зиновьевым александром ивановичем

На правах рукописи
ЗИНОВЬЕВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ
ИЗУЧЕНИЕ ГЕМАТО - И МИЕЛОПРОТЕКТОРНОЙ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИКАРБАМИНА ПРИ ЛУЧЕВОЙ
СУПРЕССИИ ГЕМОПОЭЗА И ХИМИОТЕРАПИИ
ОПУХОЛЕЙ
(Экспериментальное исследование)
14.03.06– фармакология, клиническая фармакология
(медицинские науки)
Автореферат
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО
«Пензенский государственный университет»
«Медицинский институт»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Моисеева Инесса Яковлевна
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Изюмов Евгений Геннадиевич
Доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный
медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию»
Защита состоится «___» _____________2011г. в ________ часов на
заседании диссертационного совета Д208.041.01 при ГОУ ВПО «Московский
государственный медико-стоматологический университет »
Минздравсоцразвития России (127473, Москва, ул. Делегатская, 20/1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского
государственного медико-стоматологического университета (127206,
Москва, ул. Вучетича, д. 10а).
Автореферат разослан «_____» ___________________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор
Е.Н.Ющук
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Защита организма человека и животных от
воздействия ионизирующего излучения (ИИ) является одной из самых
актуальных проблем радиационной биологии и медицины (Гуськова А.К.,
2004; Ярмоненко С.П., 2006). Экологические катастрофы техногенного и
природного происхождения, использование лучевой энергии в медицине и
промышленности
требуют
применения
медицинских
мероприятий,
направленных как на профилактику лучевой болезни, так и реабилитацию
здоровья
населения,
подвергшегося
радиоактивному
воздействию
в
различных дозах (Ильин Н.В., Соловьев В.Ю., 2004; Хмельницкий О.К.,
Парусов Ю.Ю., 2004; Кеирим-Маркус И.Б., Юганова Т.И., 2005; Баранов А.В.,
Рождественский Л.М., 2008). Радиопротекторы как средства индивидуальной
химической защиты могут применяться в чрезвычайных ситуациях на
предприятиях
атомной
промышленности
при
выполнении
срочных
ремонтных работ в условиях повышенной радиации или на загрязненной
радионуклидами территории, при космических полетах, а также в онкологии
при лучевой терапии опухолей (Баранов А.В., Рождественский Л.М., 2008).
Известно, что при облучении в сублетальных дозах решающее
значение имеет поражение кроветворной системы. Лечебный эффект
высокодозной
радиотерапии
онкологических
больных
ограничивается
развитием серьезных побочных эффектов, среди которых особое место
занимает депрессия кроветворения (Васин М.В. и др., 2008; Сакаева Д.Д.,
Лазарева Д.Н., 2008). Поэтому очевидна актуальность поиска и разработки
новых радиопротекторных средств, а также необходимость в проведении
исследований по выявлению новых фармакодинамических эффектов у
известных препаратов, способных снизить степень лучевого поражения и
ускорить постлучевое восстановление костного мозга (Квачева Ю.Е., 2003;
Ярмоненко С.П., 2006).
Использование современной интенсивной радио- и химиотерапии
опухолей также требует системы обеспечения ее переносимости, т.е.
3
применения
препаратов
сопровождения
(Переводчикова
Н.И.,
2005;
Ведерникова Н.В., 2009; Трещалин И.Д. и др., 2009; Трещалин И.Д. и др.,
2009). Необходимость разработки новых методов фармакологической
коррекции метаболического статуса, защиты организма от токсических
побочных эффектов противоопухолевых средств и лучевой терапии,
определила выбор наших научных исследований.
С этой точки зрения препарат дикарбамин: МНН - имидазолилэтанамид
пентандиовой кислоты, фармгруппа: лейкопоэза стимулятор, Код ATX:
V03AF, который ускоряет дифференцировку и функциональное созревание
нейтрофилов, представляет для нас научный интерес в свете изучения его
гемато- и миелопротекторных эффектов в связи с появлением в литературе
новых научных данных о его фармакодинамических свойствах. В ряде
предыдущих исследований была установлена способность дикарбамина
индуцировать дифференцировку опухолевых клеток экспериментальной
меланомы, эритробластоза Френд
и др., модифицировать токсичность
циклофосфамида, снижать активность апоптоза гемопоэтических клеток,
развивающегося
под
воздействием
химиопрепаратов
(Райхлин
Н.Т.,
Небольсин В.Е. и др., 2003; Райхлин К.Т., Трещалин К.Д. и др., 2003;
Райхлин Н.Т., Андронова Н.В. и др., 2005; Каршиева С.Ш., 2009; Седакова
Л.А., и др., 2010). Дикарбамин в настоящее время применяется как средство
сопровождения химиотерапии для уменьшения ее миелосупрессивных эффектов
(Трещалин И.Д., Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А. и др., 2009; Bychkov M.B. et al., 2009).
Цель исследования: изучение в профилактическом и лечебном
режимах гемато- и миелопротекторной эффективности дикарбамина при
лучевой супрессии гемопоэза и цитостатической терапии опухолей.
Задачи исследования.
1. Оценить показатели лейкоцитарного состава периферической крови в
условиях экспериментального костномозгового синдрома у мышей при
профилактическом режиме введения дикарбамина.
4
2. Изучить изменения лейкоцитарного состава периферической крови в
динамике в условиях экспериментального костномозгового синдрома у
мышей при лечебном режиме введения дикарбамина.
3. Оценить влияние дикарбамина в различных режимах введения на
выживаемость и среднюю продолжительность жизни мышей на фоне
воздействия ионизирующей радиации.
4. Исследовать гемато- и миелопротекторную активность дикарбамина в
условиях экспериментальной лучевой супрессии гемопоэза у кроликов.
5. Изучить влияние дикарбамина на эффективность лучевой и цитотоксической
терапии в условиях роста карциномы легких Льюис(LLC) у мышей.
Научная новизна работы.
1.
Впервые
дикарбамина
в
показаны
условиях
гемато-
и
миелопротекторные
экспериментального
эффекты
пострадиационного
костномозгового синдрома.
2. При введении дикарбамина в различных режимах в дозах, начиная с
5,0, 15,0, 50,0 мг/кг у экспериментальных животных выявлены статистически
значимые
различия
по
целому
ряду
исследуемых
показателей
лейкоцитарного состава периферической крови мышей, по сравнению с
контрольной
группой,
подтверждающие
гематопротекторный
эффект
препарата.
3. Дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг при лечебном пероральном введении
обеспечивал достаточно высокий уровень фармакологической защиты
кроветворной ткани кроликов после воздействия ионизирующей радиации,
что выражалось в статистически значимом уменьшении продолжительности
и глубины пострадиационного дефицита субпопуляций миелокариоцитов,
устранении
феномена
повторного
падения
абсолютных
показателей
миелокариоцитов, а также эффективной защите и стимуляции процессов
пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников.
4. Применение дикарбамина в дозе 15,0 мг/кг при лечебном
пероральном введении по сравнению с препаратом сравнения мексамином,
5
обеспечивало поддержание более оптимального лейкоцитарного состава в
условиях экспериментального костномозгового синдрома у кроликов.
5. Дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг при внутрибрюшинном (в/б) лечебном введении
и пероральном как лечебном, так и профилактическом введении увеличивал
продолжительность жизни мышей, подвергнутых облучению в дозе 5 Гр.
6. Сочетанное применение лучевой терапии с введением дикарбамина
как в профилактическом, так и лечебном режимах, не влияло на темпы роста
первичного опухолевого узла карциномы Льюис у мышей линии С57В1/6.
7. Дикарбамин
в условиях модели с хирургическим удалением
первичного опухолевого узла карциномы Льюис при сочетанном применении
с циклофосфаном увеличивал антиметастатический эффект цитостатика.
Практическая значимость исследования. Полученные
расширяют
представление
о
спектре
фармакологического
данные
действия
дикарбамина и являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего
изучения его миело- и гематопротекторной эффективности в условиях
лучевого и цитостатического повреждения биологических систем и могут
служить основой для расширения спектра его применения в медицинской практике.
Внедрение в практику. Разработанные положения включены в
программу обучения студентов на кафедре клинической морфологии с
курсом онкологии ГОУ ВПО «Пензенский государственный университет» и
на кафедре общей и клинической фармакологии ГОУ ВПО «Мордовский
государственный университет им Н.П. Огарева».
Основные положения, выносимые на защиту:
1.
Дикарбамин
профилактическом,
так
в
дозах
и
5,0,
лечебном
15,0
и
режимах
50,0
мг/кг,
введения
в
как
при
условиях
экспериментального костномозгового синдрома в значительной степени
предотвращает
снижение
числа
лейкоцитов
у
мышей
за
счет
сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови и
ускорял процесс восстановления количества лейкоцитарных клеток до
исходного уровня.
6
2. Дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг в лечебном режиме способствует
защите уровня лейкоцитов и лимфоцитов кроликов в периферической крови
и ядросодержащих клеток костного мозга на ранних этапах после гаммаоблучения и ускоренному восстановлению кроветворения.
3. Дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг в лечебном и профилактическом
режимах
введения
увеличивает
продолжительность
жизни
мышей,
подвергнутых облучению в дозе 5 Грей (Гр).
4. Однократное лучевое воздействие в дозе 2,0 Гр не оказывает
противоопухолевого и антиметастатического эффектов на модели карциномы
легких Льюис у мышей линии С57В1/6.
5. Дикарбамин не увеличивает темпов роста первичного опухолевого
узла и процесс спонтанного метастазирования опухоли LLC, а в условиях с
хирургическим удалением первичного опухолевого узла при сочетанном
применении с циклофосфаном увеличивает антиметастатический эффект цитостатика.
Личный
вклад
соискателя.
Экспериментальное
исследование,
протоколирование результатов, анализ полученных данных, статистическая
обработка данных проведены лично А.И. Зиновьевым. В ходе сбора
материала для диссертационной работы соискателем были освоены
унифицированные методики количественного изучения клеточного состава
периферической крови и костномозгового пунктата, оценки противоопухолевой и
антиметастатической эффективности, вариационной статистики.
Апробация работы. Результаты работы и основные положения
диссертации
доложены
и
обсуждены
на
межрегиональной
научно-
практической конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и
образования»
(Пенза,
2009),
научно-технической
конференции
профессорско-преподавательского состава и студентов (Пенза 2008, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том
числе – 3 в центральных журналах, рекомендуемыми ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 205
страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения,
7
выводов, списка использованной литературы, содержащего 337 источников,
из них российских - 267, иностранных - 70. Работа иллюстрирована 41
таблицой и 47 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Экспериментальные животные. Эксперименты были выполнены на 40
половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг, 1038
аутбредных белых мышах массой 18-20 гр и 206 мышах-самках линии
С57В1/6. Животных содержали на стандартном пищевом рационе вивария со
свободным доступом к воде. Все манипуляции с животными проводились в
соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных
животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей
(ETS N 123, Страсбург, 18 марта 1986 г.).
Препараты. В работе использовали субстанцию препарата дикарбамин
производства ОАО «Валентафарм», Россия. Навески субстанции растворяли
в воде для инъекций и вводили в объеме 0,2 мл мышам и 2,0 мл кроликам в
зависимости от поставленных задач в различных режимах и дозах.
Профилактический режим состоял в трехкратном введении препарата - за 3
суток, 2 суток и за 1 ч до облучения, лечебный режим включал введение
препарата дважды - через 1 ч и 24 ч после облучения.
В качестве средства сравнения в условиях экспериментальной лучевой
супрессии
гемопоэза
использован
3-(2-аминоэтил)-5-метоксиндол
(мексамин), субстанция производства ОАО «Сигма». Мексамин вводили в
профилактическом режиме внутрь в дозе 2,3 мг/кг за 1 ч до облучения.
Модель лучевого повреждения. Облучение проводилось с помощью
аппарата АГАТ-«С» разовой очаговой дозой 5 Гр при мощности дозы 0,33
Гр/мин. Расстояние от источника ионизации до ионизируемой поверхности
составляло 90 см. При этом процентная доза равнялась 94 %, а максимальная
доза ионизации составила 5,31 Гр.
8
Дизайн
исследований.
гематопротекторных
свойств
Изучение
дикарбамина
дозовой
у
мышей
зависимости
в
условиях
экспериментального костномозгового синдрома проводили на аутбредных
белых мышах-самцах массой 18-20 г (n=270), которые подвергались
однократному воздействию ионизирующей радиации по представленной
ниже схеме. Субстанцию дикарбамина вводили в 4-х дозах (0,5 мг/кг, 5,0
мг/кг, 15,0 мг/кг, 50,0 мг/кг) в профилактическом и лечебном режимах, в/б и
внутрь. Содержание лейкоцитов крови и лейкоформула изучались по
унифицированным методикам у животных до облучения, а затем на 3-и сутки
после облучения и в дальнейшем еженедельно в течение 45 суток (8
контрольных точек). Для определения содержания лейкоцитов крови и
лейкоформулы в каждой контрольной точке (-3, 3, 10, 17, 24, 31, 38, 45 дни
после облучения), забиралась кровь из хвостовой вены мышей. Схема
эксперимента представлена в табл.1.
Таблица 1. Схема экспериментов по изучению влияния дикарбамина на
морфологический состав периферической крови мышей при воздействии
ионизирующей радиации
№ Опытные
Количест
Режим введения
группы
во мышей,
шт.
1 контроль
15
ионизирующая радиация + физиологический
раствор в объеме 0,2 мл внутрибрюшинно
2 опыт 1-5
75
в профилактическом режиме в/б в дозах 0,05; 0,5; 5,0;
15,0; 50,0 мг/кг
3 опыт 6-9
60
в профилактическом режиме внутрь в дозах 0,5; 5,0; 15,0;
50,0 мг/кг
4 опыт 10-13
60
в лечебном режиме в/б в дозах 0,5; 5,0; 15,0;
50,0 мг/кг
5 опыт 14-17
60
в лечебном режиме внутрь в дозах 0,5; 5,0; 15,0;
50,0 мг/кг
Изучение влияния различных режимов введения дикарбамина на
выживаемость и среднюю продолжительность жизни мышей на фоне
воздействия ионизирующей радиации проводили на 768 аутбредных белых
мышах-самцах массой 18-20 г., которые подвергались однократному
воздействию ионизирующей радиации в диапазоне доз от 5,0 до 8,5 Гр. с
9
шагом в 0,5 Гр. для определения LD50, LD16, LD84. Субстанцию дикарбамина в
дозе 15,0 мг/кг вводили в профилактическом и лечебном режимах двумя
путями (внутрибрюшинно, внутрь). Наблюдение за животными проводилось
в течение 45 дней после облучения. Учитывали количество павших
животных и сроки их гибели. Дизайн эксперимента представлен в табл. 2.
Таблица 2. Схема экспериментов по изучению влияния дикарбамина на
выживаемость и среднюю продолжительность жизни мышей на фоне
воздействия ионизирующей радиации
№ Опытные
Группы
1 контроль 1
2
3
4
5
6
7
8
9
Количество
Режим введения
мышей, шт.
16
физиологический раствор в объеме 0,2 мл до
облучения (за 3 суток, 2 суток, за 1 ч.) в/б +
облучение в дозе 5,0 Гр.
контроль 2
16
Облучение в дозе 5,0 Гр + физиологический
раствор в объеме 0,2 мл через 1 ч. и 24 ч
после облучения
Контроль 3160
облучение в дозе 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0;
12
8,5 Гр.
опыт 1-7
112
дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг в/б до
облучения в дозе 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5
Гр.
опыт 8-11
64
дикарбамин в дозе 5,0 мг/кг внутрь до
облучения в дозе 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 Гр.
опыт 12-18
112
дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг до облучения
внутрь + облучение в дозе 5,0; 6,0; 6,5; 7,0;
7,5; 8,0; 8,5 Гр.
опыт 19-25
112
Облучение в дозе 5,0;6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5
Гр + дикарбамин в/б в дозе 15,0 мг/кг после
облучения
Опыт 2664
Облучение в дозе 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 Гр +
29
дикарбамин внутрь в дозе 5,0 мг/кг после
облучения
Опыт 30112
Облучение в дозе 5,0;6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5
36
Гр + дикарбамин внутрь в дозе 15,0 мг/кг
после облучения
Оценку миело- и гематопротекторной эффективности дикарбамина в
условиях экспериментальной лучевой супрессии гемопоэза проводили на 40
кроликах
породы
Шиншилла.
Схема
постановки
экспериментов
представлена в табл.3. Дикарбамин вводили внутрь в лечебном режиме в дозе
10
15,0 мг/кг. Препаратом сравнения явился радиопротектор мексамин, который
вводили внутрь в дозе 2,3 мг/кг за 1 ч до облучения.
Таблица 3. Схема изучения миело- и гематопротекторной эффективности
дикарбамина в условиях экспериментальной лучевой супрессии гемопоэза
№ Опытные Кол-во кроликов,
группы
шт.
Режим введения
1 контроль I
10
интактные кролики
2 контроль II
10
3
опыт 1
10
облучение D-5 Гр. + дикарбамин внутрь
15мг/кг через 1ч и 24 ч после облучения
4
опыт 2
10
облучение D-5 Гр. + мексамин внутрь в
дозе 2,3 мг/кг за 1 ч до облучения
воздействие ионизирующей радиации в
дозе 5 Гр.
Методы. Забор костного мозга и периферической крови производили у
интактных животных и на 3, 7, 10, 14, 21, 28 сутки после облучения.
Венозную кровь забирали из краевой вены уха кроликов, где
определяли: клеточный состав (абсолютное число лейкоцитов, эритроцитов,
тромбоцитов в 1 л крови), концентрацию гемоглобина в крови, лейкоцитарную
формулу периферической крови с расчетом индекса ядерного сдвига.
Для исследования костного мозга проводили пункцию подвздошной
кости под местным обезболиванием раствором новокаина 2 % – 2,0 мл при
помощи
асептической
аспирации
иглой
Кассирского
и
шприцом
(обезвоженным). Из части полученного пунктата быстро готовили мазки,
другую разводили для подсчета миелокариоцитов и мегакариоцитов.
Производили цитологический анализ мазков пунктата.
В костном мозге определяли абсолютное число миелокариоцитов,
абсолютное
и
относительное
количество
бластов,
промиелоцитов,
миелоцитов, метамиелоцитов, палочко-, сегментоядерных нейтрофилов,
эозинофилов,
пронормобластов,
нормоцитов
базофильной,
полихроматофильной и оксифильной генераций, моноцитов, лимфоцитов,
плазматических
клеток
и
мегакариоцитов,
11
а
также
абсолютное
и
относительное количество клеток в состоянии митотического деления.
Рассчитывали лейкоэритробластическое соотношение, индекс созревания
нейтрофилов (ИСН) (Меньшиков В.В., 1987).
Модель опухолевого роста. Карцинома легких Льюис (LLC).
Опухолевую ткань LLC трансплантировали мышам-самкам линии С57В1/6
внутримышечно в бедро задней лапки слева в количестве 1×106 клеток в
растворе Хенкса (ООО «Биолот», Россия).
Методы.
Оценку
эффективности
терапевтических
воздействий
лекарственных препаратов проводили в соответствии с “Методическими
рекомендациями по доклиническому изучению средств, обладающих
способностью
ингибировать
процесс
метастазирования
и
повышать
эффективность цитостатической терапии злокачественных опухолей” (М., 1992).
Противоопухолевый
эффект
оценивали
по
показателю
индекса
торможения роста массы первичной опухоли (ИТРО), который в динамике
рассчитывали по объему первичного опухолевого узла и в конце
эксперимента – по его массе. Антиметастатический эффект оценивали по
следующим показателям: процент животных с метастазами, среднее число
поверхностных метастазов на одно животное, степень метастатического
поражения легких в зависимости от количества и размера метастазов.
Вычисляли индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ).
Хирургическое удаление первичной опухоли LLC, перевитую в
подушечку лапки, проводили под нембутал-эфирным наркозом. Операцию по
удалению опухоли выполняли при наложении перетягивающего жгута на
уровне нижней трети бедра. Конечность ампутировали на уровне коленного сустава.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку
результатов экспериментального исследования проводили с помощью пакета
статистических
программ:
русифицированная
версия
программы
STATISTICA 6.0 (StatSoft – Russia,1999), BIOSTAT (S.A. Glantz, McGraw Hill,
перевод на русский язык – «Практика, 1998). Проверка нормальности
распределения проводилась по критерию Шапиро-Уилка. Оценка равенства
12
дисперсий производилась с помощью критерия Левена. Определялись
основные
статистические
характеристики:
среднее,
стандартное
квадратическое отклонение. Достоверность различий рассчитана с помощью
Т-критерия Стьюдента в случае равенства дисперсий, его модификации (Ткритерий с раздельными оценками дисперсий) в случае неравенства
дисперсий и с поправкой Бонферрони для множественных сравнений.
Определение LD (летальной дозы)
50,
LD16, LD84, стандартной ошибки LD50 и
границ 95% доверительного интервала LD50 проведено по методу Финни
(Иванов Ю. И., Погорелюк О.Н., 1990). Статистическое сравнение величин
LD50 определяли с помощью метода доверительных интервалов LD50. При
исследовании
дозовой
зависимости
гематопротекторных
свойств
дикарбамина критическая величина уровня значимости принята равной
0,001, в остальных исследованиях - принята равной 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
На первом этапе работы нами была изучена дозовая зависимость
гематопротекторных
свойств
дикарбамина
путем
исследования
пострадиационной динамики клеточного состава крови у мышей в условиях
экспериментального
костномозгового
синдрома.
Для
этого
была
использована общепринятая экспериментальная модель, в которой мышей
подвергали общему однократному гамма облучению в сублетальной дозе 5,0
Гр. Дикарбамин вводили в/б и внутрь в профилактическом и лечебном
режимах в дозах 0,05, 0,5, 5,0, 15,0, 50,0 мг/кг. В течение 45 дней после
облучения наблюдали за изменением клеточного состава периферической крови.
Кратковременное тотальное воздействие ионизирующей радиации в
дозе 5 Гр вызывало выраженные изменения лейкоцитарного состава
периферической крови исследуемых животных (табл. 4).
Таблица 4. Лейкоцитарный состав периферической крови мышей в условиях
лучевой супрессии кроветворения, М (s).
Сутки после облучения
Показатель
-3
3
10
17
24
31
38
45
9
(×10 /л)
13
лейкоциты
6,24 1,05
0,8
1,66
1,5
2,42
1,8
2,79
(2,07) (0,07)* (0,30)* (0,13)* (0,75)* (0,15)* (0,13)* (0,07)*
палочкоядерные 0,31 0,07
0,07
0,13
0,59
0,22
0,18
0,34
(0,17) (0,01)* (0,02)* (0,03) (0,05)* (0,03) (0,04) (0,04)
сегментоядерные 3,14 0,08
0,06
0,19
0,17
0
0
0,28
(1,12) (0,01)* (0,04)* (0,03)* (0,09)*
(0,05)*
моноциты
0,34 0,60
0,39
0,87
0,53
0,29
0,25
0,56
(0,18) (0,05)* (0,15) (0,06)* (0,05)* (0,05) (0,03) (0,05)*
лимфоциты
2,35 0,29
0,25
0,48
0,26
1,90
1,37
1,64
(0,98) (0,03)* (0,09)* (0,06)* (0,03)* (0,11) (0,12) (0,05)
Примечание: * -P< 0,001 при сравнении с группой интактных животных.
Профилактическое в/б введение препарата в дозе 0,05 мг/кг не
предупреждало изменений лейкоцитарного состава периферической крови мышей.
Профилактическое в/б введение дикарбамина в дозе 0,5 мг/кг не
предотвращало падение показателей, однако в дальнейшем наблюдалось
более быстрое, относительно контроля, повышение уровня клеток.
Мы отметили, что в ранний период после профилактического в/б
введения дикарбамина в дозе 5,0 мг/кг степень лейкопении была менее
выражена в группах облученных мышей, получавших препарат, чем в
контрольной
количества
группе,
затем
лейкоцитов
до
наблюдалось
исходного
ускоренное
уровня
восстановление
(табл.
5).
Уровень
сегментоядерных нейтрофилов на протяжении большей части эксперимента
был выше контрольных цифр (p2<0,001). Количество палочкоядерных
нейтрофилов на 3, 10, 17 сутки опыта не отличалось от исходных данных,
затем наблюдался абортивный подъем показателя на 24 сутки до
0,67±0,09×109/л с последующим его снижением на 38 сутки до уровня
контрольных
данных.
В
последней
контрольной
точке
уровень
палочкоядерных нейтрофилов не отличался от значения показателя у
интактных животных (p1=0,056). Содержание лимфоцитов у мышей с
дикарбамином на всем протяжении исследования было значимо выше, чем в
группе облученных животных, получавших физиологический раствор (табл. 5).
Таблица 5. Лейкоцитарный состав периферической крови мышей на фоне
профилактического в/б введения дикарбамина в дозе 5,0 мг/кг, М (s).
показатель
Сутки после облучения
14
(×109/л)
-3
лейкоциты 6,24
(2,17)
палочко0,31
ядерные
(0,17)
сегменто- 3,14
ядерные
(1,12)
моноциты 0,34
(0,18)
3
1,3
(0,11)* #
0,21
(0,04)#
0,20
(0,04)*#
0,14
(0,03) #
10
1,3
(0,11)*#
0,21
(0,02) #
0,05
(0,02) *
0,08
(0,02)*#
17
3,6
(0,3)*#
0,32
(0,04)
0,43
(0,05)*#
0,36
(0,06)#
24
3,95
(0,11) *
0,67
(0,09) *
0,55
(0,09)*#
0,79
(0,09)*#
31
3,8
(0,11) *
0,27
(0,04)
0,68
(0,05)*#
0,84
(0,05)*#
38
4,15
(0,11) *
0,17
(0,04)
1,00
(0,06)*#
0,37
(0,04)*
45
1,3
(0,11)*#
0,20
(0,04)*
0,19
(0,03)*#
0,10
(0,03)*#
лимфо2,35
0,75
0,96
2,34
1,90
2,01
2,61
0,80
#
#
#
циты
(0,98) (0,06)* (0,08)*
(0,22)
(0,19)* (0,12)
(0,14)* (0,06)*#
Примечание:* - р< 0,001 при сравнении с группой интактных животных; #- р 2< 0,001 при
сравнении с контрольной группой.
Дальнейшие
исследования
показали,
что
дикарбамин
в
профилактическом и лечебном режимах в/б и пероральном способах
введения в дозах 5,0, 15,0, 50,0 мг/кг проявил статистически значимый
гематопротекторный
эффект
в
виде
уменьшения
глубины
падения
абсолютного уровня лейкоцитов за счет сегментоядерных нейтрофилов и
лимфоцитов, а так же ускоренного процесса восстановления количества
лейкоцитарных клеток до исходного уровня. На фоне дикарбамина в
различных
режимах
введения
в
изученных
дозах
различия
между
величинами большинства исследуемых показателей лейкоцитарного состава
периферической крови мышей в большей части контрольных точек были
статистически незначимы по сравнению друг с другом, за исключением дозы
5,0 мг/кг, на фоне которой при в/б введении был отмечен статистически
значимо меньший эффект исследуемого препарата, чем при пероральном (рис.1).
15
Рис. 1 Показатели лейкоцитарного состава периферической крови
мышей на фоне профилактического в/б и перорального введения препарата
дикарбамин в дозе 5, 0 мг/кг
Примечание :* - р< 0,001 при сравнении с контрольными данными
На основании полученных результатов для дальнейшего исследования
нами выбраны дозы дикарбамина 5,0 и 15,0 мг/кг во всех режимах введения.
На
втором
этапе
работы
было
проведено
изучение
влияния
дикарбамина в различных режимах введения на выживаемость и среднюю
продолжительность жизни мышей на фоне воздействия ионизирующей
радиации. При анализе полученных результатов не было обнаружено
статистически значимых различий между величинами LD50/45 в контрольной и
опытных
группах.
Однако
было
получено
статистически
значимое
увеличение показателя LD16/45 в опытных группах относительно контрольной.
Дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг увеличивал продолжительность жизни
животных, подвергнутых облучению в дозе 5 Гр: при в/б введении в
лечебном режиме - на 51,3%, при введении внутрь в профилактическом
режиме – на 48,0%, при введении внутрь в лечебном режиме – 47,3% (рис.2).
Дикарбамин в дозе 5,0 мг/кг в различных режимах перорального введения не
влиял на LD50/45 и продолжительность жизни животных.
На основании вышеизложенных результатов нами в дальнейшем
использовалась доза дикарбамина 15 мг/кг и пероральный путь введения.
16
45
*
40
35
30
сутки
25
20
15
10
5
0
5 Гр
6 Гр
6,5 Гр
7 Гр
Обл. без коррекции
15 мг/кг проф. внутрь
7,5 Гр
8 Гр
15 мг/кг проф. в/бр
15 мг/кг леч. внутрь
8,5 Гр
15 мг/кг леч. в/бр
Рис. 2. Выживаемость облученных мышей на фоне дикарбамина в дозе 15
мг/кг в различных режимах введения.
Примечание: *-P<0,01 при сравнении с контрольной группой.
Исследование
миело-
и
гематопротекторной
эффективности
дикарбамина в условиях экспериментального костномозгового синдрома
проводили на 40 кроликах породы Шиншилла. Было показано, что
дикарбамин
и
мексамин
снижали
тяжесть
пострадиационной
тромбоцитопении, уменьшали глубину и продолжительность послелучевой
лейкоцитопении у кроликов, однако на фоне мексамина в конце
эксперимента появились признаки критических нарушений лейкоцитарного
состава венозной крови в виде лейкоцитоза, абсолютной и относительной
нейтропении с регенераторным ядерным сдвигом, абсолютного лимфоцитоза (рис 3).
Лейкоциты
Лимфоциты
12
*#
9
10
*#
8
*#
*#
7
#+
9
6
#
4
*#
#+
х10 /л
8
х109/л
10
*#
*#+
*#+
*#+
*#+
*
*
*
*
*
*
5
*#
2
*
*#+
*
1
0
*#+
#
4
3
*#+
2
*#
6
*#+
*#+
*
*
#
*#+
*
##
*
*#+
#
*
*
0
Исход
3-е сутки
Интактные
5-е сутки 7-е сутки
Облучение
10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
Облучение+Дикарбамин
Исход
3-е сутки 5-е сутки 7-е сутки 10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
Интактные
Облучение+Мексамин
Облучение
Облучение+Дикарбамин
Облучение+Мексамин
Рис. 3. Клеточный состав периферической крови кроликов на фоне
дикарбамина и мексамина в условиях лучевой миелосупрессии
Примечание: *-P1<0,05 - при сравнении с группой интактных животных; #-P2<0,05 - при
сравнении с контрольной группой; +-Р3 <0,05 – при сравнении с группой с облучением и
введением мексамина.
17
В острый период опустошения костного мозга (первую неделю после
облучения) происходило существенное снижение клеточности костного
мозга у животных всех исследуемых групп.
В группе с применением дикарбамина в первые дни после воздействия
количество миелокариоцитов сократилось до 9,90±1,25х109/л, затем началось
интенсивное
накопление
клеток-предшественниц
с
восстановлением
исходного уровня на 7-е сутки (рис. 4). Классической пострадиационной
динамики
с
транзиторным
опустошением
кроветворной
подъемом
счет
кроветворения,
за
повторным
ткани
после
задействования
уменьшением
общего
облучения,
сохранных
очагов
количества
клеток
отмечено не было. Абсолютное количество клеток-предшественниц в пробах
оставалась на достаточно высоком уровне, с 7-х суток не менее, чем в группе
интактных животных. У кроликов, получавших мексамин, наблюдалась
аналогичная динамика абсолютного количества миелокариоцитов, однако в
конце 4-й недели эксперимента произошло повторное падение показателя до
4,00±0,55х109/л.
Мегакариоциты
Миелокариоциты
0,9
90
*
0,8
80
0,7
70
*#+
0,6
х109/л
60
х109/л
*
*#+
50
*#+
40
*#
30
*# #
20
*# *#
10
*
*
#
*
*#
*#
*
*
0,5
0,4
0,3
*
*#+
0,2
*#
*#+
* *#
0,1
0
*
*#+*#
*
*# *#
# *#
*
*#+
*#
*#
0
Исход
3-е сутки 7-е сутки 10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
Интактные
Облучение
Облучение+Дикарбамин
Исход
3-е сутки 7-е сутки 10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
Интактные
Облучение+Мексамин
Облучение
Облучение+Дикарбамин
Облучение+Мексамин
Рис. 4. Содержание миелокариоцитов и мегакариоцитов в пунктате
костного мозга на фоне дикарбамина и мексамина в условиях лучевой
миелосупрессии.
Примечание: *-P1<0,05 - при сравнении с группой интактных животных; #-P2<0,05 - при
сравнении с контрольной группой; +-Р3 <0,05 – при сравнении с группой с облучением и
введением мексамина.
У
животных,
получавших
дикарбамин,
после
воздействия
ионизирующей радиации в первые 2 недели опыта отмечалось сокращение
18
численности мегакариоцитов в 1 л в среднем вдвое (рис. 4). Во второй
половине месяца (14-й, 21-й и 28-й день после лучевого повреждения)
наблюдалось восстановление мегакариоцитарного ростка. В серии с
мексамином в первой половине опыта наблюдалась аналогичная динамика
показателя, во второй половине эксперимента количество мегакариоцитов
уменьшалось и составило 68,75±7,21х106/л на 21-е сутки, 25,00±2,44х106/л –
на 28-е сутки. В контрольной серии первоначальный двухнедельный дефицит
мегакариоцитов был статистически значимо более глубоким.
В группе контроля на 3-й день после радиоактивного повреждения
абсолютное количество бластных клеток сократилось в 5 раз, через 3 недели
после облучения увеличилось в 13 раз относительно показателя в группе
интактных животных, в конце наблюдения – нормализовалось. В группе с
использованием дикарбамина и мексамина через 3 дня после лучевого
повреждения абсолютное содержание бластных клеток в костномозговом
пунктате
сократилось только в 2 раза, а на 7-й день опыта этот
пострадиационный дефицит был полностью скорректирован. В дальнейшем
на фоне дикарбамина продолжалось накопление бластных клеток в костном
мозге с нормализацией показателя в конце исследования, на фоне мексамина
абсолютное содержание бластных клеток статистически значимо не
отличалось от данных в группе интактного контроля, однако в конце
эксперимента произошло значительное уменьшение показателя.
Радиационное воздействие вызывало костномозговую палочкоядерную
и сегментоядерную нейтропению продолжительностью до двух-трех недель
(рис. 5). В конце третьей недели отмечалось транзиторное увеличение
количества палочкоядерных нейтрофилов, еще через 7 дней – повторное
падение, содержание сегментоядерный нейтрофилов во второй половине
опыта постепенно повышалось до 3,08±0,47х109/л.
19
Сегментоядерные нейтрофилы
Палочкоядерные нейтрофилы
7
8
*#+
6
*#+
5
*
х109/л
*#+
4
2
*#+
4
*
*# #
1
*#+
* *#
*
*
#
*
#+
*#
#+
*#
*#+
* *#
1
*
*
*
#
*#
*#
*
0
*#
Исход
0
Исход
*
2
*#
*#
*#
*#+
5
3
3
3-е сутки 7-е сутки 10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
3-е сутки 7-е сутки 10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
Интактные
Облучение
Облучение+Дикарбамин
Интактные
Облучение+Мексамин
Облучение
Облучение+Дикарбамин
Облучение+Мексамин
Рис. 5 Содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов в
пунктате костного мозга на фоне дикарбамина и мексамина в условиях
лучевой миелосупрессии.
Примечание: *-P1<0,05 - при сравнении с группой интактных животных; #-P2<0,05 - при
сравнении с контрольной группой; +-Р3 <0,05 – при сравнении с группой с облучением и
введением мексамина.
На
фоне
дикарбамина
и
мексамина
сокращение
численности
палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов было менее выраженным
нежели, в группе контроля, а дальнейшее накопление клеток – более
интенсивным. На фоне мексамина в конце периода наблюдения произошло
существенное повторное снижение абсолютного количества палочкоядерных
и сегментоядерных нейтрофилов в костномозговом пунктате (рис. 5).
Лимфоциты
х109/л
х109/л
*#+
7
6
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
*
*#+
*
*#+#
*
Исход
3-е сутки
Интактные
#
*#+
*
#
*#+
*
*#
*#+
*#
*#+
*#
*
7-е сутки 10-е сутки 14-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
Облучение
Облучение+Дикарбамин
Облучение+Мексамин
Рис. 6 Содержание лимфоцитов в пунктате костного мозга на фоне
дикарбамина и мексамина в условиях лучевой миелосупрессии.
Примечание:*-P1<0,05-при сравнении с группой интактных животных; #-P2<0,05-при
сравнении с контрольной группой; +-Р3 <0,05–при сравнении с группой с облучением и
введением мексамина.
Дикарбамин
и
мексамин
удерживали
количество
лимфоидных
элементов на 3-и сутки эксперимента на статистически более высоком
20
уровне относительно группы контроля, а в дальнейшем способствовали более
быстрому восстановлению их количества (рис 6).
Весьма важным аспектом в онкофармакологии является не только
оценка
у
препаратов
сопровождения
их
специфических
свойств
-
способности снижать и/или защищать организм хозяина от нежелательных
побочных реакций, вызываемых лучевой терапией и противоопухолевыми
средствами, но и изучение их влияния на основной процесс: не будут ли при
этом они сами оказывать стимулирующего влияния на рост первичной
злокачественной опухоли и модифицировать процесс метастазирования.
Выполненные нами исследования показали, что на модели перевивной
опухолевой системы - LLC, при проведении лучевой терапии (2 Гр), а также
в сочетании лучевой терапии с введением дикарбамина в дозе 15,0 мг/кг в
профилактическом и лечебном режимах показали, что размеры, масса
первичной опухоли и показатели ИТРО во всех экспериментальных группах
не отличались между собой.
При проведении химиотерапии опухоли LLC циклофосфаном в дозе 20
мг/кг, в/б, 5-ти кратно через день, через 24 ч. после имплантации опухоли
при
раздельном и
сочетанном применении
с
дикарбамином,
нами
обнаружено, что циклофосфан в монорежиме статистически значимо снижал
как массу опухоли, так и количество метастазов у животных. При сочетанном
применении циклофосфана и дикарбамина наблюдалась тенденция к
уменьшению массы опухоли и среднего числа метастазов относительно
значения показателя на фоне монотерапии циклофосфаном (табл. 6).
Таблица
6.
Показатели
антиметастатической
эффективности
дикарбамина и циклофосфана при раздельном и сочетанном применении
Показатель
Масса тела, г
Масса опухоли, г
Среднее число
метастазов на одно
животное
Экспериментальные группы
Контроль Дикарбамин Циклофосфан Дик.+Цикл.
35,00,4
34,00,5
29,50,7
28,30,6
13,30,4
11,70,5*
9,70,3***
8,90,2***,#
15,54,0
9,23,4*
3,91,8**
2,81,2**
21
ИИМ%
40,0
74,8
82,0
Примечание: *,**,*** р  0,05; 0,01; 0,001- достоверность отличий по отношению к
контролю
# р  0,05 - достоверность отличий по отношению к группе с циклофосфаном.
Дикарбамин проявлял антиметастатическую активность на модели с
хирургическим удалением первичного опухолевого узла LLC, а при
сочетанном применении с циклофосфаном после удаления опухоли
наблюдалась суммация изучаемого феномена (табл. 7).
Таблица 7. Показатели антиметастатической эффективности дикарбамина в
условиях хирургического удаления первичного опухолевого узла и при
сочетанном введении с циклофосфаном
Опытные
Группы
Препараты
Частота
Среднее число ИИМ,
метастазирования,
метастазов на 1 %
%
животное
1 схема введения препаратов: дикарбамин перорально с 1 по 13 сутки
эксперимента в дозе 0,5 мг/кг; циклофосфан внутрибрюшинно 2-х кратно до
операции с интервалом 96 ч. в дозе 100 мг/кг.
контроль
физ. р-р
100
34,84,9
1 группа
Дикарбамин
100
32,011,8
8,0
2 группа
циклофосфан
100
19,55,1*
43,9
3 группа
дикарбамин
+циклофосфан
100
16,42,4***
52,8
2 схема введения препаратов: дикарбамин перорально 0,5 мг/кг с 14 суток
эксперимента (начало введения через 24 часа после операции) по 28 сутки;
циклофосфан внутрибрюшинно 2-х кратно после операции с интервалом 96
ч. в дозе 100 мг/кг.
контроль
физ. р-р
100
37,18,2
1 группа
Дикарбамин
100
28,68,5
22,9
2 группа
циклофосфан
100
18,04,3*
51,5
3 группа
дикарбамин
+циклофосфан
100
6,70,9***,#
81,9
Примечание: *,*** р  0,05; 0,001- достоверность отличий по отношению к контролю
#
р  0,05 - достоверность отличий по отношению к группе с циклофосфаном.
22
ВЫВОДЫ
1.
Дикарбамин
в
дозах
5,0,
15,0
и
50,0
мг/кг
как
при
профилактическом, так и лечебном режимах введения мышам, облученным в
сублетальной дозе, препятствовал снижению уровня сегментоядерных
нейтрофилов и лимфоцитов на ранних этапах после гамма-облучения и
ускорял процесс восстановления количества лейкоцитарных клеток.
2. Дикарбамин в дозе 15,0 мг/кг в разных режимах введения
увеличивал продолжительность жизни мышей, подвергнутых облучению в
дозе 5 Гр, на 47-51%.
3. Дикарбамин снижал тяжесть пострадиационной тромбоцитопении,
уменьшал глубину и продолжительность лейкоцитопении, обеспечивал
достаточное
абсолютное
и
относительное
количество
грануло-
и
агранулоцитов после выхода из послелучевого лейкоцитопенического
периода у кроликов; при введении препарата сравнения мексамина в конце
эксперимента появлялись признаки критических нарушений лейкоцитарного
состава венозной крови в виде лейкоцитоза, абсолютной и относительной
нейтропении, абсолютного лимфоцитоза.
4. Дикарбамин обеспечивал достаточно высокий уровень защиты
кроветворной ткани после воздействия ионизирующей радиации, что
выражалось
в
уменьшении
продолжительности
и
глубины
пострадиационного дефицита субпопуляций миелокариоцитов, устранении
феномена повторного падения абсолютных показателей миелокариоцитов, а
также эффективной защите и стимуляции процессов пролиферации и
дифференцировки кроветворных предшественников; мексамин не устранял
повторного пострадиационного торможения пролиферативной активности и
дефицита миелокариоцитов через 4 недели после лучевого повреждения.
5. Дикарбамин не стимулировал рост первичного узла
опухолевой системы LLC, не усиливал процесс
модельной
метастазирования, а в
условиях модели с хирургическим удалением первичного опухолевого узла
23
при
сочетанном
применении
с
циклофосфаном,
увеличивал
антиметастатический эффект цитостатика.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Целесообразно дальнейшее экспериментальное исследование гемато- и
миелопротекторного эффекта дикарбамина при лучевом и цитостатическом
воздействии, в том числе в условиях опухолевого роста.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Моисеева И. Я., Зиновьев А. И., Кустикова И. Н., Филимонов С. А.
/Влияние
препарата
периферической
«Дикарбамин»
крови
в
на
лейкоцитарный
условиях
состав
экспериментального
костномозгового синдрома // Известия высших учебных заведений.
Поволжский регион. Медицинские науки. – 2008. – Т.8. -№4. –С. 17-24.
2. Моисеева И. Я., Зиновьев А. И., Мозерова И. В., Филимонов С. А.
/Влияние дикарбамина на выживаемость и продолжительность
жизни облученных мышей // Известия высших учебных заведений.
Поволжский регион. Медицинские науки. – 2009. – Т.9. -№1. –С. 3340.
3. Моисеева И. Я., Зиновьев А. И., Кустикова И. Н., Филимонов С. А.
/Исследование пострадиационной динамики лейкоцитарного состава
крови мышей на фоне лечебного введения дикарбамина // Актуальные
проблемы
медицинской
науки
и
образования:
материалы
межрегиональной научной конференции (Пенза, 24-25 апреля 2009 г.).
– Пенза: Информационно-издательский центр ПензГУ, 2009. – С. 172-174.
4. Моисеева И. Я., Зиновьев А. И., Филимонов С. А. /Экспериментальное
исследование радиомодифицирующей активности дикарбамина при
пероральном введении // Актуальные проблемы медицинской науки и
образования: материалы межрегиональной научной конференции
24
(Пенза, 24-25 апреля 2009 г.). – Пенза: Информационно-издательский
центр ПензГУ, 2009. – С. 174-175.
5. Моисеева И. Я, Зиновьев А. И., Мозерова И. В., Филимонов С. А.
/Влияние
дикарбамина
на
пострадиационную
динамику
лейкоцитарного состава периферической крови мышей // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. – Т.73. -№1. –
С. 20-23.
6. Зиновьев А.И., Кинзирская Ю.А. /Изучение антиметастатической
эффективности дикарбамина у мышей с карциномой легких Льюис в
условиях хирургического удаления первичного опухолевого узла //
Современные проблемы науки и образования. - 2010. - №6.
(приложение "Медицинские науки"). - C. 8.
7. Кинзирский А.С., Кинзирская Ю.А., Зиновьев А.И./ Изучение
влияния дикарбамина на эффективность цитостатической терапии
у мышей с карциномой Льюис // Известия высших учебных
заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. – 2010. №4(16). – С. 44-49.
25