркеров апоптоза (Fas, FasL, Bcl-2). Установленный факт, вероятно, указывает на отсутствие явного проапоптогенного, индуцирующего апоптоз, действия узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета на кожу больных атопическим дерматитом. 5. Отсутствие после лечения достоверной положительной динамики экспрессии маркеров апоптоза (Fas, FasL, Bcl-2), остающееся высокое содержание ключевых эффекторных клеток воспалительного инфильтрата (CD45RO+, CLA+) в коже больных атопическим дерматитом, по-видимому, может свидетельствовать в пользу целесообразности назначения больным атопическим дерматитом более длительных курсов узкополосной (311 нм) фототерапии с целью увеличения продолжительности ремиссии. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Горячева Т.А. Анализ структурных изменений кожи больных атопическим дерматитом под влиянием узкополосной (311 нм) средневолновой ультрафиолетовой терапии / Горячева Т.А., Самсонов В.А., Катунина О.Р., Волнухин В.А. венерологии. – 2009. - №3. – С. 43-49. // Вестник дерматологии и 23 2. Горячева Т.А. Клинические результаты узкополосной (311 нм) фототерапии больных атопическим дерматитом / Горячева Т.А., Самсонов В.А., Надгериева О.В., Волнухин В.А. // Российского журнала кожных и венерических болезней. – 2009. - №3. – С. 22-25. 3. Горячева Т.А. Клинико-иммуноморфологический анализ содержания ключевых эффекторных клеток воспалительного инфильтрата в коже больных атопическим дерматитом под действием узкополосного (311 нм) спектра ультрафиолета / Горячева Т.А., Самсонов В.А., Катунина О.Р. // Вестник дерматологии и венерологии. – 2009. - №6. – С.52-58. 4. Смольянникова В.А. Динамика морфологических и морфометрических показателей кожи у больных атопическим дерматитом на фоне узкополосной средневолновой ультрафиолетовой терапии / Смольянникова В.А., Надгериева О.В., Царегородцева Е.Е., Горячева Т.А. // «Х Всероссийская конференция дерматовенерологов». Тезисы научных работ. – М., 2006. – С.22. 5. Самсонов В.А. Узкополосная средневолновая ультрафиолетовая терапия у больных атопическим дерматитом / Самсонов В.А., Волнухин В.А., Надгериева О.В., Горячева Т.А. // «Х Всероссийская конференция дерматовенерологов». Тезисы научных работ. – М., 2006. – С.51. 6. Самсонов В.А. Ультрафиолетовой облучение с длиной волны 311 нм в терапии больных атопическим дерматитом / Самсонов В.А., Волнухин В.А., Надгериева О.В., Горячева Т.А., Боровая О.В.// «II Всероссийский конгресс дерматовенерологов». Тезисы научных работ. – СПб., 2007.С.94. 7. Горячева Т.А. Эффективность узкополосной (311 нм) фототерапии больных атопическим дерматитом с учетом ближайших и отдаленных клинических результатов лечения / Горячева Т.А., Самсонов В.А., Надгериева О.В., Волнухин В.А. // «Х Всероссийский дерматовенерологов». Тезисы научных работ. – М., 2008. – С.21. съезд 24 Список использованных сокращений. АтД – атопический дерматит. CD45RO – мембранные маркеры клеток костномозгового происхождения, кожно-ассоциированные Т-клетки памяти. CLA – кожный лимфоцитарный антиген, рецептор хоминга в кожу. Ki-67 – маркер клеточной пролиферации. ICAM-1 (intercellular adhesion molecule) – маркер молекул межклеточной адгезии Fas – мембранный рецептор проапоптотического действия. FasL – лиганд для проапоптотического рецептора Fas. Bcl-2 – внутриклеточные белковые рецепторы антиапоптотического действия. SCORAD (Severity Scoring of Atopic Dermatitis) – полуколичественная шкала оценки степени тяжести кожного процесса при атопическом дерматите.
