Разработка технологии производства молокосвертывающего

УДК 637.325:543.54
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА
МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СЫРОДЕЛИЯ.
1. ВЛИЯНИЕ рН И ОБЪЕМА ЭКСТРАГЕНТА НА ВЫХОД
ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Ельчанинов В.В., к.т.н., Коваль А.Д., к.т.н., Кригер А.В., к.т.н.,
Н.В. Овчарова, Белов А.Н., к.т.н.
ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, Барнаул
Актуальность. Технология получения натуральных молокосвертывающих ферментных препаратов (МФП) животного происхождения включает
несколько основных стадий: (1) экстракция слизистых оболочек желудков
водно-солевыми растворами и активация молокосвертывающих ферментов
(МФ); (2) осаждение МФ неорганическими солями (высаливание); (3) отделение осадка МФ, удаление избытков влаги; (4) сублимационная сушка
"ферментного теста", его измельчение, смешивание с поваренной солью,
формулирование. Одним из "узких мест" технологии производства сухих
МФП является стадия сублимационной сушки. Высокая энергоемкость этой
стадии вносит значительный вклад в удорожание конечного продукта, кроме
того, в процессе сублимирования теряется часть ферментативной активности.
Кроме высокой стоимости к недостаткам сухих МФП следует отнести образование тонкодисперсной пылевидной взвеси, которая при аспирации может
вызывать раздражение слизистой оболочки верхних дыхательных путей и аллергические реакции у персонала. Зарубежные производители МФП - "Caglificio Clerici" (Италия), "Сhristian Hansen" (Дания) и др. - выпускают жидкие
и сухие варианты одного и того же препарата. Таким образом, из технологической схемы элиминируются стадии высаливания и сублимационной сушки,
что приводит к значительному удешевлению продукции. По сравнению с сухими МФП жидкие препараты более удобны в работе и не вызывают раздражения верхних дыхательных путей.
Цели и задачи. Работа выполнена в рамках НИР - "Разработать технологию производства жидкого натурального молокосвертывающего ферментного препарата животного происхождения" (Тема № 10.02.03.06). Стратегической целью НИР является разработка технологии получения жидкого препарата говяжьего пепсина и подбор физико-химических параметров, обеспечивающих его длительное (не менее 6 месяцев) хранение без снижения ферментативной активности. Цель предварительного этапа исследований - добиться получения максимального выхода ферментативной активности на
единицу массы сырья. Задачей данной работы стало исследование влияния на
выход пепсина двух технологических параметров – величины рН и соотношения сырья и экстрагирующего раствора (экстрагента).
Материалы и методы. Удельную молокосвертывающую активность
(МА) жидких препаратов определяли по ранее опубликованной методике [1].
В качестве контроля использовали отраслевой контрольный образец сычужного фермента (ОКО СФ) 2010/2011, производства ОАО "МЗСФ".
Слизистые оболочки сычугов КРС получены на ООО "АМК" (г.
Алейск). Замороженные (-200С) слизистые оболочки размораживали при 20240С, измельчали на мясорубке, полученный фарш использовали в качестве
сырья для экстрагирования пепсина.
Для исследования влияния рН на выход пепсина, готовили экстрагенты
следующего состава: в дистиллированную воду вносили 0,2М соляную кислоту до получения растворов с рН равными 1,5; 2,0; 2,5; 3,0. В экспериментах
по выбору оптимального для экстракции значения рН соотношение слизистых оболочек сычугов и экстрагента составляло 1:5 (масса : объем). МА экстракционной смеси контролировали через 12 и 24 часа. Суммарный выход
МА определяли через 24 часа экстракции.
Для выбора оптимального соотношения сырья и экстрагирующего раствора готовили экстракционные смеси, содержащие фарш из слизистых оболочек сычугов (40 гр) и экстрагент (рН=1,5), в соотношениях: 1:3, 1:5, 1:10
(масса : объем). Активность полученного экстракта и суммарный выход МА
определяли через 12 часов.
После добавления экстрагента к измельченным слизистым оболочкам,
смеси интенсивно перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 минут.
Экстракцию проводили при 22-240С, через 12 и 24 часа, отделяли полученный экстракт фильтрацией через пластиковое сито с диаметром отверстий ~1
мм и 1 слой лавсана, и определяли в нем удельную МА (усл.ед./мл). Суммарный выход ферментативной активности в условных единицах (усл.ед.) рассчитывали как произведение удельной МА экстракта на его объем.
Результаты и обсуждение. Влияние рН экстрагента. Пепсин, как и
другие гастральные аспартатные протеиназы, синтезируется клетками слизистой оболочки желудка в виде ферментативно неактивного предшественника
(зимогена) – пепсиногена [2]. Это предотвращает повреждение внутриклеточных белков и является одним из механизмов регуляции протеолитической
активности. Структуры зимогенов и зрелых ферментов очень похожи. Но, в
отличие от зрелого фермента, N-концевая последовательность зимогенов содержит дополнительный полипептидный участок - про-сегмент (активационный сегмент), длиной 35-49 аминокислотных остатков [3] - который стерически блокирует активный центр и препятствует образованию ферментсубстратного комплекса. После секреции гастральных протеиназ (пепсина,
химозина, гастрикцина) в просвет желудка, - в результате ограниченного
протеолиза и удаления про-сегмента, зимогены превращаются в ферментативно активные зрелые протеиназы [2]. Зимогены гастральных аспартатных
протеиназ относительно стабильны при нейтральных значениях рН, но быстро превращаются в активные ферменты при рН ≤ 5,0 (активация при рН > 5,0
протекает с очень низкой скоростью [3]). При понижении рН происходит
разрыв пептидной связи (аутолиз) между С-концевой аминокислотой актива-
ционного пептида и N-концевой аминокислотой полипептидной цепи фермента, отделение про-сегмента и освобождение активного центра [4].
При промышленном производстве пепсина экстракцию фермента, как
правило, проводят параллельно с активацией зимогена, поэтому выбор оптимального значения рН экстрагента чрезвычайно важен, поскольку влияет на
активность полученного экстракта. Результаты исследования зависимости
удельной МА экстракта от рН экстрагента представлены на рисунке 1.
Рисунок 1 - Зависимость удельной молокосвертывающей активности
экстракта от рН экстрагента.
Удельная молокосвертывающая
активность (усл. ед./мл)
Через 12 часов
Через 24 часа
3500
3000
2647
2500
1816
2000
1500
2069
1272
995
1000
500
2840
325
375
0
рН=3,0
рН=2,5
рН=2,0
рН=1,5
Наиболее эффективно экстракция и активация пепсина происходит при
рН=1,5 (757%), наименее эффективно - при рН=3,0 (100%). После фильтрации и отделения проэкстрагированных тканей сычугов, объемы экстрактов,
для экстрагентов с различными значениями рН, составили: рН=3,0 - 140 мл,
рН=2,5 - 115 мл, рН=2,0 - 125 мл и рН=1,5 - 155 мл. В экстракционной смеси
при рН=1,5 отмечено уменьшение количества экстрагируемого материала,
видимо, в силу интенсивного "самопереваривания" тканей, что может быть
связано с максимальной протеолитической активностью пепсина при низких
значениях рН [5]. При рН экстрагента равном 1,5, экстракт отделялся легче,
чем при более высоких значениях рН, но, в то же время, был наименее прозрачным.
Исследование зависимости суммарной МА экстракта от рН экстрагента
(Рис.2) наглядно свидетельствует об эффективности экстрагента с рН=1,5.
Если принять суммарный выход МА (после 24 часов экстракции) при рН=3,0
за 100%, то при рН=2,5 суммарный выход ферментативной активности составил 279%, при рН=2,0 - 493%, а при рН=1,5 – 839%. Дополнительная экстракция и активация в течение 12 часов увеличивали удельную и суммарную
активность экстрактов при рН=3,0 - на 15%, при рН=2,5 - на 28%, при рН=2,0
- на 14% и при рН=1,5 - на 7%. Увеличение рН экстрагента на 0,5 единицы
приводит к снижению удельной МА на 37%, а суммарного выхода МА на
70%.
Суммарная молокосвертывающая
активность (усл.ед.)
Рисунок 2 – Зависимость суммарной молокосвертывающей активности
экстракта от рН экстрагента.
Через 12 часов
Через 24 часа
500 000
440128
410356
400 000
300 000
258686
227035
200 000
146266
114414
100 000
45464 52436
0
рН=3,0
рН=2,5
рН=2,0
рН=1,5
Таким образом, установлено, что при понижении рН экстрагента с 3,0
до 1,5 выход удельной и суммарной молокосвертывающей активности увеличивается на 657% и 739%, соответственно. Следовательно, водный раствор
соляной кислоты с рН=1,5 является экстрагентом выбора для одновременной
экстракции и активации говяжьего пепсина из сычугов КРС.
Влияние соотношения ткани сычугов и экстрагента. Результаты исследования зависимости удельной МА экстракта от соотношения ткань сычугов : экстрагент представлены на рисунке 3. При увеличении количества экстрагента с 3 частей/1 часть сырья, до 5 и 10 частей на 1 часть сырья, удельная
молокосвертывающая активность экстракта падает, соответственно, на 18% и
45%. В то же время, параллельно с уменьшением удельной МА, уменьшается
вязкость экстрактов, что влияет на эффективность удаления проэкстрагированных слизистых оболочек, даже методом грубой фильтрации. После фильтрации и отделения проэкстрагированных тканей сычугов, объемы экстрактов для различных соотношений составили: (1:3) - 80 мл, (1:5) - 190 мл,
(1:10) - 380 мл. В случае соотношений (1:5) и (1:10) экстракт отделялся легче
и был прозрачнее, чем при соотношении (1:3).
Из данных представленных на рисунке 4 видно, что суммарный выход
МА, возрастает с увеличением объема экстрагента на единицу массы сырья.
По сравнению с соотношением (1:3) суммарный выход пепсина для соотношений (1:5) и (1:10), увеличивается на 94% и 162%, соответственно.
Рисунок 3 - Зависимость удельной молокосвертывающей активности
экстракта от соотношения массы ткани сычугов и объема экстрагента.
Удельная
молокосвертывающая
активность (усл. ед./мл)
3500
3000
2731
2500
2231
2000
1509
1500
1000
500
0
1:3
1:5
1 : 10
Соотношение ткань сычуга : экстрагент (масса : объем)
Рисунок 4 - Зависимость суммарной молокосвертывающей активности
экстракта от соотношения массы ткани сычугов и объема экстрагента.
Суммарная
молокосвертывающая
активность (усл. ед.)
700 000
573257
600 000
500 000
423887
400 000
300 000
218483
200 000
100 000
0
1:3
1:5
1 : 10
Соотношение ткань сычуга : экстрагент (масса : объем)
Несмотря на низкую удельную активность экстрактов, полученных при
соотношении сырья и экстрагента равном 1:10, суммарный выход фермента в
этом случае - наибольший. Наблюдаемый нами эффект, очевидно, объясняется тем, что при бóльших объемах экстрагента, концентрация слизи в экстракте снижается, и это позволяет отделять экстракт с наименьшими потерями
ферментативной активности.
В условиях пилотного или полномасштабного получения пепсина, полученные нами данные позволяют сделать выбор оптимального соотношения
сырья и экстрагента, исходя из мощностей оборудования и особенностей
технологической схемы производства. Очевидно, что при получении большого объема экстракта с низкой концентрацией фермента понадобится
больше времени и энергозатрат для того, чтобы сконцентрировать его до необходимой активности. Как правило, активность жидких натуральных МФП
животного происхождения составляет не менее 10000 усл.ед./мл. Для получения минимально необходимой молокосвертывающей активности, экстракт,
полученный при соотношении 1:3 (МА=2731 усл.ед./мл), достаточно сконцентрировать в ~3,7 раза. Экстракт, полученный при соотношении 1:10
(МА=1509 усл.ед./мл), придется концентрировать уже в ~6,6 раза, но при
этом появляется возможность увеличить выход конечного продукта на
~160%. В конечном итоге, определяющим фактором при выборе соотношения сырья и экстрагента должен стать экономический расчет баланса затрат
на производство 1 усл. ед. МА и прибыли, полученной от её реализации.
Выводы. По результатам проведенного исследования сделаны следующие выводы: (1) при понижении рН экстрагента с 3,0 до 1,5 выход удельной и суммарной молокосвертывающей активности увеличивается; (2) увеличение объема экстрагента с 3 до 10 частей на 1 часть сырья, приводит к
снижению удельной МА, при этом, за счет повышения эффективности удаления проэкстрагированного сырья, суммарный выход ферментативной активности существенно возрастает.
Таким образом, максимальный выход говяжьего пепсина может быть
получен при рН экстрагента равном 1,5 и соотношении сырья и экстрагента
1:10.
Список литературы.
1. Ельчанинов, В.В. Молокосвертывающий фермент из сычугов северного оленя / В.В. Ельчанинов, М.С. Уманский, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, В.Г.
Шелепов // Сыроделие и маслоделие.- 2005.- №4.- С.13-16.
2. Kageyama, T. Pepsinogens, progastricsins and prochymosins: structure,
function, evolution and development / T. Kageyama // Cell. Mol. Life Sci.- 2002.N 2.- P. 288-306.
3. Richter, C. Mechanism of activation of the gastric aspartic proteinases:
pepsinogen, progastricsin and prochymosin. Review article / C. Richter, T. Tanaka,
R.Y. Yada // Biochem. J.- 1998.-V 335.- P. 481-490.
4. Nielsen, F.S. Activation of porcine pepsinogen A: the stability of two
non-covalent activation intermediates at pH 8,5 / F.S. Nielsen, B. Foltmann //
Eur.J.Biochem.- 1993.- V 217.- P. 137-142.
5. Cheese Chemistry, Physics and Microbiology, Third edition, Volume I:
General Aspects. Rennets: General and Molecular Aspects / M.J.C. Grabbe.;
P.F.Fox, P.L.H. McSweeney, T.M. Cogan, T.P. Guinee, eds.- London, UK: Elsevier Academic Press, 2004.- P. 19-45.
Реферат
УДК 637.325:543.54
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА
МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СЫРОДЕЛИЯ.
1. ВЛИЯНИЕ рН И ОБЪЕМА ЭКСТРАГЕНТА НА ВЫХОД
ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Ельчанинов В.В., к.т.н., Коваль А.Д., к.т.н., Кригер А.В., к.т.н.,
Н.В. Овчарова, Белов А.Н., к.т.н.
ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, Барнаул
Исследовано влияния на выход, в процессе экстракции говяжьего пепсина, двух технологических параметров – величины рН и соотношения сырья
и экстрагирующего раствора (экстрагента). Установлено, что при понижении
рН экстрагента с 3,0 до 1,5 выход удельной и суммарной молокосвертывающей активности увеличивается, соответственно, на 657% и 739%. Увеличение объема экстрагента с 3 до 10 частей на 1 часть сырья, приводит к снижению удельной МА на 45%, при этом, за счет повышения эффективности удаления проэкстрагированного сырья, суммарный выход ферментативной активности возрастает на 162%.