ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ КАФЕДРА «МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ»

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ
КАФЕДРА «МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ И
ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ»
Н. Н. Митрофанова
В.Л. Мельников
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ.
Учебно-методическое пособие
для студентов медицинских вузов
ПЕНЗА 2012
Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов «Общая
микробиология» составлено в соответствии с программой для студентов 2 – 3
курса по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии 2002 г.
По каждой теме сформулирована цель занятия. Имеется план и методика
выполнения различных экспериментальных работ с микроорганизмами.
Приведены современные методы диагностики различных инфекций.
Руководство рекомендовано для самостоятельной подготовки студентов к
практическим занятиям.
2
Занятие № 1 Бактериологическая лаборатория и оборудование рабочего
места. Техника безопасности при работе в лаборатории. Устройство
современных микроскопов. Морфология бактерий и методы ее изучения.
Цель: Изучить и научиться выполнять правила противоэпидемического
режима в бактериологической лаборатории,
Научиться готовить фиксированный препарат, окрашивать его простым
методом и изучать при помощи иммерсионного микроскопа.
Знать: основные задачи медицинской микробиологии, устройство,
оснащение, режим работы, с оборудование и материалы различных
лабораторий, правила работы в них, типы микроскопов, основные принципы
классификации микроорганизмов
Уметь: подготовить иммерсионный микроскоп к работе, приготовить
мазок, окрасить его с помощью простых методов окраски, осуществить
микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа. Описать морфологию
бактерий в мазке по схеме. Приготовить нативный препарат, определить
подвижность микроорганизмов.
Обоснование темы: все работы с микроорганизмами проводятся в
специализированных лабораториях, в которых необходимо использовать
определенные правила по технике безопасности и специфические приемы для
работы с патогенными биологическими агентами
Вопросы для самоподготовки:
1.
Предмет и задачи медицинской микробиологии
2.
История развития микробиологии.
3.
Основные принципы классификации микроорганизмов.
4.
Оснащение и режим работы бактериологической лаборатории
5.
Типы микроскопов и методы микроскопии
6.
Строение механической и оптической части микроскопа.
7.
Понятие о простых методах окраски.
8.
Принципы классификации микроорганизмов.
ПЛАН
Программа:
1. Правила по технике безопасности.
2. Классификация лабораторий и основное оборудование.
3. Морфология бактерий и методы ее изучения.
4. Типы микроскопов и их устройство.
5. Этапы приготовления фиксированного мазка из бактерий.
6. Приготовление нативных препаратов для прижизненного изучения
микроорганизмов.
7. Простые методы окраски препаратов.
3
8. Основные принципы классификации микроорганизмов.
Демонстрация:
1. Приготовление мазков из бактериальных культур
2. Подвижность бактерий в препарате «висячая» капля
3. Подвижность бактерий в препарате «раздавленная» капля
4.Красители, используемые в микробиологии
Задание студентам:
1. Освоить методы работы с иммерсионным микроскопом.
2. Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окрашенные простым
методом, описать морфологию бактерий в мазке по схеме, зарисовать
(стафилококки, диплококки, стрептококки, сарцины, палочки, клостридии,
стрептобациллы, вибрионы, спирохеты, актиномицеты)
3. Приготовить мазки из бактерий. выращенных на жидкой и плотной
питательной средах.
4. Окрасить мазки простым методом. Зарисовать, определив
принадлежность к морфологическому типу.
5. Приготовить нативные препараты методом «висячая» капля и
«раздавленная» капля. Определить подвижность микроорганизмов.
Информационный материал.
Лаборатория
–
организация,
в
которой
выполняются
экспериментальные, диагностические производственные работы с патогенными
биологическими агентами (ПБА).
ПБА – патогенные для человека микроорганизмы (бактерии, вирусы,
хламидии, риккетсии, простейшие, грибы, микоплазмы) а также генноинженерно-модифицированные
микроорганизмы,
яды
биологического
происхождения
9токсины,
гельминты,
биологические
материалы,
подозрительные на содержание вышеперечисленных агентов.
Все микробиологические, биохимические, молекулярно-биологические
исследования микроорганизмов проводят в специальных лабораториях,
структура и оборудование которых зависят от объектов исследования и от
целевой направленности (научные исследования, диагностика заболеваний,
изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и
животных) осуществляется в иммунологических и серологических
лабораториях.
Бактериологические,
вирусологические,
микологические
и
серологические лаборатории входят в состав центров Роспотребнадзора,
диагностических центров и крупных больниц.
В лабораториях Роспотребнадзора выполняют бактериологические,
вирусологические, серологические, паразитологические анализы материалов,
полученных от больных и контактировавших с ними лиц, обследуют
4
бактерионосителей и производят санитарно-микробиологические исследования
воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и т.д.
В бактериологических и серологических лабораториях больниц и
диагностических центров производят исследования с целью диагностики
кишечных, гнойных, респираторных и др. инфекционных заболеваний,
осуществляют
микробиологический
контроль
за
стерилизацией
и
дезинфекцией.
Диагностику карантинных и особо опасных инфекций (чума, туляремия,
сибирская язва и др.) проводят в специальных лабораториях, организация и
порядок деятельности которых строго регламентирован.
В вирусологических лабораториях диагностируют заболевания,
вызванные вирусами (грипп, полиомиелит, и т.п.), некоторыми бактериями –
хламидиями (орнитоз) риккетсиями (сыпной тиф). При организации и
оборудовании вирусологических лабораторий учитывают специфику работы с
вирусами, культурами клеток и куриными эмбрионами, требующую
строжайшей асептики.
В микологических лабораториях проводят диагностику заболеваний,
вызванных патогенными грибами – возбудителями микозов.
Лаборатории обычно размещаются в нескольких помещениях, площадь
которых определяется объемом работ и целевым назначением. В каждой
лаборатории предусмотрены: боксы для работы с отдельными группами
возбудителей, помещения для серологических исследований, помещения для
мойки и стерилизации посуды. Приготовления питательных сред, виварий с
боксами для здоровых и подопытных животных, регистратура для приема и
выдачи анализов.
Требования, предъявляемые к бактериологическим лабораториям:
1. Все бактериологические лаборатории должны иметь разрешение на
работу с ПБА
2. Лаборатория должна размещаться в отдельном здании или в
изолированной части здания
3. Лаборатория должна иметь 2 входа: для сотрудников и для доставки
патологического материала
4. Исходя из требований бактериологической безопасности, лаборатория
должна иметь: водопровод, канализацию, вентиляцию, освещение
(естественное, искусственное), отопление
5. Все помещения лаборатории делятся на две зоны: «заразная» и
«чистая» где не проводятся работы с ПБА.
«Чистая» зона должна включать:
Гардероб, комнату отдыха, комнату для работы с документами, кабинет
заведующего, подсобные помещения, моечную, комнату для приготовления
питательных сред, препараторскую, стерилизационную.
«Заразная» зона должна включать: помещения для приема, регистрации,
сортировки материала, боксированные помещения, боксы биологической
безопасности, комнату для проведения бактериологических исследований,
5
комнату для проведения серологических исследований, комнату для
проведения гельминтологических исследований, термостатную (не во всех
лабораториях), автоклавную.
Отличие боксированных помещений от боксов:
Боксированные помещения осуществляют защиту исследуемого
материала от вторичного инфицирования, боксы предназначены для защиты от
ПБА персонала и окружающей среды, в связи с чем они имеют автономные
системы коммуникаций.
Группы возбудителей инфекционных заболеваний:
1. Возбудители особо опасных инфекций: чумы, натуральной оспы,
лихорадки Ласса, Эбола.
2. Возбудители высококонтагиозных бактериальных, грибковых,
вирусных инфекций: сибирская язва, холера, сыпной тиф, бешенство
3. Возбудители бактериальных, грибковых, вирусных, протозойных
инфекций, выделенных в отдельные нозологические группы: коклюш,
столбняк, ботулизм, туберкулез, кандидоз, грипп, полиомиелит
4. Возбудители бактериальных, грибковых, вирусных септицемий,
менингитов, пневмоний, энтеритов (возбудители анаэробных клостридиальных
инфекций, синегнойная инфекция, герпесвирусы, возбудители амебиаза)
Оборудование бактериологической лаборатории.
Микроскоп. Изучение морфологии микроорганизмов производится с
помощью различных микроскопов, увеличение которых колеблется от 500 до
1000 раз.
Для микробиологических исследований используют несколько типов
микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные
методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный) применяются
различные марки микроскопов «Биолам», МБР -1 и т. д.
Микроскоп (от греческих слов micros — малый, skopeo — смотрю) —
оптический прибор для изучения малых объектов, недоступных
невооруженному глазу. Разрешающая способность оптического микроскопа
равна 0,2 мкм, полезное увеличение 1 000
В микроскопе различают механическую и оптическую часть.
В механическую часть микроскопа входят - штатив, состоящего из
основания и тубусодержателя, тубус с револьвером для объективов,
предметный столик для микропрепаратов.
В тубус микроскопа сверху вставлен окуляр. В штатив встроены
механизмы грубого (макровинт) и тонкого (микровинт) перемещения
предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть микроскопа состоит из осветительной системы,
объективов, окуляров и конденсора.
Осветительная система находится под предметным столиком и состоит из
зеркала и конденсора с диафрагмой.
Зеркало служит для отражения световых лучей по направлению к
объективу и внутрь микроскопа. Одна сторона зеркала плоская, другая
6
вогнутая. При дневном свете пользуются плоским зеркалом, при искусственном
освещении — вогнутым.
Конденсор состоит из системы линз, предназначенных для собирания
лучей, идущих от зеркала, в одной точке — фокусе, который должен
находиться в плоскости рассматриваемого препарата. При микроскопировании
с дневным светом конденсор должен быть поднят до уровня предметного
столика; при искусственном освещении конденсор опускают до тех пор, пока
при малом увеличении изображение источника света не появится в плоскости
препарата. При изучении неокрашенных объектов следует опускать конденсор.
Объем лучей регулируется диафрагмой, находящейся под конденсором.
Окрашенные препараты рассматриваются при открытой диафрагме; при
рассматривании неокрашенных объектов следует уменьшить диаметр отверстия
диафрагмы.
Объектив - основной оптический элемент микроскопа. Он представляет
собой систему линз, заключенных в металлическую оправу.
Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния, а следовательно,
и от кривизны фронтальной линзы. Чем больше кривизна фронтальной линзы,
тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива.
Все объективы разделяются на сухие и иммерсионные. Сухим называют
такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым
препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателей
преломления стекла и воздуха, часть световых лучей отклоняется и не попадает
в глаз наблюдателя.
При исследовании микробов применяется иммерсионная система. Ее
преимущество перед сухими объективами состоит в том, что между стеклом и
линзой устанавливается однородная среда (стекло препарата — масло — стекло
объектива) с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи,
не преломляясь и не изменяя своего направления, попадают в объектив, чем я
достигается наилучшее освещение.
Разрешающая способность – возможность различать раздельно две
близко расположенные точки. Для оптического микроскопа она равна 0,2 мкм.
Для проведения иммерсионной микроскопии обычно пользуются кедровым
маслом, показатель преломления которого почти равен показателю
преломления стекла. При этом капля масла помещается на стекло препарата и в
нее погружается иммерсионный объектив.
Окуляры имеют две линзы: верхнюю и нижнюю. Расстояние между
линзами, равно полусумме их фокусных расстояний. Таким образом, по длине
окуляра можно приблизительно определить общее фокусное расстояние. На
окуляре указано значение
его увеличения. Увеличение микроскопа
ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на
увеличение окуляра.
Окуляр дает только увеличение, объектив раскрывает качество
изображения.
7
Электронный микроскоп.
В 1932 г. был изобретен электронный микроскоп, в котором вместо
световых лучей используется поток электронов. При электронной микроскопии
возможно рассматривать объекты, размер которых в 50—100 раз меньше
видимых в обыкновенном микроскопе.
Увеличение даваемое электронным микроскопом, равно 20000-40000 раз.
При последующем оптическом увеличении в 4—5 раз можно получить полезное
увеличение в. 100000—200000 раз.
По расположению линз и ходу лучей электронный микроскоп очень
похож на проекционный оптический микроскоп. В зависимости от того, из
каких линз собран микроскоп, различают электростатические и
электромагнитные микроскопы. Источником электронов в этом приборе
является электронная пушка (электронно-лучевая трубка с катодом, состоящим
из раскаленной нити, и анодом-цилиндром). Вылетевшие из нити электроны
разгоняются высоким электрическим напряжением (50 000— 100000 V).
Вышедший из электронной пушки пучок электронов попадает в конденсорную
электромагнитную линзу, которая сводит их на рассматриваемый предмет,
лежащий на тонкой (1/1000000 см) пленке коллодия. После этого лучи
попадают на объективную электромагнитную линзу, собирающую
расходящиеся лучи и дающую первое (промежуточное) увеличение предмета.
Это изображение можно наблюдать на специальном промежуточном
экране. В центре последнего сделано маленькое отверстие (апертурная
диафрагма). Небольшая часть первого увеличенного изображения, равная
отверстию промежуточного экрана, служит “предметом” для дальнейшего
увеличения. Поток электронов через это отверстие попадает на проекционную
электромагнитную линзу, снабженную апертурной диафрагмой. Второе
увеличенное изображение, даваемое проекционной линзой, принимается на
флюоресцирующий экран или на фотографическую пластинку Можно
прибегнуть также к последующему оптическому увеличению.
С помощью электронной микроскопии удалось получить замечательные
результаты в области микробиологии: обнаружить многие важные особенности
и детали морфологии микроорганизмов (морфология вирусов и бактериофага и
др.).
Виды микроскопии
1.
Светлопольная микроскопия (микроскопия в проходящем свете)
используется для изучения окрашенных объектов в фиксированных препаратах
2.
Темнопольная микроскопия
Применяется для прижизненного изучения микроорганизмов в нативных
неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на
явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в
жидкости (эффект Тиндаля) Эффект достигается с помощью специального
конденсора (парабалоид или кардиоид), которые заменяют обычный конденсор
в биологическом микроскопе. При этом способе освещения в объектив
попадают только лучи, отраженные от поверхности объекта. В результате на
8
темном фоне (неосвещенное поле зрения) видны ярко освященные частицы.
Для наблюдения в темном поле свет устанавливают и центрируют, как и для
светлого поля, заменяют конденсор на специальный, прибавляют свет до
максимума, открывают конденсор до максимума. Для темнопольной
микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля»
3.
Люминесцентная микроскопия.
Люминесценция – способность некоторых веществ под влиянием
падающего на них света испускать лучи с другой длиной волны (например,
таким свойством обладают ультрафиолетовые лучи). Объект, не видимый в
ультрафиолетовом излучении, приобретает яркий блеск после обработки
специальными веществами – флюорохромами.
Установка для люминесцентной микроскопии состоит из источника света
с сине-фиолетовым фильтром и микроскопа. На окуляр микроскопа надевают
желтый светофильтр.
Преимущества люминесцентной микроскопии:
1.цветное изображение
2.высокая степень контрастности объектов
3.возможность исследования непрозрачных объектов
4.возможность исследования динамики жизненных процессов
5.обнаружение локализации отдельных микроорганизмов, вирусов
6.развитие методов цитогистохимии, экспрессная цитодинамика.
Фазово-контрастная микроскопия
Предназначена
для
нативных
препаратов.
Фазово-контрастное
приспособление дает возможность увидеть прозрачные объекты. Свет проходит
через различные биологические структуры с разной скоростью, которая зависит
от оптической плотности объекта. В результате возникает изменение фазы
световой волны, не воспринимаемое простым глазом. Фазовое устройство
состоит из особого конденсора и объектива и обеспечивает преобразование
изменение фазы световой волны в видимые изменения амплитуды. Таким
образом достигается усиление различий в оптической плотности объектов.
Для фазово-контрастной микроскопии используется обычный микроскоп
и дополнительное фазово-контрастное устройство КФ-1, КФ-4 и специальные
осветители.
4.
Электронная микроскопия.
Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами
разрешающей способности светового микроскопа.(0,2 мкм). Применяются для
изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов.
Световые лучи в этом микроскопе заменяют поток е, имеющий 0,005 нм.
Высокая разрешающая способность электронного микроскопа (0,1-0,2 нм)
позволяет получить общее полезное увеличение до 1000000.
Термостат
Используется для роста и размножения микроорганизмов.
9
В термостате поддерживается постоянная температура при помощи
терморегуляторов. которые как только температура достигнет установленного
уровня, автоматически уменьшают или прекращают доступ притока тепла.
Термостаты имеют двойные стенки, между которыми находится воздух
или вода, подогреваемая источником тепла . Дверца термостата герметически
закрывается. Термостат снабжен термометром Культуры бактерий чаще всего
помещают в термостат на 24 часа — срок, обеспечивающий максимальное
размножение большинства патогенных микроорганизмов.
Холодильник.
Используется
для
хранения
культур
микроорганизмов,
иммунобиологических препаратов.
Центрифуга.
Используется для разделения жидкостей с различной плотностью, для
получения сыворотки крови, для разделения твердых тел от жидкостей.
Сушильный шкаф.
Имеет несколько температурных режимов. Применяется для сушки
лабораторной посуды.
Бактериоскопический метод состоит в. изучении микроорганизмов под
микроскопом. Исследованию могут подвергаться как микроорганизмы в живом
состоянии, так и убитые окрашенные микробные клетки.
Методические указания:
Приготовление препаратов для микроскопического исследования.
Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки
или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой.
Петлю прокаливают в пламени спиртовки. Вращательным движением
вынимают из пробирки пробку и обжигают край пробирки. Вводят петлю в
пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, захватывают
материал. После приготовления препарата петлю прожигают в пламени
спиртовки.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков.
1.Для приготовления препарата подготавливают предметное стекло,
обезжиривая его.
2.На обезжиренное предметное стекло наносят взвесь бактерий и
равномерно распределяют ее по поверхности стекла.
3.Мазок высушивают на воздухе или в пламени спиртовки.
4.Высушенные мазки подвергают фиксации, в результате которой
бактерии погибают и прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для
фиксации мазка предметное стекло проводят несколько раз через пламя
горелки. Иногда мазки фиксируют химическим способом ( спиртами, смесью
Никифорова и т.д.).
Этапы приготовления фиксированного мазка:
1.Подготовка предметного стекла
10
2.Приготовление мазка
3.Высушивание микропрепарата
4.Фиксация микропрепарата
Окраска препарата простым способом.
1.Фиксированный мазок помещают на «салазки» в кювету, дают ему
остыть.
2.Наносят на него пипеткой несколько капель красителя на 2-3 мин.
3.Смывают краситель водой.
4. Высушивают препарат фильтровальной бумагой.
Морфология бактерий – размер, форма и взаимное расположение
бактериальных клеток
Схема описания морфологии бактерий в мазке:
1.
Форма
2.
Размеры
3.
Характер концов ( для палочек )
4.
Взаиморасположение
Приготовление нативных препаратов для прижизненного изучения
микроорганизмов.
Метод «висячей» капли.
1. На покровное стекло наносят каплю исследуемого материала.
2. Предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают
вазелином, прижимают к покровному стеклу так. Чтобы капля находилась в
центре лунки.
3. Переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В готовом
препарате капля должна висеть над лункой, не касаясь ее дна.
Для микроскопии вначале используют объектив малого увеличения,
находят край капли, а затем устанавливают иммерсионный объектив и
исследуют препарат, определяя подвижность микроорганизмов.
Метод «раздавленной» капли.
На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю
исследуемого материала и покрывают ее покровным стеклом. Капля не должна
выходить за пределы покровного стекла. Раздавленную или висячую каплю,
микроскопируют с помощью с иммерсионной системы в затемненном поле
зрения — при суженной диафрагме и опущенном конденсоре.
Рекомендуется их микроскопировать в микроскопе с темным полем
зрения.
Контрольные вопросы:
1. Что изучает медицинская микробиология?
2. Какие виды лабораторий существуют?
11
3. Назовите основные виды микроскопов, используемых для работы
различных лабораторий.
4. Что такое морфология бактерий?
5. Назовите основные морфологические формы бактерий.
6. Почему разрешающая способность иммерсионного объектива выше,
чем сухого?
7. Назовите этапы приготовления мазка для иммерсионной микроскопии.
8. Для чего необходима фиксация мазка?
9.
Какова
последовательность
простой
окраски
препарата
микроорганизмов?
Д. З. Заполнить таблицу:
Отличительные черты прокариот от эукариот
признак
прокариоты
эукариоты
Мезосомы
Анаэробный процесс
Фиксация азота
Мембранные
структуры
Органеллы движения
Генетический материал
Расположение
Форма
Внехромосомная ДНК
Гистоны
Тип деления
Синтез белка
рибосомы
Место синтеза
Клеточная стенка
Структурные элементы
Стеролы
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б,, Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г.
2. Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии.
М. 1997 г.
3. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. СпецЛит. 2000 г.
12
Дополнительная:
1.
Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г.
2.
Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983
г.
3.
Шлегель Г. Общая микробиология. М., 1982 г.
13
Занятие № 2 Морфология бактерий. Тинкториальные свойства бактерий.
Окраска по методу Грама.
Цель: Научиться окрашивать мазки по методу Грама и изучать
морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов
Знать: Особенности морфологии бактериальных клеток. Методику
окрашивания по методу Грама.
Уметь: Приготовить мазок, окрасить его, осуществить микроскопию с
помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и отдельные
особенности ультраструктуры клеток бактерий.
Обоснование темы: Морфология бактериальной клетки имеет важное
значение
для
классификации
бактерий
и
используется
для
бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных
заболеваний
Вопросы для самоподготовки:
1. Основные морфологические группы бактерий.
2. Особенности морфологии грибов, актиномицетов, риккетсий, спирохет,
микоплазм и хламидий.
3. Понятие о простых и сложных методах окраски.
4. Выявление различий в строении клеточной стенки бактерий с помощью
окраски по Граму.
ПЛАН
Программа:
1. Морфология бактериальных клеток.
2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама
3. Основные отличительные черты простых и сложных методов
окрашивания.
Демонстрация:
1. Мазок из смеси бактерий ( окраска по методу Грама)
2. Мазки различных морфологических форм микроорганизмов.
Задание студентам:
1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим
и тинкториальным свойствам в готовом препарате из смеси бактерий (окраска
по методу Грама). Зарисовать.
2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и
стфилококка,
окрасить
по
методу
Грама,
микроскопировать
и
дифференцировать
бактерии
по
морфологическим
признакам
и
тинкториальным свойствам. Зарисовать.
14
3. Микроскопировать и зарисовать мазки различных морфологических
форм бактерий. Заполнить таблицу:
Основные морфологические формы бактерий
Кокки
Палочки
Извитые
Нитчатые
Информационный материал.
Морфологические формы бактерий
Известны четыре основные формы бактерий: шарообразная,
палочковидная и извитая и нитевидная. В соответствии с этим все бактерии по
форме подразделяются на следующие группы:
1) кокки (шарообразные),
2) бактерии (палочковидные),
3) спириллы (извитые в виде спирали)
4) актиномицеты (нитевидные)
1. Кокки — бактерии круглой формы, имеющие в диаметре 1—2 мкм.
Они различаются между собой по взаимному расположению отдельных клеток,
которое зависит от способа их деления. Если по окончании деления кокки
разъединяются на отдельные шарики, получается форма микрококка. Группа из
двух кокков носит название диплококка. Если деление кокков происходит в
одном направлении и образующиеся кокки не разъединяются, то получается
цепочка из шариков. Эта форма носит название стрептококка. При делении в
двух взаимно перпендикулярных направлениях возникают сочетания по четыре
кокка — тетракокка.
Если деление происходит в трех взаимно перпендикулярных
направлениях, кокки соединяются в виде объемных пакетов и получают
название сарцин .
Если кокки образуют скопления клеток в виде виноградных гроздьев, они
называются стафилококками.
Кроме того, кокки могут иметь правильную круглую форму, овальную
форму, ланцетовидную форму, бобовидную форму.
2. Бактерии – имеют палочковидную форму размером от нескольких
долей микрона до 1—5 мкм (различают короткие, длинные, тонкие и толстые
палочки). Они различаются друг от друга наличием споры, ее диаметром,
формой концов и т.д. Бациллами называют палочки, которые способны
образовывать споры, не превышающие в диаметре клетку. Клостридиями
считают бактерии, способные к образованию спор, значительно превышающих
диаметр бактериальной клетки. Палочки, не способные к спорообразованию,
называются бактериями (в узком смысле этого слова).
Бывают палочки с закругленными концами, например, кишечная палочка,
с обрезанными краями (палочка сибирской язвы); с заостренными краями
(фузобактерии). У коринобактерий края палочек утолщены из-за наличия в них
запасов валютина.
15
Палочки могут располагаются одиночно,
по две бактерии
(диплобациллы), в виде цепочек (стрептобациллы); некоторые палочки
располагаются под углом (коринобактерии дифтерии ).
3. Извитые формы. Если бактерия имеет один завиток спирали, она
называется вибрионом (холерный вибрион ). Длина вибрионов 1—3 мкм.
Кампилобактерии имеют изгибы тела, напоминающие крылья летящей чайки.
Спириллы, спиралевидные, неподвижные микроорганизмы, имеющие
более одного завитка, длиной от 5 до 30 мкм .
Спирохеты - подвижные, извитые формы микроорганизмов. Различают
следующие разновидности спирохет: трепонемы имеют 8-12 завитков,
симметричны; боррелии имеют 3-8 крупных завитка, не симметричны и
лептоспиры, симметричные микроорганизмы имеющие более 10 мелких
завитков и 2 крупных изгиба на концах клетки, напоминающие букву S или C.
Методические указания:
Сложные методы окраски используют для выявления различных
компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в
зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов
окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных
красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.
Окраска по методу Грама:
1. На фиксированный мазок нанести основной краситель – генциановый
фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.
2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.
3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.
4. Промыть водой.
5. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин.
6. Промыть водой, высушить.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет,
грамотрицательные в красный. Принцип метода заключается в том что
генциановый фиолетовый связывается с пептидогликаном клеточной стенки.
Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много
красителя. Тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя
фиксирует краситель за счет образования комплекса краситель-пептидогликанйод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро
теряют краситель и обесцвечиваются. А грамположительные микрооганизмы
остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Дополнительный краситель
окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.
Окраска по Граму имеет дифференциально-диагностическое значение. К
грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки и др., к
грамотрицательным – гонококки, кишечная палочка, менингококки и др.
Некоторые виды окрашиваются по Граму вариабельно в зависимости от
различных внешних и внутренних факторов.
Для правильной окраски следует соблюдать технику окрашивания.
16
Контрольные вопросы:
1.Назовите основные морфологические формы бактерий.
2 Каково строение клеточной стенки бактериальной клетки?
3.Каковы основные отличительные признаки Гр(-) и Гр(+)
микроорганизмов?
4. Каково значение сложных методов окрашивания при диагностике
инфекционных заболеваний?
5. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов
по методу Грама.
Д.З. Заполнить таблицу
Структура бактериальной клетки
органоид
функция
Методы
выявления
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология ,
вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по
микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1.
Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2.
Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3.
Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.
17
Занятие № 3 Строение бактериальной клетки. Сложные методы
окраски.
Цель: Изучить строение бактериальной клетки, функции и методы
выявления отдельных органоидов. Научиться окрашивать мазки по методу
Циля-Нильсена, Бурри и Бурри-Гинса, Нейссера, Ожешко.
Знать: Особенности морфологии и ультраструктуры бактериальных
клеток.
Уметь: Приготовить мазок, окрасить его сложным методом, осуществить
микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и
отдельные особенности ультраструктуры клеток бактерий.
Обоснование темы: Строение бактериальной клетки имеет важное
значение
для
классификации
бактерий
и
используется
для
бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных
заболеваний
Вопросы для самоподготовки:
1. Отличительные черты клеток прокариотов от клеток эукариотов.
2. Облигатные компоненты клеток прокариотов
3. Факультативные компоненты клеток прокариотов.
4. Методы изучения структуры бактериальных клеток и их практическое
значение.
5. Бактериоскопический метод диагностики. Его достоинства и
недостатки.
ПЛАН
Программа:
1. Ультраструктура бактериальных клеток
2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама
3. Сложные методы окраски (методы Ожешко, Циля-Нильсена, БурриГинса, Нейссера )
Демонстрация:
1. Капсула бактерий (окраска по методу Бурри-Гинса)
2. Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза в мокроте (окраска по
методу Циля-Нильсена)
3. Спорообразующие бактерии (окраска по методу Ожешки)
4. Зерна волютина у коринебактерий дифтерии (окраска по методу
Нейссера)
Задание студентам:
1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим
и тинкториальным свойствам в готовом препарате (окраска по методу Грама).
Зарисовать.
18
2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и
стфилококка,
окрасить
по
методу
Грама,
микроскопировать
и
дифференцировать бактерии по морфологическм признакам и тинкториальным
свойствам. Зарисовать.
4.
Микроскопировать и зарисовать:
- капсулы клебсиелл (окраска по методу Бурри и Бурри-Гинса)
- коринебактерии дифтерии, содержащие зерна валютина (окраска по
методу Нейссера)
- кислотоустойчивые микобактерии (окраска по методу Циля-Нильсена)
- споры бацилл сибирской язвы (окраска по методу Ожешки)
Информационный материал.
Сложные методы окраски используют для выявления различных
компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в
зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов
окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных
красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.
В бактериальной клетке имеются облигатные органоиды, к которым
относят клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму,
нуклеоид, рибосомы, мезосомы и факультативные органоиды: капсула,
жгутики, фимбрии, пили, споры, плазмиды, включения.
Нуклеоид бактерий представлен двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и
расположен в центре клетки. Основными отличительными чертами ядерной
субстанции бактерий от эукариотических клеток являются:
1.
Отсутствие ядерной оболочки
2.
Отсутствие ядрышка
3.
Отсутствие гистонов
Для обнаружения бактериального ядра необходимо применение
электронной микроскопии или применение окраски по способу Фельгена или
по Романовскому-Гимза.
Цитотоплазма бактерий состоит из растворимых белков. Рибосомы
бактерий состоят из двух субъединиц и имеют коэффициент седиментации 70S.
В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы питательных веществ в
виде включений, которые можно обнаружить при помощи различных методов
окрашивания. Например, в цитоплазме у С. diphtheriae присутствуют зерна
волютина, они являются включениями фосфатов и имеют в отличие от
цитоплазмы щелочную реакцию. Для выявления зерен волютина применяют
окраску по методу Нейссера.
Клеточная стенка бактерий придает им определенную форму, участвует
в процессах обмена веществ и деления клетки.
У бактерий можно выявить присутствие клеточной стенки с помощью
электронной микроскопии, при окрашивании по методу Грама, Циля-Нильсена.
19
Клеточная стенка грамположительных бактерий значительно толще, чем
у грамотрицательных, в ней содержится значительное количество
пептидогликана (40-90%) связанного с тейхоевыми кислотами. У
грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана не превышает 10%.
Цитоплазматическая мембрана участвует в регуляции осмотического
давления, в процессах обмена и транспорта веществ. Она окружает наружнюю
часть цитоплазмы и состоит из двойного слоя липидов со встроенными
поверхностными и интегральными белками. Цитоплазма способна
образовывать особые впячивания, которые получили название мезосом.
Мезосомы принимают участие в делении клетки, в процессе спорообразования,
в синтезе некоторых веществ.
Капсула расположена снаружи клеточной стенки, представляет собой
слизистое образование, состоящее из полисахаридов или полипептидов. Она
имеет защитное значение, у патогенных бактерий капсула образуется чаще
всего внутри организма человека или животного и препятствует фагоцитозу,
повышает устойчивость к действию антител.
Некоторые бактерии (например, клебсиеллы, псевдомонады) образуют
капсулу и в организме больного, и на питательной среде, где они дают
крупные, слизистые колонии.
Капсула выявляется при специальных методах окраски.
Споры образуются при неблагоприятных условиях внешней среды (Вас.
аnthracis, С. tetani). Спорообразование способствует сохранению вида и не
является способом размножения. У клостридий спора превышает диаметр
клетки, у бацилл – нет. Форма спор может быть овальной или округлой. У С.
Tetani споры расположены терминально, для Вас. Аnthracis характерно
центральное расположение спор. Споры химически инертны, поэтому
окрашиваются с трудом. Для выявления этих структур используют окраску по
методу Ожешки.
Жгутики имеются у подвижных бактерий. Они состоят из белка
флагеллина. Оределение подвижности бактерий имеет диагностическое
значение. По числу жгутиков и их расположению бактерии делятся на
монотрихи, имеющие один жгутик, лофотрихи с пучком жгутиков на одном
конце клетки, амфитрихи имеют жгутики на обоих концах, и перитрихи, у
которых жгутики расположены вокруг тела.
Жгутики можно обнаружить при электронной микроскопии после
обработки тяжелыми металлами или в световом микроскопе после окраски по
методу Леффлера, серебрения по Морозову.
Фимбрии и пили представляют собой нитевидные образования,
расположенные на поверхности бактериальной клетки, состоящие из белка
пилина. Существует несколько разновидностей фимбрий, которые отличаются
друг от друга по выполняемым функциям: адгезия, питание, водно-солевой
обмен. Пили участвуют в процессе конъюгации и образуются мужскими
клетками-донорами.
20
Бактериоскопический метод диагностики основан на выявлении
возбудителей инфекционных заболеваний в исследуемом материале по
морфологическим, тинкториальным свойствам по взаимному расположению с
применением различных методов окраски или в нативном состоянии.
Сфера применения: метод используется для диагностики заболеваний,
возбудители
которых
обладают
характерными
морфологическим,
тинкториальными, свойствами и типичной локализацией в организме,
Например: гонорея, сифилис, возвратный тиф, туберкулез, некоторых микозы.
К достоинствам метода относятся быстрота, доступность, экономичность.
К недостаткам метода относятся недостаточная информативность, низкая
чувствительность, невозможность дифференциации внутри вида.
Методические указания:
Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.
Окраска зерен волютина по методу Нейссера:
1. На фиксированный мазок нанести уксуснокислый метиленовый синий
Нейссера на 2-3 мин.
2. Промыть водой.
3. Нанести дополнительный краситель - везувин.
4. Промыть водой, высушить.
При окраске образуется нерастворимый в воде комплекс: красительвалютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а
гранулы валютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем окрашивается
везувином в желтый цвет.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:
1. На фиксированный мазок нанести нанести фильтровальную бумагу,
пропитанную карболовым фуксином Циля и прогреть в течение 3-5 мин.
2. Промыть водой.
3. Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.
4. Промыть водой.
5. Докрасить мазок раствором метиленового синего 3-5 мин.
6. Промыть водой, высушить.
В основе метода лежат разрыхление клеточной стенки бактерий для
усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под
действием кислоты. Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким
содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но
затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой.
Некислотоустойчивые бактерии окрашиваются дополнительным красителем.
Окраска капсул по методу Бурри-Гинса:
1. Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи
стекла сделать мазок.
2. На мазок нанести водный раствор фуксина на 1-2 мин.
3. Промыть водой, высушить.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы не окрашиваются и
остаются прозрачными на темном фоне туши.
21
Окраска спор по методу Ожешко:
1. Протравливание мазка 0,5 % раствором соляной кислоты 2-3 мин при
нагревании.
2. Промыть водой.
3. Окрасить по методу Циля-Нильсена.
Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается
использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей
оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. В результате
окрашивания споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные
формы – синий.
Контрольные вопросы:
1. Какое строение и функции имеет нуклеоид бактериальной клетки?
2. Какое значение в жизни бактерий имеют плазмиды?
3. Каково строение спор бактерий?
4. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов
по методу Циля-Нильсена, Бурри, Ожешки, Нейссера.
5. С помощью какого метода окраски возможно обнаружить капсулы у
бактерий?
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология ,
вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по
микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.
22
Занятие № 4 Физиология микроорганизмов.Бактериологический метод
диагностики.питание бактерий. Питательные среды. Методы выделения
чистых культур микроорганизмов.
Цель: Научиться выделять чистую культуру микроорганизмов,
учитывать рост микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
Знать: Схему бактериального метода диагностики инфекционных
заболеваний, особенности и классификацию питательных сред, особенности
питания бактерий.
Уметь: Описывать культуральные свойства микроорганизмов, выделять
чистые культуры с помощью механических методов.
Обоснование темы: Бактериологический метод является основным
методом диагностики инфекционных заболеваний, для его постановки
необходимы сведения о основных питательных потребностях бактерий и
условиях их культивирования.
Вопросы для самоподготовки:
1. Особенности бактериологического метода диагностики,
достоинства и недостатки.
2. Питание бактерий. Потребности в питательных веществах.
3.Требования, предъявляемые к питательным средам.
4. Классификация питательных сред.
5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
его
ПЛАН
Программа:
1. Метаболизм аэробных и анаэробных бактерий.
2. Питательные среды, применяемые для культивирования.
3. Понятие о чистой культуре и методы ее выделения.
Демонстрация:
1. Готовые питательные среды: мясо-пептонный агар, мясо-пептонный
бульон, среда Эндо, желточно-солевой агар, солевой бульон, селенитовый
бульон, среда Плоскирева.
2. Техника посева исследуемого материала петлей и шпателем на чашку
Петри с плотной питательной средой с целью получения изолированных
колоний.
Задание студентам:
1.Ознакомиться с питательными средами, их назначением: мясопептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среда Эндо, среда
23
Плоскирева, желточно-солевой агар ЖСА, солевой бульон (СА) селенитовый
бульон и основными инградиентами для их изготовления.
2. Описать характер роста микроорганизмов на плотной питательной
среде, оценить культуральные свойства бактерий
3.Описать характер роста микроорганизмов на жидких питательных
средах.
4. Выполнить 1 этап выделения чистой культуры аэробов из
исследуемого материала и наметить ход дальнейшего исследования.
Осуществить посев инокулята по методу Дригальского. Осуществить посев
инокулята истощающим штрихом.
6. Заполнить таблицу. Методы выделения чистых культур
микроорганизмов.
Информационный материал.
Основные среды:
Пептонный бульон. Выпускается в сухом виде, состоит из триптического
гидролизата кильки хлорида натрия.
Питательный агар. Состав: ферментативный гидролизат кормовых
дрожжей, агар, хлорид натрия.
Элективные питательные среды.
Желточно-солевой агар. Содержит 8-10% хлорида натрия, который не
препятствует росту стафилококков и питательную основу с лецитином, при
расщеплении которого вокруг колоний образуется перламутровый венчик
преципитата.
Дифферинциально-диагностические среды.
Среда Эндо - плотная, сложная питательная среда, по классификации
сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева
и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.
Состав: МПА - питательная основа; лактоза - дифференциальный фактор;
фуксин, нейтрализованный гипосульфитом - индикатор на РН.
Принцип работы среды - если выросшие микроорганизмы расщепляют
лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут
окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так
выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не
расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.
Среда Плоскирева - плотная, сложная питательная среда, по
классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется
для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного
МПА.
Состав: МПА - питательная основа; соли желчных кислот - элективный
фактор; лактоза - дифференциальный фактор; нейтральный красный индикатор на РН.
Принцип работы среды - соли желчных кислот подавляют рост
непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24
24
часа, а позже - через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут
окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и
поэтому их колонии окрашены в цвет среды.
Среда ЖСА (желточно-солевой агар) - плотная, сложная питательная
среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным.
Применяется для выделения стафилококков.
Состав: МПА - питательная основа; 10% NaCl - элективный фактор;
лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.
Принцип работы среды - 10% NaCl подавляют рост других микробов,
поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки
продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких
колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА
колонии Staphylococcus aureus.
Требования к питательным средам:
1. Среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые
для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и
кислорода, минеральные соли, факторы роста для ауксотрофных
микроорганизмов.
2. Среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в
среде должно быть таким же как и внутри клетки, для чего в среду добавляют
0,5 % NaCl.
3. Среды должны быть стерильными для обеспечения возможности
выделения чистой культуры
4. Среды должны содержать достаточное количество доступной воды т.к.
бактерии питаются по законам осмоса и диффузии.
5. Среды должны обладать определенным ОВП, т.е. соотношением
веществ, отдающих и принимающих.
6. Среды должны быть прозрачными – удобнее следить за ростом
культур.
7. Среды должны быть по возможности унифицированными по
содержанию основных компонентов: содержание аминного азота, общего азота,
содержание хлоридов, пептона.
Культуральные свойства микроорганизмов – особенности роста
микроорганизмов на плотной питательной среде.
Бактериологический метод – основной метод диагностики
инфекционных заболеваний. Включает в себя посев исследуемого материала на
питательные среды, выделении чистой культуры и ее идентификацию( посев на
плотные питательные среды, на жидкие питательные среды, определение
морфологических,
тинкториальных,
культуральных,
биохимических,
антигенных, свойств, чувствительности к антибиотикам, количества
микроорганизмов в исследуемом материале – определение вида и штамма
микроорганизма.)
25
Выделение чистой культуры основа бактериологической работы, т. к. в
процессе деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим
смесь микроорганизмов, а идентификация вида возможна тогда, когда бактерии
получены в чистом, изолированном виде.
Для получения чистой культуры необходимо отделить клетки разных
видов друг от друга. По способу их отделения различают две основных группы
методов выделения чистых культур:
1. Методы, основанные на механическом разделении.
2. Методы, основанные на различиях в биологических свойствах.
Чаще всего используют механические способы разъединения
бактериальных клеток - специальные методы посева.
Техника посева материала на плотную питательную среду.
Получение изолированных колоний. Образование изолированных
колоний достигается путем механического распределения микробов при посеве.
Существует несколько способов посева материала.
Посев по методу Дригальского производится шпателем в чашку Петри на
плотную питательную среду. Предварительно в центр среды петлей вносят
каплю исследуемой культуры, а затем растирают по всей поверхности с
помощью стерильного шпателя.
Посев истощающим штрихом производят петлей, предварительно
разделив чашку Пери на 4 равных квадрата. Посев начинают с 1 квадрата
параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.
Получение сливного роста можно использовать для накопления
полученной культуры . В пробирку со скошенным агаром вносят петлю с
материалом и производят посев зигзагом, двигаясь снизу вверх.
Ко второй группе методов получения чистых культур микроорганизмов
относятся:
а) фильтрация. Исследуемый материал пропускают через специальные
фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют
микроорганизмы по величине (например, для очистки вирусов от бактерий)
Биологические методы выделения основаны на различиях в
биологических свойствах микроорганизмов.
а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную
воду скошенного агара, при этом подвижные формы микроорганизмов при
размножении «выползают» на поверхность агара из конденсационной воды
(Proteus vulgaris).Отсевая верхний край культуры в воду свежескошенного агара
и повторяя эту манипуляцию несколько раз, можно получить чистую культуру.
б) метод прогревания – прогревают материал до 800С на водяной бане 1015 мин., при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при
посеве на питательную среду прорастают ( метод позволяет отделить споровые
культуры от неспоровых)
26
в) метод охлаждения – выращивание микроорганизмов при низких
температурах. Применяют для выделения чистых культур психрофильных
бактерий (микроорганизмы рода Yersinia выращивают при температуре 50 С)
г) бактериостатический метод при посеве в исходный материал
добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые
угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на других (пенициллин
задерживает рост Гр+ микроорганизмов, не влияя на ГР-, 5% Н2SO4 убивает
большинство микроорганизмов, исключая кислотоустойчивых (возбудитель
туберкулеза)
д) метод обогащения посев на элективные среды
е) заражение лабораторных животных.
Методические указания:
Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:
1.Форма колонии
2.Размер колонии
3.Цвет
4.Характер края
5.Характер поверхности
6. Консистенция
Посев по методу Дригальского.
1.Подготовить 3 чашки Петри со стерильной питательной средой.
2. В центр среды петлей вносят 1 каплю исследуемой культуры.
3. Равномерно растирают каплю шпателем по поверхности питательной
среды в чашке Петри.
4. Не обжигая шпателя, переносят материал последовательно во вторуюи
третью чашки Петри.
На третьей чашке Петри после инкубации должны вырасти
изолированные колонии микроорганизмов.
Посев истощающим штрихом.
1.Подготовить чашку Петри со стерильной питательной средой.
2. Разделить чашку Пери на 4 равных квадрата.
3. Посев производят петлей, начинают с 1 квадрата параллельными
штрихами и заканчивают в 4 квадрате.
Таблица. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
Метод выделения
Описание метода
Область применения
чистой культуры
Схема бактериологического метода лабораторной диагностики
Исследуемый материал
27
I этап (нативный материал): Микроскопия.
Посев на среды обогащения или на плотные питательные среды
II этап (изолированные колонии): Изучение культуральных,
тинкториальных и морфологических свойств. Посев на скошенный
питательный агар для выделение чистой культуры
III этап (чистая культура): Идентификация выделенной культуры.
Заключение о выделенной культуре
Контрольные вопросы:
1.Для чего предназначены питательные среды и каковы основные
требования к ним?
2. Какие элективные среды Вам известны? Назовите их состав.
3. Какие методы применяются для выделения чистых культур
микроорганизмов?
4. Почему бактериологический метод диагностики является основным
при диагностике инфекционных заболеваний?
5. Назовите основную схему бактериологического исследования.
6.Чем определяется длительность бактериологического исследования?
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология ,
вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по
микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.
28
Занятие № 5 Физиология микроорганизмов. Биохимические свойства
микроорганизмов.
Цель: Научиться определять чистоту выделенной культуры, делать
пересевы петлей, учитывать результаты определения биохимических свойств
бактерий.
Знать: Схему бактериального метода диагностики инфекционных
заболеваний, способы поступления питательных веществ в бактериальную
клетку, особенности обмена веществ бактериальной клетки, классификацию и
функции ферментов, методы идентификации микроорганизмов.
Уметь: Описывать биохимические свойства бактерий и осуществлять
пересевы для получения чистой культуры микроорганизмов и распознавания их
биохимических свойств.
Обоснование темы: Изучение биохимических свойств микроорганизмов
проводится с целью идентификации микроорганизмов, что является основным
звеном в диагностике инфекционных заболеваний
Вопросы для самоподготовки:
1. Пластический и энергетический обмен
2. Питание бактерий Способы поступления питательных веществ в
бактериальную клетку. Пермеазы.
2.Ферменты бактериальной клетки.
3. Идентификация и внутривидовое типирование.
4. Способы изучения биохимических свойств бактериальной клетки.
ПЛАН
Программа:
1. Особенности обмена веществ бактериальной клетки.
2. Идентификация бактерий.
3. Изучение биохимических свойств микроорганизмов.
Демонстрация:
1. Незасеянный «пестрый ряд».
2.Варианты изменения «пестрого ряда».
3. Незасеянная и измененная среда Клиглера.
4.Среда Симмонса.
5.СИБы.
6 Микрометод изучения биохимических свойств бактерий. Пластинки для
идентификации.
29
Задание студентам:
1.Изучить состав, назначение и внешний вид сред Гисса. Зарисовать
варианты изменения «пестрого ряда». Определить биохимическую активность
различных микроорганизмов по средам Гисса.
2. Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить характер роста
и присутствие посторонних бактерий.
3.Убедится в чистоте выделенной культуры методом микроскопии
окрашенного по Граму мазка.
4. Поставить каталазную пробу на предметном стекле.
5. Учесть результаты определения биохимической активности
выделенных чистых культур на среде Клиглера.
6.Осуществить посев материала на скошенный МПА для получения
чистой культуры
Информационный материал.
Обмен веществ (метаболизм) - совокупность процессов превращения
веществ и энергии, направленных на сохранение и воспроизведение жизни.
Уровень метаболизма микробной клетки выше, чем у других организмов.
Обмен веществ объединяет два процесса: пластический обмен (анаболизм,
ассимиляция) и энергетический обмен (катаболизм, диссимиляция,).
Пластический обмен – это конструктивный метаболизм, при котором
происходят реакции синтеза молекул клетки микроорганизма, обеспечивает
усвоение веществ из окружающей среды, используемых для построения
клеточных структур.Эта работа требует энергии, которую клетки получают в
результате энергетического обмена.
Энергетический обмен – расщепление питательных веществ (белков,
углеводов, липидов и др.). Эти процессы могут происходить в аэробных или
анаэробных условиях. Катаболизм и анаболизм взаимосвязаны.
У микробной клетки соотношение поверхности к массе очень высоко по
сравнению с другими организмами. Микробные клетки обладают огромным
набором ферментов.
Биохимическая идентификация.
. Для оценки биохимической активности бактерий используют
следующие реакции:
Ферментацию – неполное расщепление субстрата до промежуточных
продуктов.
Окисление- полное расщепление субстрата до углекислого газа и воды.
Утилизацию – использование субстрата для роста.
Диссимиляцию субстрата.
Гидролиз субстрата.
Традиционный метод идентификации по биохимическим свойствам
заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические
среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности
30
микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных
продуктов его метаболизма.
Определение сахаролитической активности.
1. Определение биохимической активности с помощью посева на среды
«пестрого ряда». Короткий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гиса с монои дисахаридами, глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В
длинный «пестрый ряд» кроме перечисленного входят среды с арабинозой,
ксилозой, галактозой, глицерином и т. д. Для оценки способности бактерий
ферментировать углевод в среды добавляют индикатор Андреде, позволяющий
выявить образование кислых продуктов расщепления и «поплавок» для
обнаружения газа.
2. Определение биохимической активности на среде Клиглера. Среда
Клиглера предназначена для определения ферментации глюкозы, лактозы,
выделения сероводорода и выделения газа. Разливается в пробирки и
скашивается наполовину. Незасеянная среда Клиглера имеет красный цвет.
Если после инкубации скошенная часть среды меняет цвет с красного на
желтый, происходит ферментация лактозы, если столбик агара меняет цвет с
красного на желтый – происходит ферментация глюкозы. Если в столбике агара
наблюдается почернение – выделяется сероводород и происходит ферментация
глюкозы. Если в среде наблюдаются пузырьки газа, следовательно в процессе
ферментации выделяется газ.
Определение протеолитических свойств микроорганизмов.
Для определения протеолитических ферментов производят посев
культуры на мясо-пептонную желатину, которую инкубируют при комнатной
температуре несколько дней. При наличии протеолитических ферментов
бактерии разжижают желатин.
При разрушении белков может выделятся аммиак, индол или
сероводород.
Реакция на аммиак. Применяют полоску фильтровальной бумаги
пропитанной индикатором. При положительном результате бумага синеет.
Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий
добавляют несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола на
поверхности появляется розовое кольцо.
Реакция на сероводород. Можно использовать фильтровальную бумагу с
сульфатом железа. При выделении сероводорода бумага окрашивается в
черный цвет.
Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят 1-2 капли раствора
пероксида водорода и вносят нее петлю с исследуемой культурой. Выделение
пузырьков газа свидетельствует о наличии каталазы.
Определение биохимической активности микроорганизмов с
использованием Системы индикаторных бумаг (СИБы)
Принцип действия: диски из фильтровальной бумаги, пропитанные
питательными средами (питательная среда + субстрат+индикатор) и
высушенные, хранятся во флаконах. В лаборатории диски раскладываются в
31
стерильные пробирки и заливаются суспензией исследуемой культуры в
физрастворе. Учет проводят после 18-24 часовой инкубации в термостате по
изменению цвета индикатора.
Определение биохимической активности микроорганизмов с
использованием Панелей биохимической идентификации.
Принцип действия: в лунках специальных пластиковых панелей
находятся
соответствующие
высушенные
среды
(питательная
основа+субстрат+индикатор). В лаборатории в лунки вносят суспензию
исследуемой культуры и после инкубации (5-24 часа) учитывают результат по
изменению цвета индикатора.
Примеры: Панель биохимической дифференцировки энтеробактерий,
панель биохимической дифференцировки стафилококков.
Системы автоматизированной идентификации.
Принцип действия тот же, что и в предыдущем пункте. Но инкубация
панелей, учет результатов и идентификация проводятся при помощи
компьютера.
Методические указания:
Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью
сред "пестрого ряда".
1.Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в
среды "пестрого ряда".
2.Посевы инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч или больше.
3.В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования
кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды;
4.При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду
с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке.
5.Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа
регистрируется по разрыву столбика.
При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку
бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида
углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая
картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют
"пестрым рядом».
Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью
среды Клиглера
1. Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей на
среду Клиглера
2. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч.
3. В том случае, если бактерии ферментируют лактозу до образования
кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в
области скошенной части.
32
4. В том случае, если бактерии ферментируют глюкозу до образования
кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в
области «столбика».
5. В том случае, если бактерии выделяют сероводород, наблюдается
изменение цвета среды с красного на черный в области «столбика».
6. При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов
наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа в толще среды.
При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.
Контрольные вопросы:
1.Для чего проводится идентификация микроорганизмов?
2. Какие методы идентификации наиболее часто применяются в
современных бактериологических лабораториях?
3. Для чего применяется «пестрый ряд» и каков его состав?
4. Что такое протеолитические свойства? Каким образом можно их
определить?
5. Что такое СИБы? Для идентификации каких бактерий их применяют?
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология ,
вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по
микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.
33
Занятие № 6 Физиология микроорганизмов. Дыхание микроорганизмов.
Анаэробы. Методы культивирования. Влияние факторов внешней среды
на микроорганизмы. Дезинфекция. Стерилизация.
Цель: Изучить принципы создания сред для анаэробов и методы их
культивирования, основные методы стерилизации и дезинфекции и
оборудование, применяемое для этого.
Знать: Особенности дыхания микроорганизмов, основные методы
выделения чистых культур анаэробов, состав питательных сред, применяемых
для выращивания анаэробов, способы контроля дезинфекции и стерилизации.
Уметь: Описывать культуральные свойства анаэробных бактерий и уметь
выбрать способ дезинфекции и стерилизации в зависимости от свойств объекта.
Обоснование темы: Анаэробы являются возбудителями многих
заболеваний, для их диагностики требуются специфические методы
культивирования.
Вопросы для самоподготовки:
1.Дыхательные цепи микроорганизмов.
2.Классификация микроорганизмов по типу дыхания.
3.Особенности питательных сред для анаэробов.
4. Создание условий для культивирования анаэробов.
5. Методы выделения чистой культуры анаэробов.
6. Стерилизация и дезинфекция.
7. Контроль качества дезинфекции и стерилизации.
ПЛАН
Программа:
1. Изучение питательных сред для анаэробов: среда Кита-Тароцци, среда
Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера, молоко
по Тукаеву.
2. Описание культуральных свойств анаэробов.
3. Изучение способов создания анаэробных условий.
4. Методы стерилизации; аппаратура, используемая для стерилизации.
5. Методы дезинфекции.
6. Методы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции.
Демонстрация:
1. Питательные среды – среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер,
Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера.
2.Варианты роста анаэробов на этих питательных средах.
3. Эксикатор, анаэростат.
4. Аппаратура, применяемая для стерилизации.
34
Задание студентам:
1. Зарисовать и записать состав и назначение питательных сред: среда
Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга,
молоко по Тукаеву, агар Цейсслера.
2. Описать особенности роста анаэробов на питательных средах.
3. Учесть результаты опытов, поставленных с целью контроля
стерилизации. Сделать заключение. Заполнить таблицу: Методы контроля
режима стерилизации.
4. Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФизлучения на стафилококки.
5. Заполнить таблицу: Основные методы дезинфекции и контроля
качества дезинфекции.
6. Оценить результаты посева материала на скошенный МПА.
Информационный материал.
Питательные среды для выращивания анаэробов:
Среда Вильсон-Блер (железосульфитный агар) готовиться из
питательного агара, к которому добавляется глюкоза, сульфит натрия, хлорид
железа (2). Анаэробные клостридии на этой среде образуют колонии черного
цвета за счет восстановления сульфита натрия в сульфид, который, соединяясь
с хлоридом железа, дает черный осадок.
Среда Китта-Тароцци. Состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и
кусочков печени. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового
масла.
Тиогликолевый бульон с гемином (элективная среда для культивирования
неспорообразующих анаэробов). Состоит из гемина, гидролизата казеина,
глюкозы, цистеина, сульфата натрия, хлорида натрия, тиогликолата натрия.
Сахарно-кровяной агар Цейсслера. Состоит из питательного агара, 1-2 %
глюкозы, дефибринированной крови.
Среда Вейнберга. Состоит из питательного агара, печени, фосфата
натрия, 0,5 % глюкозы, хлористоводородной кислоты.
Стерилизация (обеспложивания, «sterilis»—бесплодный)– полное
уничтожение объекта от всех микроорганизмов, находящихся как в
вегетативных, так и споровых формах. Для стерилизации применяют в
основном физические методы: стерилизация в сушильно-стерилизационном
шкафу, стерилизация текучим паром, тиндализация, автоклавирование,
прокаливание, воздействие ионизирующих излучений, кипячение. Методы
стерилизации
1. Физические методы. Существуют различные способы стерилизации
при помощи высокой температуры
35
1. Прокаливание на огне - фламбирование (спиртовка) — применяется
для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл,
предметных стекол, пинцетов.
2. Кипячение применяется редко. Кипячением в воде в течение 10-40
минут можно стерилизовать многоразовые шприцы, иглы.
3. Стерилизация сухим жаром производится в печах Пастера. Сегодня
для этой цели применяются сухожаровые шкафы различных марок.
Простейшая печь Пастера состоит из металлической емкости с двойными
стенками, оборудованной термометром для контроля температуры и
нагревательным элементом.
Приготовленный соответствующим образом материал ставят в печь и
стерилизуют в течение 45 минут при температуре 165—170°. Пробирки, колбы,
флаконы закрывают ватными пробками.
4. Стерилизация паром проводится при более низкой температуре чем
стерилизация сухим жаром, и производится при температуре в 100—120°.
Различают:
1) стерилизация паром под давлением,
2) стерилизация текучим паром.
Стерилизация паром под давлением — основана на том, что
образующийся
пар не выходит наружу, а скапливается в замкнутом
пространстве и повышает давление. Соответственно давлению повышается и
температура кипения воды; при повышении давления на 1 атм. температура
кипения будет равна 120°, при повышении давления на 2 атм.— 134,18° и т. д.
При такой температуре микроорганизмы и их споры погибают очень быстро
(при 120° в течение 15—20 минут).
Этим способом стерилизации пользуются для обеспложивания
питательных сред, лабораторной посуды, металлических и стеклянных
инструментов, для обеззараживания инфекционного материала .
Стерилизация паром под давлением производится в автоклавах. На
сегодняшний день это самый распространенный способ стерилизации в
бактериологической практике
Автоклав представляет, собой металлическую цилиндрическую емкость с
толстыми двойными стенками и с герметически закрывающейся массивной
крышкой. Автоклав оборудован манометром и термометром для контроля
давления и температуры. Под дном автоклава находятся нагревательные
элементы. Стерилизуемые предметы помещают внутрь емкости и герметично
закрывают крышку, начинается повышение давления и температуры.
Стерилизация текучим паром производится в аппарате Коха (рис. 38),
представляющем собой высокий металлический цилиндр, с двойным дном и
неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно аппарата
наливают воду, подогреваемую снизу до кипения. Образующийся пар
выделяется через края неплотно закрытой крышки. Стерилизацию производят в
течение 30—40 минут с момента выделения пара.
36
Стерилизацию текучим паром можно производить также и в автоклаве; в
таком случае крышка автоклава остается незавинченной, а выпускной кран
открытым. Текучим паром стерилизуют предметы, портящиеся от действия
высокой температуры (питательные среды).
Однократная обработка текучим паром не обеспечивает полной
стерилизации, так как при температуре в 100° гибнут вегетативные формы, но
не споры бактерий. Полное обеспложивание при помощи текучего пара
достигается при повторной (дробной) стерилизации.
Дробная стерилизация. Дробной стерилизации подвергаются материалы,
не переносящие температуры выше 100° (желатина, молоко, питательные среды
с углеводами). При температуре в 100°погибают
вегетативные формы
бактерий, затем дают оставшимся спорам прорасти в вегетативные формы и
через сутки снова стерилизуют материал при 100°. Оставшимся спорам снова
дают прорасти и через сутки снова стерилизуют материал при 100°, добиваясь
таким образом 100% стерилизации
Тиндализация представляет собой дробную стерилизацию при низкой
температуре, предложенную Тиндалем для объектов, не переносящих
температуры в 100°. Их подвергают нагреванию в течение 5—6 дней подряд
при более низкой температуре ( 56—60°) по 1 часу ежедневно. Тиндализация
производится или на водяной бане, или в специальных приборах с
терморегуляторами.
Пастеризация. Метод предложен Пастером для частичной стерилизации
жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры),
используется при температурной обработке продуктов питания(соки, молоко,
вино ). Способ основан на том, что при нагревании жидкости до 50—60° в
течение 15—30 минут или до 70—80° в течение 5—10 минут погибает
большинство бесспоровых микробов, а споры остаются жизнеспособными.
Поэтому необходимым условием является упаковка и охлаждение
пастеризованного продукта.
В бактериологической практике пастеризация при 90° применяется для
разделения споровых и бесспоровых видов бактерий.
5. Обработка материалов рентгеновскими, ультрафиолетовыми, γ-лучами
Радиационный метод стерилизации используется для стерилизации
изделий медицинского назначения одноразового применения (одноразовые
чашки Петри)
Стерилизация ультрафиолетовым облучением используется для
стерилизации воздуха помещений медицинского назначения, сложных изделий
медицинского назначения (искусственный клапан сердца и т.д.)
2. Механические методы стерилизации.
Стерилизация фильтрованием.
Применяется в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут
нагреванию (сыворотки, белковые лекарственные вещества и т. д.).
37
Для этой цели применяются фильтры тонкой очистки из мелкопористых
веществ. Они готовятся в виде цилиндрических свечей (фильтр Шамберлана,
Берке-Фельда) или асбестовых пластинок (фильтр Зeйтца).
Фильтрование производится под повышенным давлением, вследствие
чего жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник, или же создается
разрежение в приемнике и тогда жидкость всасывается в него через фильтр.
Поэтому к фильтрующему прибору присоединяется или нагнетающий, или
разрежающий насос.
Наиболее простым способом является фильтрование с помощью
водоструйного насоса: в приемнике создается отрицательное давление и
жидкость всасывается через фильтр. Стерильность профильтрованной
жидкости проверяется путем ее посева на питательную среду - посев остается
стерильным.
3. Химические методы. Методы основаны на обработке оборудования
химическими веществами, обладающими бактерицидными свойствами.
Применяются при стерилизации приборов и материалов, чувствительным к
высоким температурам.
Дезинфекция – мероприятия, направленные на уничтожение или
снижение численности микроорганизмов. Для дезинфекции применяют
физические и химические методы.
Механические методы – влажная уборка.
Физические методы: кипячение, сжигание трупов.
Химические методы: методы с использованием веществ, обладающих
антисептическими свойствами (дезинфектантов)
Классификация дезинфектантов
1. галогенсодержащие дезинфектанты (имеют в своем составе
галогены) — препараты йода (спиртовой раствор йода, раствор Люголя,
йодоформ, йодинол, йодопирин), хлора (хлорамины, хлориты);
2. перекисные соединения - перекись водорода, пергидроль (30%
водный раствор перекиси водорода) дезоксон-1 и др.
3. кислоты и их соли - борная, салициловая, тетраборат натрия, калия
перманганат, щелочи - аммиак и его соли, бура;
4. спирты - 70°—80° этанол и др.;
5.
альдегиды
формальдегид,
гексаметилен-тетрамин,
бетапропиолактон;
6. детергенты - декамин, хлоргексидин, этоний и др.
7. поверхностно-активные вещества, относящиеся к четвертичным
аммониевым соединениям и амфолитам (ниртан, амфолан и др.)
8. производные 8-оксихинолина - хинозол, интестопан, нитроксолин, 4хинолона - оксолиновая кислота, хиноксалина - хиноксилин, диоксидин;
9. производные нитрофурана - фурацилин, фурагин, фуразолидон;
10. производные фенола - трикрезол, фенилрезорцин, фенилсалицилат;
38
11. дегти - деготь березовый, ихтиол и др.;
12. красители - бриллиантовый зеленый, метиленовый синий,
этакридина лактат;
13. соединения тяжелых металлов - дихлорид ртути, нитрат серебра,
колларгол, протаргол, сульфат цинка.
14. газовая смесь из оксида этилена с метилбромидом
Методические указания:
1. Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:
1.Форма колонии
2.Размер колонии
3.Цвет
4.Характер края
5.Характер поверхности
6. Консистенция
2.Окраска по методу Грама:
1. На фиксированный мазок нанести основной краситель –
генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги.
Выдержать 2 мин.
2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.
3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.
4. Промыть водой
5. На мазок нанести дополнительный краситель – водный фуксин.
Выдержать 2 мин.
6. Промыть водой.
7. Высушить с помощью полоски фильтровальной бумаги
3. Таблица. Основные методы дезинфекции и контроля качества
дезинфекции.
Объект
Воздух в перевязочных
Поверхности
Инструменты, белье,
перевязочный материал
Метод дезинфекции
Метод контроля
4.Таблица. Методы контроля режима стерилизации.
Методы
Физические
Химические
Биологические
Принцип метода
39
Контрольные вопросы:
1.Для чего проводится стерилизация?
2. Какие методы дезинфекции наиболее часто применяются в
современных условиях?
3. Для чего питательные среды для анаэробов заливают сверху
вазелиновым маслом?
4. Какие биологические методы создания анаэробных условий Вам
известны?
5. Как проводится контроль стерильности?
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., Медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по
микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982
40
Занятие № 7 Антагонизм микробов и антибиотики.
Цель: Научиться проводить качественную и количественную оценку
чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Познакомиться с
принципами рациональной химио- и антибиотикотерапии.
Знать: Определение понятия «антибиотики», их классификация,
механизм действия, применение, получение, основные методы определения
антибиотикорезистентности.
Уметь:
осуществлять
постановку
диффузионного
теста
на
антибиотикорезистентность и учитывать его результаты.
Обоснование темы: Уничтожение патогенных для человека микробов
является одной из важнейших проблем в профилактике и лечении различных
заболеваний. Для борьбы с микробами используют методы антимикробной
терапии. Каждый метод имеет свои особые цели и условия применения.
Вопросы для самоподготовки:
1.Антибиотики, их классификация.
2.Антимиробный спектр и методы его определения.
3Практическое применение антибиотиков. Понятие о химиотерапии
4. Принципы рациональной антибиотикотерапии.
5. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, механизмы ее
формирования.
6. Методы определения антибиотикорезистентности.
ПЛАН
Программа:
1. Методы выявления антагонизма у бактерий.
2. Методы постановки тестов на антибиотикорезистентность.
3. Диффузионный тест, особенности его постановки
4. Учет результатов диффузионного теста.
5. Принципы рациональной антибиотикотерапии.
Демонстрация:
1. Результат постановки диффузионного теста.
2. Опыт по бактериоцинотипированию.
3. Аптимикробные препараты.
4. Тест с ТТХ.
5. Тест с использованием метода серийных разведений.
Задание студентам:
1.Учесть результаты опыта по бактериоцинотипированию.
2.Заполнить таблицу:
41
3.
Описать
постановку
диффузионного
теста
на
антибиотикорезистентность, осуществить постановку теста и учесть
результаты. Заполнить таблицу:
Название
антибиотика
Диаметр зоны задержки
роста
Вывод
4. Отметить достоинства и недостатки данного метода
5. Учесть результаты теста на антибиотикорезистентность методом
серийных разведений.
Информационный материал
В природных условиях различные виды микроорганизмов живут в
ассоциациях, оказывая взаимное влияние друг на друга, зависящее свойств
микробов и от окружающих условий. Одной из форм взаимодействия микробов
является антагонизм.
Антагонизм - взаимоотношения между микроорганизмами, которые
проявляются в бактериостатическом или бактериоцидном действии друг на
друга (задержка развития и гибели микроорганизмов, на которых микробантагонист оказывает свое действие)
Явление антагонизма в мире микробов известно давно (Мечников);
антагонизм наблюдается среди многочисленных групп микробов и в настоящее
время широко используется в медицинской практике в виде применения
антибиотиков для лечения и профилактики инфекционных болезней.
Антагонисты обнаруживаются в почве, воздухе, воде. При посеве исследуемого
материала или смесей микробов присутствие микробов-антагонистов
обнаруживается по светлым зонам, окружающим их колонии; эти зоны
свидетельствуют о подавлении роста угнетаемого микроба, причем величина
зоны угнетения определяет ту или иную степень активности антагониста.
1. Чашку с мясо-пептонным агаром равномерно засевают шпателем
суточной
бульонной
культурой
угнетаемого
микроба
(например,
стафилококка). Затем из чашки с агаром, предварительно засеянной
антагонистом (например, актиномицетом), вырезают вместе с агаром колонию
антагониста и накладывают на первую засеянную чашку (колонией кверху).
Эту чашку ставят в термостат при 37°. Результат учитывают через сутки —
образуется стерильная зона.
2. На чашку с мясо-пептонным агаром посредине широкой полосой
засевают суточную бульонную культуру антагониста (например, В. coli M-17).
Через сутки перпендикулярно к посеву вплотную подсевают суточную
бульонную культуру угнетаемого микроба (стафилококк, шигелла). Результат
42
учитывают через сутки пребывания в термостате — рост угнетаемого микроба
отступает от полосы, засеянной антагонистом.
Антибиотики
–
специфические
продукты
жизнедеятельности
микроорганизмов, обладающие активностью по отношению к определенным
организмам – бактериям, грибам, актиномицетам. Антибиотики задерживают
либо подавляют их рост.
Существует несколько классификаций, основанных на разных признаках
и свойствах антибиотических препаратов.
Основные классификации следующие:
По происхождению; по химической структуре; по механизму действия;
по спектру действия; по конечному эффекту.
Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют
различными методами. Наиболее распространены следующие.
Метод серийных разведений.
Готовят основной раствор препарата, содержащий определенное
количество единиц. Затем в ряд пробирок наливают 1 мл. МПБ. В первую
пробирку последовательно переносят по1 мл. основного раствора препарата,
затем во 2-ю, 3-ю и т.д.при этом каждое следующее разведение содержит вдвое
меньше антибиотика, чем в предыдущем разведении. Затем в каждую пробирку
вносят одинаковое количество испытуемой культуры. Контролем являются 2
пробирки. В одной из них МПБ и микроорганизм, в другой МПБ и антибиотик.
Посевы инкубируют 18-24 ч. в термостате. Минимальная концентрация
антибиотика, при которой не проявляется размножение бактерий, называется
бактериостатической дозой.
Метод дисков.
На поверхность питательной среды (АГВ) в чашки Петри засевают
«газоном» исследуемую культуру микроорганизмов. Посев проводят, затем на
поверхность посева на расстоянии друг от друга накладывают бумажные диски
одинакового диаметра, пропитанные различными антибиотиками. Посевы
выдерживают в термостате в течение суток. Вокруг дисков образуется зоны
задержки роста. Ее измеряют и делают вывод об антиботической активности
препарата. Если диаметр зоны задержки роста до11мм, микроорганизм
устойчив к действию данного антибиотика, если составляет от 11 до 15 мм,
микроорганизм считается умеренно устойчивым, от 15 до 25мм – чувствителен,
и свыше 25 – высоко чувствителен.
Методические указания:
Таблица:Принципы классификации микроорганизмов.
Классификация
Примеры
По химическому строению
43
По происхождению
По способу получения
По группам чувствительных микроорганизмов
По конечному эффекту
По спектру действия
По механизму действия
Методика посева методом бактериального «газона»:
1.Приготовить 2 мл. взвеси исследуемой культуры.
2. Вылить 1 мл. взвеси на поверхность питательной среды при помощи
пипетки.
3. «Прокачать» чашку Петри для равномерного распределения материала
по поверхности среды.
4. Убрать избыток жидкости с поверхности среды при помощи пипетки.
44
5. Пипетку с оставшейся взвесью поместить в дезраствор.
Оценка действия на бактерии антимикробных препаратов методом
дисков.
1.Исследуемую культуру засевают газоном на чашку Петри с плотной
питательной средой (чаще всего на МПА).
2.На засеянную поверхность среды сразу же раскладывают (не более 6 на
чашку) стандартные бумажные диски, содержащие антибиотики (30 мкг).
Каждый диск маркирован тремя буквами от названия соответствующего
антибиотика.
3.Засеянные чашки помещают в термостат.
4.Через 24 часа учитывают результат, измеряя диаметр зоны задержки
роста. Чувствительность культуры к антибиотику определяют по таблице, но
ориентировочно можно считать: до 12 мм - устойчив, до 20 – умеренно
устойчив, более 20 - чувствителен.
Контрольные вопросы:
1.Что такое антибиотики? Какова история их открытия?
2. На чем основан механизм действия пенициллинов?
3. Дайте характеристику диффузионному методу постановки теста на
антибиотикорезистентность. Назовите его достоинства и недостатки.
4. Каковы требования к антимикробным препаратам?
5. Какие осложнения могут вызывать антибиотики?
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по
микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982
45
Занятие №8 Бактериофагия.
Цель: Изучить методы выделения, идентификации и титрования
бактериофагов. Познакомиться с принципами применения препаратов
бактериофагов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний.
Знать: Строение бактериофагов, их классификацию, их основные
свойства. Определение понятий фагопрофилактика, фаготипирование,
фаготерапия, фагодифференцировка.
Уметь: осуществлять постановку опыта по фаготипированию,
фагодифференцировке, учитывать их результаты.
Обоснование темы: Фаготипирование является одним из методов
идентификации микроорганизмов. Бактериофаги нашли широкое применение
для лечения и профилактики инфекционных заболеваний.
Вопросы для самоподготовки:
1.Строение бактериофага, его морфологические группы.
2.Свойства бактериофагов.
3. Этапы взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой.
4. Феномен роста бактериофага на плотной и жидкой питательной среде.
5. Качественные пробы на бактериофаг.
6.Способы титрования бактериофагов.
7 Применение бактериофагов в медицине.
ПЛАН
Программа:
1.Методы выделения бактериофага из окружающей среды и их
идентификация.
2.Метод титрования бактериофага по Грациа
3. Метод определения лизогенных бактерий.
4.Метод фаготипирования стафилококков.
5.Качественный проба на бактериофаг по Отто.
Демонстрация:
1. Методы выделения фага из внешней среды.
2. Фаготипирование микроорганизмов.
Задание студентам:
1.Учесть результаты опыта по фаготипированию.
2. Описать постановку качественной пробы на бактериофаг по Отто,
поставить его и учесть результаты.
3.Учесть результаты количественного теста на определение бактериофаг.
46
Информационный материал.
Культивирование вирусов
1. Выделение вирусов на лабораторных животных
В настоящее время лабораторные животные применяются сравнительно
редко для выделения вирусов из инфекционного материала. Этот метод почти
полностью заменен выделением вирусов в культурах клеток и развивающихся
куриных эмбрионах, поскольку это более экономично, менее трудоемко и
позволяет быстро учитывать результаты исследования.
Лабораторных животных используют главным образом для выделения
вирусов, не вызывающих развития цитопатических изменений в культурах
клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах, а именно: для вирусов
Коксаки А, возбудителей трансмиссивных инфекций и лимфоцитарного
хориоменингита. Для выделения указанных вирусов применяют белых мышей.
Методы заражения животных, учет результатов исследования и применяемые
методы серологической идентификации выделенных вирусов описаны в раз
делах «Энтеровирусные инфекции», «Энцефалиты», «Лимфоцитар ный
хориоменингит».
2. Работа с развивающимися куриными эмбрионами
Для вирусологических исследований используют оплодотворенные яйца
7—12-дневного возраста, которые обычно получают из птицеводческих
хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обыкновенном термостате, на дно
которого ставят лотки с водой для увлажнения воздуха. Температура в
термостате должна быть 37— 38°С, а влажность воздуха — 60—65%.
Отбирают крупные чистые (но немытые) оплодотворенные яйца,
предпочтительно от белых кур, хранившиеся не более 10 дней при 5—10°С.
Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который
при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка. В
термостате яйца содержат на специальных деревянных или металлических
подставках, имеющих несколько рядов круглых отверстий размером 3,5—4 см.
В процессе инкубации яйца следует ежедневно выносить из термостата на 20—
30 мин для проветривания и периодически просматривать в затемненной
комнате над овоскопом с целью контроля за развитием эмбриона. Овоскоп
представляет собой деревянную или металлическую коробку без дна с
поверхностью 12X12 см и высотой 10 см. Сверху делают отверстие диаметром
3,5 см для яйца, а в боковой стенке внизу — небольшую выемку для шнура от
электрической лампочки, которую помещают внутрь.
При работе с вирусами могут быть использованы различные методы
заражения куриных эмбрионов, но наибольшее практическое применение
получило нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в
аллантоисную, амниотическую полость .
3. Работа с культурами клеток
Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда
условий. Одним из них является строгое соблюдение стерильности при работе,
47
так как используемые питательные среды служат питательным субстратом
также для бактерий и грибов. Клетки тканей обладают весьма высокой
чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать
исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в
состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки
посуды и резиновых изделий, применяемым при культивировании клеток.
Для выделения вирусов от больных могут быть использованы разные
методы культивирования тканей вне организма. Однако в настоящее время
наибольшее практическое применение получили однослойные культуры
первично трипсинизированных и стабильных линий клеток. Преимуществом
однослойных культур клеток является относительная простота методики
приготовления клеточного слоя и легкость учета вызываемых вирусами
морфологических изменений в нем.
Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных
сосудах — матрацах — вместимостью 1 л, 250 и 100 мл и в обычных
бактериологических пробирках, обработанных соответствующим способом .
Трипсинизированные культуры клеток
Сущность метода заключается в разрушении межклеточных связей в
тканях протеолитическими ферментами и разобщении клеток для выращивания
монослоя на поверхности стекла.
Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов,
забитых животных и птиц, а также извлеченные у человека при операции.
Используются нормальные и злокачественно перерожденные ткани,
эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к
размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью
дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более
интенсивной способностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому
клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивируются вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных. Наибольшей
потенцией роста среди тканей эмбриона обладают клетки соединительной
ткани, а от взрослых животных — эпителиальные клетки.
Наиболее широкое применение в вирусологической практике нашли
культуры из трипсинизированных эмбриональных клеток человека, кур, коров,
овец, свиней, кроликов, морских свинок, белых мышей и почечных клеток
взрослых обезьян.
Выбор ткани зависит от чувствительности ее клеток in vitro к тому или
иному вирусу. Строгого параллелизма между восприимчивостью животных in
vivo и чувствительностью клеток их тканей in vitro к вирусам не наблюдается.
Получение и обработка тканей перед трипсинизацией. Извлечение
эмбрионов и анатомирование тканей производят в боксе вблизи газовой
горелки в строго асептических условиях. Извлекаемые ткани не должны
соприкасаться с дезинфицирующими растворами, губительно действующими
на клетки.
48
Эмбриональные ткани человека получают из родильных- домов в виде
свежих соскобов полости матки при удалении 8—14-недель-ной беременности
у женщин, не больных инфекционными заболеваниями. Соскоб собирают в
стерильный сосуд, доставляют в лабораторию не позднее 3—4 ч после
операции и разбирают на эмалированном лотке, обеззараженном спиртом и
обжиганием. Так как кусочки тканей (кожа, мышцы, легкие, почки) бывают
загрязнены, их отмывают в течение 30 мин тремя порциями солевого раствора,
содержащего высокую концентрацию антибиотиков (500 ЕД пенициллина и
200 ЕД стрептомицина на 1 мл среды).
Используют также ткани 5—6-месячных плодов после искусственного
аборта и амниотическую оболочку, которую получают от рожениц с
нормальными родами. Оболочку освобождают от плаценты, хориона и
тщательно промывают солевым раствором с высоким содержанием
антибиотиков.
Перевиваемыми линиями клеток называют культуры, обладающие
способностью к размножению и перевивкам вне организма. В табл. 16
представлен перечень клеток, получивших наибольшую известность и
применение.
При пересеве перевиваемых клеток питательную среду отсасывают
пипеткой Мора и выливают. Клетки монослоя снимают с поверхности стекла
при помощи диспергирования химическими веществами, в качестве которых
используют 0,02% раствор версена или 0,25% раствор трипсина. Версен дает
наилучшие результаты при диспергировании эпителиоподобных клеток, а
трипсин — при диспергировании фибробластоподобных клеток.
В матрацы вместимостью 1000, 250 и 100 мл диспергирующий раствор
добавляют соответственно по 30, 15 и 10 мл. Культуры клеток, залитые
раствором, инкубируют в термостате до отделения клеток от поверхности
стекла при легком покачивании сосуда (с раствором вергена — обычно 10 мин,
с раствором трипсина — 5 мин). Взвесь клеток разливают в пробирки и
осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин. При диспергировании
клеток трипсином осадок отмывают солевым раствором; при использовании
версена отмывания не требуется, так как при добавлении питательной среды
содержащийся в ней кальций прекращает действие версена. Осажденные
центрифугированием клетки ресуспендируют в небольшом количестве
питательной среды. Взвесь клеток контролируют на стерильность, после чего
подсчитывают в камере Горяева в окрашенном или неокрашенном виде.
Вирусы бактерий (бактериофаги) широко распространены в природе.
Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему
микроорганизмов.
Строение бактериофагов.
Типичная частица бактериофага имеет форму головастика и состоит из
головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45—
49
140 нм и хвоста толщиной 10—40 и длиной 100—200 нм. В головке,
окруженной белковой оболочкой — капсидом, содержится нуклеиновая
кислота. Различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие бактериофаги. Хвост
представляет собой белковую оболочку — продолжение белковой оболочки
головки. Содержимое головки состоит дезоксирибонуклеиновой кислоты
(ДНК) (длина её нити во много раз превышает размер головки и достигает 60—
70 мкм, эта нить плотно скручена в головке) или рибонуклеиновой кислоты
(РНК) и около 3% белка и некоторых других веществ. Отросток имеет вид
полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки,
подобные мышечным. У ряда бактериофагов чехол способен сокращаться,
обнажая часть стержня. На конце отростка у многих бактериофагов имеется
базальная пластинка с несколькими шиловидными или другие формы
выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют
прикреплению фага к бактерии. Оболочки головки и отростка состоят из
белков. Общее количество белка в частице фага 50—60% , нуклеиновых кислот
— 40—50% .
В оболочку фаговой частицы и отростка входит белок, состоящий из
полиаминов: спермин, путресцин, кислоторастворимый пептид.
Другие бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие —
нитевидны, размером 8x800 нм.
1.Классификация бактериофагов по морфологическому строению:
Различные формы бактериофагов (А-Г) и геометрические формы головок
фагов (Д, Е). А. Нитевидная форма (колифаг fd). Б. Головка (гексагональный
контур) с отростком и сократимым чехлом (например, колифаги Т2, Т4 и Т6).
В. Головка с длинным, гибким несократимым отростком (например, колифаги
Т1 и Т5). Г. Головка с коротким отростком (например, колифаги ТЗ и Т7, фаг
сальмонеллы Р22). Д. Октаэдр. Е. Икосаэдр. (Bradley D. E., Bacteriol. Rev., 31
[1967], 230.)
Каждый
бактериофаг
обладает
специфическими
антигенными
свойствами, отличными от антигенов бактерии-хозяина и других фагов.
Имеются антигены, общие для ряда фагов (особенно содержащих РНК).
Бактериофаги подобно другим вирусам являются абсолютными
внутриклеточными паразитами.
2.Классификация бактериофагов
по характеру взаимодействия с
микробной клеткой.
По характеру взаимодействия с микробной клеткой различают
вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают продуктивную
инфекцию, заканчивающуюся образованием новых фаговых частиц и лизисом
бактериальных клеток. Умеренные фаги вызывают интегративную инфекцию,
не приводящую к лизису клеток. ДНК этих фагов включается в хромосому
бактерий и передается при их делении по наследству. Такой тип
взаимодействия фага с бактериальной клеткой называют лизогенией. А
50
бактерии, несущие в своей хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются
лизогенными.
Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной культуры
сопровождается лизисом бактерий и просветлением среды.
Выделение фага из объектов окружающей среды. Для получения
вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал через
бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с бактериальной культурой засевают
в бульон и инкубируют. После лизиса культуры оставшиеся бактерии удаляют
центрифугированием или фильтрацией.
Методические указания:
Качественный метод определения фагов (метод Отто).
Чашку Петри с питательным агаром засевают бульонной культурой
газоном. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так,
чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в
термостате просматривают чашки, отмечая наличие зоны лизиса по месту
стекания капли фага.
Фаготипирование бактерий.
Исследуемую бульонную культуру бактерий засевают на поверхность
питательного агара в чашке Петри, делят на квадраты, на которые наносят по
одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации
отмечают те квадраты, в которых имеется лизис бактерий. Фагопип
бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее
лизис.
Практическое использование бактериофагов.
1. Фаготерапия.
–
применение
бактериофагов
для
лечения
инфекционных заболеваний.
2. Фагопрофилактика – применение бактериофагов для профилактики
инфекционных заболеваний.
3. Фагодифференцировка – применение бактериофагов для определения
вида исследуемой культуры.
4. .Фаготипирование – применение бактериофагов для внутривидовой
идентификации исследуемых микроорганизмов (определение фаготипа)
5. Санитарно-показательные
микроорганизмы.
Использование
бактериофагов
(колифагов)
в
качестве
санитарно-показательных
микроорганизмов.
Контрольные вопросы:
1.Каково строение бактериофага?
2. Назовите основные этапы взаимодействия фага с бактериальной
клеткой?
3. Что такое профаг?
4.Какие качественные методы идентификации фагов Вам известны?
5. Какова методика титрования фагов в жидкой среде по Аппельману?
51
6. Назовите основные сферы применения бактериофагов в медицине.
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология ,
вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по
микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982
52
Занятие № 9 Генетика микроорганизмов.
Цель: Ознакомиться с особенностями наследственности, видами
изменчивости микроорганизмов, теоретическим и практическим значением
генетики микроорганизмов, с современными методами генетических
исследований и использованием их в медицинской практике.
Знать: Строение генома бактерий, виды изменчивости микроорганизмов,
практическое применение методов генетики в народном хозяйстве, медицине.
Уметь: осуществлять постановку экспериментов по выявлению
различных видов изменчивости.
Обоснование темы: для идентификации микроорганизмов применяют
многие молекулярно-генетические методы, что значительно ускоряет
постановку правильного диагноза.
Вопросы для самоподготовки:
1.Материальная основа наследственности.
2.Понятие о генотипе и фенотипе бактерий.
3.Виды изменчивости.
4. Классификация мутаций.
5. Репарации поврежденной ДНК.
6. Генетические рекомбинации у бактерий, механизмы и значение.
7. Классификация и роль плазмид.
8. ПЦР и ДНК-зонды, их применение.
ПЛАН
Программа:
1. Модификационная изменчивость. Пигментообразование при разных
температурах. О и Н- формы при росте на МПА и среде Плоскирева.
2. Мутационная изменчивость.
3. Рекомбинантная изменчивость. Постановка опытов по трансформации,
трансдукции и конъюгации.
4. Применение методов генетики в медицине.
Демонстрация:
1. Опыт по пигментообразованию.
2. Рост протея на МПА и среде Плоскирева.
3. Диссоциация энтеробактерий на различные формы колоний.
4. Эксперимент по различным видам рекомбинаций.
Задание студентам:
1.Заполнить таблицу: Классификация и функции плазмид.
53
2.
Заполнить
таблицу:
Молекулярно-генетические
методы
лабораторной диагностики.
3. Описать различные виды колоний энтеробактерий при диссоциациях.
4.Учесть результаты опытов, поставленных с целью выявления
трансдукции, трансформации и коньюгации. Сделать заключение.
Информационный материал.
Ген – структурная и функциональная единица наследственной
информации, участок ДНК, контролирующий синтез определенного белка.
Геном
- совокупность генов гаплоидного набора хромосом клетки.
Амплификация - увеличение числа копий генов / часто плазмид
молекулярным весом / в клетке.
Элиминация - удаление генов из клетки / особенно плазмид под
действием УФ, акридиловых красителей/.
Траспозоны
- участки ДНК, способные к перемещению внутри
молекулы и от одной к другой, могут быть переданы из клетки в клетку.
Is – последовательности
- нуклеотидные последовательности, не
кодирующие выработку белка, а ответственные за встраивание транспозонов в
молекулу ДНК.
Мутация - изменение генотипа.
Сексдуция - перенос фрагмента хромосомы F – фактора при конъюгации.
Трансдуцирующий фаг - умеренный фаг, который переносит
бактериальные гены от донора к реципиенту.
Фактор компетенции - особый белок, создающий условия для
трансформации в клетке.
Генетический аппарат бактерий имеет ряд особенностей организации.
Особенности генетического аппарата бактерий:
а/ цитологические:
1. Наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом;
2. В отличие от ядра нуклеоид не имеет ядерной мембраны;
3. В нуклеоиде нет ядрышек;
4. В нуклеоиде одна хромосома;
5. В бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное
вещество – плазмида;
6. Молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ.
б/ молекулярные:
1. Хромосома бактерий имеет кольцевую структуру;
2. Хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит
гистонов;
3. В ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных /
минорных / азотистых оснований, или выполняют защитную функцию
гистонов;
4. ДНК бактерий содержит is – последовательности, строение которых
аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов;
54
5. Отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава:
Соотношение гуанина и цитозина /Г/Ц – индекс/ у бактерий имеет
видовые отличия.
Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды –
дополнительные,
внехромосомные
элементы
наследственности
/
внехромосомная молекула ДНК, гены которой отвечают за ряд селективных
свойств и способен к автономной репликации.
Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой двунитчатой ДНК,
но ее размеры значительно меньше хромосомы. Плазмида содержит
структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной
репликации, is – последовательности. У некоторых плазмид есть гены,
ответственные за ее трансмиссивность / перенос, передачу/. Такие плазмиды
называются трансмиссивными / конъюгативными/.
Основные свойства плазмид:
1. Гены плазмид несут не обязательную для клетки информацию, а лишь
сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать
может, а без хромосомы нет;
2. Плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молекулярную массу,
чем хромосомная;
3. Плазмиды способны к автономной репликации или их репликация
находится под ослабленным контролем хромосомы;
4. Для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление
амплификации / многопийности/;
5. Некоторые плазмиды /F, R – факторы/ способны находиться как в
автономном, так и интегрированном с хромосомой состоянии; штаммы, у
которых F- фактор интегрирован с хромосомой, - Hr – штаммы;
6. Молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и
химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем
хромосомных;
7. Некоторые физические /УФ, СВЧ и др./ и химические / акридиловые
красители/ агенты вызывают алиминацию / удаление, потерю / плазмид;
8. Плазмиду могут содержать tra – гены и самостоятельно передаваться в
процессе конъюгурации, это конъюгативные плазмиды; частота передачи
плазмидных генов выше, чем хромосомных; трансмиссионность /передача,
перенос / плазмид может быть связан и с переносом их в клетки умеренными
трансдуцирующими фагами;
9. В клетке могут находится несколько разных плазмид, но некоторые
плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы
несовместимости плазмид.
Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий. Различают:
1. R – плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость;
2. F – плазмиды – определяют пол бактерий;
3. Col – плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов;
4. Hlj - плазмиды – кодируют синтез гемолизинов;
55
5. Ert – плазмиды – детерминируют синтез энтеротоксина;
6. Плазмиды биодегративные – обуславливают расщепление сложных
ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПАВ и др.
Плазмиды играют важную роль в процессах рекомбинации /обмена
генетической информации/ у бактерий.
У бактерий имеется 2 типа изменчивости: фенотипическая и
генотипическая. Фенотипическая изменчивость (модификации)- это изменение
внешних признаков, не затрагивающее генотип.
Фенотип- совокупность всех признаков и свойств организма,
сформировавшихся в процессе его индивидуального развития; фенотип
определяется взаимодействием генотипа с условиями окружающей среды.
Генотипическая изменчивость затрагивает не только фенотип но и
генотип
- совокупность всех генов клетки.
Проявлениями фенотипической изменчивости у бактерий являются
модификации: кратковременные / в пределах одного поколения/ и длительные/
сохраняются в поколениях/.
Отличия длительной модификации от мутации
1. Отсутствие изменений в структурных генах генотипа;
2. Приобретение новых свойств большим числом особей в популяции;
3. «Затухание» /исчезновение/ признака в ряду поколений.
Примером фенотипической изменчивости бактерий является диссоциация
- расщепление признака при изменении условий культивирования: переход
форм с гладкими колониями в Р – формы с шероховатыми колониями, потеря
пигмента, появление неподвижных вариантов у подвижных бактерий и т.д.
Генотипическая изменчивость бактерий связана с мутациями и
рекомбинациями. /см. словарь основных терминов/.
Мутации у бактерий могут быть спонтанные и индуцированные
известным мутагеном. По локализации различают: а/ генные – затрагивают
один ген; б/ хромосомные – затрагивают группу генов; в/ плазмидные –
затрагивают гены плазмид.
Механизм мутаций Вам известен. Это: а/ делеция – потеря гена или
участка ДНК; б/ дупликация – удвоение генетического фрагмента; в/
транспозиция – изменение положения гена; г/ инверсия – переворот участка
ДНК на 180; д/ вставка нового гена.
Фенотипическое проявление мутаций чаще ведет к потере признака –
прямая мутация или к его восстановлению – обратная мутация. Так как у
бактерий одна хромосома, то частота фенотипических проявлений мутаций
высока, а делеция большого участка хромосомы летальна для бактерий.
Вторым механизмом генотипической изменчивости у бактерий являются
рекомбинации. - перераспределение генетического материала родителей в
потомстве / обмен генетического материала, приводящий к появлению новых
сочетаний генов/.
56
Особенности рекомбинации у бактерии:
1. Однонаправленность переноса генетической информации /от донора к
рецепиенту/;
2. Неодинаковое долевое участие генома и реципиента в образовании
рекомбинанта /реципиентный геном полностью переходит к рекомбинанту, а от
донора только отдельные гены, плазмиды/;
3. В результате рекомбинации образуется мерозигота
/частичная
зигота/;
4. Наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъюгация,
трасформация, трансдукция, слияние протопластов.
Механизмы рекомбинации:
I.
Конъюгация – перенос генетической информации при
непосредственном контакте донора и реципиента. Это аналог полового
процесса у бактерий. Поло у бактерий определяет F – плазмиды: в «мужских»
клетках /F+/ она есть, в «женских» /F-/ - отсутствует.
Отличия f+ b f- клеток
1. У F+ клеток есть дополнительная генетическая информация /F –
фактор/;
2. F+ клетки имеют на поверхности специальные  - пили,
обеспечивающие контакт при конъюгации;
3. F+ клетки имеют дополнительный i – антиген / белок  - пилей/;
4. F+ и F- клетки отличаются поверхностным зарядом;
5. F+ клетки чувствительны к «мужским» фагам, которые не
адсорбируются на F- клетках;
6. F+ клетки обладают свойствами донора/отдают генетическую
информацию/, а F- клетки – свойствами реципиента /воспринимают
генетическую информацию/. Как уже указывалось, рецепиентные клетки
участвуют в образовании рекомбинанта всем своим геномом, а донор передает
свою генетическую информацию лишь частично. Чаще это конъюгативные
плазмиды, но Hr – штаммы /см. словарь основных терминов/ передают с
высокой частотой хромосомные гены при коньюгации.
II. Трансдукция – перенос генетической информации от донора к
рецепиенту с помощью трансдуцирующего фага. Трандуцирующий фаг – это
умеренный фаг, при который при индукции дизогенной культуры захватывает
соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток вносит в них
эти гены.
При строгой специфичности локуса интеграция умеренного фага с
хромосомой лизогенной клетки /например, для фага  - рядов с lас – опероном,
для фага Р – рядов с trp – опероном и т.д./ при индукции захватываются и
переносятся всегда строго определенные гены – это специфическая
трансдукция. Перенос случайных бактериальных генов умеренным фагом –
общая трансдукция.
Захват случайных бактериальных геновы может
57
происходить при сборке фагов или в том случае, каогда профаг не имеет строго
определенного локуса в геноме бактерий.
Изменение свойств бактерий, инфицированных умеренным фагом, может
происходить и под действием генов самого фага – явление фаговой, или
лизогенной конверсии.
Отличия трансдукции от фаговой конверсии:
1.
Приобретение новых свойств при трансдукции идет за счет
бактериальных генов, а при фаговой конверсии – за счет фага.
2.
Частота трансдукции значительно ниже частоты фаговой
конверсии.
III. Трансформация – передача генетической информации при
культивировании реципиента на среде с ДНК донора.
Трансформация возможна у близкородственных бактерий. Реципиент
получает не всю молекулу ДНК донора, а ее отдельные фрагменты. Реципиенты
клетки должны быть в состоянии компетентности. У клетки, готовой
воспринять генетическую информацию, обнаруживается особый белок –
фактор компетентности.
Его действие связывают: а/ с повышением
проницаемости клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, б/ с ингибированием ДНКаз, в/ с активированием синтеза и рестриктаз. Это состояние наблюдается в
процессе деления клетки. Когда она активно строит свою ДНК, то в этот
момент могут быть захвачены фрагменты чужой ДНК. In vivo в популяции
часть клеток всегда активно размножается, а часть погибает, то есть имеются
условия для трансформации. In vitro эти условия создают искусственно.
Молекулярно-биологические методы идентификации
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Принцип метода:
Исследуемый материал подвергается специальной обработке, при
которой происходит лизис клеток с выходом ДНК. Часть материала
переносится в пробирку, содержащую смесь мононуклеотидов, ДНКполимеразу и праймер – уникальную последовательность нуклеотидов,
присущую искомому возбудителю. Циклическое изменение температуры ( 30
циклов) позволяет осуществить репликацию определенного возбудителя. Этот
процесс называется амплификацией, в результате которого количество
специфической ДНК увеличивается в миллионы раз. Такие количества ДНК
могут быть выявлены с помощью электрофореза в агаровом геле.
Преимуществами метода ПЦР являются:
1. Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых
биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК
микроорганизмов, так и к ДНК человека.
2. Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР
определяется уникальный участок гена, характерный только для данного
возбудителя. Для повышения специфичности возможно определятьнесколько
58
разных генов одного микроба. Так, например, для определения Ureaplasma
urealyticum можно выявлять как ген 16S-RNA, так и ген уреазы. А для
идентификации Chlamydia trachomatis, помимо определения хромосомальной
ДНК и ДНК криптической плазмиды сталовозможным выявлять
рибосомальную РНК (NASBA). Это значительно повышает достоверность
исследования.
3. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна
выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности
большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это
значительно
превышает
чувствительность
культуральных
методов
исследования.
4. Малый объем биологического материала. Проведение анализа
возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что
крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине.
5. Возможность диагностики не только острых, но и латентных
инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно
культивируемых,
некультивируемых
и
персистирующих
форм
микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и
хронических инфекциях.
Недостатки метода ПЦР
1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего
микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании
ПНР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный
контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого
происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод выявляет РНК
только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений.
2. Высокая чувствительность. Ряд
микроорганизмов (условнопатогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом
количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые
количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена
с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR).
3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось
выше, для амплификации можно использовать различные участки генома
возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно
изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при
использовании тест систем разных производителей
ДНК зондирование.
Принцип метода: Исследование проводят с помощью нуклеиновых
зондов – фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам
микробного генома и несущих метку ( радионуклид, фермент или флюорохром
) . Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В
зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-,
видо- или типоспецифическими.
59
Сазернблоттгшг (гибридизация по Сазену) - выявление участка ДНК
путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на
мембране фрагментов искомой ДНК с мечеными комплементарными ДНКзондами. Сначала с помощью гель-электрофореза разделяют фрагменты ДНК.
После электрофореза гель переносят в щелочной раствор для получения из
двунитевой ДНК однонитевых фрагментов. Затем фрагменты ДНК переносят из
геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембраны и гибридизируют со
специфической меченой пробой ДНК (комплементарным олигонуклеотидным
зондом, меченным радионуклидом или флюо-рохромом). Неспецифически
связанные молекулы зонда отмываются, а меченые участки выявляют путем
экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография), на
которой проявляются полосы меченого зонда ДНК. Зонды, меченные
флюорохромом, выявляют при помощи люминесцентной микроскопии.
Нозернблоттинг применяют для выявления и гибридизации РНК (фрагментов
РНК). В этом методе размер и количество специфических молекул и РНК
определяются после обработки общей РНК или поли(А)РНК. Молекулы РНК
выделяют гель-электрофорезом и переносят на иммобилизованную мембрану.
Искомые последовательности РНК определяют гибридизацией с меченой
пробой.
ДНК- ДНК -гибридизация
ДНК-ДНК-гибридизация основана на денатурации, т.е. разделении
двунитевой ДНК на отдельные нити в щелочной среде при температуре около
90 °С и последующем восстановлении (отжиге) двунитевой структуры с
комплементарной меченой нитью ДНК (молекулярным зондом) при понижении
температуры до 10-37 °С. Гибридизацию часто проводят на фильтрах (блотгибридизация), или in situ. Молекулярный зонд с присоединенным биотином
гиб-ридизируется на ДНК-мишени. После отжига и промывки на образец
наносят антибиотиновый конъюгат (стрептавидин, соединенный с щелочной
фосфатазой) и проводят специфическое окрашивание клеток. Стрептавидин
можно метить, кроме щелочной фосфатазы, флюорохромами. Стрептавидин с
меткой избирательно связывается биотином, что выявляется при микроскопии.
Так выявляют локализацию микробов в ткани, хромосомные аномалии в
клетках и т.д.
Риботипирование
Риботипирование - выявление количественных различий по рибосомным
оперонам и нуклеотидным последовательностям. Проводят гидролиз ДНК,
которую разделяют в агарознок; геле и затем гибридизируют с ДНК-зондами на
один или более генов, кодирующих 16S-, 23S-, 58-рибосомные РНК. Бактерии
можно типировать по серотипу, фаготипу и по риботипу. Методически сходно
с рибо-типированием IS-типирование: проводят сравнительный анализ числа
копий IS-элементов и рестрикционного разнообразия нуклеотидных
последовательностей различных штаммов микробов.
Рестрикционный анализ
60
ДНК расщепляют с помощью рестриктаз (бактериальных эндонуклеаз),
которые распознают и разрывают определенные последовательности
нуклеотидов в нужных участках. Отдельные рестриктазы способствуют
вьщелению строго определенных фрагментов ДНК. Размер полученных
фрагментов ДНК можно определить путем электрофореза в агарозном или
полиакриламидном геле. После электрофореза каждый фрагмент ДНК
располагается в определенном участке геля в виде дискретной полосы.
Фрагменты ДНК выявляют путем обработки геля бромидом этидия, который
связывается с ДНК. Такие фрагменты ДНК высвечиваются при
ультрафиолетовом облучении в красной области спектра. Длину каждого
фрагмента можно выявить, сравнивая расстояние, пройденное фрагментом
ДНК при электрофорезе, с расстоянием, пройденным стандартным фрагментом
ДНК известного размера.
Методические указания:
Таблица: Классификация и функции плазмид.
Название плазмид
Функции плазмид
Таблица: Молекулярно-генетические методы лабораторной
диагностики.
Название метода
Достоинства
Недостатки
метода
метода
Контрольные вопросы:
1.Чем отличается строение генома бактерий от клеток эукариотов ?
2. Что такое рекомбинации и каковы их основные виды?
3. Каково значение плазмид?
4. Какие достоинства и недостатки имеются у метода ПЦР?
5. Назовите основные методы внутривидового типирования
микроорганизмов.
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология,
вирусология , иммунология. СпецЛит, 2000 г
61
4. Борисов Л. Б.
микробиологии. М. 1973 г.
Руководство
к
практическим
занятиям
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982
62
по
Занятие № 10. Контрольное занятие по теме «Морфология и физиология
микроорганизмов».
Цель: проверить знания по теме «Общая микробиология».
Знать: классификацию,
микроорганизмов.
морфологию,
физиологию
и
генетику
Вопросы для самоподготовки:
1. История микробиологии. Этапы развития. Современные задачи. Вклад
российских ученых в развитие микробиологии и иммунологии.
2. Предмет и задачи медицинской микробиологии и иммунологии.
Клиническая микробиология, ее задачи. Критерии этиологической диагностики.
Диагностика нозокомиальных инфекций.
3. Бактериологическая лаборатория. Классификация и значение.
Оборудование рабочего места. Правила поведения в бактериологической
лаборатории.
4. Основные систематические группы микроорганизмов. Понятия
«популяция», «культура», «штамм», «колония», «клон». Бактерии: определение,
систематическое положение. Тесты для дифференциации представителей
различных семейств бактерий.
5. Морфологические формы бактерий. Понятие о морфологических
свойствах микроорганизмов. Нитчатые формы бактерий: актиномицеты,
нокардии.
6. Структура и химический состав бактериальной клетки. Клеточная
стенка, микроорганизмы с дефектной клеточной стенкой, их характеристика,
строение, репродукция, методы изучения, роль в патологии человека,
лабораторная диагностика.
7. Строение и функции цитоплазматической мембраны, цитоплазмы,
рибосом, мезосом бактериальной клетки. Ядерный аппарат бактерий и его
особенности.
8. Споры, капсулы, жгутики, реснички, ворсинки, фимбрии, пили.
Функциональное назначение органелл. Методы выявления. Определение
подвижности бактерий.
9. Тинкториальные свойства бактерий. Цели и методы окраски.
10. Иммерсионный микроскоп. Особенности устройства. Принцип действия.
Использование в практике.
11. Методы
микроскопического
исследования
(люминесцентная,
темнопольная,
фазово-контрастная,
электронная
микроскопия).
Бактериоскопический метод диагностики, его задачи и возможности
12. Ферменты бактерий. Понятие о биохимических свойствах
микроорганизмов.
Автоматическая
регуляция
синтеза
ферментов.
Идентификация бактерий по ферментативной активности.
13. Типы окислительно-восстановительных процессов у бактерий.
63
14. Понятие о метаболизме. Анаболизм и катаболизм. Особенности
метаболизма у бактерий. Методы изучения метаболизма бактерий. Способы
получения энергии бактериями, Мембранное и субстратное фосфорилирование.
15. Особенности дыхательного аппарата бактерий.
16. Структурные особенности наследственного вещества бактерий.
Плазмиды бактерий: определение, основные свойства, классификация.
17. Строение генома бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе. Виды
наследуемой изменчивости. Механизмы передачи генетического материала у
бактерий.
18. Механизмы изменчивости. Мутации, их особенности, типы мутантов у
бактерий.
19. Модификации у бактерий: кратковременные и длительные. Механизм
модификаций. Отличие мутационной изменчивости от длительных модификаций.
20. Типы и механизмы питания бактерий. Классификация бактерий по
источникам углерода и азота.
21. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к
питательным средам. Рост и размножение бактерий. Фазы роста на жидких
питательных средах.
22. Принципы и методы выделения чистых культур микроорганизмов.
Культивирование бактерий.
23. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы,
Использование в практике. Стерилизация, способы, аппаратура. Дезинфекция.
Дезинфектанты.
24. Влияние биологических факторов на микроорганизмы. Использование в
практике.
25. Понятие о химиотерапии и химиотерапевтических препаратах.
Классификация химиопрепаратов.
26. Антибиотики: классификация по источнику получения, механизму и
спектру действия.
27. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
Механизмы формирования и пути преодоления лекарственной устойчивости
возбудителей
инфекционных
болезней.
Принципы
рациональной
антибиотикотерапни. Осложнения антибиотикотерапии.
28. Химиотерапия вирусных инфекций.
29. Бактериофаги. Получение, титрование, использование. Взаимодействие
фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги.
Применение в медицине Внутривидовое типирование бактерий. Методы.
Использование в практике.
30. Основы медицинской биотехнологии.
31. Бактериологический метод диагностики, его задачи и возможности.
32. Вирусы как своеобразная форма жизни. Принципы классификации
вирусов. Структура и химический состав вирусов. Особенности биологии
вирусов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот.
33. Процессы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками и
64
факторы, способные их нарушить. Методы культивирования вирусов.
34. Патогенные грибы. Их классификация, особенности биологии.
Список литературы:
1.
2.
3.
4.
Обязательная:
Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология,
вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М.
Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, вирусология
, иммунология. СпецЛит, 2000 г
Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии.
М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974 .
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982
65