ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«КУРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ
АКАДЕМИЯ ИМЕНИ ПРОФЕССОРА И.И.ИВАНОВА»
На правах рукописи
Татарников Кирилл Викторович
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И СПОСОБОВ ПРОФИЛАКТИКИ И
ЛЕЧЕНИЯ КОЛИБАКТЕРИОЗА СВИНЕЙ
06.02.02.- Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
Диссертация на соискание учебной степени
кандидата ветеринарных наук
Научный руководитель:
доктор ветеринарных наук
профессор Евглевский Ан.А.
Курск – 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ……………............................... 5
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………......
10
2.1 Характеристика и физиология микроорганизмов и питательные
среды для их выращивания…………………………................................... 10
2.2 Виды и характеристика Е. coli, формы течения и средства
профилактики колибактериоза свиней…………….................................... 16
2.3
Биотехнологические
основы
повышения
эффективности
антибиотиков………………………………………………………….……
26
2.4 Проблемы и механизмы повышения эффективности пробиотиков в
свиноводстве……………………………….………………………….….
2.5
Влияние
магнитных
полей
на
биологические
32
свойства
микроорганизмов ………………………………………………………
35
Заключение………………………………………………………………..... 38
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………......
39
3.1 Материалы и методы исследований…………………………………..
39
3.2 Результаты разработки и апробации минеральной питательной
среды для выращивания и выделения E. сoli…………………….............
47
3.3 Влияние электрогеомагнитного воздействия на биологические
свойства E. coli………………………........................................................... 51
3.4
Мониторинг
чувствительности
региональных
E.
coli
к
антибиотикам………………………………………………………………
53
3.5. Изыскание способов получения колибактериозной анатоксинвакцины
с
повышенной
иммуногенной
и
протективной
активностью…...............................................................................................
55
3
3.6 Результаты повышения биоцидного действия антибиотиков в
отношении E. coli и лечебной эффективности амоксициллина и
энрофлоксацина при колибактериозе поросят………............................
63
3.7 Антибиотикотерапия желудочно-кишечных болезней поросят с
применением пробиотических препаратов………………………………. 70
4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ…....................... 76
5 ВЫВОДЫ…………………………….…………………………………...
90
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ……….…….................................. 92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………..…………………………... 93
4
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
КАВ – Колибактериозная анатоксин – вакцина
МПК – минимальная подавляющая концентрация
АБП – антибактериальные препараты
ПМП – постоянное магнитное поле
E. coli – кишечная палочка
ХТП – химиотерапевтические препараты
МИК – минимальная ингибирующая концентрация
МПА – мясопептонный агар
МПГБ – мясопептонный глицериновый бульон
‘S – sensitive, чувствительный
R – resistore, резистентный
I – intermeoliate, промежуточный
РНК – рибонуклеиновая кислота
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
Н – антиген - жгутиковый
О – антиген – соматический
К – антиген – капсульный
АБК – ацидофильная бульонная культура
ПАБК – пропионоацидофильная бульонная культура
ПАСК – парааминосалициловая кислота
ЛПС – липополисахаридный комплекс
МКГ – микрограмм [одна тысячная 1 мг]
АМП - аденозинмонофосфат
5
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Кишечную палочку впервые выделил из кишечника и фекалий детей немецкий врач Теодор Эшерих в 1885 году.
Разнообразный род E. coli отличается по ферментативным, серологическим свойствам, подвижности, патогенности, иммуногенности, антигенности,
чувствительности к антибиотикам, образованию и свойствам токсинов, строению, выделению колицина, вызывающие гибель без лизиса родственных
бактерий [Шахов А.Г, 2007; Самуйленко А.Я.,2005; Виноходов В.О., 2001;
Панин А.Н., 2007].
Для специфической профилактики колибактериоза изготавливают моно
и ассоциированные инактивированные вакцины путем выращивания лабораторно-производственных отечественных и зарубежных штаммов E. coli на
мясогидролизатном или казеиногидролизатном бульоне с последующей детоксикацией и полимеризацией комплекса токсинов 0,5 - 0,7% раствором
формальдегида [Самуйленко А.Я., 2005; Панин А.Н., 2007; Гордон А., 2006].
Наличие в бульонах балластных веществ мяса, казеина и низкое накопление биомассы микроорганизмов снижает иммуногенную и протективную
эффективность анатоксин - вакцин. Поэтому возникает необходимость создания синтетических питательных средств с доступными компонентами,
обеспечивающих стабильно высокое накопление кишечной палочки и высокоэффективных детоксикаторов и полимеризаторов бактериальных экзо- и
эндотоксинов вместо 0,5 - 1 % растворов формальдегида. [Покровский В. И,
1999; Воробьев А. А, 1999; Федоров Ю. Н, 2005].
Протективная активность колибактериозной вакцины во многом зависит от способа и места введения с учетом роли местного иммунитета [Н. Безредка, 1925; Виноходов В. О., 2000; Урбан В. П., 1985; Королева Е. А., 2011].
Многолетнее применение противомикробных препаратов, физикохимическое воздействие привело к образованию у E. coli устойчивости ко
многим антибактериальным препаратам.
6
Соединение одних антибиотиков с другими, клавулановой и органическими кислотами, внесение в состав энрофлоксацина трилона - Б, аргинина,
колимицина не обеспечило качественного прорыва в повышении биоцидного
и лечебного действия лекарственных средств [Ковальчук Н. М., 2001; Девришев Д. А., 2010; Шахов А. Г., 2003].
Полимеризация антибиотиков по принципу получения анатоксин - вакцин с помощью 0,2% раствора формальдегида или 0,1% раствора глутарового
альдегида и этония позволило повысить их биоцидное действие в отношении
E. coli и лечения животных больных колибактериозом [Д. А. Евглевский,
2012-2013]. Актуальность разработки минеральной питательной среды,
принципиально новой технологии получения и применения колибактериозной анатоксин-вакцины, повышения биоцидной и лечебной эффективности
антибиотиков, определили выбор темы, цель, задачи и направление исследований.
Цель работы. Целью научных исследований явилось совершенствование жидкой и плотной минеральной питательной среды для выделения и выращивания E. coli, повышение иммуногенной и протективной активности колибактериозной анатоксин-вакцины и биоцидного и лечебного действия энрофлоксацина и амоксициллина.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
1. Разработать и апробировать экономически доступную и эффективную минеральную питательную среду для выращивания и выделения E. coli;
2. Изучить влияние геомагнитного воздействия на биологические
свойства E. coli;
3. Разработать рациональную технологию получения и способов применения колибактериозной анатоксин-вакцины;
4. Повысить биоцидные и лечебные свойства энрофлоксацина и
амоксициллина полимеризацией формальдегидом или глутаровым альдегидом, отдельно и с алкилдиметилбензиламмонием хлоридом в отношении E.
coli и колибактериозе поросят.
7
Научная новизна. На основе сущности и механизмов физиологических процессов у микроорганизмов, способности глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлорида обеспечивать полимеризацию с образованием крупных полимерных соединений и их детоксикацию, впервые изучены и определены:
 Установлены параметры повышения устойчивости E. coli к энрофлоксацину и амоксициллину и температуре в железорудных регионах Курской и Белгородской областей;
 Определен состав минеральной жидкой питательной среды для максимального накопления E. coli и концентрации комплекса токсинов вместо
балластных веществ мясо- и казеиногидролизатном бульоне при изъятии дорогостоящих аспарагина и глицина;
 Научно обоснована технология изготовления колибактериозной
анатоксин-вакцины;
 На основе повышения протективной эффективности при оральном
введении поросятам колибактериозной анатоксин-вакцины, по сравнению с
подкожной вакцинацией, подтверждена роль местного иммунитета, обоснованная Безредка Н.;
 Повышение биоцидного действия энрофлоксацина и амоксициллина
в отношении E. coli и терапевтической эффекивности при колибактериозе
поросят достигнуто полимеризацией 0,1% глутаровым альдегидом и 0,1%
раствором алкилдиметилбензиламмония хлорида при 400С в течение 2-3 суток по принципу инактивации, полимеризации и детоксикации бактериальных анатоксин-вакцин.
Практическая ценность. Разработанная жидкая минеральная питательная среда обеспечивает накопление до 75 – 90 млрд/мл E. coli в течение 2
– 3 суток выращивания для получения колибактериозной анатоксин-вакцины,
а плотная среда с 2,5% агаром для оперативного выделения микроорганизмов. Эффективность полимеризации и детоксикации комплекса колибакте-
8
риозных токсинов 0,2 – 0,3% глутарового альдегида с 0,2 – 0,3% алкилдиметилбензиламмония хлорида позволяет исключить использования канцерогенного формальдегида и ртутьсодержащего мертиолята.
Установленное повышение устойчивости E. coli, выделенных в железорудных регионах Курской и Белгородской областей к энрофлоксацину и
амоксициллину и температуре необходимо учитывать при терапии поросят,
больных колибактериозом и проведении ветеринарно-санитарных мероприятий.
Оральное введение поросятам колибактериозной анатоксин-вакцины
по сравнению с подкожной вакцинацией увеличивает протективные свойства
биопрепарата и подтверждает теорию и практическую ценность местного
иммунитета, предложенные Безредка Н.
Повышение биоцидных свойств энрофлоксацина и амоксициллина полимеризацией по принципу технологии изготовления анатоксин-вакцины
позволяет снизить дозу препарата и сроки лечения желудочно-кишечных болезней поросят, вызванные полирезистентными E. coli отдельно и в ассоциации с другими микроорганизмами.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты разработки и апробации жидкой и плотной минеральной
питательной среды для выделения и выращивания E. coli;
2. Влияние геомагнитного воздействия на биологические свойства E.
coli;
3. Материалы изыскания рациональной технологии получения колибактериозной анатоксин-вакцины;
4. Иммуногенные и протективные свойства колибактериозной анатоксин-вакцины при подкожном и оральном введении поросятам;
5. Биоцидные и лечебные свойства модифицированного полимеризацией энрофлоксацина и амоксициллина в отношении E. coli и при
колибатериозе поросят.
Апробация работы. Результаты исследований рассмотрены на расши-
9
ренном заседании кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии и
представлены в трех докладах в материалах международных научнопрактических конференций «Актуальные проблемы агропромышленного
производства», Курск, 2013г.
Публикация результатов исследований. По теме диссертационной
работы опубликовано 12 научных статей, в том числе 9 в изданиях, рецензируемых ВАК РФ, получен 1 патент на изобретение №2476210 от 27.02.2013г.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и включает общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и результаты исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список литературы,
приложения.
Работа иллюстрирована 14 таблицами, 7 рисунками. Список литературы содержит 213 источников, в том числе 84 иностранных.
10
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Характеристика и физиология микроорганизмов
и питательные среды для их выращивания
Систематика микроорганизмов включает три надцарства: 1) безъядерные (акариоты) - вирусы; 2» предъядерные (прокариоты) - бактерии и 3)
ядерные (эукариоты) от греч. а – нет, pro - до +karyon - ядро - это грибы, растения, животные.
Вирусы являются неклеточными образованиями, содержащие один вид
нуклеиновой кислоты - РНК или ДНК. Их насчитывают более 4-х тысяч видов. Для выращивания вирусов используют: 1) птичьи эмбрионы (куриные и
т.д.); 2) культуры клеток из эмбрионов, органов и тканей молодых животных;
3) восприимчивые лабораторные животные.
В отличие от вирусов бактерии имеют генетический аппарат, содержащий два вида нуклеиновых кислот, в целом полноценен, но не оформлен в
ядро. Поэтому бактерии объединены в надцарство - предъядерные или прокариоты.
Клетки грибов, растений и животных содержат два вида нуклеиновых
кислот, но в отличие от бактерий их надцарственный, генетический материал
сформирован в ядро клетки. Поэтому их относят к надцарству ядерные или
эукариоты.
На основании сходства определенных признаков возбудители инфекционных болезней подразделяются на множество видов: бактерии, вирусы,
грибы, микоплазмы, хламидии, риккетсин, вибрионы, спириллы, спирохеты,
нитевидные формы бактерий - актиномицеты, раньше назывались лучистыми
грибами. Из актиномицетов получают более 20% всех антибиотиков (стрептомицин, тетрациклин, нистатин, эритромицин, рифампицин).
Кроме того изучены вироиды, вызывающие более 100 болезней растений, вызываемые необычными вирусами, а также прионы - низкомолекулярные белки, не имеющие нуклеиновой кислоты, не вызывают ответных иммунных реакций организма, весьма устойчивы к высоким температурам и из-
11
лучениям.
Кроме вирусов животных, вироидов растений выделены у многих бактерий - вирусы, названные бактериофагами, вызывающие разрушение, лизис
многих бактерий, в том числе бацилл сибирской язвы, стафилококков, сальмонелл и т.д.
По форме бактерии подразделяются на палочковидные, кокковидные,
извитые и ветвящиеся.
Стафилококки (от греч. Staphyle - виноградная гроздь) представляют
кокки, расположенные в виде грозди винограда, в результате деления кокков
в разных плоскостях. Бактерии делятся поперечным делением на две дочерние клетки - кишечная палочка, сальмонеллы в течение 20-30 минут, а микобактерии туберкулеза в течение 20 -24 часов.
Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и ядра (нуклеод). Некоторые
бактерии имеют капсулу, микрокапсулу, слизь, жгутики, фимбрии и в неблагоприятных условиях образуют обезвоженную структуру, называемую спорой.
Клеточная стенка участвует в процессе деления клетки и транспорте
метаболитов. Наиболее толстая клеточная стенка у грамположительных бактерий толщиной до 50 нм, у грамотрицательных - около 15-20 нм.
Клеточная стенка бактерий содержит полисахариды, липиды, белки
(протеины) и основной компонент (90%) многослойный пептидокликан (муреин), обеспечивающий прочность и форму бактерий. С пептидогликаном
клеточной стенки грамположительных бактерий связаны тейхоевые кислоты
(от греч. Teichos – стенка). Строение и состав пептидной части пептидогликана у грамотрицательных бактерий стабильны, а у грамположительных бактерий аминокислоты пептидогликана отличаются по составу и последовательности [9, 32, 70, 173].
Грамотрицательные бактерии после воздействия спиртом утрачивают
генциановиолетовый краситель, обесцвечиваются и при обработке фуксином
12
окрашиваются в красный цвет. Это обусловлено меньшим количеством пептидогликана.
У грамположительных бактерий при окраске по Граму (Грам - датский
микробиолог, предложивший окраску бактерий в 1884г.) образуется синефиолетовая окраска из-за связывания генциацианвиолета с йодом.
В состав бактерий входят вода - около 80% ее массы, в спорах количество воды уменьшается до 18-20%. Бактерии содержат более 2000 различных
белков, а в целом белки составляют 40-80% сухой массы бактерий [41, 43,
45].
Белки бактерий обладают ферментативной, иммуногенной, антигенной,
вирулентной активностью и имеют видовую принадлежность. Кроме белков
бактерии содержат две нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), углеводы, липиды, минеральные элементы - фосфор, калий, натрий, сера, железо, кальций,
магний, цинк, медь, кобальт, марганец, углерод и азот.
Выход вещества из клетки, в том числе экзотоксинов происходит за
счет диффузии и участия транспортных систем. Для роста микробов необходимо вносить в питательные среды аминокислоты для построения белков,
пурины, пиримидины для образования нуклеиновых кислот и витамины,
входящие в состав ферментов. Проникновение питательных веществ в бактериальную клетку происходит в результате простой диффузии.
Ферменты макро- и микроорганизмов участвуют в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), т.е. метаболизма. Изучено более
2000 ферментов [45, 52, 62, 7].
У бактерий различают эндоферменты, участвующие в дыхание, питании и делении клетки и в биосинтезе различных структурных элементов
клетки.
В то же время экзоферменты выделяются ферментной системой клетки
в окружающую среду, для расщепления макромолекул питательной среды до
простых соединений, которые усваиваются клеткой. Кроме того экзоферменты бактерий выполняют защитную функцию путем инактивации антибиоти-
13
ков [79, 80, 96, 98].
Некоторые экзоферменты (нейромидаза, ферменты агрессии и др.) бактерий разрушают ткань и клетки, обеспечивая проникновение микробов и их
токсинов в ткани организма. Ферменты микроорганизмов используют в качестве активных веществ, в генетической инженерии и применяют в легкой и
пищевой промышленности, в качестве биодобавок в стиральные порошки
для расщепления и уничтожения органических загрязнений [39, 45, 82].
Ферментативное различие у бактерий используют для их идентификации. Сахаролитические свойства ферментов (расщепление сахаров) определяют по конечным продуктам образования щелочей, кислот, сероводорода,
аммиака и др. Определяют Е. coli на дифференциально - диагностических
средах Эндо, Гиса, Плоскирева и др.
В частности пестрый ряд среды Гиса состоит из МПБ или полужидкого
мясопептонного агара с добавлением углевода [лактозы, манита и др.] и индикатора РН (меняющего цвет при расщеплении углевода с кислотообразованием и пузырьков газа).
Среды Эндо и Левина представляют собой МПА с лактозой и индикатором РН (фуксин и пр.) На этих средах бактерии расщепляющие лактозу с
образованием кислоты окрашены в красный цвет с металлическим блеском
(среда Эндо для кишечной палочки) или в темно-синий цвет на среде Левина.
В то же время бактерии (сальмонеллы, дизентерийные палочки) не расщепляющие лактозу на этих средах образуют неокрашенные колонии.
Протеолитические свойства бактерий определяют по разжижению желатина и разложению белка с образованием индола, сероводорода и аммиака.
По отношению к молекулярному кислороду бактерии подразделяются на три
группы: 1) облигатные (обязательные аэробы), растущие на средах с доступом кислорода; 2) облигатные (строгие анаэробы), растущие на средах без
кислорода, который для них токсичен; 3) факультативные бактерии, растущие как при наличии, так и отсутствии кислорода.
Размеры бактерий колеблются от 0,2 до 10 мкм (1 мкм равняется 1000
14
нанометров), а вирусов от 20 до 400 нм. В настоящее время, известно около
7000 видов бактерий и 4-х тысяч вирусов. Бактерии размножаются бинарными делением на две одинаковые клетки. При оптимальных условиях роста
бактерии делятся через 20 - 40минут. Рост палочковидных бактерий происходит в длину, а у кокков во всех направлениях. Для выращивания бактерий
используют жидкие, плотные и полужидкие питательные среды [11, 38, 217].
Жидкие среды готовят на основе водных растворов бульонов и гидролизатов мяса, казеина, крови. Для получения плотных сред к ним добавляют
агар, желатин или силикогель. Агар представляет собой сложный полисахарид из морских водорослей, который растворяется при 90 - 100° и сохраняет
жидкое состояние до 45°С. Для приготовления плотных сред агар добавляют
в бульон в концентрации 2 - 3%, а в полужидкие до 0,5 - 0,7 % [126, 83, 207].
В качестве универсального источника азота и углерода в питательные
среды добавляют пептоны - продукты неполного расщепление белков (протеинов) с помощью ферментов (пепсина, дрожжей и т.д.).
Различают универсальные среды – мясопептонный бульон (МПБ =
мясная вода + 1% пептона + 0,5% NaCL) и мясопептонный агар (МПА =
МПБ + 2 - 3% агара).
В настоящее время проводятся исследования с использованием синтетических сред вместо МПБ.
Кроме универсальных сред для выращивания микробов используют
дифференциально - диагностические, селективные, избирательные, обогатительные, а также дифференциально - селективные; специальные, например
для выделения микобактерий – среда Левенштейна - Йенсена и синтетические, приготовленные из известных химических ингредиентов и полусинтетические с добавлением продуктов природного происхождения [79, 80, 52,
194].
Повышение эффективности биопрепаратов требует от исследователей
разработки питательных сред, отличающихся постоянством состава и свободных от продуктов неопределенного химического характера - белков, экс-
15
трактивных веществ мяса, пептонов, продуктов растительного происхождения. Такими являются питательные среды, составленные из различного набора химически чистых солей, аминокислот, микроэлементов.
В 1893 г., благодаря работам русского ученого К.В. Ушинского, была
впервые установлена возможность культивирования патогенных микроорганизмов без утраты присущих им свойств на растворах солей, не содержащих
продуктов животного и растительного происхождения. Автор приготовил
среду следующего состава: глицерина – 50 мл, хлористого натрия – 5 – 7 г,
хлористого кальция – 0.1 г, сернокислого магния – 4 г, двузамещенного фосфорнокислого – 1,0 г и молочнокислого аммония – 10 г на 1 л дистиллированной воды. В другом варианте своей среды он ввел 3,4 г аспарагиновокислого натрия.
На описанных вариантах сред автор с успехом выращивал холерный
вибрион, бактерии рожи свиней, Е. coli, сальмонеллы.
Рассматривая, предложенную автором, среду с позиций современных
знаний биохимии питания микроорганизмов, необходимо указать, что она
содержит все жизненно необходимые минеральные элементы: магний, калий,
ионы серной и фосфорной кислоты и источник углерода, глицерин.
Полученные результаты стали прообразом большинства синтетических
питательных сред.
В последующем была изучена роль в физиологии микроорганизмов серы, кальция, меди, железа, кобальта, витаминов и аминокислот.
Следует указать, что фосфор и калий постоянно составляют самое
большое количество минерального остатка. Они входят в состав нуклеиновых кислот, некоторых липидов и ферментов.
Кроме того, ионы фосфора и калия наряду с ионами натрия необходимы для поддержания осмотического давления среды, для выполнения функций буфера в среде. Ионы кальция, магния и серы необходимы для функции
внутриклеточных энзимов. Ион серы при этом активно включается в клеточные белки. Ион магния активирует почти все энзимы, требующие наличия
16
двухвалентных катионов.
Краткий отбор литературы дает основание утверждать, что минеральные питательные среды с аспарагином, глицерином, и с ионами железа, цинка и т.д. обеспечивают сохранение морфологических и биологических
свойств микроорганизмов, а лимонная кислота цикла Кребса, растворение
ингредиентов.
При сочетании различных веществ необходимо помнить, что они могут
взаимодействовать друг с другом, образуя при этом различные соединения
Особенно важно создавать такие условия для роста бактерий, при которых не
происходило бы осаждения углекислых и фосфорнокислых солей. Поэтому
необходимо учитывать совместимость, стабильность и нестабильность вносимых ингредиентов среды.
В питательных средах при культивировании микроорганизмов, так
называемые несущественные элементы для жизнедеятельности клетки, могут
оказывать косвенное влияние, или могут создавать благоприятные физикохимические условия среды, способствовать полному растворению основных
ингредиентов в питании бактерий. Разделение элементов питательной среды
на основные, или существенные, и на дополнительные, или несущественные
метаболиты является условным и ориентировочным [96, 122, 126, 217, 218].
Достигнутые успехи в конструировании минеральных питательных
сред создают перспективу совершенствования существующих, и поиска новых, более эффективных, экологически безопасных, технологически доступных и выгодных ингредиентов в составе питательных сред, обеспечивающих
высокое накопление бактериальной массы при изготовлении вакцины и анатоксинов.
2.2 Виды и характеристика Е. coli, формы течения и средства профилактики колибактериоза свиней
Эшеризиоз свиней, колибактериоз, колидиарея, колиинфекция, колибациллез – остро протекающая инфекционная болезнь поросят, характеризующаяся диареей, явлениями токсемии, реже септицеии, и сопровождающаяся
17
высокой смертностью.
Возбудитель колибактериоза, впервые в 1885 г., выделил из кишечника
детей молодой немецкий врач Теодор Эшерих. В 1937 г. род Еscherichia
включен в состав семейства Enterobacteriaceae. В 1988 г. международный комитет для Е. coli рекомендовал термин «бловар», «серовар», «фаговар» вместо «биотип», «серотип» и «фаготип» [13, 14, 207, 214].
Е. coli – одиночные короткие палочки с закругленными концами, иногда биполяры и нитевидной формы. Обычная длина кишечной палочки составляет 1 – 1,5 км, ширина 0,6 – 0,8 мкм, но встречаются очень мелкие и
длинные (до 3 – 3,5 мкм) варианты. Е. coli не образуют спор, слабоподвижны,
редко встречаются неподвижные варианты. По Граму кишечная палочка красится отрицательно (красные цвет).
Кишечная палочка входит в микроценоз организма, является постоянным обитателем толстого кишечника млекопитающих, птиц, рыб, рептилий,
амфибий, ее можно обнаружить на различных видах растений.
Кишечная палочка в пищеварительном тракте животных и человека
утилизирует остатки непереваренной пищи, корма, синтезирует биологически активные витамины группы В, биотин, витамин К, никотиновую и пантотеновую кислоты и вырабатывают антибиотикоподные вещества – колицины
и микроциды [77, 137, 143].
Плазмиды, бактериофаги, антибактериальные препараты, факторы
внешней среды способствуют Е. coli расширить среду обитания, паразитирования [82, 83, 123]. В итоге у Е. coli выработалась способность вызывать разные формы инфекции путем адаптации тропизма к другим органам, тканям
[82, 98, 147, 220]. Е. coli после разрушения, лизиса гемолизом эритроцитов
способны использовать освободившийся гемоглобин в качестве источника
железа [23, 149, 159].
Кроме того, эшерихиозные гемолизины, эндотокины, энтеротоксины,
цитолизины способны разрушать другие микроорганизмы и фагоциты, делая
их нежизнеспособными [19, 97, 129, 163, 218].
18
Несмотря на то, что бактериальные микроорганизмы в 2000 раз меньше
клеток органов и тканей животных и человека у них в процессе эволюции
сформировались физиологические процессы и механизмы самозащиты [38,
49, 214, 217].
Постоянное применение антибактериальных препаратов в отношении
Е. coli привело к возникновению резистентности более чем к 35 моно- и комбинированным средствам [34, 48, 55, 203].
Скорость размножения и география распространения антибиоустойчивых микроорганизмов и их нарастание создают угрозу для животных и человека, т.к. традиционные поиски новых более эффективных биоцидных
средств практически исчерпали свои возможности [31, 32, 34, 149].
В последнее время возрос интерес к изучению получения и применения
бактериофагов, литических ферментов, пробиотиков, бактерий – антагонистов антимикробных пептидов и субстанций бактериального происхождения
– бактериоцины [187, 191].
Патогенные факторы Е. coli – адгезины, инвазии, экзотоксины, цитотоксины и эндотоксины контролируются хромосомными и плазмидными генами и умеренно конвертирующими фагами [109, 193,208].
Обеспечение патогенности эшерехий не возможно без участия плазмид. К плазмидам относят генетический аппарат клеточных органоидов –
митохондрий, пластид, а также группы сцепления, не являющиеся жизненно
важными для микроорганизмов [173, 175, 183].
У Е. coli изучено более 30 различных колицинов, которые обозначаются буквами латинского алфавита – А, В, С и другие.
Колицины – вещества белковой природы, способные подавлять рост и
развитие родственных микроорганизмов, путем адсорбции на рецепторах
клетки, вызывают нарушения микробного метаболизма [51, 53, 144].
В настоящее время колицины кишечной палочки широко применяются
в комплексе с антибактериальными препаратами – энронит (энрофлоксацин),
эндометрамат – К (генталицин + колистин сульфат) [справочник Видаль ве-
19
теринар, 2013].
У Е. coli почти все компоненты (белки, липополисахариды, нуклеопротеиды) обладают антигенными (иммуногенными) свойствами и вызывают
иммуногенную перестройку организма [10, 32, 33, 182].
Автор теории местного иммунитета Безредка А.М. считал, что каким
бы путем ни вводили вакцину против кишечных инфекций, происходит
«вакцинация» кишечника, наиболее чувствительной к этим инфекциям органа. При подкожной иммунизации «вакцинация» кишечника наступает окольным путем, а при энтеральной – кишечник вакцинируется непосредственно
[13, 14, 17, 137, 171].
Следует указать на возможность энтеральной вакцинации с целью создания иммунитета, появились в сообщениях в 1880 г. Л. Пастера, Шамбергена, Э. Ру, в 1904 г. A. Wright, а в 1905 г. Г.Н. Габрического [13, 14, 29, 156].
В связи с широкой вариабельностью кишечной палочки особое внимание уделяется выбору вакцины с учетом видовой принадлежности возбудителя [21, 25, 29, 70].
В настоящее время для борьбы с эшерихиозом свиней выпускаются современные вакцины и сыворотки, охватывающие достаточно широкий спектр
серогрупп эшерихий, обладающих различными адгезивными антигенами:
1. КОЛИ – ВАК – вакцина против эшерихиоза животных (К88, К99,
987Р, F41, ТС и ТЛ – анатоксины) Армавирская биофабрика, Орловская биофабрика, Ставропольская биофабрика.
2. Вакцина, инактивированная против колибактериоза (эшерихиоза)
поросят, Ставропольская биофабрика.
3. Вакцина поливалентная гидроокись – алюминиевая формолтиомерьаловая против колибактериоза (эшерихиоза) свиней, Краснодарская
биофабрика.
4. Вакцина поливалентная гидроокись – алюминиевая против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят, ягнят, Омский биокомбинат.
5. Сыворотка поливалентная против колибактериоза (эшерихиоза)
20
сельскохозяйственных животных, Армавирская биофабрика.
6. Сыворотка антиадгезивная и антитоксическая против эшерихиоза
сельскохозяйственных животных, Армавирская биофабрика.
7. Сыворотка против колибактериоза сельскохозяйственных животных,
Краснодарская биофабрика.
С учетом наличия в «жизненном цикле» Е. coli, чередования смены фаз
пребывания бактерий в организме животных, человека и во внешней среде,
роли факторов персистенции с другими микроорганизмами, сложности идентификации, влияния антибактериальной терапии остаются актуальными изучение биологических свойств, методов и средств диагностики, терапии и
специфической профилактики колибактериозов животных и людей [19, 31,
72, 192].
Кишечная палочка хорошо растет на обычных простых и синтетических плотных и жидких питательных средах (МПБ, МПА и др.), оптимальный рН среды 7,2-7,4 , но выдерживают как кислые, так и щелочные среды. В
мясо-пептонном бульоне (МПБ) дает равномерное помутнение с образованием беловатого осадка, который легко разбивается при встряхивании. При росте на средах Гисса Е. coli сбраживает лактозу до кислоты и газа, что является одним из важных признаков, дающих возможность дифференцировать
кишечную палочку от других многочисленных представителей семейства Enterobacteriaceae. Культуры Е. coli, как правило, разлагают до кислоты и газа
манит, глюкозу, арабинозу. Они образуют индол, аммиак, не образуют сероводород, дают положительную реакцию с метиленовым красным и отрицательную Фогес-Проскауэра, желатину не разжижают, не утилизируют цитраты, не расщепляют мочевину [51, 56, 64, 173].
На плотных питательных средах Е. coli образуют выпуклые колонии
средней величины, обычно 13мм в диаметре, влажные, блестящие, прозрачные и не прозрачные в проходящем свете. При росте на дифференциальнодиагностической среде Эндо кишечная палочка образует ярко красные с металлическим блеском колонии [40, 44, 66, 157].
21
Эшерихии обладают биохимической активностью. Они ферментируют
галактозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, левулезу и другие углеводы. Бактерия не разжижает желатину, не разлагает мочевину, восстанавливает нитриты в нитраты, образует индол. Эшерихии продуцируют до 30 видов колицинов - веществ, несущих антибиотические свойства.
Устойчивость. Механизм образования резистентности к химическим
веществам, антибиотикам у бактерии довольно сложный. Он зависит от совершенства защитных приспособлений микроорганизма. В этой связи имеет
значение, прежде всего, состояние здоровья организма, дефекты фагоцитоза,
недостаточности клеточной и гуморальной защиты, различные отклонения в
микроценозе нормальной микрофлоры организма, характер применения лекарственных препаратов. Перечисленные факторы снижают общую резистентность организма. В этих условиях чувствительные к лекарственным
препаратам микроорганизмы могут стать нечувствительными или слабочувствительным. Применение лекарственных веществ при этом станет малоэффективным или вообще не эффективным.
Лекарственные препараты обладают избранной специфичностью действия на структурные элементы микробной клетки. Это действие проявляется
в отношении оболочки клетки, цитоплазматической мембраны, синтеза нуклеиновых кислот, белка, рибосом и др. Микроорганизмы, с другой стороны,
проявляют генетическую резистентность против лекарственных веществ. Эта
функция выполняется хромосомным аппаратом, наружной мембраной микробной клетки, а также мутагенными популяциями микроорганизмов. В этом
отношении эшерихии обладают широким спектром устойчивости.
Escherichia coli обладает рядом факторов вирулентности: энтеротоксигенностъю (выработка энтеротоксинов, повреждающих кишечный эпителий),
адгезивностью (синтез антигенов, с помощью которых бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам и реализуют свой болезнетворный потенциал), инвазивностъю (проникновение в кишечный эпителий с последующим
внутриэпителиальным размножением, либо прохождением через него). Все
22
эти факторы вирулентности в естественных условиях действуют комплексно,
создавая инфекционный процесс. Однако, по выраженности одного из указанных факторов, Е. coli можно разделить на энтеротоксигенные, энтеропатогенные, энтероинвазивные и септические.
Кишечная палочка имеет сложную антигенную структуру, включающую К - антиген (поверхностный капсульный оболочный), О - антиген (соматический) и Н-антиген (жгутиковый). За последние десятилетия получены
кардинально новые данные о детерминантах Е. coli и их молекулярногенетических характеристиках. Так, установлено, что ведущими факторами
их патогенности являются энтеротоксины, индуцирующие синдром диареи, а
также группа фибринальных антигенов белковой природы, обеспечивающих
адгезию и последующую колонизацию возбудителя в кишечнике. В настоящее время известно значительное количество адгезивных генов, выделяемых
эшерихиями у новорождённых поросят, при этом более важное значение в
развитии диареи принимают К88, К99, 987Р и др. Исследованиями показано,
что основными возбудителями колибактериоза у поросят являются эшерихии
следующих серогрупп: 0137, 0138, 0139, 0141, 0142, 0147 и 0149.
Кишечная палочка пользуется большим арсеналом факторов патогенности, из которых наиболее важную роль играют капсула, ингибиторы опсонизации, адгезины, токсины, сидерофоры, способность образовывать биопленку.
Капсула маскирует и защищает бактерию от факторов иммунитета и
антимикробных препаратов. Ее антигены имеют полисахаридную природу. В
настоящее время у Е. coli их идентифицировали свыше 100. Их подразделяют
на термолабильные микрокапсульные (L и B) и термостабильный капсульный [A]. Выделенные изолята с капсульным антигеном К1 проявляют
наибольшую устойчивость к бактерицидному действию сыворотки крови.
Е. coli способны формировать биопленку, интенсивно вырабатывать
капсульное вещество. Она надежно защищает бактерию от неблагоприятных
факторов, в т.ч. антибиотиков.
23
Адгезины обеспечивают первый этап колибактериозной инфекции –
колонизацию тканей. К их числу относятся пили (фимбрии) и поверхностные
компоненты бактериальной клетки (непильные адгезины). Пилями бактериальные клетки прикрепляются к клеткам хозяина и друг к другу. Часть новых
генераций макроорганизма после каждого деления остается в такой колонии,
а часть отделяется и заселяет соседние участки тканей хозяина. У AVEC
встречается фимбрии типа 1 [F1A], P [F11] и AC/I. Е. coli использует фимбрии типа 1 для первичного прикрепления. Различные варианты Е. coli включают гемолизины, эндотоксин и энтеротоксниы. Гемолитическую активность
проявляют термолабильные токсины, внеклеточный ß – гемолизин и энтерогемолизин, локализующийся в наружной мембране бактериальной клетки, а
также цитолизин А. Они «пробуравливают» плазмалемму не только эритроцитов, но и других клеток, в т.ч. фагоцитов, делая их нежизнеспособными.
Эндотоксин [липополисахарид] защищает бактерию от опсонизирующего действия комплемента. Частично утратившие его штаммы становятся
чувствительными к бактерицидному действию нормальной сыворотки крови.
Железо необходимо кишечной палочке для синтеза ДНК, транспорта
кислорода и электронов, пероксидов.
Е. coli выделяет гемолизины, разрушающие эритроциты, освобождающийся при этом гемоглобин служит ей источником железа. Действие сыворотки создает основу для септицемии и диссеминации по внутренним органам.
Энтеротоксины кишечной палочки делят на термостабильные и термолабильные. Токсины, связавшись с апикальной мембраной энтероцитов,
нарушает транспорт воды и хлора, индуцирует потерю энтероцитами ворсинок, высвобождение простагландинов и серотонина, а также нарушает транспорт кальция. В результате развивается диарея соответствующего типа.
Эшерихиозная диарея у новорождённых поросят возникает, в большинстве случаев, при нарушении зоогигиенических условий содержания и
ветеринарно-санитарного режима, при наличии факторов стресса связанных,
24
главным образом, с технологией выращивания, а также специфических факторов - бактерий, вирусов и их сочетаний. Важным аспектом в возникновении эшерихиоза является неполноценное и несбалансированное кормление
свиноматок: плохое качество кормов, недостаток незаменимых аминокислот
животного происхождения и витамина А, определяющих внутриутробный
рост и развитие плода, а также его резистентность к условно-патогенной
микрофлоре, активизируемой вирусными инфекциями.
Наиболее восприимчивыми к колибактериозу являются новорождённые поросята и поросята сосуны двух - четырех недельного возраста, а также
поросята впервые 2 нед. после отъема. Болезнь, как правило, протекает эпизоотически, часто стационарно. Особенно широкое распространение эшерихиоз получил на крупных промышленных комплексах, где в период массовых опоросов возбудитель быстро распространяется от помета к помету,
охватывая большое количество животных,
Источником возбудителя служат больные и переболевшие колибактериозом подсвинки и свиньи - бактерионосители. Основной путь заражения
алиментарный, реже - аэрогенный. Известны случаи внутриутробного заражения поросят. Факторами передачи возбудителя могут быть предметы ухода, корма [молоко], посуда, руки свинарок, загрязненные выделениями больных животных. К механическим переносчикам инфекции можно отнести
мух, клопов, мышей, крыс и др. животных.
В результате ослабления общей резистентности организма новорождённых поросят, энтеропатогенные штаммы кишечной палочки проникают в
тонкий отдел кишечника, где интенсивно размножаются, выделяя эндо- и экзотоксины. Термолабильный токсин, продуцируемый большинством эшерихий, адсорбируется на ворсинках эпителиальных клеток тонких кишок и вызывает активизацию аденилатциклазы. что приводит к резкому увеличению
концентрации внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата [с АМР]. Этот вторичный месседжер вызывает гиперсекрецию электролитов и
дополнительную диффузию воды молодыми клетками слизистой оболочки
25
кишечника в просвет тонкой кишки, а также угнетает реабсорбцию натрия. В
результате просвет кишечника переполняется жидкостью, усиливается перистальтика и возникает диарея. Следствием повышенной секреции является
выделение из организма воды и электролитов, что приводит к ацидозу. Это
может при тяжелом течении болезни детерминировать дегидратационный
шок.
Из-за пониженной защитной функции стенок кишечника эшерихии
проникают в лимфу, затем - в кровь и ткани, вызывая септицемию. В результате действия эндотоксина и гемолизина, присущих возбудителю колибактериоза поросят, нарушается проницаемость стенок сосудов, что сопровождается отеками, развитием асептического воспаления в интерстиции с последующими нарушениями функции нервной системы.
Инкубационный период инфекционной болезни у новорождённых поросят в среднем составляет 12-18 часов. В зависимости от количества и вирулентности возбудителя, условий внешней среды и резистентности восприимчивых поросят эшерихиоз может протекать в трех основных формах: энтеритной, энтеротоксимической (отёчной) и септической. Течение болезни при
этом может быть сверхострое, острое, подострое и хроническое.
Из результатов исследований Виноходова О.В. следует, что протективная активность колибактериозных вакцин при оральном введении превышает
подкожную иммунизацию. При этом иммунизирующая доза при энтеральной
вакцинации должна превышать в 100 раз дозу подкожного введения.
Существенным недостатком инактивированных вакцин и анатоксинов
для профилактики колибактериоза не только свиней, но и других животных
остается использование мясо – казеиногидролизатных питательных сред для
выращивания Е. coli и 0,3 – 0,7 % растворов формальдегида для детоксикации и полимеризации комплекса токсинов [29, 34, 81].
Перспективным в повышении иммуногенной и протективной активности колибактериозной вакцины является разработка синтетической [минеральной] питательной среды для выращивания Е. coli и замена канцероген-
26
ного формальдегида на более эффективные полимеризаторы и детоксикаторы
с высоким показателем биоразложения до 90% [33, 38, 48, 199].
2.3 Биотехнологические основы повышения эффективности антибиотиков
В настоящее время химиотерапевтические препараты, способные разрушать микробные клетки или подавлять размножение их популяции получили обобщенное название антибиотики (от греч. аntibios - против жизни).
Антибиотики, синтезированные бактериями, грибами, растениями и
животными называются природными, а подвергнутые химической модификации получили название синтетических и полусинтетических.
К синтетическим антибиотикам относятся препараты, полученные химическим путем: сальварсан, стрептоцид, который в организме распадается
на сульфаниламид, являющийся аналогом парабензойной кислоты [ПАБК],
бисептол, фторхинолоны, метронидазол.[50, 90, 93, 94].
В дальнейшем было установлено, что ПАБК необходима микроорганизмам для синтеза витамина В9 (фолиевой кислоты), являющейся коферментом ряда аминокислот, а если микробы используют сульфаниламид происходит нарушение синтеза аминокислот и бактерии погибают.
Однако длительное применение сульфаниламидных препаратов вызывало устойчивость микробов к ним [кроме бисептола, который с успехом используется для лечения стафилококковой и стрептококковой инфекции].
Первый антибиотик был открыт в 1928 году английским бактериологом
А. Флемингом, который установил, что в культуре стафилококка, загрязненной плесенью, не происходит рост стафилококков и сделал предположение,
что это объясняется выделением плесенью особого вещества, которое он
назвал пенициллин. В 1940 году Флори и Чейн удалось выделить пенициллин
в чистом виде, а в 1945 году они стали Нобелевскими лауреатами [82].
В течение двух десятилетий [с 1940 по 1960 гг.] были открыты основные действующие антибиотики - стрептомицин [1944], полимиксин [1947],
27
хлортетрациклин [1948], неомицин [1949], нистамин [1950], эритромицин,
циклосерин [1952], канамицин [1955]. В 1943 году было произведено всего
13 кг пенициллина, а в настоящее время только антибиотиков пенициллинового ряда [бета-лактамные антибиотики] выпускаются более 100 наименований. Пенициллины представляют собой сложные соединения, содержащие
бета-лактамное кольцо.
В гуманной и ветеринарной медицине из 10000 различных антибиотиков используется 150-200 препаратов. Выпуск антибиотиков в России в последние десятилетия прекращен.
В целом антибиотики вызывают поражение печени, кроветворных органов, слизистых оболочек, мочевых путей, аллергические реакции [68, 91,
92].
В ряде стран, в том числе США, 75-80% свиней, половина индеек,
цыплят и 10% крупного рогатого скота выращивается с применением антибиотиков. Применение кормовых антибиотиков привело к множественной
лекарственной устойчивости микроорганизмов. С 2004 года в странах ЕС использование кормовых антибиотиков запрещено. Все животноводческие и
птицеводческие комплексы России во избежание полного падежа и болезней
животных используют зарубежные препараты.
В зависимости от источника получения различают 6 видов антибиотиков: антибиотики, полученные из грибов рода Penicillinum - пенициллины и
цефалоспорины; антибиотики, полученные из актиномицетов - стрептомицин, эритромицин, нистамин, левомицетин и т. д.; антибиотики, полученные
из бактерий Bacillus и Pseudomonas; антибиотики животного происхождения;
антибиотики растительного происхождения [из шалфея, ромашки, календулы
и т. д.]; синтетические антибиотики.
Применение антибиотиков постоянно сопровождается появлением
микроорганизмов, устойчивых к ним.
Обычно, уже через 1-3 года после применения нового антибиотика появляются устойчивые к нему бактерии, а через 10-20 лет формируется полная
28
резистентность к этому антибиотику.
В настоящее время преодоление бактериальной резистентности проводится с помощью клавулановой кислоты, полученной в 1976 году из продукта метаболизма гриба Streptomyces clavuligeris в Словении. Клавулановая
кислота и ее соли обеспечивают необратимое связывание и ингибирование
многих бактериальных ферментов - бета-лактамаз.
Антибактериальная терапия комбинацией антибиотиков (амоксиклава,
медоклава, сульбактама, аугментина, солютаба) с клавулановой кислотой
привело к появлению устойчивых бактерий и к новым антибиотикам.
Для повышения эффективности в группу хинолонов с успехом введен
фтор и пиперазиновый радикал.
У полученных препаратов выявлен уникальный механизм бактериального действия, связанный с ингибированием бактериальных ферментов.
Однако, широкое и повсеместное применение производных фторхинолона в птицеводстве - байтрила (энрофлоксацин, офлоксацин и т.д.) вызвало
низкую чувствительность к отдельным выделенным бактериям - сальмонеллам, стафилококкам, кишечной палочки [28, 39, 42, 49].
Таким образом, в ответ на мощный натиск антибиотиков бактерии ответили уникальными биологическими реакциями, сила которых не уступает
силе атаки [34, 56, 57, 70].
Известно, что в кишечнике, почве, воде существует многообразие микроорганизмов, происходит постоянный обмен генетическим материалом и,
возможно, в появлении лекарственной устойчивости микроорганизмов к новому антибиотику зависит от многих других модификаций, мутаций, физикохимических воздействий [47, 49, 137].
По мнению большинства зарубежных ученых, механизм действия антибиотиков связан с угнетением синтеза белка и ферментов в микробной
клетке [168, 169].
Важным фактором, влияющим на изменение биологических свойств
микроорганизмов, является воздействие магнитных полей. Степень выра-
29
женности возникающих изменений зависит от вида, величины, частоты,
формы, направления импульса гео и электромагнитных полей [45, 51, 72, 114,
119]
Под действием ряда факторов у микроорганизмов формируются новые
варианты плазмид, обмен генами лекарственной устойчивости и за счет генофонда образуются гены самозащиты, гены устойчивости к лекарственному
средству или экологическому воздействию [39, 42, 173, 203, 213].
Для преодоления известных и неизученных механизмов защиты бактерий от антибиотиков необходим поиск, разработка препаратов, которые были
бы нечувствительны и устойчивы к защитным ферментам, подавляли их синтез в бактериальной клетке, обладали повышенной проницаемостью, проявляли минимальную токсичность для организма и депрессивное действие на
иммунную систему [29, 32, 34, 211, 213].
Механизм действия антибиотиков направлен на подавление размножения и разрушения патогенных и непатогенных бактерий, грибов, опухолей и
проявление токсического действия на организм.
Сочетанное использование одних антибиотиков с другими в последующем привело к появлению лекарственноустойчивых микроорганизмов.
При этом повышение бактерицидной эффективности антибиотиков
происходит на фоне повышения нефротоксичности, нейротоксичности и т.д.,
снижение иммунитета и появление еще более резистентных патогенных микроорганизмов.
Создание новых лекарственных форм и комбинаций антибиотиков не
обеспечивает качественного прорыва и снижения токсичности в фармакокинетике антимикробных препаратов [13, 16, 219].
Результаты определения чувствительности должны иметь количественное выражение. Для того, чтобы получать объективные воспроизводимые и сравнимые результаты, в течение многих лет проводится работа по
стандартизации методов и средств определения антибиотикочувствительности [156, 158, 186].
30
При использовании антибиотиков и других химиотерапевтических
препаратов [ХТП] на практике важно определять чувствительность к ним
клинически значимых штаммов микроорганизмов. Чувствительность микроорганизмов необходимо определять в каждом случае влияния инфекции и
периодически в ходе лечения. С этой целью применяют несколько методов
исследования: диско-диффузионный, метод серийных разведений, метод Етестов.
Главным показателем чувствительности, независимо от метода ее
определения, является величина минимальной ингибирующей концентрации
микроорганизмов. Значимость этой работы трудно переоценить, учитывая
тот факт, что клиническая эффективность антибиотиков будет зависеть не
только от правильно определенной invitro чувствительности, но и от ряда
других, иногда трудно прогнозируемых факторов: фенотипической и генотипической изменчивости возбудителя, особенностей фармакокинетики и фармакодинамики препарата, а также состояния антиинфекционной защиты
больных животных. Наибольшее внимание уделено диско-диффузионному
методу, широкое применение которого нуждается в первоочередной унификации [24, 26, 45].
На практике величина МИК позволяет отнести исследуемый штамм
микроорганизма к одной из трех общепринятых категорий: чувствительный,
умеренно-устойчивый и устойчивый.
Микроорганизм считают чувствительным, если у него нет механизмов
резистентности к данному антимикробному средству и при лечении стандартными дозами этого препарата, отмечается хорошая терапевтическая эффективность. Устойчивым к антимикробному средству считают микроорганизм, если он имеет механизмы резистентности к данному препарату и при
лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, нет клинического
эффекта даже при использовании максимальных терапевтических доз этого
препарата. Микроорганизм относят к умеренно-устойчивым, если по своей
чувствительности он занимает промежуточное значение между чувствитель-
31
ными и устойчивыми штаммами и при лечении инфекций, вызванных данным возбудителем, хорошая клиническая эффективность наблюдается только
при использовании высоких терапевтических доз препарата [или при локализации процесса в местах концентрации антимикробного средства].
Выбор антибиотика для лечения зависит от чувствительности возбудителя, возможности достижения антибиотиком очага инфекции без снижения
его активности и от побочного действия.
Эшерихии ферментируют галактозу, лактозу, арабинозу, ксилозу и
другие углеводы. Бактерия не разжижает желатин, не разлагает мочевину,
восстанавливает нитриты в нитраты, образует индол. Эшерихии продуцируют до 30 видов колицинов - веществ, несущих антибиотические свойства.
Механизм образования резистентности к химическим веществам, антибиотикам у бактерий довольно сложный. Он зависит от совершенства защитных приспособлений микроорганизма. В этой связи имеет значение, прежде
всего, состояние здоровья организма, дефекты фагоцитоза, недостаточность
клеточной и гуморальной защиты, различные отклонения в микроцинозе
нормальной микрофлоры организма, характер применения лекарственных
препаратов. Перечисленные факторы снижают общую резистентность организма. В этих условиях чувствительные к лекарственным препаратам микроорганизмы могут стать нечувствительными или слабочувствительными.
Применение лекарственных веществ при этом станет малоэффективным или
вообще неэффективным [24, 26, 167].
Лекарственные препараты обладают избранной специфичностью действия на структурные элементы микробной клетки. Это действие проявляется
в отношении оболочки клетки, цитоплазматической мембраны, синтеза нуклеиновых кислот, белка, рибосом и др.
Кишечная палочка проявляет генетическую резистентность против лекарственных веществ. Эта функция выполняется хромосомным аппаратом,
наружной мембраной микробной клетки, а также мутагенными популяциями
микроорганизмов. В этом отношении эшерихии обладают широким спектром
32
устойчивости.
Спектр токсинов различных вариантов E. coli неодинаков и включает
гемолизины, эндотоксин и энтеротоксины [167, 168, 170].
Гемолитическую активность проявляют термолабильные токсины, внеклеточный β-гемолизин и энтерогемолизин, локализующийся в наружной
мембране бактериальной клетки, а также цитолизин А.
Впервые приоритетное повышение биоцидного и лечебного действия
антибиотиков достигнутое путем полимеризации и детоксикации 0,2% раствором формальдегида или 0,2% раствором глутарового альдегида с 0,2%
раствором этония в отношении резистентных микроорганизмов создает
надежду на перспективность исследований по потенцированию биоцидного и
лечебного действия антибиотиков.
2. 4 Проблемы и механизмы повышения эффективности
пробиотиков в свиноводстве
Для лечения, профилактики и повышения продуктивности животных
применяются пробиотики – это живые бактериальные микроорганизмы. Пробиотики или эубиотики («ЭУ» - хорошие) синтезируют биологически активные соединения – ферменты, витамины, антибиотики, нормализуют процессы пищеварения, подавляют патогенную микрофлору для организма [30, 36,
181].
Впервые для коррекции и нормализации пищеварения использовал И.
И. Мечников бифидо- и лактобактерии.
В ветеринарии первоначально в качестве пробиотиков использовали
АБК (ацидофильнобульонная культура) и ПАБК – пропионоацидофильная
бульонная культура [9, 35, 85, 206].
Для получения пробиотиков используют молочно-кислые, ацидофильные бифидобактерии, кишечную и сенную палочки, фекальный стрептококк
и т. д. [7, 30, 35, 38].
В настоящее время выпускается большое количество коммерческих
33
моно и ассоциированных симбионтных, эубиотических препаратов – колибактерин, Bacillus subtilis штамма 44, бифилакт, лактобактерин, лактобациллин, бифидобактерии, бактонорм, бификол, иммунобак, линолак [27, 31, 187].
Для практических целей используют четыре поколения эубиотических
препаратов – это содержащие один штамм бактерий самоэлиминирующие
[Bac. subtilis];симбионтные, поликомпонентные или комбинированные, содержащие несколько штаммов бактерий и четвертое поколение – сорбированные живые микроорганизмы [43, 53, 70].
Для сорбирования живых пробиотических микроорганизмов используют активированный уголь, отруби, кукурузную и рыбную муку, сухое молоко, сахарозу. Повышение эффективности пробиотических микроорганизмов
достигнуто с помощью сорбентов и пробиотиков [22, 31, 36].
Современные пробиотические препараты выпускаются в лиофилизированном [высушенном] виде, капсулах, а также в таблетированной форме [7,
85, 94].
Это обеспечивает повышение сохранности, улучшение транспортировки и строгое дозирование микроорганизмов.
Использование антибиотиков при желудочно-кишечных болезнях телят, поросят приводит к дисбактериозу, нарушению пищеварения и развитию
диареи [87, 96, 103].
При отдельных формах колибактериоза с успехом используется регидратационная терапия больных телят, поросят, птицы. Превентивная терапия
нормализует водносолевой и электролитный обмен и кислотно-щелочное
равновесие, улучшает функцию сердечно-сосудистой системы, печени, почек. При легкой дегидратации больным животным применяют дегидратационные растворы, которые сдерживают размножение E. coli, сальмонелл и т. д.
в кишечнике, а при тяжелой – щелочные растворы [102, 112, 207].
В качестве основных компонентов превентивной терапии используют
глюкозу, хлористый натрий, хлорид магния, ацетат натрия, фосфорнокислый
калий. Ряд авторов рекомендуют дегидратационные растворы в качестве
34
симптоматических и патогенетических средств вместо этиотропной терапии
[9, 22, 96, 217].
При выраженной диспепсии и токсикозе после антибиотикотерапии
назначают разгрузочную диету с введением в рацион пробиотика, сухого молока, ферментов, сырной сыворотки, а также пробиотиков для нормализации
пищеварения и кишечной микрофлоры [173, 206, 211].
Использование мясокостной и рыбной муки вызывает окисление белков и развитие метаболитического ацидоза.
Наибольший лечебный эффект после антибиотикотерапии, голодной
диеты и превентивной терапии с регидратационными растворами является
применение пробиотиков [187, 201, 206].
Эубиотические микроорганизмы способствуют синтезу противовоспалительных цитоксинов, хемоксинов, антител и являются антагонистами патогенной микрофлоры [34, 35, 38, 73, 91].
Несмотря на наличие в одной дозе пробиотиков: биофлор, колибактерин, бификол и т. д., не менее 1010 живых бактерий, количество доз при профилактике и лечении желудочно-кишечных и послеродовых заболеваний
увеличивают в 5-7 раз [13, 14, 18, 40]. Энтеральное введение пробиотиков и
вакцинацинных препаратов основано на теории местного иммунитета, разработанное А. М. Безредка [2, 13, 14, 207].
Впоследствии установлено, что пероральная иммунизация должна превышать дозу подкожной вакцины в 100-200 раз [14, 18, 187].
Феномен органотропности обусловливает вакцинацию именно кишечника при оральном способе внесения живых или инактивированных микроорганизмов, а при подкожной вакцинации иммунитет обеспечивается окольным путем [13, 25, 44].
В оценке иммунитета ряд авторов на первое место поставили клеточные реакции организма, а гуморальному (антительному) – второе. В этом
разгадка механизма и теории местного иммунитета [13, 26, 183].
Экспериментальными исследованиями доказано, что антитела после
35
оральной иммунизации образуются не всегда или выражены слабее, чем после подкожной.
В то же время при отсутствии в сыворотке крови специфических антител оральная вакцинация обеспечивает высокую защиту [14, 35, 85, 155, 187].
Представленные данные свидетельствуют об эффективном использовании пробиотиков отдельно и в комплексной профилактике и терапии животных при желудочно-кишечных и послеродовых заболеваниях [30,36, 45, 175].
2.5 Влияния магнитных полей на биологические свойства
микроорганизмов.
Магнитное поле является одним из малоизученных факторов внешней
среды, воздействующим на организм человека, животных, микроорганизмов,
кровь и форменные элементы. Название магнитное поле и явление магнетизма произошло от Магнетис в Малой Азии, где были обнаружены залежи магнитного железняка – «камня, притягивающего железо». В сфере магнитного
поля все предметы, живые организмы намагничиваются и изменяют свои
свойства. Солнечная активность, линии электропередач, космическое пространство, средства связи, геомагнитное поле способны изменять магнитное
поле, вызывать образование магнитных бурь.
Изучено, что отрицательные ионы от поверхности Земли смещаются
вверх, а положительные ионы притягиваются отрицательным зарядом Земли.
Воздействие электромагнитного поля обеспечивает взаимосвязь между движущимися электрическими токами (зарядами). Доказано, что активность и
солнечные бури, лунные затмения, геоэлектромагнитное воздействие, полярное сияние способны изменять состояние нервной системы, ее реактивность,
поведение организма, в весьма неблагоприятном смысле [48, 52, 60, 73, 169].
В зависимости от состояния солнца, космических лучей проявляется
поведение людей, микроорганизмов. У ряда микроорганизмов ускоряется
рост, образование метахроматических волютиновых зерен, вирулентность
вирусов, проявление эпизоотий и эпидемий.
36
Заслуживает внимания монография А.Л. Чижевского, вышедшая в 1983
году «Эпидемия и электромагнитные пертурбации внешней среды». Это поистине триумф научного мышления и познания от наблюдений, статистического обобщения к биохимическому эксперименту, к предвидению патологических процессов и защите жизни. Им было доказано об особой биологической роли ионов атмосферного воздуха и биоэффектах циклической деятельности солнца.
Влияние магнитных полей на ткани, органы неоднородны, а длительное воздействие и напряженность магнитного и геомагнитного поля вызывают изменения и нарушения нервной, сердечно-сосудистой системы, нарушение структуры клеток и сывороточных белков. Электромагнитное воздействие снижает углеводный и солевой обмен, уровень ионов К, Na, Mg. Са [47,
48, 94, 167].
Доказано, что интенсивность и длительность воздействия магнитных
полей вызывает переход от адаптационных реакций организма в патологическую и существенные сдвиги в структуре и функциях органов и тканей [62,
24, 47, 219].
Обоснованность гипотез и выводов А.Л. Чижевского о влиянии магнитных полей, солнечной активности на проявление инфекционного процесса, в зависимости от продолжительности воздействия подтверждены результатами исследований, в т.ч. ученых Курского Государственного Медицинского университета.
Из обзора литературы следует, что длительное воздействие слабых переменных и постоянных магнитных полей, «омагничивание» снижает активность гуморального и клеточного иммунитета и в целом резистентность организма животных и человека.
Массовое применение антибиотиков в лечении животных и человека
привело к появлению распространенности резистентности микроорганизмов
к температуре, дезинфицирующим и лекарственным средствам. Считают, что
в основе устойчивости микроорганизмов к антибиотикам лежит фермента-
37
тивная деструкция лекарственных препаратов [17, 19, 49, 220].
В тоже время влияние и механизм действия слабых магнитных полей
на биологические свойства микроорганизмов и развитие инфекционного
процесса, устойчивость к антибиотикам остается открытым.
Методом серийных разведений у E. Coli, сальмонелл при длительных
пересевах (более 23) в слабом магнитном поле выявлено повышение резистентности к пенициллину, стрептомицину, левомицитину, окситетрациклину, и фторхинолонам (энрофлоксацину) в 2-4 раза и более [Киселева В.В.,
1996; Калуцкий П.В. и др. 1997].
В целом полученные результаты о влиянии слабых магнитных полей,
геомагнитного и электромагнитного воздействия являются относительными,
так как результаты получены в зоне искусственных электромагнитных полей,
превышающих экологический уровень [Чевинец В.М., 1975, 1981; Чернощёков К.А., 1981, 1991; Калуцкий П.В., 1995].
Исходя из краткого обзора литературы, следует, что успех и перспективность борьбы с инфекционными болезнями и эффективность проведения
ветеринарно-санитарных мероприятий зависит от изученности роли и влияния комплекса геомагнитного, геохимического, лучевого и эволюционного
воздействия на микроорганизмы, животных и человека в глобальном и региональном масштабе.
38
Заключение
Из обзора литературы следует, что совершенствование средств и способов специфической профилактики, антибиотикотерапии с применением
пробиотиков возможно с повышением резистентности новорожденных поросят и поросят после отъема, супоросных свиноматок, разработки рациональной технологии получения колибактериозной вакцины путем выращивания
лабораторных и свежевыделенных штаммов E.coli на жидкой минеральной
питательной среде вместо содержащей балластные вещества мясо – или казеиногидролитного бульона, изыскание более эффективных средств полимеризации и детоксикации бактериальных токсинов, а также потенцирование
биоцидного и лечебного действия антибиотиков.
39
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Материалы и методы исследований
Работа выполнена на кафедре эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии Курской государственной сельскохозяйственной академии имени
профессора И.И. Иванова, Курской областной ветеринарной лаборатории,
Железногорской зональной ветеринарной лаборатории и на базе свиноводческих комплексов ЗАО АПЦ «Фатежский» Курской области и ЗАО «Мираторг» Белгородской области.
Объектом исследований служили лабораторные и свежевыделенные E.
Coli от павших поросят, фекалий, кормов, поверхностей помещений цехов
комплексов и водных источников из регионов с различным геомагнитным
полем.
В изучении физиологических и иммунологических показателей использованы поросята 3-х пород: дюрок, ландрас и крупная белая с определением
белков плазмы крови, соотношение альбумина и глобулина, микроэлементов
в возрастной динамике. С учетом возможного инфицирования проводили
контроль поросят и свиноматок, хряков в цехах ожидания, осеменения, опороса, выращивания и откорма. Цеха осеменения и опороса состоят из 2-х
корпусов по 2,5 – 3,0 тысячи голов, в цехе доращивания из 3-х корпусов по 8
– 9 тысяч голов в каждом и цех откорма в 6 корпусов по 3 – 4 тысячи голов.
Выращивание проводится от 100 до 170 суток с реализацией на мясо, массой
100 – 120 кг. Условия содержания и кормления поросят в ЗАО «Мираторг»
представлены на рисунках 1,2,3,4.
Впервые 4 недели протекает подсосный период – молоко свиноматки и
вода являются основной пищей поросят. От свиноматки поросят массой 10 –
12 кг отнимают с 4 по 6 неделю. Температура помещений в первые 20 – 25
дней на уровне на уровне пола находится в диапазоне 28 – 30°С, а затем
спускается до 27°С. В процессе исследований изучали иммунологические
показатели сыворотки крови, витаминов, микроэлементов. Мониторинг обсемененности кормов микрофлорой – стафилококками, протеем, кишечной
40
Рисунок 1 - Условия содержания хряков.
Рисунок 2 - Условия содержания и кормления поросят.
41
Рисунок 3 - Содержание поросят на подсосе.
Рисунок 4 -Кормление поросят на откорме.
42
палочкой и плесневыми грабами проводили путем высева на специальные
элективные питательные среды.
Для выращивания E. сoli использовали, в сравнительном аспекте, существующие питательные среды и варианты модифицированных минеральных сред с экономически доступными ингридиентами, обеспечивающими
стабильное высокое накопление микроорганизмов. Выращивание E. сoli проводили в 2 –х литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру, в течение 2 – 3 суток. Концентрацию E. сoli определяли по стандарту мутности,
изготовленный Контрольным институтом им. Тарасевича.
Изучение роста E. сoli проводили на разных вариантах питательных
средах с использованием лимонной и янтарной кислот, аспарагина и глицерина в 2-х литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру.
Для культивирования E. сoli использовали мясопептонный, казеиногидролизатный бульон с глицерином с рН 7,1 – 7,2 и на вариантах минеральных сред с лимонной и янтарной кислотами в диапазоне 3 – 5 г/л, макро- и
микроэлементами, 1 % глюкозы, аспарагин и глицерин до 1 г/л. Реакцию среды устанавливали 5 – 10 % раствором аммиака.
Выращенную суспензию E. сoli подвергали автоклавированию при 1,0
атм., в течение 30 минут.
Детоксикацию и полимеризацию комплекса колибактериозных токсинов проводили первоначально 0,2 – 0,3 % раствором глутарового альдегида
при 40 0С в течение 3 – 5 суток, а затем 0,2 % раствором алкилдиметилбензиламмония хлоридом.
Для выделения E. сoli использовали мясопептонный бульон и минеральную питательную среду с 2,5 % агара с рН 7,1 – 7,3. Приготовление
плотной минеральной питательной среды проводили путем разведения жидкой синтетической среды в соотношении 1:1 и 1:2 при внесении 2,5 % агара.
Полученную взвесь с агаром подогревали до расплавления агара, а затем разливали по флаконам, пробиркам и в чашки Петри, в стерильных условиях.
Выделение E. сoli проводили из трупов и фекалий поросят и поверхно-
43
стей водных источников с повышенным геомагнитным фоном. Перед посевом поверхность печени, лимфоузлов, сердца, селезенки фламбировали раскаленным шпателем.
Свежевыделенные и лабораторные штаммы E. сoli сохраняли на поверхности агара в пробирках и во флаконах с МПГБ и минеральной жидкой
питательной среде в течение 2 – 4 недель с последующим пересевом на свежие питательные среды.
Приготовление колибактериозной анатоксин-вакцины проводили выращивание E. сoli в 2-х литровых биобутылях с объемом среды, равной 1
литру, в течение 2 – 3 суток, до 70 – 90 млрд/мл микробных клеток с последующим автоклавированием при 1,0 атм в течение 20 – 30 минут. Полученную взвесь автоклавированных кишечных палочек с комплексом токсинов,
использовали для изготовления анатоксин-вакцины, путем детоксикации и
полимеризации, первоначально 0, 3 – 0, 4 % раствором формальдегида при 40
0
С в течение 4 – 5 суток. Второй вариант технологии изготовления колибак-
териозной анатоксин-вакцины включал детоксикацию и полимеризацию
комплекса токсинов 0, 2 – 0, 3 % глутаровым альдегидом при 40 0С в течение
2 – 3 суток, а затем 0, 2 – 0, 3 % раствором алкилдиметилбензиламмония хлоридом при 40 0С в течение 2 – 3 суток. В качестве контроля использовали
взвесь автоклавированных E. сoli с растворенными токсинами без их детоксикации и полимеризации.
Изучение на безвредность 2-х вариантов колибактериозной анатоксинвакцины проводили путем подкожного введения 3 – 5 мл препарата 2 – 3 месячных поросят 3-х кратно, с интервалом 2 суток и по 0, 1 мл белым мышам
3-х кратно, с интервалом 3 суток.
В качестве контроля использовали взвесь автоклавированных E. сoli
без детоксикации и полимеризации токсинов. Полученные 2 варианта анатоксин-вакцины вводили поросятам подкожно двукратно, с интервалом 12 –
13 суток по 7 – 10 мл и путем выпаивания с водой или в смеси с кормом по
20 – 30 мл 2 раза в день, в течение 3-х суток.
44
После вакцинации 30 - 45 дневным поросятам вводили подкожно и
орально суспензию вирулентных эшерехий.
В качестве контроля использовали невакцинированных поросят и после
подкожного и орального введения суспензии автоклавированных E. сoli без
полимеризации и детоксикации токсинов.
Изучение эффективности иммуногенных свойств колибактериозной
анатоксин-вакцины проводили определением титра специфических антител в
сыворотки крови поросят и после вакцинации. Титр реакции агглютинации с
сывороткой крови поросят проводили в лунках пластин с колибактериозным
антигеном (взвесью бактерий) биофабричного производства.
Повышение биоцидных свойств амоксициллина и энрофлоксацина
проводили по принципу полимеризации и детоксикации бактериальных токсинов в первом варианте 0, 2 % формальдегидом при 40 0С в течение 5 суток,
а во втором 0, 1 % глутаровым альдегидом в смеси с 0, 1 % алкилдиметилбензиламмония хлоридом. Полученный модифицированием два варианта
амоксициллина и энрофлоксацина изучали на биоцидное действие в отношении вирулентных лабораторных и свежеприготовленных E. Сoli и терапевтическую эффективность после орального и подкожного заражения поросят.
Изучение биоцидного действия коммерческого амоксициллина и энрофлоксацина подвергнутых полимеризации проводили методом серийных
разведений с использованием МПГБ и жидкой минеральной питательной
среды и методом диффузии в агаре со стандартными бумажными дисками,
пропитанные определенной концентрацией антибиотика. При этом штаммы
E. Сoli считали чувствительными к амоксициллина и энрофлоксацина при задержки роста микроорганизмов вокруг диска в пределах 15 – 25 мм и более, а
менее 15 мм вокруг бумажного диска – резистентными.
Методом серийных разведений МИК определяли минимальную концентрацию антибиотика, задерживающей видимый рост микроорганизма в
пробирках, флаконах с питательной средой, содержащих убывающие концентрации антибиотика. Учетным признаком является наличие или отсут-
45
ствие мутности бульона (роста культуры) в пробирках. В контроле культуре
должна быть мутность, в контроле антибиотика – нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации антибиотика, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирке прозрачен).
Для получения результатов методом диффузии в агаре использовали
стандартизованные условия (состав и количество среды, количество засеваемых микробов, температура и сроки инкубирования, стандартные и опытные
диски). Каждому значению диаметра зоны вокруг диска с антибиотиком соответствует определенное значение МИК. По диаметру зоны задержки роста
E. Coli определяли степень чувствительности к тому или иному антибиотику:
чувствительные (S), умеренноустойчивые (I) и устойчивые ®.
К категории S (от англ. Sensitive, чувствительный) относили те, для которых использование средних терапевтических доз будет достаточным для
трехкратного превышения МИК.
В категорию I (от англ. Intermediate, промежуточный) относят те микробы, для подавления которых потребуются максимальные терапевтические
дозы.
Категорию R (от англ. Resistans, устойчивый) составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным in
vivo.
Определение чувствительности методом серийных разведений и дискодиффузионным методом позволяет рекомендовать дозу антибиотика для лечения больных животных, в т.ч. колибактериоза поросят. Метод серийных
разведений считается наиболее точным, но относительно трудоемким. Критерием чувствительности является величина терапевтического действия.
Использование метода серийных разведений позволило определить
концентрацию модифицированного энроксила в отношении 10 тысяч E. Сoli
в 1 мл питательной среды.
Изучение влияния постоянного тока и геомагнитного воздействия на
суспензию бульонных культур E. Coli проводили на чувствительность к ком-
46
мерческому и модифицированному полимеризацией энроксилу, дезинфицирующим веществам, в частности к 1 % фенолу, 3 % фенолу, 3 % этония, и к
температуре. Для получения постоянного магнитного поля (ПМП) использовали постоянный магнит. После антибиотерапии амоксициллина и энрофлоксацина поросят, больных колибактериозом с синдромом диареи использовали
пробиотики «Пробифор», бифидобактерии и лактобактерии после предварительного выращивания на минеральной жидкой питательной среде с 5 – 10 %
молочной сыворотки.
1 раздел
Изыскание и апробация жидкой и плотной с 2,5 % агара минеральной питательной среды для выращивания и выделения
E. сoli
2 раздел
Изучить влияние экологического воздействия на биологические свойства E. сoli
3 раздел
Научно обосновать рациональную технологию получения и
способов применения колибактериозной анатоксин-вакцины
4 раздел
Повысить биоцидную и лечебную эффективность амоксициллина и энрофлоксоцина в отношении E. сoli и при колибактериозе поросят.
Рисунок 5 – Схема исследований.
В качестве сравнения использовали базисную терапию – оральную дегидратацию, диету, ферменты, симптоматические средства. При лечении ис-
47
ключали энтеросорбенты и средства этиотропной терапии.
Для выполнения поставленной цели и задач исследований основные
направления включали изыскание рационального состава минеральной питательной среды с доступными ингредиентами для разработки и апробации более оптимальной технологии получения и применения колибактериозной
анатоксин-вакцины, изучение влияния экологического воздействия на биологические свойства E. Coli и повышение биоцидного и лечебного действия энроксила с использованием общепринятого диско-диффузионного метода и
серийных разведений в жидкой питательной среде.
В целом исследования проводили по следующим разделам, представленным на рисунке 5.
3.2 Результаты разработки и апробации минеральной питательной
среды для выращивания и выделения E. Сoli
Для биофабричного получения колибактериозной анатоксин-вакцины
используются мясогидролизный или казеиногидрализатный глицериновый
бульон с 0, 5 – 1, 0 % пептона с определенным содержанием аминокислоты –
триптофан. Зависимость питательной ценности среды от качества мяса или
казеина, слабый рост E. Сoli и других энтеробактерий, содержание балластных веществ вызывает необходимость разработки и стандартного состава питательной среды на основе химических ингредиентов.
Содержание органических и трикарбоновых кислот, глицерина, аспаргина, фосфорнокислой и серосодержащих соединений в синтетических питательных средах создает основание конструирования питательной среды,
обеспечивающей стабильное и максимальное накопление E. Сoli и лакто- и
бифидобактерий. Для многих микроорганизмов минеральный состав питательных сред является очень близким. Об этом свидетельствует пригодность
МПА, МПГА, МПГБ практически для всех кокковидных и палочковидных
микроорганизмов. В то же время универсальных сред, пригодных для всех
микроорганизмов не может быть, так как рецептура питательных сред опре-
48
деляется строением микроорганизмов и их обменом веществ.
Изыскание рационального состава минеральной питательной среды
проводили с использованием концентраций лимонной и янтарной кислот от 1
до 7 г/л, аспарагина и глицерина от 0, 5 – 5 г/л, с разным по наименованию и
содержанию солевых компонентов глицерина, глюкозы, молочной сыворотки, водородных ионов (рН) от 6,9 до 7,3.
Для выращивания E. Сoli использовали три штамма лабораторных
культур и 2 штамма свежевыделенных E. Сoli.
Сравнительную оценку минеральной питательной среды проводили по
максимальной концентрации E. Сoli при выращивании в 2-х литровых биобутылях с объемом среды равной 1 литру, в течение 2 – 3 суток инкубирования
микроорганизмов. Концентрацию E. Сoli определяли по стандарту мутности,
изготовленной контрольным институтом им. Тарасевича.
По максимальному накоплению E. Сoli был определен следующий состав (рецептура) минеральной жидкой питательной среды с молочной сывороткой.
Питательные свойства жидкой минеральной среды для E. Сoli не изменяются как при последовательном растворении солевых ингредиентов, так и
после предварительного смешивания в сухом виде, с последующим внесением глицерина и молочной сыворотки. Следует отметить хороший рост и
накопление E. Сoli происходит на минеральной питательной среде без молочной сыворотки и пептона. В последующем определена пригодность питательной среды для выращивания сальмонелл, протея, бифидо- и лактобактерий. Рациональный состав жидкой питательной среды представлен в таблице 1.
Перед автоклавированием реакция раствора питательной среды устанавливается 5 – 10% раствором аммиака до рН 7, 2 – 7, 3.
Результаты накопления микроорганизмов на жидкой минеральной питательной среде в 2-х литровых биобутылях с объемом 1 литр представлены
в таблице 2 и на фото № 1.
49
Таблица 1- Состав минеральной жидкой питательной среды для выращивания кишечной палочки, сальмонелл и бифидобактерий.
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Наименование ингредиентов
Количество в граммах
Лимонная кислота
3,0
Янтарная кислота
2,0
Фосфорнокислый калий 2-х замещенный
4,0
Фосфорнокислый натрий 2-х замещенный
2,0
Хлористый натрий
2,0
Сернокислый магний
0,6
Сернокислый цинк
0,4
Сернокислое железо
0,3
Глицерин
20 мл
Дистиллированная вода
До 1 литра
рН 7,2 – 7,3 до автоклавирования
Для выделения чистой культуры и поддержания кишечной палочки ис-
пользуются ряд «классических» плотных питательных сред – среда Эндо,
Плоскирева.
Таблица 2 - Накопление микроорганизмов на жидкой минеральной питательной среде.
№
п/п
Наименование микроорганизмов
Сроки выращивания
1
3 – 4 суток
4
Кишечная палочка
(лабораторный штамм)
Кишечная палочка
(свежевыделенный штамм)
Сальмонеллы
(лабораторный штамм)
Бифидобактерии
5
Лактобактерии
3 суток
2
3
6
3 – 4 суток
3 – 4 суток
3 суток
Накопление (концентрация) микроорганизмов
75 ± 10 млрд/ мл
(густая масса)
75 ± 10 млрд/ мл
(густая масса)
70 ± 5 млрд/ мл
(густая масса)
До 1 – 2 см крошковидной массы
Крошковидная
масса до 1 – 2 см
осадка
3 – 4 млрд/ мл
Выращивание кишечной палоч3 – 4 суток
ки на казеиноферментативной
жидкой среде
В то же время практически отсутствуют плотные питательные среды
50
для поддержания и сохранения пробиотических микроорганизмов. Полученные результаты оптимального роста и накопления кишечной палочки до 75 ±
5,0 млрд/ мл, вместо 3 – 4 млрд/ мл на ферментативном гидролизате казеина с
пептоном, положены в основу изготовления и апробации плотной, с 2,5 %
агара, питательной среды.
В сравнительном аспекте были изготовлены три варианта плотной питательной среды или разведении минеральной жидкой среды в цельном виде
и разведении 1:1 или 1:2.
В целом принципиальных различий при визуальном просмотре пробирок со скошенном агаром и в чашках Петри не выявлено В связи с этим за
основу был взят вариант плотной питательной среды при разведении в соотношении 1:1, рецептура которого представлена в таблице 3.
Таблица 3 - Состав плотной минеральной с 2,5% агаром питательной
среды для выделения и поддержания кишечной палочки
№ п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Наименование ингредиентов
Количество в граммах
Лимонная кислота
1,5
Янтарная кислота
0,5
Фосфорнокислый калий 2-х замещенный
1,5
Фосфорнокислый натрий 2-х замещенный
1,0
Хлористый натрий
0,5
Сернокислый магний
0,3
Сернокислое железо
0,3
Сернокислый цинк
0,3
Агар-агар
25
Дистиллированная вода
До 1 литра
рН 7,1 – 7,2 перед автоклавированием
При выращивании кишечной палочки и бифидобактерий происходило
полное покрытие поверхности агара в пробирках и чашках Петри в течение 2
– 3 суток выращивания. Полученные результаты роста кишечной палочки на
плотной минеральной среде с 2,5 % агара использованы в исследованиях при
определении чувствительности к антибиотикам, а жидкая минеральная среда
для выращивания E. сoli и получения колибактериозной анатоксин-вакцины.
51
3.3 Влияние электрогеомагнитного воздействия на
биологические свойства E. coli
Изучено, что под воздействием электрического тока, солнечной активности, геомагнитного и магнитного влияния и линий высокого напряжения
космического пространства происходит намагничивание воды, почвы, живых
организмов, изменение проницаемости мембран, определяющих гомеостаз
живых систем. Сильные изменения геомагнитного поля приводят к образованию магнитной бури, неустойчивости жизнедеятельности живых организмов.
В целом магнетизм – глобальное свойство природы, которое получило свое
название от города Магнетис в Малой Азии, где были обнаружены залежи
магнитного железняка – «камня», притягивающего железо. Подобное явление проявляется в зоне железорудных залежей в естественных условиях и
усилено под действием высоковольтных линий электропередач, а в обиходе в
пространстве электробытовой техники. В современных условиях вызывает
научный и практический интерес изучение влияния на биофизиологические
свойства макро- и микроорганизмов экологических факторов.
Исходя из вышеизложенного, возникает необходимость выяснения
причин появления лекарственноустойчивых микроорганизмов, в частности
изучение чувствительности E.coli к температуре, антибиотикам, дезинфицирующим средствам.
Для изучения влияния электрических линий в зоне железорудных разработок и залежей использовали лабораторные и свежевыделенные бульонные культуры E. coli во флаконах с МПГБ. Хранение бульонных культур
E.coli проводили при температуре 15-25°С в течение 60 суток с концентрацией 1млн/мл микроорганизмов. Полученные результаты представлены в таблицах 4 - 6.
52
Таблица 4 - Чувствительность лабораторных и подвергнутых электрогеомагнитному воздействию E. сoli к температуре.
Характеристика ки№п/п шечной палочки в
1млн/мл суспензии
Оптимальные сроки гибели микроорганизмов в минутах
80°С
100°С
1
Суспензия кишечной
палочки до электрогеомагнитного воздействия
10,5±1,0
2,5±0,5
2
Суспензия кишечной
палочки после электрогеомагнитного
воздействия
12,5±1,0
3,5±0,5
Таблица 5 - Чувствительность лабораторных и подвергнутых электрогеомагнитному воздействию E.coli к производственным амоксициллину, энрофлоксацину, линкоспектину.
Характеристика
№п/п E. coli в 1млн/мл суспензии
1
Суспензия кишечной
палочки до электрогеомагнитного воздействия
Бактерицидное действие мкг/мл
амоксициллин энрофлоксацин линкоспектин
55±2,0
46±2,0
46±2,0
Суспензия кишечной
2
палочки после элек60±2,0
51±2,0
52±2,0
трогеомагнитного
воздействия
Из полученных результатов исследований, представленных в таблицах
(4, 5, 6) следует, что суспензия 1млн/мл кишечной палочки после электрогеомагнитного воздействия в течение 60 суток проявляла повышенную
устойчивость к линкоспектину, амоксициллину и энрофлоксацину на 3-4%, к
температуре 80°С и 100°С на 4-5% и дезинфицирующим веществам 1% хлорамину, 1% фенолу, 3% этонию и 1% глутаровому альдегиду на 5-6% по
сравнению с контролем.
53
Таблица 6 - Чувствительность лабораторных и подвергнутых электрогеомагнитному воздействию E. coli (1млн/мл) к дезинфицирующим соединениям.
№п/п
Характеристика E.
coli в 1млн/мл суспензии
1
Суспензия кишечной
палочки до электрогеомагнитного воздействия (контроль)
2
Суспензия кишечной
палочки после электрогеомагнитного
воздействия
Бактерицидное действие в минутах
1% р-р
хлорамина
1% р-р
фенола
3% этоний
1% глутаровый альдегид
3 минуты
6 минут
3 минуты
1,5 минуты
4 минуты
8 минут
4,5 минуты
2,5 минуты
Данные, представленные в таблицах, позволяют учитывать показания и
противопоказания к их использованию в качестве эпизоотических маркеров,
в выборе средств лечения больных животных и проведении ветеринарносанитарных мероприятий.
3.4 Мониторинг чувствительности региональных E. coli
к антибиотикам.
В настоящее время E. coli разделяют на серогруппы О-, К- и Н-антигены,
по чувствительности к антибиотикам, токсигенности, адгезивности, термоустойчивости, лизогении, колициночувствительности.
Отсутствие адекватной лабораторной диагностики при эпизоотических и
эпидемических вспышках колибактериоза, обмена результатов исследований
затрудняет оценку региональных гео-, экологических и эволюционных воздействий.
Массовое применение антибактериальных препаратов в терапии колибактериоза животных привело к возникновению антибиотикоустойчивых E. coli.
Особую опасность представляет передача антибиотикорезистентных E. coli
54
от животных к человеку и наоборот, что способствует распространению генов резистентности среди нормальной микрофлоры кишечника.
Изучение чувствительности E. coli проводили к природным и химическим
антибиотикам с помощью бумажных дисков и в бульонных культурах с концентрацией 1000 микробных клеток в 1 мл. В исследованиях использовали E.
coli, выделенные от поросят, принадлежащих фермерским хозяйствам и свинокомплексам Курской и Белгородской областей с нормальным и повышенным геомагнитным полем железорудных регионов. Полученные результаты
представлены в таблице 7.
Таблица 7 - Резистентсность к антибиотикам культуры E. сoli, выделенных из различных патматериалов на территории с повышенным уровнем
геомагнитного поля Железногорского района.
Наименование
антибиотика
Общее
количе- Количество рези- % резистентных
ство исследован- стентных культур культур
ных культур
Амоксициллин
6
3
50
Гентамицин
10
2
20
Энрофлоксацин
12
6
50
Энрофлоксацин с
12
3
25
колистинсульфатом
Из данных, представленных в таблице следует, что практически 45 – 50%
выделенных E. сoli были резистентны к амоксициллину, канамицину, левомицетину, полимиксину, стрептомицину и окситетрациклину. В пределах 20
– 25% выделенных E. coli были устойчивы к гентамицину и энрофлоксацину
с колистин-сульфатом.
Из данных, результатов Курской областной ветеринарной лаборатории,
бактериологической лаборатории больницы №4 определения чувствительности E. coli следует, что резистентность к вышеуказанным антибиотикам составляла 15 – 25% от количества, выделенных микроорганизмов. Полученные результаты сопоставимы с данными Жуковской ветеринарной лаборатории Калужской области.
55
Установленная повышенная устойчивость E. coli, выделенных в регионе с
повышенным геомагнитным полем определили необходимость повысить
биоцидные и лечебные свойства линкоспектина, энрофлоксацина, амоксициллина полимеризацией глутаровым альдегидом с четвертичным аммониевым соединением – алкилдиметилбензиламмония хлорида.
3.5. Изыскание способов получения колибактериозной анатоксинвакцины с повышенной иммуногенной и протективной активностью.
Изучено, что род кишечной палочки представлен 7 видами, способными вызывать диареи, гнойные воспаления, септицемию отдельно и в ассоциации с гноеродными кокками, синегнойной палочкой и являются международным стандартом бактериальной загрязненности.
У кишечной палочки выявлено 4 фактора патогенности: 3-х факторов
адгезии и колонизации, имеющие фимбриальную структуру; факторы инвазии; экзотоксины и цитотоксины (термостабильные) и эндотоксины (липополисахариды).
В зависимости от факторов патогенности диареегенные E.coli разделяют на энтеротоксигенные, энтероинвазивные, энтеропатогенные и энтерогеморрагические.
У кишечной палочки основу протективного действия обеспечивают
микрокапсульные антигены, клеточная мембрана и жгутики. Это комплексные капсульные О-антигены, капсульные К-антигены и жгутиковые Нантигены. В целом все компоненты E. coli (белки, липополипротеиды, липополисахариды, полисахариды, нуклеопротеиды) обладают иммуногенными и
протективными свойствами и способны обеспечивать образование клеточного и гуморального иммунитета.
В сообщении Виноходова В. О (2000г.) указывается, что в корпускулярных, цельноклеточных, формолтиомерсаловых колибактериозных вакцинах содержится весь комплекс антигеноактивных субстанций.
Доказано, что формальдегид обеспечивает уплотнение клеточной
56
структуры микроорганизмов и их молекулярных экзо- и эндотоксинов, а пищеварительные ферменты – пепсин, панкреатин, трипсин, не способны разрушать формализированные бактериальные структуры и их антигенные субстанции.
Для получения инактивированных цельноклеточных колибактериозных
вакцин необходимо максимальное накопление бактериальной массы. В биофабричных условиях выращивание E. coli проводят на белковогидрализатных
бульонных средах и питательный бульон на основе панкреатического (ферментативного) гидрализата кильки (Т. Н. Рождественская, 2011).
Устранение указанных недостатков способа получения колибактериозной и других бактериальных формолтиомерсановых вакцин возможно путем
конструирования жидкой минеральной питательной среды, свободной от
балластных веществ мяса, казеина, кильки и замена канцерогенных формальдегида и ртутьсодержащего тиомерсана на более эффективные детоксикаторы и полимеризаторы с повышенным биоразложением.
Однако существенных изменений в отношении технологии изготовления вакцин не произошло.
В последние годы проведены ряд исследований по замене канцерогенных формальдегида и мертиолята и неполноты детоксикации и инактивации
бактериальных суперэнтеротоксинов с помощью β-пропилактона, тирозина,
перекиси водорода, фотоокисления антибиотиков. Однако предполагаемый
протективный эффект не был получен. Особое внимание было обращено на
замену гидролизатов мяса, казеина и кильки на синтетические жидкие питательные среды. При этом следует отметить положительные результаты
орального способа применения колибактериозных биопрепаратов, основанного на роли местного иммунитета и чувствительности органов и тканей к
бактериальным, вирусным и грибковым микроорганизмам. С учетом тропизма микроорганизмов и проявления патологического поражения органов в
птицеводстве доминируют энтеральная и аэрозольная вакцинация, обеспечивая непосредственно первенство клеточных реакций организма и соответ-
57
ственно защиту того или иного органа.
Однако в свиноводстве энтеральная и респираторная вакцинация не
выходит за рамки практического применения.
Вышеизложенные теоретические и прикладные аргументы и факты
были положены в основу перспективных разработок повышения эффективности колибактериозной анатоксин-вакцины и способа ее применения.
Получение колибактериозной анатоксин-вакцины проводили путем
выращивания лабораторных и свежевыделенных E. coli от павших поросят в
2-х литровых биобутылях с объемом синтетической среды равной 1 литру в
течение 2-3 суток. При этом концентрация микроорганизмов составляла
75±10 млрд/мл. После автоклавирования суспензии E. coli при 1,0 атм. в течение 30 минут проводили детоксикацию и полимеризацию комплекса растворимых экзо- и эндотоксинов с микроорганизмами вначале 0,3-0,5% формальдегида или 0,2-0,3% глутарового альдегида при 40°С в течение 3-5 суток, а затем 0,2-0,3% этония. В последующем с учетом канцерогенности
формальдегида и дефицитности этония использовали для детоксикации и полимеризации токсинов 0,2-0,3% раствор глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлорида, который как этоний является бесчетвертичным
аммониевым соединением. Исходя из того, что 25% раствор глутарового альдегида используется в смеси с 14% и 25% алкилдиметиламмония хлорида детоксикацию и полимеризацию проводили в один этап. Общая схема получения колибактериозной анатоксин-вакцины представлена на рисунке 2.
Полученную колибактериозную анатоксин-вакцину проверяли на безвредность, иммуногенность и протективную активность.
Безвредность колибактериозной анатоксин-вакцины проверяли на 10
белых мышах и 15-ти дневного возраста 25 поросятах путем 3-х кратного
подкожного введения с интервалом 3 суток, белым мышам в объеме 0,3-0,4
мл и поросятам в объеме 7-10 мл. При наблюдении в течение 10 суток после
последнего введения вакцины животные оставались здоровыми без видимых
изменений на месте введения.
58
Выращивание кишечной палочки на жидкой минеральной среде в 2-х литровых биобутылях равной 1 литру в течение 2-3 суток до 75±10 млрд/мл
микроорганизмов.
↓
Автоклавирование суспензии E. coli при 1 атм. в течение 30 минут.
↓
Детоксикация и полимеризация комплекса экзо- и эндо-, и энтеротоксинов
в суспензии с микроорганизмами 0,3% глутарового альдегидом с 0,3% алкилдиметилбензиламмония хлоридом при 40°С в течение 3-5 суток.
↓
Сорбция колибактериозной анатоксин-вакцины на гидроокиси алюминия
5мг/мл для подкожной вакцинации.
↓
Расфасовка препарата по флаконам и стерилизация при 100°С
в течение 30 минут.
Рисунок 6 - Способ получения колибактериозной анатоксин-вакцины.
Испытание колибактериозной анатоксин-вакцины на протективную активность. Вакцинацию поросят (82 головы) проводили подкожным введением колибактериозной вакцины двукратно с интервалом 14 суток в объеме 910 мл с концентрацией 70 млрд/мл микробных клеток и путем энтеральной
иммунизации 172 поросят путем ежедневной выпойки в течение 7 суток колибактериозной вакцины в объеме 25-30 мл с концентрацией 70 млрд/мл
микробных клеток.
Через 15 суток после подкожной вакцинации провели инфицирование
47 поросят подкожным введением 100-150 тысяч вирулентных E. coli. Одновременно провели заражение контрольных, невакцинированных 11 поросят.
При наблюдении за подкожно вакцинированными 82 поросятами в течение 15 суток у 70 поросят не было отмечено случаев заболевания, а 12 по-
59
росят заболели. Из них 2 поросенка пало, а остальных подвергли антибиотикотерапии с пробиотиками. В то же время все 11 контрольных поросят заболели после подкожного заражения 150т. мл E. coli. Их них 4 пало, а остальных подвергли лечению.
Анализ протективной активности энтеральной вакцинации с водой 172
поросят колибактериозной анатоксин-вакциной в дозе 70млрд/мл микробных
клеток в течение 7 суток с последующим оральным заражением животных в
дозе 150000 вирулентными E. coli выявили 13, заболевших колибактериозом,
поросят. В то же время все 9 контрольных, невакцинированных поросят заболели, и из них 3 пало, а остальные 6 голов подвергли лечению.
Сводные результаты протективной активности колибактериозной анатоксин-вакцины представлены в таблице 8.
Таблица 8 - Результаты протективной активности колибактериозной
анатоксин-вакцины.
Способ заражения
№п/п
Способ вакцинации поросят
1
Подкожно
двукратно в
объеме 10 мл
2
Контроль
(невакцинированные)
3
4
Энтерально с
водой в течение 7 суток в
объеме 3040мл
Контроль
(невакцинированные)
Кол-во
голов Подкожный
150т. E. coli
79
Энтерально
с водой
Заболело Пало
150т. E.
coli
+
-
12
2
11
+
-
11
4
172
-
+
13
3
9
-
+
9
3
60
Из данных, представленных а таблице, следует, что колибактериозная
анатоксин-вакцина обеспечивала защиту поросят при энтеральной и подкожной вакцинации. Однако, при энтеральной вакцинации защитный эффект составил свыше 90%, а при подкожной в пределах 70%.
Изучение иммуногенной активности колибактериозной анатоксинвакцины проводили у поросят, после подкожной и энтеральной вакцинации
путем определения титра сывороточных антител, способных вызвать реакцию агглютинации с колибактериозным антигеном, содержащих 109 микробных клеток в 1мл.
Постановку пластинчатой РА проводили путем нанесения по 1-2 капли
на чистое предметное стекло иммунной сыворотки от вакцинированных подкожным и энтеральным методом в разведении 1:10 и 1:100. Производственный стандартный антиген вносили петлей и перемешивали. Учет реакции
проводили через 3-4 минуты, покачивая стекло.
Таблица 9 - Результаты определения титра антител у вакцинированных
поросят в пробирочной РА.
Разведение сыворотки и результаты РА
№п/п
Вид сыворотки
Способ вакцинации
1
Исследуемая, от
вакцинированных
поросят
Подкожный
+
+
+
+
-
2
Контрольная
Не вакцинировали
-
-
-
-
-
Исследуемая, от
вакцинированных Энтеральный
поросят
±
-
-
-
-
Не вакцинировали
-
-
-
-
-
3
4
Контрольная
1:100 1:200 1:300 1:400 1:500
61
Постановку пробирочной реакции агглютинации проводили в объеме
1мл иммунной и контрольной сыворотки в разведении от 1:100, 1:200, 1:400
и 1:500. При этом суспензию антигена разводили физиологическим раствором до 5-6 млрд/мл взвеси с контролем стандарта мутности. Штатив с пробирками вначале выдерживали при 37°С в течение 12-15 часов, а затем при
комнатной температуре - 18-24 часа. Учет реакции агглютинации проводили
с помощью лупы. Сводные данные представлены в таблице 8.
Из представленных в таблице данных следует, что у подкожно вакцинированных поросят колибактериозной анатоксин-вакциной сыворотка вызывала
агглютинацию автоклавированных E. coli (стандартный биофабричный антиген в разведении от 1:100 до 1:400).
В то же время у энтерально вакцинированных поросят практически отсутствовали антитела, способные вызывать агглютинацию, склеивание микробных клеток E. coli.
Из полученных результатов следует, что энтеральная вакцинация поросят колибактериозной анатоксин-вакциной обеспечивает более эффективную
защиту поросят от заражения вирулентными E. coli, но не вызывает образование агглютинирующих антител.
Проведенные исследования и полученные результаты определили рациональную технологию получения колибактериозной анатоксин-вакцины
путем выращивания E. coli на минеральной жидкой питательной среде вместо гидролизатов мяса, казеина и кильки. Практические знания физиологии
микроорганизмов позволяют исключить использование последних питательных компонентов. В то же время подобное производство отечественных и зарубежных биопрепаратов продолжает оставаться и не может быть оправдано,
в т. ч. применение 0,3-0,7% формальдегида для детоксикации и полимеризации комплекса бактериальных токсинов. Взамен формальдегида с успехом
использован глутаровый альдегид.
С учетом роли местного иммунитета и полученных результатов следует,
что энтеральная вакцинация поросят колибактериозной анатоксин-вакциной
62
обеспечивает более эффективную защиту поросят от заражения вирулентными E. сoli.
Это создает предпочтение специфической профилактики колибактериоза
поросят перед антибиотикотерапией, т. к. в последнее время отмечается высокий уровень устойчивости E. coli к антибиотикам, дезинфицирующим
средствам и не позволяет рассматривать эти препараты как эффективные
средства.
Результаты гематологических и иммунологочекских исследований крови
у вакцинированных поросят представлены в таблице 8.
Таблица 10 - Гематологические показатели и содержание белков крови
контрольных и вакцинированных поросят.
Показатели
Контроль невакцинированные
Общий белок, г/л
60,2±2,5
Энтеральная
вакцинация 30
– 40 мл двукратно
62,4±2,5
Гемоглобин, г/л
87,5±3,5
89,5±3,5
90,5±3,5
Альбумин, г/л
Гаммаглобулины,
г/л
Эритроциты, млн/мл
(мл/мкл)
48,4±2,5
51,5 ±2,5
62,5±2,5
22,5±2,5
28,5±2,5
32,5±2,5
3,7±0,5
3,9±0,5
4,2±0,5
7,5±0,5
8,2±0,5
8,9±0,5
Лейкоциты, тыс/мл
(тыс/ мл)
Подкожная
вакцинация 7
– 10 (двукратно)
64,2±2,5
Из данных, представленных в таблице, следует, что гематологические
показатели крови клинически здоровых и вакцинированных поросят находились в диапазоне физиологических значений. По содержанию гемоглобина,
альбуминов, эритроцитов и лейкоцитов не выявлено различий, а по гаммаглобулину отмечено повышение у вакцинированных поросят. Полученные
показатели у вакцинированных поросят подтверждают протективную безвредность и иммуногенную активность анатоксин-вакцины при подкожном и
энтеральном введении.
63
3.6 Результаты повышения биоцидного действия антибиотиков в отношении E. coli и лечебной эффективности амоксициллина и энрофлоксоцину при колибактериозе поросят
Распространение детерминантной полирезистентности к антибиотикам
среди грамотрицательных патогенных, комменсальных и микроорганизмов
окружающей среды достигло глобальных масштабов. В настоящее время
множественная глобальная устойчивость среды E. coli не обеспечивает
должного терапевтического эффекта при колибактериозе поросят. Внесение в
состав классических антибиотиков клавулановой кислоты, сочетание химических антибактериальных препаратов с содержанием фтора и пиперазинового радикала, трилона – Б, колистина и т.д. являются недостаточными и
вредными для окружающей среды, продуктов питания и эволюционной
устойчивости макро- и микроорганизмов. Повсеместное применение пенициллина, амоксициллина, окситетрациклина, левомицетина, рифампицина,
полимиксина, эритромицина, гентамицина и энрофлоксацин, геомагнитное
воздействие привело к появлению микроорганизмов, в т.ч. E. coli, устойчивыми ко многим лекарственным и дезинфицирующим средствам и температуре.
В целом, современные средства и способы повышения биоцидного и лечебного действия антибиотиков исчерпали свои возможности. Кардинальное
решение преодоления полирезистентности микроорганизмов к лекарственным средствам – это повышение их устойчивости к пищеварительным сокам, ферментам ЖКТ, бактерий, и уровня клеточного и гуморального иммунитета. Одним из ключевых подходов преодоления мультирезистентных
микроорганизмов является создание стабильной композиции антибактериальных препаратов, устойчивой к деструктивному действию ферментов бактерий.
В развитии колибактериоза любой формы основную роль играет колонизация возбудителя в тонком отделе кишечника и способность адгезивных ан-
64
тигенов прочно прикрепляться с ворсинками слизистой кишечника, а скорость их размножения практически вытесняет или конкурирует с пробиотическими микроорганизмами.
Преимущественное использование импортных антибиотиков с первых
дней жизни поросят способствуют образованию многочисленных серологических групп кишечной палочки, устойчивых к лекарственным средствам и
обладающих высокой патогенностью и токсикогенностью.
Существующие способы повышения эффективности антибиотиков, путем
создания новых поколений так называемых «сильных» антибиотиков, сочетание одних антибиотиков с другими, введение в их состав фторпиперазинового радикала, клавулановой кислоты на короткое время обеспечивают бактерицидный эффект на фоне токсических действий для организма.
В связи с этим возникает принципиальная необходимость модификации
антибиотиков по более рациональному направлению. В сущности антибиотики это токсические вещества, продуцируемые различными микроорганизмами в основном плесневыми грибами и актиномицетами. В процессе их
применения у патогенных микроорганизмов, в том числе и у кишечной палочки, появились ферменты, расщепляющие антибиотики.
Известные способы получения анатоксинов, вакцин, аллергоидов основаны на использовании различных детоксикаторов и полимеризаторов - 0,5 1.0% раствора формальдегида, бета-пропилактона, глутарового альдегида,
перекиси водорода, фотоокисления, обеспечивают иммуногенную и протектиную активность. Однако указанные средства и способы детоксикации полимеризации в отношении антибиотиков не применялись.
В последнее время авторами впервые повышена эффективность и снижена токсичность антибиотиков путем детоксикации и полимеризации по
принципу получения биопрепаратов, путем детоксикации и полимеризации
антибиотиков 0,15±0,05% раствором формальдегида.
Недостатком указанного способа является использование формальдегида,
обладающего канцерогенными свойствами, образование осадка при 9°С и
65
ниже и сравнительно низкая бактерицидная, вирусоцидная и фунгицидная
активность по сравнению с глутаровым альдегидом. Кроме того, 0,2 - 0,7%
растворы формальдегида не обеспечивают полноту детоксикации и полимеризации ряда токсинов.
Поставленная задача достигается модификацией антибиотиков путем детоксикации и полимеризации вначале 0 , 1 5 % р а с т в о р о м глутарового
альдегида при 40 оС в течение 2 - 3 суток, а затем 0,1% раствором этония или
0,1% раствором алкилдиметилбензиламмония при 40 °C в течение 2 - 3 суток.
Аналогичные результаты с этонием получены при использовании глутарового альдегида с 0,1% алкилдиметилбензиламмония хлоридом или раствором «Биопаг - Д», разработанного в Московском институте экологотехнологических проблем, представляющий собой водорастворимый полимер с широким биоцидным действием, высокой стабильностью и низкой токсичностью, относящийся к гуанидиновым основаниям.
В патентной и научно-технической литературе не обнаружены решения, с
использованием для детоксикации и полимеризации антибиотиков с помощью глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом или
«Биопаг - Д» для повышения эффективности в отношении патогенных кишечных палочек.
В исследованиях использованы следующие антибиотики: линко-спектин 100; энрофлоксацин, амоксициллин лабораторные и свежевыделенные E.coli
от больных и павших телят, поросят.
Полученные результаты иллюстрированы следующими примерами.
Пример №1. Способ получения модифицированных антибиотиков.
Детоксикация и полимеризация указанных антибиотиков с исходной концентрацией 200 мг/мл вначале 0,1 % глутаровым альдегидом при 40°C в течение 2 - 3 часов, а затем 0,1% раствором этония или 0,1% алкилдиметилбензиламмония хлоридом при 40°С в течение 2 - 3 суток не вызывало образование осадков при сохранении прозрачности растворов в течение 3 -х лет при
66
хранении от 5 °С до 25 °С.
Пример № 2. В исследованиях использованы лабораторные E.coli и свежевыделенные от больных и павших поросят.
Выделенные 8 штаммов E.coli обладали повышенной мультирезистентностью к указанным антибиотикам и сравнительно умеренной к энрофпоксацину, линкосептину.
Чувствительность лабораторных и свежевыделенных культур E.coli к указанным антибиотикам изучали методами серийных разведений и бумажных
дисков диффузионным способом. В качестве питательных сред использовали
МПБ и МПА с рН - 7,0 - 7.2 жидкую синтетическую среду и плотную с 2,5%
агар на минеральной основе.
Для посева использовали 20 - 24-суточные больные культуры с концентрацией E.coli 10000 и 100000 микроорганизмов в 1 мл.
При этом на поверхность агара в чашках Петри вносили 1 мл суспензии
E.coli, а затем после 10 – 15 -минутного подсушивания раскладывали бумажные диски с антибиотиками.
При этом установлено увеличение зоны задержки роста мультирезистентных E.coli к модифицированным детоксикацией и полимеризацией антибиотиков составляет 1,7 -1,9 см к 10000 и 100000 микроорганизмам в 1 мл
соответственно. В то же время на коммерческие антибиотики зона задержки
роста E.coli на поверхности агара достигала 0,8 см. Следует отметить снижение чувствительности E.coli на 20 – 40 % к аммоксициллину, стрептомицину,
линкоспепктину энрофлоксацину и другим антибиотикам, а после детоксикации и полимеризации указанные антибиотики проявляли повышенную
бактерицидную активность в д ва р а за .
Из полученных результатов следует, что утраченная бактерицидная активность антибиотиков к мультирезистентным E.coli после модификации не
только восстанавливалась, но и увеличивалась в два раза.
С учетом совместимости соединения глутарового альдегида и алкилдиметилбензиламмония хлорид, и апробации в промышленном масштабе, прово-
67
дилась детоксикация и полимеризация антибиотиков природных и химических (фторхинолонов) одномоментным воздействием.
Полученные результаты обобщены и представлены в формуле изобретения со следующей трактовкой: «Способ повышения эффективности антибиотиков к резистентным E.coli, включает детоксикацию и полимеризацию 200
мг/мл препарата 0,1% глутарового альдегида с 0,1%-ным алкилдиметилбензиламмония при 40 °С в течение 2 – 3 суток.»
Установленное повышенное биоцидное действие ряда антибиотиков в отношении полирезистентных E.coli явилось основанием изготовления амоксициллина и энрофлоксацина путем полимеризации для энтерального способа
лечения поросят, больных колибактериозом и нарушением пищеварения.
Способ полимеризации амоксициллина и энрофлоксацина представлен на
рисунке 7.
Растворение 50 граммов амоксициллина или
энрофлоксацина в 1 л дистиллированной воды.
Внесение в раствор амоксициллина, энрофлоксацина глутарового альдегида и алкилдиметилбензиламмония хлорида до 0,1%
концентрации и проведение полимеризации
при 40°С в течении 3-4 суток
Расфасовка по флаконам. Срок хранения
3 года при 5 – 25 °С.
Рисунок 7 - Способ получения экспериментальных антибиотиков
Полимеризацией.
Полученный модицифицированный амоксициллин полимеризацией
0,1% глутаровым альдегидом с 0,1% алкилдиметилбензиламмония хлоридом
использован для изучения безвредности биоцидной и лечебной эффективности.
68
Антибактериальное
действие
модифицированного
амоксициллина
определяли по диаметру подавления роста E. coli с помощью бумажных дисков, пропитанных антибиотиком и методом серийных измерений, а лечебную
активность путем подкожного и энтерального введения. Сводные результаты
исследований представлены в таблице 11.
Таблица 11 - Диапазон диаметров зон подавления роста E. coli, содержащие 20мкг амоксициллина в бумажном диске.
коммерческий
амоксициллин
модифицированный
амоксициллин
диаметры зон подавления роста в
мм
диаметры зон подавления роста в мм
№п/п
Наименование мест выделения E. coli
1
Кишечная палочка, выделенная от больного человека
22-25
30-35
2
Кишечная палочка, выделенная из трупа павшего
поросенка
21-23
27-29
3
Лабораторная культура E.
coli
21-23
27-29
4
Кишечная палочка, выделенная от павшего поросенка фермерского хозяй19-21
25-27
ства Железногорского
района
Из данных исследований, представленных в таблице, следует, что зона
подавления роста E. coli модифицированным амоксициллином составляет
17-20 мм, а коммерческим 10-13 мм. При этом E. coli выделенные от павшего
поросенка фермерского хозяйства Железногорского района Курской области
проявили резистентность к 2 видам амоксициллина. Полученные результаты
свидетельствуют об эволюционном изменении E. coli в сторону увеличения
устойчивости к антибиотику.
Определением биоцидного действия модифицированного амоксицил-
69
лина методом серийных разведений в МПБ и жидкой синтетической среде
установлена активность экспериментального амоксициллина для лабораторных штаммов E. coli в пределах 0,3-0,5 мкг/мл к 1000 микроорганизмов в 1
мл, а для свежевыделенных в концентрации 0,7-0,9 мкг/мл.
Изучение безвредности модифицированного амоксициллина проводили
путем энтерального введения 4 грамм препарата с водой (12 гол) и кормом
(9гол) ежедневно в течение 3-х суток. При этом установлено, что, несмотря
на повышенную вдвое лечебную дозу, поросята хорошо переносили без видимых клинических проявлений, повышения температуры и не влияли на
общие гематологические показатели. Сводные данные гематологических исследований крови поросят и лечебной эффективности амоксициллина после
энтерального введения представлены в таблице 12,13.
Таблица 12 - Гематологические показатели крови поросят.
Показатели
До оральной выпойки
(контроль)
После оральной выпойки
модифицированного
амоксициллина
Гемоглобин, г/л
91,5+3,0
93±3,0
Лейкоциты,
тыс/мкл
4,5+0,25
4,6±0,25
Лейкоциты,
тыс/мкл
9,2+0,5
9,4±0,5
Из данных, представленных в таблице, следует, что модифицированный амоксициллин обеспечивает 100% лечебную эффективность поросят,
экспериментально зараженных E. coli и заболевших колибактериозом поросят в течение 2-3 дней лечения. В то же время из 19 поросят при лечении в
течение 4-5 дней коммерческим амоксициллином пало 4 поросенка. Полученные результаты подтверждают лечебную эффективность модифицированного амоксициллина на фоне сокращения срока лечения до 2-3 суток.
70
Таблица 13 - Результаты лечения поросят, зараженных E. coli
(10тыс/мл).
Кол-во и масса
поросят
Сроки лечения
27 гол.
(20-30 кг)
2-3 дня
19 гол.
20-30 кг
4-5 дней
Амоксициллин модифицированный
заболело
пало
27
1
Коммерческий
амоксициллин
заболело пало
19
4
Результаты изучения лечебной эффективности модифицированного полимеризацией амоксициллина 0,1% глутаровым альдегидом с 0,1% алкилдиметилбензиламмония хлорида проводили путем экспериментального заражения поросят (27 голов) путем выпойки с водой 10 тысяч вирулентных E. coli.
Через трое суток с появлением диареи у поросят проводили энтеральное введение энрофлоксацина и амоксициллина (2 грамма на голову) утром и вечером в течение 3-х суток.
Полученные результаты подтверждают лечебную эффективность модифицированного (экспериментального) амоксициллина при заражении поросят вирулентной E. сoli.
3.7 Антибиотикотерапия желудочно-кишечных болезней поросят с
применением пробиотических препаратов
Колибактериоз поросят – острая, тяжело протекающая болезнь, появляется в первые дни после рождения и характеризуется потерей аппетита, общими нарушениями, диспепсией и диареей с водянистым, желтым зловонным стулом. Поросята быстро слабеют и через короткое время гибнут. При
вскрытии обнаруживается энтерит, перитонит, плевриты. При дифференциальной диагностике у поросят необходимо исключить сальмонеллез, вирусный гастроэнтерит, дизентерию, чуму. У новорожденных поросят в кишеч-
71
нике отсутствуют лакто- и бифидобактерии, собственные антитела, усиливается моторика желудка и перистальтика кишечника. Развитие бактериальной
этиологии болезней и колибактериоза протекают с появлением высокой температуры, обусловленной тем, что липополисахаридный комплекс (ЛПС)
клеточной стенки бактерий с током крови достигает центра терморегуляции
гипоталамуса, который увеличивает теплопродукцию. Другое проявление
бактериального инфекционного процесса – это синдром интоксикации. Эти
два признака являются универсальными ко всем инфекциям.
E. coli делят по жгутиковым и поверхностным антигенам на серогруппы. Из результатов лабораторного мониторинга по Курской области следует,
что среди выделенных E. coli, вызывающих диарею поросят, телят и птицы
выделяются 17,7% энтеропатогенных сероваров при детском энтероколите.
При этом E. coli человеческого вида примерно одинаково распространены у
городских и сельских детей, а люди, работающие в животноводстве, являются носителями бактерий животного вида. Механизмы передачи возбудителя
инфекции состоит из трех фаз, звеньев – это выделение возбудителя из организма, нахождение во внешней среде и внедрение его в организм нового хозяина. Следует различать монотропные патогенные микроорганизмы, паразитирующие в одном органе или ткани и политропные (пантропные), паразитирующие во всех тканях и органах. В целом специфическая локализация возбудителя ограничивается четырьмя анатомо-физиологическими системами
животного: пищеварения, дыхания, кровообращения и наружных покровов.
В настоящее время разработано более 1000 различных природных и
химических антибиотиков. Однако в лечебной работе используются около
250. Комбинация одних антибиотиков с другими, внесение в их состав клавулановой, лимонной, фумаровой органических кислот, фтора, пиперазинового радикала, трилона Б, аргинина, колистина и т. д. увеличивает их токсическое действие на органы и ткани организма. При энтеральном введении антибиотики действуют не только на патогенные микроорганизмы, но и на
нормальную микрофлору. Изучено, что хорошо размножаются в кишечнике
72
ацидофильные палочки, бифидобактерии, которые выполняют защиту пищеварительного тракта.
Причиной желудочно-кишечных болезней поросят является дисбактериоз на фоне развития патогенных микроорганизмов в т. ч. E. coli и сальмонелл. Постоянное применение антибиотиков еще более усугубляет патологический процесс. Использование молочнокислых продуктов болгарскими сыроварами, установление И. И. Мечниковым антагонизма молочнокислых
бактерий патогенным микроорганизмам и основанная им технология, применение АБК (ацидо-бульонной культуры), ПАБК (пропионоацидофильной бульонной культуры) создали необходимость поиска микроорганизмов и разработки способов получения препаратов под названием эубиотики (гр «эу» хорошие) или пробиотики. Название пробиотик имеет латинское происхождение и означает «для жизни». Он был введен в 1977г. Ричардом Паркером и
обозначал вытеснение патогенных микроорганизмов и возврата к балансу
между нормальной и вредной микрофлорой.
Существующие технологии изготовления «классических» монобактериальных пробиотиков – бифидум, лакта, колибактерин, B. Subtilus – биоспорин, энтерол, а затем полибактериальных – бифолонг, аципол, линекс,
бифацид, лактобифил, «Бактенорм» и генноинженерные основаны на выращивании в течение 2-3 суток эубиотических микроорганизмов на мясо-, казеиногидролизатном агаре с глюкозой, кровяной, молочной и сырной сывороткой смывом физиологическим раствором микроорганизмов с поверхности
агара, установление концентрации микробных клеток до 3-5 млрд/мл, смешивание в равном соотношении и лиофилизацию, или создание пастообразной субстанции, таблеток, капсул.
Применение ряда пробиотиков показало их низкую эффективность при
лечении желудочно-кишечных болезней новорожденных телят и поросят, а
высев на питательные среды выявил слабый и неравномерный рост микроорганизмов и прорастание патогенной микрофлоры – стафилококками., сальмонеллами, протея, E. coli и колебание температурного режима от 5°С до
73
30°С. Упрощенная сертификация, многоуровневый маркетинг импортируемых пробиотических препаратов и финансовый интерес провайдеров увеличивает их импорт при практически прекращении отечественного производства.
В настоящее время выращивание лакто- и бифидобактерий производится на плотной агаровой среде с добавлением молочной или подсырной
сыворотки, а также гидролизата творога или кильки. Основными недостатками существующих питательных сред является их непостоянство состава и
необходимость смыва выращенных лакто- и бифидобактерий с поверхности
агара.
Для устранения указанных недостатков была разработана жидкая питательная среда, содержащая стабильные компоненты: лимонную, янтарную
кислоту, пептоны, глюкозу, обеспечивающая высокое накопление бактериальной массы, до 90 млрд/мл. При выращивании в 2-х литровых биобутылях
с объемом среды, равной 1 литру, лакто- и бифидобактерии образуют рыхлую массу и колонии в виде «зерен», «тяжей» с прозрачной надосадочной
жидкостью. В качестве контроля использовали коммерческий «Бактенорм» и
«Лактобифил».
Применение пробиотических микроорганизмов обусловлено их способностью адгезии к клеткам кишечника, антимикробным и токсинонейтрализующим действием, улучшением пищеварения, путем выработки ферментов, витаминов, молочной кислоты и т.д.
Для изучения биоцидного действия производственного и экспериментального амоксициллина и энрофлоксацина на E. coli и лакто- и бифидобактерий, использовали метод серийных разведений с использованием МПГБ и
жидкой синтетической питательной среды. Полученные данные представлены в таблице 14.
Из данных, представленных в таблице, следует, что производственный
амоксициллин в концентрации 3,2 мкг/мл, проявил биоцидное действие на
1000/ мл E. coli и 105 лактобактерии и бифидобактерии, но не действовал в
74
отношении 10000/ мл E. coli. В то же время экспериментальный амоксициллин и энрофлоксацин, действовали в отношении 1000/ мл и 10000/ мл E. coli,
лакто- и бифидобактерии.
Таблица 14 - Сводные данные биоцидного действия производственных
и экспериментальных амоксициллина и энрофлоксацина на E. coli, лактобактерий и бифидобактерий
Антибиотики
мкг/мл
E. coli
1000/ мл
Тест-микробы
E. coli Лактобактерии Бифидобактерии
10000/
105 в 1 мл
105 в 1 мл
мл
Производственный
амоксициллин 3,2
+
мкг/ мл
Экспериментальный
амоксициллин 3,2
+
мкг/ мл
Производственный
энрофлоксацин 2,4
+
мкг/мл
Экспериментальный
энрофлоксацин 2,4
+
мкг/мл
Производственный
амоксициллин 3,2
+
мкг/ мл с 0,1% HCl
Производственный
энрофлоксацин 2,4
+
мкг/мл с 0,1% HCl
В последующем установлено,
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
что производственный амоксициллин и
энрофлоксацин с 0,1 % соляной кислотой не инактивировал E. coli в концентрации 10000/ мл, но проявлял биоцидные действия к лакто- и бифидобактериям, в концентрации 105 / мл.
Исходя из того, что производственный и экспериментальный амоксициллин и энрофлоксацин отдельно и в смеси с 0,1% соляной кислотой при
энтеральном введении, способствуют развитию дисбактериоза после антибиотикотерапии поросят провели выпаивание утром и вечером в течение 3-х
суток суспензией лакто- и бифидобактерий в концентрации 109 / мл в объеме
75
10 – 15 мл. В исследованиях использовали 76 голов поросят после лечения
желудочно-кишечных болезней производственным (38 голов) и экспериментальным амоксициллином (38 голов), один раз в сутки, в течение 3 – 6 суток
по 2,0 г и 1,0 г соответственно.
Прекращение поносов у 38 поросят происходило через 2 – 3 суток при
лечении экспериментальным амоксициллином по 1 грамму на животное, а
при лечении поросят производственным амоксициллином по 2 грамма одному поросенку, прекращение поносов происходило у 38 поросят через 5 – 6
суток.
Нормализация пищеварения и нормофлоры у поросят происходило через 2 – 3 суток после выпойки суспензией из свежевыращенных лакто- и бифидобактерий на жидкой синтетической среде. При этом из кишечника вынужденно убитых 3-х поросят были выделены лакто- и бифидобактерии. В то
же время восстановления лакто- и бифидобактерий в таблетках, капсулах,
пасте происходило через 6 – 7 суток.
Из полученных результатов следует, что для нормализации молочнокислых бактерий в кишечнике поросят после антибиотикотерапии необходимо выпаивать суспензией из свежевыращенных лакто- и бифидобактерий.
76
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исходя из необходимости разработки минеральной питательной среды
для выращивания и выделения E. сoli, способы приготовления колибактериозной анатоксин-вакцины с использованием эффективного детоксикатора и
полимеризатора глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом повышения биоцидного и лечебного действия амоксициллина и энрофлаксацина была определена актуальность темы, цель и задачи исследований и общая характеристика работы.
Диссертационная работа написана по традиционной схеме и состоит из
2-х основных разделов - это обзор литературы и результатов исследований.
В первом разделе проанализированы современные источники литературы по нормализации физиологического статуса поросят, к состоянию и основам научных исследований по решению цели и 4-х задач по повышениию
эффективности диагностики, средств специфической профилактики с помощью колибактериозной анатоксин-вакцины и терапии поросят, больных желудочно-кишечными болезнями и колибактериозом, с использованием экспериментальных [модифицированных] амоксициллина и энрофлоксацина, подвергнутых полимеризации.
В первой главе 2.1 представлены основы физиологических иммуногематологических показателей сыворотки, плазмы и форменных элементов
крови новорожденных поросят и в процессе выращивания, а также роль витаминов D, C и микроэлементов, состава молозива, молока и функция кишечника.
В частности иммунодефицитное состояние у поросят проявляется при
концентрации гаммаглобулинов ниже7-8 мг/мл, а повышенный уровень иммуноглобулинов M[Jg M] свидетельствует о развитии болезни и необходимости определения возбудителя, эпизоотической обстановки и изучения условий кормления, содержания и показатели микроклимата. При иммунодефиците происходит снижение активности клеток неспецифического иммунитета
77
– моноцитов, нейтрофилов и клеток специфического иммунитета. В целом
иммунодефицитные состояния подразделяются на первичные, вторичные,
гуморальные и клеточные, которые угнетают полноценный иммунный ответ
организма, в частности организма поросят, специфической профилактики и
антибиотикотерапии возможно на фоне физиологических и гематологических показателей и применения способов и средств их корректировки [22, 37,
42].
Из обзора источников литературы в главе 2.2 следует, что для получения колибактеридной, сальмонеллезной, стафилаккоковой анатоксин-вакцин
и.т.д и пробиотических препаратов используются мясо-, казеино и килькогидролизатные бульоны для выращивания микроорганизмов. В то же время
все виды микобактерий туберкулеза выращивают на синтетических питательных средах, которые стали прообразом большинства питательных сред.
Изучение физиологии, химического состава и роли белков, липидов,
полисахаридов, нуклеиновых кислот и микроэлементов позволили определить основные функции составных частей бактерий. В настоящее время
практически изучена содержание и роль микроэлементов в физиологии микроорганизмов. В частности изучено что фосфор и калий составляют самое
большое количество минерального остатка. Они входят в состав нуклеиновых кислот, липидов, ферментов, а в комплексе с ионами кальция, магния,
серы натрия поддерживают осмотическое давление среды, активируют все
экземы. Белки и ферменты бактерий обладают ферментативной, иммуногенной, антигенной и вирулентной активностью. Входящая в состав синтетических питательных сред лимонные и янтарные кислоты цикла Кребса. Обеспечивают полное растворение вносимых солевых компонентов питательной
среды. Полученные результаты по конструированию питательных сред, изученности функции составленных компонентов бактериальной клетки создают
перспективу поиска новых ингредиентов в составе синтетических сред для
получения анатоксин-вакцин, свободных от балластных веществ мяса, козеина, кильки.
78
В главе 2.3 представлены виды и биологические свойства E. сoli, в т. ч
адгезинов, экзо-, эндо и энтеротоксинов, плазмид и характеристика антигенных претективных и гематогенных свойств белков, микополисахаридов, нуклеопротеидов [53, 59, 60, 82, 85, 97].
В связи с различием E. сoli изготавливаются ассоциированные колибактериозные анатоксин-вакцины путем выращивания кишечной палочки на
мясогидролизатном глицериновом бульоне. Основные недостатки поливалентных колибактериозных анатоксин-вакцин - это выращивания производственных, биофабричных штаммов E. сoli, а не свежевыделенных на мясопептонных средах и применения для детоксикации и полимеризации 0,5-0,7
% формальдегида ртутьсодержащего консерванта мертиолята.
Аналогичные технологии используются отечественными и иностранными производителями. В частности, изготавливают Армовирская, Орловская, Ставропольская и Краснодарская биофабрики поливалентные формолтиомерсановые алюминиевые вакцины.
Естественно, указанные анатоксин-вакцины не отвечают современным
требованиям, а практически столетнее их производство не обеспечивает полноту протективную активность для специфической профилактики колибактериоза свиней.
Следует учитывать разнообразие видов E. сoli, широкий спектр резистентности, вирулентности энтеротоксигенов, адгетинов, сложную структуру
антигенов: поверхностно- капсульного [К], соматического [О] и жкутивого[Н]. Кроме того различные варианты E. coli содержат гемогизины, экзо- и
эндотоксины и энтеротоксины способные выделять более 30 видов колицинов, обладающие антибактериальным действием [109, 121, 126].
В условиях пониженной резистентности организма поросенка, сложной
и постоянной изменчивости структуры E. сoli иммунные сыворотки не способны обеспечивать изоляцию микроорганизмов и их токсинов.
Однако изготовленные иммунные сыворотки путем иммунизации поросят производственными штаммами E. сoli, используемые и при получении
79
колибактериозных формолтиомерсановых анатоксин-вакцин не в состоянии
проявить лечебно- профилактический эффект.
Для устранения недостатков и повышения протективной активности
вакцин и лечебного действия иммунной сыворотки необходимое современное оперативное биотехнологическое обоснования их получения.
В повышении протективной эффективности колибактериозной анатоксин-вакцины с учетом роли местного иммунитета и экспериментального подтверждения ряда авторов ведущее значение вероятно играет энтеральный
способ вакцинации.
Однако практическое воплощение энтеральной вакцинации как альтернативы подкожному способу иммунизации поросят и других видов животных пока остается открытым [71, 77, 103, 112].
В главе 2.4 представлены существующие способы и биотехнологические подходы повышения биоцидного и лечебного действия природных и
химических антибиотиков. Сочетание одних антибиотиков с другими, внесение в их состав квалувановой, лимонной, фумаровой и янтарной кислот, создание ряда поколений фторхинолонов, содержащих энрофлоксацин и фтор
не обеспечивают качественного прорыва.
Классические способы сдерживания или региональные ограничения
распространенности резистентности к антибиотикам остаются недостаточными на глобальном уровне. Распространение устойчивости к антибиотикам
продолжает увеличиваться среди патогенных, комменсальных бактерий и
микрофлоры окружающей среды.
Установление влияния геомагнитного воздействия на устойчивость ряда бактерий к температуре, дезинфицирующим и антибактериальным препаратом является частным примеров экологического воздействия на бактериальные клетки и организм животных и человека.
Проявление устойчивости бактерий к антибиотикам следует рассматривать как результат не только селективных, но еще более сложных экологических и эволюционных процессов, влияющих на бактериальные популяции
80
[114, 120, 124].
Внесение в состав энрофлоксацинов, колистина, аргинина, трилона-Б
обеспечивало кратковременный успех в отношении резистентных микроорганизмов на фоне повышения токсического действия и проявления дисбактериоза.
Принципиально новое биотехнологическое обоснование повышения
биоцидного и лечебного действия достигнуто с помощью 0,2 % формальдегида или 0,1 % глутаровым альдегидом с 0,2 % этонием [20, 27, 30, 41, 70,
82].
Однако дефицитность этония как четвертичного аммониевого соединения сдерживает практическое использование. Необходимо изучение и поиск
других полимеризаторов [82, 85, 91, 99, 108, 121].
Энтеральное применение антибиотиков при желудочно-кишечных болезнях и колибактериозе поросят приводит к гибели патогенных и условнопатогенных микроорганизмов и полезных бифидо- и лактобактерий [70, 108,
112, 125].
Успех восстановления нормофлоры с помощью моно- и поликомпонентных пробиотиков во многом зависит от температурного режима хранения эубиотических микроорганизмов, и их устойчивости к кислой среде и
действию ферментов.
В основе изготовления колибактериозной сальмонеллезной, стаффилакокковой, протеино-синегнойной анатоксин вакцин является использование
мясо-, казеиногидролизатные с пептоном и глицерином, а для получения
пробиотических микроорганизмов творожистая, молозивная сыворотки или
гидролизаты кильки.
Естественно такие питательные среды не позволяют получать более
эффективные биопрепараты, т.к. содержат балластные вещества гидролизатов мяса, казеина, кильки. Неравномерность роста и небольшое накопление
до 5-7 млрд/мк E. coli, дороговизна и дефицитность компонентов питательной среды сдерживает их производственное использование.
81
Изучено, что для большинства аэробных микроорганизмов активными
являются все ступени цикла Кребса, являющими инструментом ассимиляционного процесса обмена у бактерий. Существующее общее утверждение, что
самое основное значение для азотистого питания имеет аммонистый ион, а
для углеродистого -глицерин приняло конкретное подтверждение [53, 56, 57,
65, 70].
Использование аммиака в значительной мере зависит от качества той
или иной органической кислоты, с которой аммиак сочетается для синтеза
аминокислот. Таким образом, аммиак является узловым пунктом, куда ведут
все пути азотистого питания. Следовательно, доминирующая с 30-х годов
идея о полном наборе обязательных аминокислот не подтверждается.
Полученные результаты исследования питательной ценности аммонийных солей органических кислот показали лучшие результаты роста E. coli
на средах с лимонной, янтарной, яблочной [изоянтарной] кислотами. Использование лимонной и янтарной кислот в питательной среде имеет ряд преимуществ перед другими органическими кислотами.
Лимонная и янтарная кислоты являются сравнительно сильными органическими кислотами, образующие комплексы со многими катионами. Лимонная и янтарная кислоты являются начальным материалом для образования несколько насыщенных карбоновых кислот. Они используются в производстве цитрата магния, сукцинатов, способствуют полному растворению
ряда ингредиентов, что весьма важно при составлении синтетических питательных сред, включающих различные по своей химической природе соединения.
Лимонная и янтарная кислоты способны существовать в форме гидрата, содержащего одну молекулу воды, так и в безводном состоянии, стабильны на свету и воздухе, являются ценным исходным материалом для различных синтезов.
При создании минеральной среды для E. coli и пробиотиков учитывали
их способность существовать во внешней среде, в условиях организма.
82
В тоже время многие виды E. coli и другие микроорганизмы живут в
почве, воде и являютя непатогенными, сапрофитными [греч. Sapros - гнилой,
phyton - растение и phatos - болезнь]. При ослаблении организма, влиянии
факторов внешней среды гербицидов, дезинфицирующих и антибактериальных средств появляются новые варианты микроорганизмов, способные паразитировать, вызывать болезни животных и человека.
В результате изысканий были разработаны две минеральные питательные среды- одна жидкая для промышленного выращивания E. coli, с целью
изготовления колибактериозной анатоксин-вакцины, свободный от балластных веществ мяса, казеина, а вторая- плотная с 2,5 % агара для выделения
кишечной палочки.
Доступность ингредиентов и их полная растворимость как при последовательном растворении, так и после предварительного смешивания в сухом
виде и высокое накопление микроорганизмов подтверждает сбалансированность вносимых компонентов питательной минеральной среды.
При колибактериозе животных и человека происходит постоянное выделение микроорганизмов во внешнюю среду. Это в определенной степени
круговорот веществ или живых существ в природе.
Усиление патогенности E. coli происходит под влиянием химиотерапии, ослабления резистентности организма, факторов внешней среды, циркуляции кишечной палочки из организма во внешнюю среду и обратно в организм животных и человека [95, 98, 183].
Однако экологическое воздействие на биологические свойства E. coli и
механизмы эволюционных процессов практически остаются малоизученными.
В этой связи в задачу исследований входило изучение электромагнитного влияния на проявление чувствительности E. coli к температуре и антибиотикам.
В процессе исследований установлено повышения устойчивости E. coli
к температуре и антибиотикам.
83
Существующая обособленность, разграничения дифференциации роли
экологических воздействий, эволюционных процессов не позволяет учитывать все звенья сложных эволюционных процессов и экологических влияний
на бактериальные популяции, субклеточные плазмиды и надклеточные [виды, сообщества], субъекты эволюции [112, 137].
Диверсификация [ex unibus plurum] и унификации [ex pluribus unum],
колебательная динамики эволюционных процессов на уровне бактериальной
клетки указывает на необходимость использования многоуровневого мониторинга антибиотикорезистентности и новых эволюционных подходов, методов к пониманию и предсказанию изменений микробиосфере [115, 117].
Суммирование роли отдельных экологических фрагментов, факторов
типа влияния электромагнитных воздействий, непрерывного применения антибиотиков необходимы для безотлагательных мер в отношении процессов,
влияющих на загрязнение микробиосферы антибиотикоустойчивыми микроорганизмами [2, 49, 149].
Повышение устойчивости E.coli к температуре и антибиотикам. В зоне
повышенного геомагнитного поля следует учитывать в лечебных и ветеринарно – санитарных мероприятиях.
Для специфической профилактики колибактериоза поросят и других
видов животных используют инактивированные гидрооксивалюминевые
формолтиомерсановые моно-, поливалентные и ассоциированные вакцины.
Существенным недостатком моно- и ассоциированных бактериальных
вакцин является выращивание биофабричных микроорганизмов на мясо- или
казеино-гидролизатных средах и проведение детоксикации и полимеризации
экзо-,эндо и суперэнтеротоксинов 0,5 – 0,7% формальдегидом с ртутьсодержащим консервантом мертиолятом. При этом мясо- и казеиногидролизатные
питательные среды содержат балластные вещества мяса или казеина и не
обеспечивают
высокое накопление бактериальной массы и их токсинов
[71,84].
Практически все указанные вакцины предназначены для подкожной
84
вакцинации.
Необходимо было разработать минеральную жидкую питательную среду, обеспечивающую максимальное накопление биомассы до 90 млрд/мл и
замену канцерогенного формальдегида и метиолята на более эффектные детоксикаторы и полимеризаторы с высоким биоразложением. Испытание показало эффективность 0,2 – 0,3 %. Глутарового альдегида в комплексе с 0,2 0,3% алкилдеметилбензиламмония хлоридом. По своим биоцидным действиям глутаровый альдегид превышает в 2-3 раза формальдегид [109,193]. При
этом глутаровый альдегид обладает повышенными полимеризующими свойствами и высоким до 90% биоразложением [73,179]
В целом колибактериозные вакцины сорбированные на гидроокиси
алюминия [3-5мг/мл] при подкожном введении обладает протективной активностью после 2-х кратного введения с интервалом 14 суток в объёме 7 -10
мл с концентрацией микробных клеток 75 – 90 млрд/мл от экспериментального заражения поросят вирулентными Е.соli.
Подкожное введение колибактериозный анатоксин – вакцины вызывает
у поросят образование гемагглютинирующих антител в титре 1:200 – 1:400.
Особую практическую протективную ценность проявила колибактериозная анатоксин-вакцина путём ежедневного выпаивания с водой 3-5 недельным поросятам в объёме 30-40 мл с концентрацией инактивированных Е.соli
75-90 млрд/мл в течении 5-7 суток. В отличии от подкожной вакцинации у
поросят происходило незначительное образование гемагглютинирующих антител на фоне физиологических показателей гемоглобна, эритроцитов, лейкоцитов, антител класса А,М и Jg Y. Полученные результаты подтверждают,
что у вакцинированных поросят появляется взаимосвязь общего и местного
иммунитета и защита заболевания колибактериоза.
Отсутствие сывороточных антител при энтеральной вакцинации дополняется необходимым количеством В-лимфоцитов и плазмоцитов для образования синтеза иммуноглобулинов Jg A, Jg M, Jg Y. Следовательно, энтеральная вакцинация возбуждает лимфоидный аппарат кишечника и обеспе-
85
чивает непосредственно физиологического воспаления, стимулирует выведение антимикробных веществ для ферментативного расщепления микроорганизмов.
В основе теории и практики местного иммунитете положен феномен
органотропности и, соответственно, каким бы способом не проводили вакцинацию для профилактики желудочно-кишечных болезней – подкожным или
энтеральным, происходит иммунизация кишечника, как наиболее чувствительного к этим инфекциям органа[17,73,217].
Подкожная
вакцинация
обеспечивает
иммунизацию
кишечника
«окольным путём», а при энтеральном - кишечник вакцинируется непосредственно[2, 14, 17].
Из полученных результатов исследований тропизма вирусов и бактерий, роли местного иммунитета при респираторных и желудочно- кишечных
болезнях необходимо учитывать возможность проведения соответствующих
способов вакцинации животных.
Первоначально для лечения инфекционных болезней использовали хинин, сольварсин, новорсевил, производные висмута, сурьмы, ртути, нитрофураны – фуразолидон, ПАСК, стрептоцид, фталозол и т.д. В последующем
были получены из плесневых грибов и лучистых бактерий – актиномицетов –
антибактериальные препараты, которые назвали антибиотиками.
Повсеместные применения одних и тех же антибактериальных препаратов породило проблему лекарственной устойчивости микроорганизмов в
направлении экологического воздействия эволюционного развития.
Уместно отметить роль миграции в развитии устойчивости микроорганизмов между разными видами животных и человека, выделение во внешнюю среду с иными условиями и вновь возвращение в организм.
В результате у микроорганизмов выработались механизмы и средства
защиты и деструкции антибиотиков.
Для повышения бактериологического и бактериального действия антибиотиков использовали сочетание одних антибиотиков с другими, внесе-
86
ние в их состав клавулоновой кислоты, а затем лимонной, фумановой и янтарной кислоты. В настоящее время арсенал природных антибиотиков по
мере появления устойчивых к ним форм и видов бактерий пополняется новыми препаратами, именуемые более «сильными».
При этом на фоне биоцидной действия новые антибиотики проявляли
повышенное токсическое действие на органы и ткани животных и человека
[7, 17, 219].
Особая надежда возлагалась на химические препараты, именуемые хиноловыми разных поколений, содержащие галогены – йод, хлор, бром и
фтор. Наиболее эффективным препаратом оказался энрофлоксацин, содержащий фтор[ моно-,ди-,три] и пилодозиновый радикал. Входящий в состав
энрофлоксацина и его коммерческие аналоги. Фтор является наиболее агрессивным галогеновым элементом. Всего 1 мг фтора на 1 л воды способен вызывать ожог кожи [94, 217,224].
Длительное и повсеместное применение энрофлоксацина в птицеводстве, свиноводстве, откорме крупного рогатого скота привело к массовому
распространению моноустойчивых микроорганизмов.
Для преодоления лекарственной резистентности микроорганизмов в
состав энроксила [энрофлоксацина] ввести колистин [500000МЕ, аргинин,
трилон –Б, полиэтиленгликоль, лимонную и аскорбиновую кислоты].
Однако биоцидный и лечебный эффект комбинированных химических
энрофлоксацина, энромаг, энроксил и т.д. был кратковременный [76,93].
Для преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов к природным и химическим препаратам необходим новый биотехнологический
подход по пути полимеризации структуры антибиотиков по технологии получения бактериальных анатоксинов.
Приоритетные сообщения и защищенность патентами качественно новых препаратов были представлены в 2007-2014 гг. путём полимеризации антибиотиков с помощью 0,2% формальдегида и ли 0,1% глутарового альдегида с 0,2%этонием по принципу получения бактериальных анатоксинов и бак-
87
териально-вирусных анатоксин-вакцины.
Однако дефицитность этония сдерживает широкое использование экспериментальных антибактериальных препаратов с глутаровым альдегидом в
форме растворов, мази и порошков.
Перспективность использования глутарового альдегида с алкилдиметилбензиламмония хлоридом для повышения биоцидного и лечебного действия антибиотиков исходила из полученных показателей детоксикации и
полимеризации колибактериозных экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов.
Известно, что альдегиды обладают способностью вызывать полимеризацию ряд белковых соединений, нуклеиновых кислот, т.е. объединения одной молекулы в более крупные комплексы – полимеры, устойчивые к деструктивному действию ферментов, кислот, щелочей, растворителей [170,
178,181,18].
Получения экспериментальных серий антибиотиков путём полимеризации 0,1% глутаровым альдегидом с 0,1%алкилдиметилбензиламмония хлорида показала их безвредность, повышенную биоцидную и лечебную эффективность.
В последующем были использованы широко применяемые природный
антибиотик амоксицилин и химический энрофлоксацин [энроксил].
Испытание на безвредность на лабораторных животных, поросятах и
телятах не выявило. Клинически выраженных признаков заболевания, а физиологические показатели – гемоглобин, количество лейкоцитов, эритроцитов и гаммаглобулинов у поросят находились в пределах нормы.
Методом серийных разведений установлено повышенное биоцидное
вдвое действие экспериментальных энрофлоксацина и амоксициллина по
сравнению с производными антибиотиками в отношении патогенных свежевыделенных и лабораторных штаммов E. coli.
Биоцидное действие in vitro экспериментальных серий энрофлоксацина
и амоксициллина в минеральных концентрациях отмечено в отношении 1000
и 10000 микробных клеток в 1 мл E. coli. Последующее применение экспе-
88
риментальных образцов энрофлоксацина и амоксициллина путём выпаивания поросятам с водой в течении 2-3 суток и после однократного ежедневного подкожного введения в течение 2-3 суток вызвало прекращение поносов у
животных.
Необходимость изучения биоцидного
действия модифицированных
антибиотиков в отношении лакто- и бифидобактерий вызвано сообщениями о
том, что ряд антибиотиков не действуют на полезную микрофлору кишечника человека, поросят, телят и птицы. Это своего рода странные утверждения
и не более того. Тем не менее, экспериментально надо было проверить и
опровергнуть ложное утверждение в отношении пробиотических микроорганизмов.
Изучено, что в природе существуют самые разнообразные взаимоотношения между организмами. Антагонистические взаимоотношения между
бактериями впервые обнаружил Л.Пастер, а И.И.Мечников использовал антагонизм для подавления гнилостных бактерий в кишечнике человека с помощью молочнокислых бактерий.
Изучения биоцидного действия модифицированных амоксициллина и
энрофлоксацина установлено их бактерицидная активность в отношении
10000 и 100000 лакто-, бифидобактерий и В.subtilis. Исходя из полученных
данных антибиотикотерапии поросят необходимо проводить солевую или голодную диету, а затем выпаивать утром и вечером в течение 2-3 суток суспензии из свежевыращенных до 109 – 1012 лакто- и бифидобактерий. Это вызывает прекращение поноса у поросят и нормализацию физиологического
статуса.
Результаты исследований согласуются с показателями отечественных и
зарубежных авторов [168,175,216].
Из результатов исследований следует, что поставленная цель и задачи
выполнены. В частности разработана и успешно апробирована минеральная
питательная среда с доступными ингредиентами, обеспечивающая стабильное накопление до 75 -90 млрд/мл E. coli, вместо 5-7 млрд/мл при выращи-
89
вании на МПГБ. Отработан способ получения колибактериозной анатоксинвакцины путем детоксикации и полимеризации экзо-, эндо- и суперэнтеротоксинов 0,2-0,3% глутаровым альдегидом с 0,2 -0,3 % алкилдиметилбензииламмония хлорида вместо канцерогенного формальдегида и ртутьсодержащего мертиолята. Доказана протективная активность и безвредность энтеральной вакцинации поросят колибактериальной анатоксин- вакциной. Впервые повышена биоцидная и лечебная эффективность аммоксициллина и энрофлоксацина в отношении
E. coli и больных поросят колибактериозом.
Определена необходимость повышения жизнеспособности лакто- и бифидобактерий путём предварительного выращивания коммерческих пробиотических микроорганизмов но жидкой синтетической питательной среде.
90
5 ВЫВОДЫ
1. Для выращивания E. coli разработана жидкая минеральная питательная среда, содержащая в 1 л дистиллированной воды следующие компоненты
в граммах: янтарной кислоты -3,0; лимонной кислоты -4,0; фосфорнокислого
калия 2- зам-3,0;фосфорнокислого натрия-2-зам-3,0; хлористого натрия 1,5;сернокислого цинка-0,1;сернокислое железо 0,1; сернокислого магния 0,3 и глицерина -30,0 мл. Реакция среды устанавливается 5% раствором аммиака до 7,2 перед автоклавированием.
2. После 2-3 суточного выращивания в 2-х литровых биобутылях с объёмом среды, равной 1 литру накопление E. coli достигает 75-90 млрд/мл при
концентрации токсинов 0,9- 1,0 мг/мл.
3. Синтетическая среда в разведении 1:1 с 2,5 % агара обеспечивает
оперативное выделение E. coli из патологического материала.
4. Кишечная палочка, выделенная от поросят в зоне железорудных регионов Курской и Белгородской областей обладает повышенной устойчивостью к температуре на 5-7°С и амоксициллину, энрофлоксацину на 3-5 %.
5. Детоксикация и полимеризация комплекса токсинов вместе с автоклавированными 75-90 млрд/мл E. coli 0,2-0,3% глутаровым альдегидом с
0,25% алкилдиметилбензиламмония хлоридом при 40°С в течение 2-3 суток
обеспечивает получение безвредной с повышенной иммуногенной и протективной активностью колибактериозной анатоксин-вакцины при оральном
или подкожном введении.
6. Полимеризация 5-10% раствором амоксициллина и энрофлоксацина
0,1%; глутаровым альдегидом с 0,1% алкилдиметилбензиламмония хлоридом
при 40°С в течение 2-3 суток повышает бактериальные свойства в 1,5 - 2 раза в отношении полирезистентных E. coli и сокращает сроки лечения поросят, больных колибактериозом или после заражения вирулентными микроорганизмами.
7. Подкожное введение поросятам экспериментально амоксицилина
или энрофлоксацина в объёме 2,5 -3,0 мл в течение 2-3 суток обеспечивает
91
защиту животных от заболевания при экспериментальном заражении E. coli.
8. Оральное введение 30-40 мл экспериментального амоксициллина
или энрофлоксацина утром и вечером вызывает прекращение диареи у поросят на 2-й день лечения.
9. Методом серийных разведений экспериментального амоксициллина
и энрофлоксацина установлено биоцидное действие препаратов в отношении
1000/мл и 10000/мл E. coli и 105 лактобактерий и бифидобактерий.
10. Нормализация полезной микрофлоры кишечника поросят после антибиотикотерапии достигается выпойкой с водой или, в смеси с кормом в течение 1-2 суток суспензии 109 лактобактерий и 109 бифидобактерий, предварительно выращенных на жидкой синтетической питательной среде в течение 2-3 суток.
92
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Разработанный состав жидкой минеральной среды рекомендуем использовать для выращивания свежевыделенных и лабораторных штаммов
микроорганизмов вместо мясопептонного бульона.
2. Плотная среда с 2,5% агаром на основе синтетической питательной
среды в разведении 1:1 и 1:2 создаёт возможность оперативного выделения и
определения резистентности E. coli к антибактериальным препаратам.
3. Рациональная технология изготовления колибактериозной анатоксин-вакцины предполагает изготовление биопрепарата из лабораторных и
свежевыделенных E. coli региона.
4. Повышенная бактерицидная и терапевтическая эффективность аммоксициллина и энрофлоксацина полимеризацией глутаровым альдегидом с
алкилдиметилбензиламмония хлоридом обеспечивает эффективное лечение
поросят, больных колибактериозом отдельно и в ассоциации с другими инфекционными болезнями с полирезистентными микроорганизмами. Установленную антибиотикоустойчивость - терморезистентность E. coli, выделенных из регионов с повышенными геомагнитным полем необходимо учитывать при проведении лечебных и ветеринарно- санитарных мероприятий.
93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Безгин В.М. Основы промышленной биотехнологии/ В.М. Безгин,
Н.Н.Быкова, В.В. Козлов//Учеб. Пособие, Изд-во Курской ГСХА, 2011. –
С.512
2. Безредка А. М. Местная иммунизация. Париж, 1925. – С. 217
3. Бектимиров Т.А. Международные требования к испытанию стабильности медицинских препаратов//М.: Биопрепараты.- 2006. - №3[23]. С.28-30.
4. Бектимиров Т.А. Принципы оценки иммунологической эффективности вакцин/ Т.А. Бектимиров,М.Я. Горбунов, Н.М. Никитюк//М.: Биопрепараты.- 2007. - №1. - С.14-16.
5. Белобородова А.В. Новые показания для фторхинолонов при лечении инфекционных болезней// Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т.54. №1-2, -С.25-28.
6. Белоусов В.И. Требования к питательным средам /В.И. Белоусов//Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными болезнями: Сб. статей междунар. науч.-практ. конф. - Покров. - 2000. - С.230232.
7. Бельский В.В. Биофизические и медико-биологические аспекты
магнитобиологии / В.В. Бельский, м.П. Попов, П.В. Калуцкий // Курск,
КГМУ, 1997. – 147с.
8. Бокун А. А. Применение пробиотиков в животноводстве/ А. А. Бокун, С. В. Деревянко, Г. М. Дяченко // Ветмедицина.
9. Болотников И. А. Физико – биохимические основы иммунитета/ И.
А. Болотников, Ю. В. Конопатов. //Л.: Наука, 1987. – С. 210
10. Бортничук В. А. Разробки та застусування пробиотика «Бактонорм»
при шлунково – кишковых хворобах новонароджених телят/ В. А. Бортничук,
Н. Г. Сорокина, М. Г. Наконечная// Ветмедицина.
11. Бургасов П.Н. Руководство по вакцинному и сывороточному производству/П.Н. Бургасов//М.: Медицина, 1978.-С439.
94
12. Бырдаров С.В. Экспериментальная микробиология// София: Медицина, 1965. - С.112-113.
13. Василюк О.Я. Возможности снижения заболеваемости поросят колибактериозом методами молекулярной генной диагностики / О.Я. Василюк,
Н.А. Лобан // Вет. медицина Беларуси. - 2006. - №. 1. - С. 9-11.
14. Виноходов В. О. Биотехнология профилактики колибактериоза
птиц/ В. О. Виноходов// С – Петербург, Ломоносов, 2000. – С. 370 – 410.
15. Виноходов В.О. Фармакопрофилактика колибактериоза птиц [экспериментально-производственные исследования]: Автореф. дисс. канд. вет.
наук/В.О. Виноходов//Л., 1985. – С. 21
16. Войтенко В.Д. Повышение эффективности антибиотикотерапии//
Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки: Экспресс-информ
СПб. - 2003. - Вып.14. - С. 19-20
17. Войтенко В.Д. Аэрозоли неомицина в сочетании с иммуностимулятором при экспериментальном колибактериозе цыплят/ В.Д. Войтенко//
Международный вестник ветеринарии. - 2004. - №1. -С.58-60.
18. Волкова, М.В. Экологические аспекты вакцинации против эшерихиоза сельскохозяйственных животных / М.В. Волкова // Материалы международной научно-практической конференции «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины». - Саратов:
ГНУ СНИВИ РАСН./ ИП Моисеева Е.В., 2011.-С. 59-62.
19. Волынец Л.К. Колибактериоз в свиноводческих хозяйствах/ Л.К.
Волынец, Ю.Г. Балицкий//Ветеринария. - 1991. - №1. - С.41-43.
20. Воробьев А.А. Анатоксины/ А.А. Воробьев, Н.Н. Васильев, А.Т.
Кравченко//М.: Медицина, 1965. - С. 240.
21. Воробьев А.А. Микробиология и иммунология/ А.А. Воробьев//М.:
Медицина, 1999. - С.470.
22. Воробьёв, А.А. Современные направления в разработке иммуннобиологических препаратов/ А.А., Воробьёв// ЖМЭИ, 2009, №5.- С. 16-21.
23. Воронин Е.С. Иммунология/Е.С. Воронин, А.М. Петров, Д.А. Дев-
95
ришев//М.: Колос, 2002. - С.75-87.
24. Воронин, Е.С. Основы биотехнологических процессов/ Е.С., Воронин, И.В. Тихонов, Т.Н., Грязнева//Учеб.пос. М., МГА ВМ и Б.,2005 – С. 864.
25. Воронина, Е.И. Применение дизпаркола при желудочно-кишечных
заболеваниях поросят / Е.И. Воронина, С.И. Плотников, В.В. Чернов // Ветеринария. - 2009. - № 9. - С. 16-17.
26. Герман В.В. Разработка средств специфической защиты животных
на основе инактивированных антигенов и современных адъювантов/ В.В.
Герман, Б.Т. Стегний// Харьков: Ветеринарная медицина. - 2003- Вып.81. - С.
172-177.
27. Гинцбург, A.A. “Quorumsensing или социальное поведение бактерий/ А.А., Гинцбург, Т.С., Ильина, Ю.М. Романова// ЖМЭИ, 2011, №5. - С.
106-108.
28. Глаголев С.М. Применение диастопа для лечения колибактериоза и
сальмонеллеза у поросят/ С.М. Глаголев, В.В. Набоева //Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных. Международная научно-производственная конференция, посвященная 100 летию со дня рождения
профессора Авророва А.А.- Воронеж, 2006. - С. 1039-1041.
29. Голиков, А.В. Эффективность байтрила при инфекционных болезнях животных / А.В. Голиков, В.Н. Скворцов, Н.В. Семенова // Ветеринария. - 1994. - №1. - С. 29-30.
30. Гордон А. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ/А., Гордон, Р.,
Алистер// М., Медицина, 2006.- С.344.
31. Горелов А.В. Пробиотики: Механизмы действия и эффективность
при
инфекциях
желудочно-кишечного
тракта/
А.В.
Горелов,
Д.В.Усенко//Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2005. - №4 - С.52-56
32. Гречухин А.Н. Современный подход к терапии при ассоциированных инфекциях / А.Н. Гречухин, Т.Б. Юхова // Ветеринария. - 2009. - №
9.-С. 8-10.
33. Гречухин А.Н. Практическое руководство по ветеринарным об-
96
работкам в свиноводческих хозяйствах / А.Н. Гречухин - С. - Петербург,
2010. – С. 408.
34. Гриценко В.А. Экологические и медицинские аспекты симбиоза
Esherihiacoli и человека/ В.А. Гриценко, О.В. Бухарин// Микробиология. 2000. - №3. - С. 92-99.
35. Гуськова Т.А. Антибактериальные препараты /Т.А. Гуськова,Л.A.
Чичерина, JI.K. Романова и др. // Сб. трудов ВНИХФИ. 1984; 51-4.
36. Данилевская Н. В. Пробиотики в ветеринарии/ Н. В. Данилевская,
М. Сидоров, В. В. Субботин// Ветеринария, 2000, №11. – С. 17 – 22.
37. Данилевская Н. В. Фармакостимуляция продуктивности животных
пробиотическими препаратами. Автореф. Докт. Дис., 2007. – С. 36.
38. Девришов Д.А. Протективная активность вакцины ОКЗ/Д.А. Девришов, Е.С. Воронин//Ветеринария. - 1999. - №4. - С. 14-17
39. Девришов Д.А. Разработка и изучение свойств иммуномодуляторов
и биологических препаратов для профилактики и лечения болезней молодняка сельскохозяйственных животных:
Автореф.
дис. д-ра биол. наук/
Д.А.Девришов//М., 2000. – С. 53.
40. Духанин В.В. Резистентность кишечной палочки и сальмонелл к
антибиотикам, температуре в условиях повышенного геомагнитного поля//
Острые кишечные инфекции. - Л., 1987. - Вып.11. - С.49-52.
41. Доценко В.А. Опыт применения иммуногенного препарата, изготовленного из условно-патогенной микрофлоры/ В.А. Доценко, Р.С. Луганский// Харьков: Ветеринарная медицина. - 2005. - Вып.85. - С.390-392.
42. Евглевский Д.А. Среды для выделения и культивирования кишечной палочки и сальмонелл/ Д.А. Евглевский, С.А. Макавчик// Ветеринарный
консультант. - 2004. - №22. - С. 19-20.
43. Ефанова, Л.И. Защитные механизмы организма. Иммунодиагностика и иммунопрофилактика инфекционных болезней животных / Л.И. Ефанова, Е.Т. Сайдулдин; под ред. А.Г. Шахова. - Воронеж: ВГАУ, 2004. – С.
391.
97
44. Ефанова Л.И., Сайтфиллин Е.Т. Защитные механизмы организма.
Иммунодиагностика и иммунопрофилактика инфекционных болезней животных/ Л.И. Ефанова, Е.Т. Сайтфиллин //Воронеж: ВГАУ, 2004, С. 269-272.
45. Зароза В.Г. Новое о возбудителях колибактериоза и факторах их
вирулентности/ Зароза В.Г.//Ветер.газ., 1994. - №17.
46. Заславская Н.В. Выживаемость бактерий, находящихся в составе
со- обществ, в присутствии антибиотиков и металлов: Автореф. дис. канд.
мед. наук/ Н.В. Заславская //СПб., 2001.- С. 20.
47. Змушко Н.И. Клиническая иммунология/ Е.И. Змушко, Е.С. Белозеров, Ю.А. Митин//СПб.: Питер, 2001. —576с.
48. Иванов М.М. Антибиотикорезистентность и пути ее преодоления//
Российский ветеринарный журнал. - 2009. - №4. - С.60-63.
49. Калуцкий П.В. Магнитное поле как экологический фактор / П.В.
Калуцкий, В.В. Киселева // Материалы международного экологического форума, Курск, 1995. – С.116-117.
50. Ким Р.Е. Сравнительная эффективность различных способов лечения острых желудочно-кишечных болезней телят/ Р.Е. Ким, В.П. Урбан, Г.Е.
Лигай // Пути интенсификации производства молока и мяса, профилактика
болезней
сельскохозяйственных
животных
в
современных
условиях:
Тез.докл.Рос. науч.-практ. конф. - Смоленск, 1992. - С.157-158
51. Климова Е.А. Рациональная антибактериальная терапия/Е.А. Климова //Справочник врача общей практики. - 2006. - №10. - С.55-58.
52. Ковалев В.Ф. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии: Справочник/В.Ф. Ковалев и др.// М.: Агропромиздат, 1988. - С.
222.
53. Ковальчук Н.М. Антигенная вариабельность и вирулентность эпизоотических штаммов эшерихий/ Н.М. Ковальчук// Природные и интелектуальные ресурсы Сибири [Сибресурс-7-2001]: 7-я Междунар. науч. -прак.
конф. - Томск, 2001. - С.269-271.
54. Ковальчук Н.М. Подбор питательных сред и методов культивиро-
98
вания эшерихий для накопления термостабильного энтеротоксина/ Н. М. Ковальчук// Материалы Всероссийской конф. – Красноярск, 1999. – С. 10-15.
55. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология./ Колычев Н.М., Госманов Р.Г. - М.:КолосС, 2003, С.289-294.
56. Королёва, Е.А. Разработка вакцинных препаратов/Е.А. Королёва,
P.M., Зигангирова// ЖМЭИ, 2011,№6.- С. 120-125.
57. Коробов А.В. Справочник ветеринарного врача /А.В. Коробов// М.:
ООО «Аквариум-Принт», 2006. - С. 110-115.
58. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология/ А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. — СПб.: Специальная литература,
1998. – С. 558.
59. Красников Г.А. Влияние антибиотиков на органы иммунитета при
вакцинации/ Г.А. Красников, Б.Т. Стегний// Харьков: Ветеринарная медицина. - 2003. - Вып.81. - С.162-170.
60. Ломако Ю.В. Производственное испытание ассоциированной вакцины против колибактериоза и протейной инфекции телят и поросят/ Ю. В.
Ломако, Н. Н. Андросин// Вет. медицина. – Харьков, 2005. – Т. 2. – С. 685 –
687.
61. Макавчик, С.А. Колибактериоз птиц// Автореф. Канд. Вет. Наук
СПБ.-2007,- С. 19.
62. Макарова М. А. Маркеры вирулентности у штаммов E. coli/ М. А.
Макарова, Л. А. Кафтырева, Н. С. Григорьева// ЖМЭИ, 2012. - №3. – С. 27 –
29.
63. Масьянов Ю.Н. Иммунный статус крупного рогатого скота и свиней при наиболее распространенных болезнях и его коррекция: Автореф.
дисс. докт. вет. наук/Ю.Н. Масьянов// Воронеж, 2009. - С.48.
64. Матвеев К.И. Руководство по микробиологической диагностике
инфекционных болезней/К.И. Матвеев//М.: Медицина, 1973. – С. 422.
65. Медуницин Н.В. Экспериментальный комитет ВОЗ по биологической ситуации/ Н.В. Медуницин// М.: Биопрепараты,- 2008. - №1. - С.21-23.
99
66. Медуницын, Н.В. Основы иммунопрофилактики и терапии инфекционных болезней./ Н.В. Медуницын, В.И. Покровский// Учеб. Пособ.:М.:
ГЭОТАР-Медиа,2007 – С. 525.
67. Мечников И. И. Невосприимчивость к инфекционным болезням.
М., 1947. – С. 698.
68. Мешалова А. М. Теоретические основы и принципы конструирования энтеральных вакцин// М.: Медицина, 1974. – С. 145.
69. Мишагин Ю. Ф. Колибактериоз/ Ю. Ф. Мишагин// Руководство по
инфекционным болезням животных. – Ростов н/Д. – 2008. – С. 499.
70. Овчинникова Л.К. Школа фармаколога: эффективность и безопасность фторхинолонов/ Л.К. Овчинникова, Р.И. Ягудина, Е.А. Овчинникова// Российские аптеки. - 2000 - №9
71. Озерцковский Н.А. Бактерийные, сывороточные и вирусные лечебно-профилактические препараты/Н.А. Озерцковский, Г.И. Останина// СПб.:
Фолиант, 1999. – С. 470.
72. Першин Б. Б. Вакцинация и местный иммунитет// Медицина, 1990.
– С. 263.
73. Покровский В. И Медицинская микробиология/ В. И. Покровский,
О.К. Поздеев. – М.: ГОЭТАР, Медицина, 1999. – С. 170.
74. Полякова О.А. Биологические свойства патогенных эшерихий и
принципы отбора производственных штаммов/ О.А. Полякова, Н.И. Евглевская, Т.И. Исханова, 1991. – т. 56. – С. 19 – 26.
75. Рабинович М.И. Несовместимость и побочное действие лекарств,
применяемых в ветеринарии: учеб.пособие для вузов по спец.111201 «Ветеринария»/М.И. Рабинович//М.: Колос, 2006. – С. 247.
76. Радчук Н.А. Использование специфической профилактики колибактериоза птиц/ Н. А. Радчук, А. А. Бирюкова, Л. И. Рожнова// Сб. науч. тр.
ЛВН, 1992. – С. 77 – 79.
77. Радчук Н. А. Колибактериоз птиц/ Н. А. Радчук// Л.: Агропромиздат, 1991. – С. 207.
100
78. Райкис Б.Н. Общая микробиология с вирусологией и иммунологией/ Б.Н. Райкис, В.О. Пожарская, А.Н. Кадиев//М., 2002. - С. 233.
79. Рамон
Г.
40
лет
исследовательской
работы/
Г.
Рамон//
М.:Медицина, 1969. – С. 148.
80. Раскин Б.М. Проблема питательных сред на современном этапе//
ЖМЭИ. – 1998. - №6. - С.84-88.
81. Раскин Б.М. Отечественные питательные среды и перспективы их
разработки/ Б. М. Раскин, В. О. Пожарская// М., Медицина, 2007. – С. 233.
82. Рахманина И.А. К разработке специфической профилактики колибактериоза/ И. А. Рахманина, Т. А. Грошева// Тр. ВИЭВ, 1990., т. 51. – С. 102
– 105.
83. Романова
Ю.М. Бактериальные биоплёнки//ЖМЭИ, 2011,№3-
С.99-105.
84. Савов Д. Колисептицемия//Болести по птиците// София, Земиздат,1967.
85. Самуйленко А.Я. Биотехнология производства новых ветеринарных
препаратов/ А.Я. Самуйленко, В.И. Еремец, Т.А. Авдеева// Харьков: Ветеринарная медицина. - 2003. - Вып.82. - С.734-736.
86. Самуйленко А.Я. Биологические и технологические аспекты разработки и производства пробиотических препаратов// Харьков: Ветеринарная
медицина. - 2005. - Вып.85. - С.959-961.
87. Самуйленко А.Я. Перспективные направления в технологии культивирования бактерий при производстве вакцин для ветеринарной медицины/ А.Я. Самуйленко, А.А. Раевский// Харьков: Ветеринарная медицина. 2005. - Вып.85. - С.961-963.
88. Светоч Э.А., Гусев В.В. Этиология постотъемной коллидиареи свиней/Э.А. Светоч, В.В. Гусев//Ветеринария. - 2005. №12. - С. 23-26.
89. Сидоров М.А. Иммуногенные свойства токсинов эшерихий/ М.А.
Сидоров, Т.Д. Курашвили // Иммунитет сельскохозяйственных животных:
Тр. ВИЭВ. - М., 1979.-т.50.-С. 78-82.
101
90. Сидоров М.А. Колибактериоз [колиинфекция, колидиарея] новорожденных телят/ М.А. Сидоров // Итоги науки и техники. Животноводство и
ветеринария. - М., 1980. - Т.13. – С. 60.
91. Скворцов
В.Н.
Антимикробная
активность
ципрофлоксаци-
на/В.Н.Скворцов, А.А.Балбуцкая//Международный вестник ветеринарии,
2012 СПб.,№2.-С.40-42.
92. Смирнов М.А. Совершенствование средств диагностики, профилактики и лечения поросят, больных колибактериозом. Автореф. канд. дис.,
Курск – 2010. – С. 21
93. Страчунский Л.C. Антибактериальная терапия. Практическое руководство/ Л.С. Страчунский, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова// Москва, 2000. - с.
1-11.
94. Страчунский Л.С. Состояние антибиотикорезистентности в России/
Л.С.Страчунский // Клиническая фармакология и терапия. - 2000, №2. -С. 6-9.
95. Степанова Э.Д. Модификация питательных сред для выделения и
выращивания условно-патогенных микроорганизмов / Э.Д. Степанова, Р.Ю.
Юносова // Журнал микробиология, 2012, №2, С.117-119.
96. Субботин В.М. Современные лекарственные средства в ветеринарии: серия «Ветеринария и животноводство»/В.М. Субботин, С.Г. Субботина, И.Д.Александров// Ростов-на-Дону: «Феникс», 2000. - С. 359- 424.
97. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии/М.В.
Супотницкий//М.: Вузовская книга, 2002. – С. 278.
98. Терновская Л.Н. Питательная среда для выделения и культивирования бифидобактерий/ Л. Н. Терновская, Т. Э. Калиника, С. М. Суханова//
Журн. микробиол., 2011, №6. – С. 124 – 127.
99. Тец В.В. Изменение вирулентности энтеробактерий в присутствии
субингибирующих концентраций антибиотиков/ Тец В.В., НорманнЛ.Л.//
Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т.36. - №4. - С.20-22.
100.
Триполитова А.А. Бактериальные токсины и анатоксины/
А.А.Триполитова// Пособие для врачей. - Томск: Изд-во Томского универси-
102
тета, 1981. – С. 219.
101.
Торбан М.А. Механизмы обезвреживания токсинов формали-
ном// ЖМЭИ. - 1970. - №4. - С.83-86
102. Трунов А.И. Динамические взаимодействия между показателями
иммунной системы// Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России. - Новосибирск, 2002. - С.484-488.
103. Тулина Н.В. Наставление по применению тулина в качестве иммуностимулирующего средства/ Н.В. Тулина// Утверждено Департаментом
Ветеринарии 11 сентября 2000г.-№13; 5-2/2140.
104. Урбан В.П. Проблемы ветеринарной иммунологии/В.П. Урбан//М.: Агропромиздат, 1985. – С. 286.
105. Урбан В. П. Болезни молодняка/ В. П. Урбан// М.: Колос, 1984. –
С. 243.
106. Ушкалова Е. Значение лекарственных форм для рациональной
антибиотикотерапии. Лекарственная форма Солютаб/ Ушкалова Е.//Врач. 2007. - №3. С. 63-66.
107. Федоров Ю.Н. Иммунопрофилактика болезней новорожденных
телят// Ветеринария. - 1996. -№11.- С.3-6.
108. Федоров Ю.Н. Иммунокоррекция: применение и механизмы действия иммуностимулирующих препаратов// Ветеринария. - 2005. - №1.- С.3-6.
109. Федосеева В.Н. Бактериальные вакцины в лечении инфекционных заболеваний//М.: Биопрепараты.-2006. - №4[24]. - С. 16-19.
110. Хаитов P.M. Современные представления о защите организма от
инфекций/P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин// Иммунология. - 2001. - №1 - С.61-66.
111. Хаитов Р.М. Иммунная система и ее особенности строения и
функционирования в норме и патологии/ P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин// Иммунология. - 2007. - №5. - С.4-7.
112. Харитонов JI.B. Биологическая эффективность пробиотика на основе молочно-кислых бактерий для телят/ Л.B. Харитонов, В.А. Обрывков//
Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных жив-
103
х.: Тез.докл. Междунар. конф. - Боровск, 1990. - Ч.1. - С.55-56.
113. Хитрова А.Е., Сергеев В.А., Алипер Т.И. Эффективность применения комбинированных вакцин серии комбовак/ А.Е. Хитрова, В.А. Сергеев,
Т.И. Алипер // Ветеринария.-2007. №7.-С. 17-18.
114. Челноков В. А. Физиологический статус телят после применения
микрокапсульного препарата, включающего пробиотик и селен. Автореф.
канд. дис., Курск, 2013. – С. 21.
115. Червинец В.М. Изменчивость эшерихий в условиях экспериментального моделирования флюктуаций геомагнитного поля//Влияние магнитных полей на биологические объекты: Материалы 3-го всесоюзного симпозиума - Калининград, 1975. -С. 54.
116. Червинец В.М., Изменчивость эшерихий в условиях геомагнитного поля. // Влияние магнитных полей на биологические объекты: Материалы Всесоюзного симпозиума - Калининград, 1990. - С.54-60.
117. Червинец В.М., Антибактериальная активность серебряного геля/В.М. Червинец, В.М. Бондаренко//ЖМЭИ,2011,№4. -С.88-92.
118. Чернощеков К.А. Метод изучения геомагнитного поля на жизнедеятельность
микроорганизмов
кишечной
группы/К.А.
Черноще-
ков//ЖМЭИ - 1999.- №9.-С. 82-85.
119. Чернощеков К.А. Метод изучения геомагнитного поля на жизнедеятельность микроорганизмов кишечной группы/ К.А. Чернощеков//ЖМЭИ,
2003. - №3. – С. 82 – 85.
120. Чижевский А. Л. Вся жизнь/ А. Л. Чижевский// М., Сов. Россия,
1974. – С. 207.
121. Чижевский А. Л. Эхо солнечных бурь/ А. Л. Чижевский// М.:
Мысль, 1976. – С. 376.
122. Чуприна Р.П. Сравнительная характеристика отечественных и зарубежных вакцин// М.: Биопрепараты,- 2006. - №4[24]. - С.27-28.
123. Шапиро Н.И.
К обоснованию теории детоксикации экзоток-
синов/Н.И. Шапиро, И.В. Москвичева//Труды Московской ИВС.-1973.- №6.-
104
С. 18-30.
124. 122 Шапиро Н.И. Микроорганизмы, вирусы, бактерии и грибы/Н.И. Шапиро//СПб.: Элби-СПб, 2003.-С. 324.
125. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и
респираторных болезней телят и поросят // Ветеринарный консультант. —
№1.-. 2003.-С. 11-13.
126. Шахов А.Г. Применение иммуномодуляторов при вакцинации
животных против сальмонеллеза/ А.Г. Шахов, Ю.Н. Масьянов, Ю.Н. Бригадиров// Ветеринария. - 2006. - №6. - С.21 -26.
127. Шевелева М.А. Применение пробиотиков при антибиотикотерапии// Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т.54. - №3-4. - С.61-70.
128. Шепилова Р.Г. К вопросу оценки диагностической эффективности питательных сред/ Р.Г. Шепилова, Л. А. Нефедова// Стандарты, штаммы
и методы контроля биопрепаратов, М., 1996. – С. 136 – 143.
129. Abrahamson D.R., Rodewald R. Evidence for the sorting of endocytic
vesicle conents during the receptor - mediated transport of IgG across the newborn
rat intestine// J. Cell. Biol. - 1999. - V. 91. - P. 270 - 280.
130. Actan H. Characterisation of attaching-effacing Escherichia coli isolated from animals at slaughter in England and Wales // Veterinary Microbiology.
- 2004. - Vol. 102. - № 1/2. - P. 43 - 53.
131. Anderson J. IgM in bone marrow derived lymphocytes Synthesis surface deposition turnover and carbohydrate composition in stimulated mouse В cell
// Evr. J. Ivvunol. - 1994. - V. 4. - P. 170 - 180.
132. Axselsson L.T., Chung T. C., Dobrogosz W., Lindgren S. // Microbiol. Ecol. Hith Dis. – 1989. Vol. 2. – P. 131 – 236.
133. Bachmann P. A. Viral gastroenteritis in calves cause and prevention //
Mod. vet. pract. – 1983. – Vol. 64, N 7. – P. 559 – 565.
134. Barrington G. M., BesserТ. Е.,Lavis W.C. e. a. Expression of immunoglobulin G1 receptors in bovine mammary epithelial cells and mammary ltukocytes// J. Dairy Sci. - 1997. - V. 80. - P. 86 - 93.
105
135. Barna I., Balauca I.V. Sindromulimmunodeficatar dab indit la animale. I. I. encozele bovine. Lucr. J. /Inct. Agron. Fac. Med. Veter., Cluj - Napoca,
1999.-VoI.17 -P. 131 - 146.
136. Baster A. A receptor for antibody on В lymphocytes. II. Immunochemical and electron microscopy characteristics // J. Exp. Med. - 1992. - V. 135. P. 627 - 642.
137. BesserТ. Е., Gay C. C., Szenci O. Decreased colostral immunoglobulin absorption in calves with postnatal respiratory acidosis // J. Am. Med Assoe. 1999. - Vol. 196 – N 8. - P. 1247 - 1249.
138. BesserТ. Е.,Szenci O. Decreased colostral immunoglobulin absorption
in calves with postnatal respiratory acidosis // J. Am. Vet. Med. Assoc. - 1999. - V.
196. -P. 1239 - 1443.
139. Bianchi A.T. Development of the B- and T-cell comportments in porcine lymphoid organs from birth to adulat life: an immunohistological approach //
Vet. Immunol. Immunopathol. - 1992. - V. 33. - P. 201 -202.
140. Binns R.M., Licence S.N. Patterns of migration of labelledblod lymphocyte subpopulations: evidence for two types of Peyers patch in the young pig //
Adv. Exp. Med. Biol. - 1995. - V. 186. - P. 661 - 668.
141. Booher, S. L. Persistence of Escherichia coli 0157 : H7 in experimentally infected swine / S. L. Booher, N.A. Cornick, H.W. Moon // Veterinary Microbiology. - 2002. - Vol. 89. - № 1. - P. 69 - 81.
142. Bortolussi H., Hewlett S., Rajaraman K. Deficient priming activity of
newborn cord blood - derived polymorphonuclearneutrophilicgranulocutes with
einopolvsaccha ride and tumor necrosis factor-L triggered with formyl-metnionulleucyl-phenilalanine. // Pediatr. Res. - 1993. - V. 34. - № 3. - P. 243 - 248.
143. Bourne F. J., Curtis J. The transfer of immunoglobulinsIgG IgA and
IgM from serum to colostrum and milk in the sow // Immunol. - 1993. - V. 24. -P.
157 - 162.
144. Bowman E. P. The intestinal chemokine thymus-expressed chemokine
[CCL25] attracts IgA antibody-secreting cells // J. Exp. Med. - 2002. - V. 195. -P.
106
269 - 275.
145. Brandon M. R., Watson D. L., Lascelles A. K. The mechanism of
transfer of immunoglobulin into mammary secretion of cows// Aust. J. Biol. Med.
Sci. – 1999. -V. 49. - P. 613 - 623.
146. Brandzaeg P. Role of secretory antibodies in the defence against infection // Int. J. Med. Microbiol. - 2003. - V. 293. - P. 3 - 15.
147. Brandzaeg P. The B-cell system of human mucosae and exocrine
glands // Immunol. Rev. - 1999. - V. 171. - P. 45 - 87.
148. Brenner D.L. Opposition to the proposal to the family name Enterobacteriaceae // Int. J. System. Bad. 1983. Vol. 33. № 4. P. 892 - 895.
149. deBrito B. G., Gaziri L. C. J., Vidotto M. C. Virulence factors and
clonal relationships among E. coli strains isolated from broiler chickens with cellulitis. Inf. &Immun, 2003, 71, 7, 4175 - 4177.
150. Brown K. M., Arthur J. R. Selenium selenoproteins and human health
// Publik. Health. Nutz. – 2009. - 4 [2B]. - P. 593 - 599.
151. Brown W.R., Kloppel T.M. The liver and IgA: immunological, cell
biological and clinical implications // Hepatology. - 1999. - V. 9. - P. 763 - 784.
152. BrownW.R., Kloppel T.M. The role of the liver in translocation of
IgA into the gastrointestinal tract // Immunol. Invest. - 1999. - V. 18. - P. 269 285.
153. Butler J. E. Comparative quantitation of bovine serum IgG1 , IgG2,
IgA and IgM antibodies using the amplified enzymelinkedimmunosorbent assay [a
– ELISA] / Am. J. Vet. Res. – 1999. – V. 41. P. 1479 – 1491.
154. Chevillo N.F. Interaction of blood-borac Escherichia coli with phagocytes of spleen and liver of turkeys //Am. J. Vet. Res. 1998. V. 43: 1030 – 1040.
155. Colibacilosis. In H.G. Purchase. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification ot Avian Pathogenes, 1989, 3rd ed. American Association
of Avian Patnologists. Kennet Square. PA. P. 12 – 13.
156. Derfrancisca R. Antimicrobial resistance of commensal Escherichia
coli from dairy cattle associated with recent multi-resistant salmonellosis outbreaks
107
// Veterinary Microbiology. - 2004. - Vol. 98. -№ 1. - P. 55 - 61.
157. Dijk, A. J. The effect of dietary spray-dried porcine plasma on clinical
response in weaned piglets challenged with a pathogenic Escherichia coli /
A.J.vanDijk, P. M. M. Enthoven, S. G. C.van der Hoven, et al. // Veterinary Microbiology. - 2002. - Vol. 84. - iss 3. - P. 207 - 218.
158. Dho M.
Adhesive properties and iron uptake ability in Escherichia
coli lethal and nonlethal for chichs // Avian Dis. 1994. 28: 1016 - 1025.
159. Dho M. Escherichia coli colonization of the trachea in poultry: Comparison of virulent and avirulent strains in gnotogenic chickens// Avian Dis. 1998.
26: 787 – 797.
160. Dimitrova A. Comparative study of «Bioxan-emulsum» in suckling
pigs for prophylaxis of bacterial enteritis / A. Dimitrova, R. Bankova, S.
Yordanov, et al. // Год. Софийскийунив. «Св. КлиментОхридский», Биол. фак.
- 2005. - Р. 411 - 417.
161. Dosois C.M. Bacterial colonization and in viva expression of FI [type
I] fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli / C.M. Dosois , N. Chanteloup, M. Dho-Moulin, A. Bree, C. Desautels and
J.M. Fairbrother // Avian Dis. 1994. 38: 231 - 239.
162. Ederman R. Summary of works hop on Enteropathogenic E. coli /
Ederman R., Levine M. // J. of Infect. Diseases. - 1993.-V. 7. - № 6. - P. 1108 1118.
163. Evans D.J. Hemagglutination pattern of enterotoxic and enterotoxigenic E. coli determined with human bovine children and guinea pig erythrocytes
in the presenct and absens of mannose / Evans D.J., Evans D.G., Duport H.L. // J.
Inf. Immun. - 1999. - V.23. - № 2. - P. 336 - 376.
164. Fujioka H. Immunocytochemicalcolocalization of specific immunoglobulin A with sendaivtrus protein in infected polarized epithelium // J. Exp. Med.
– 1998. - V. 188. -P. 1223 - 1229.
165. Gaastra W., deGraaf F.K. Host specific fimbrial adhesions in noninvasive enterotoxigenic E. coli strains // Microbiol. Rev. 1982. Vol. 46. .№ 2. P.
108
129 – 161.
166. Casali P., Sehttino E.W. Structure and function of antibodies.// Carr.
Top. Microbiol. &Immunol. - 1996. - V. 210. - P. 167 - 179.
167. Georgieva R. Dynamics of T-suppressor and T-helper lymphocytes
plaqueforming cells during normal pregnancy in the sow // I. Reprod. Immunol. –
1994. - V. 6. - P. 151 - 156.
168. Ginns C.A., Browning G.F., Benham M.L., Whithear K.G.
Devel¬opment and application of aerosol challenge method for reproduction of
avian colibacilosis. Avian Pathol, 1998, 27, 505 - 511.
169. Gutzwiller A. Effect of colostrums intake on diarrhea in cadence in
new-born calves / A. Gutzwiller // Schweiz. Arch. Tierheilkd. — 2002. — Vol.
144. № 2/ - P. 654 – 656.
170. Cyles C. L. A heat-labile enterotoxin from strains of E. coil enteropatogenic for pig/ Gyles C.L., Barnum D.A. //J. Infect. Dis. — 1969. — № 120. — P.
419 – 426.
171. Gyles C.L. Naturally occurring plasmid carring genes for enterotoxin
production and drug resistance / Gyles C.L. // Science. — 1977. — V.198. — №
4313. — P.198 - 199.
172. Gyles C.L. The enterotoxins plasmids of
E. coli/ Gyies C. L.,
Falkows S., So M. // J. Infect. Dis. — 1974. — V.130. — № 1. — P. 40 - 49.
173. Hall G.A. Comparision in gnotobiotic pigs of lesions by verotoxigenic
and non-verotoxigenie E. coli// Hall G. A., Chanter N., Bland A. P. // Vet. pathol.
— 1988. - №3. - P.205 - 210.
174. Hall G. A. Dysentery caused by E, coli [S. - 102 - 9] in calves: natural
and experimental disease/ Hall G.A., Reynolds D. J., Chanter N. et al. // Vet.
Pathol. – 1985. - V. 22. - № 2. - P. 156 – 163.
175. Hosband A. I. Veterinary Immunology // N. V. 1998. – P. 357 – 365.
176. Kato I., Endo-Tanka K., Yokokura T. Suppressive effects of the oral
administration of Lactobacillus casei on type 2 collagen induced arthritis in DBA
mice //Life Sci. - 1998. -Vol. 63. - N. 8. - P. 635 - 644.
109
177. Konffman F. The bacteriology of Enterobacteriaceae / Kopengagen:
Munksgoard. 1976. – 273 P.
178. Kummar A. Occurrence of enterogenicenterotoxigenic E. coli in cow,
calves and infant children/ Kummar A., Sharma V., Thapliyal D. // Indian J. Соmр.
Microbiol. Infect. Dis. - 1982. - V.3.- № 3. - P. 174 - 177.
179. Liar H. Classification of Escherichia coli // In C. L. Gyles ted. Escherichia coli in Domestic Animals and Humans. CAB Intl. Wallingford. United
Kingdom, 1994.
180. Lobb R.R. Integrin-immunoglobulin superfamily interactions in endothelial leukocyte adhesion. Adhesion: It’s Role in Inflammatory Diesease // Eds. J.
M. Harlan, D.Y. Liu. - W.H. Freeman. - New York. - 1992.
181. Lopes B.M. Yersinia enterocolitica: production de toxinathermostablecomoindencepatogenicidad / Lopes B.M., Jimennes M.L., Gomez C.M. // Rev.
saindehig. Publica. - 1991. - V. 55. - № 7 - 8. - P. 795 - 802.
182. Macpherson A. Mucosal antibodies in inflammatory bowel disease are
directed against intestinal bacteria //Gut. - 1996. -V. 38. - P. 365 - 375.
183. Maruoka T. Identification of the rat IgA Fc receptor encoptor in the
ieukocyte receptor complex // Immunogentics. — 2004. — V. 55. — P. 712-716.
184. Matsuzaki T., Chin J. Modulating immune response with probiotic
bacteria // Immunol. Cell Biol. — 2000. — Vol. 78, N I. —P. 670 - 673.
185. Mazanec M.B. Intracellular neutralization of influenza virus by immunoglobulin A anti-hemagglutininmonpclonal antibodies// J. Virol.— 1995.— V.
69. - P. 1339 -1343.
186. Melamed D., Leitner G. and Heller E. D. A vaccine against avian
colibacillosisbaced on ultrasonic inactivation of Escherichia coli // Avian Dis.
1991. 35: 17 – 22.
187. Mellata M. Dho-Moulin M., Dosois C.M. et al. Rose of virulence factors in resistance of avian pathogenic E. coli to serum and in pathogenic¬ity.
Inf&Immun, 2003, 71, 1, 536 - 540.
188. Nagy B. Azenteropathogen E. coil torzsekvirulenciafactorainakmutasa
110
a borjakhasmenesemk diagnostic kajban/ Nagy B., Nagy G. // Magyar allator. Lapja. - 1992. — V. 37. — № 8. — P. 512 -517.
189. Nagy B. Pathogenese der enteralin E. coli infection beinewgenorenenFerkeln und Kalbern/ Nagy B. , Moon H.W. , Isaacson R.E. // Whien.
Tier. March. — 1999. — B. 66. — № 1. — P. 15 - 19.
190. Neurnann E., Oliviera M.A., Cabral C.M. et. al. Monoassociationvith
Lactobacillus acidophilus UFV-H2b20 simulates the immune defense mechanisms
of germfree mice // Braz. J. Med. Biol. Res. — 1998. — Vol. 31, N 12. - P. 1565 1573
191. Provence D. L., Curtiss R. Isolation and characterization of a gene involved in hemagglutination by an avian pathogenic E. coli strain. InfImmun, 1994,
62, 1369 -1380.
192. Rampen C., Mallard B. A. Effect of peripartum stress and healton circulating bovine lymphocyte subsets // Vet. Immunol. Immunopath. — 1997. — V.
59. – P.79 – 91.
193. Sieckmann D.G. The use of anti-immunoglobulins to induce a signal
for cell division in B lymphocytes via their membrane IgM and IgD // Immunol.
Rev. - 1980.-V. 52.-P. 55.
194. Smeaton T.C. Ehithelial cell renewal and antibody transfer in the intestine of the fetal and neonatal lamb // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. -1995. - V.
63. - P. 41-51.
195. Smith E.M. Lymphocyte production of
endorphins
and
endor-
phinmediatedimmunoregulatory activity // J. Immunol. - 1995. - V. 135. - P. 779 782.
196. Snoeck V. The IgA system: a comparison of structure and function in
different species // Vet. Res. - 2006. - V. 37. - P. 455 - 467.
197. Springer W., Luskus C. Infectious bronchitis and mixed infections
of Mycoplasma synoviae and Escherichia coli in gnotobiotic chickens. I. Synergistic role in the airsacculitissvndrome// Infect Immum. – 1994. 10: 578 – 589.
198. Veda J. Etiological studies on enterotoxigenic E. coli among isong
111
isolates from domestic animals in Japan/ J. Veda, N. Taracodoet. al // Nat. Inat.
Anim. Health Quart. — 1999. — V. 21. — №2. - P.108 -109.
199. Watkins D. A., Miller B. F., Neil D. H. In vivo inhibitory effects of
Lactobacillus acidophillus against pathogenic Escherichia coli in gnotobiotic
chicks // Poultry Scienc, 1992. N 61. P. 1298-1308.
200. Weinack O. M., Snoeyenbos G. H., Smyser C. E and Soerjadi A. S.
Competitive exclusion of intestinal colonization of Escherichia coli in chicks
//Avian Dis. 1994. 25: 696 – 705.
201. Weaver D.M. Passive transfer of colostralimmunoglobulins in calves//
J. Vet. Int. Med. - 2009. - V. 14. - P. 469-577.
202. White D. G., Dho-Moulm M., Wilson R. A. and Whittam T, S. Clonal
relationships and variation in virulence among Escherichia coli strains of avian
origin //MicrobPathog. 1993. 14: 399-09.
203. Williams P.P. Immunomodulating effect of intestinal absorbed maternal colostral lymphocytes by neonatal pigs// Can.Vet. Res. - 1993. - V. 58. - P. 1-8.
204. Wilson M.R., Svendsen J. Immunity to Escherichia coli in pigs: The
role of milk in protective immunity to E. coli enteritis// Can. J. Comp. Med. 1999. - V. 35.-P. 239-243.
205. Wooley R.E., Nolan L.K., Brown J., Gibs P.S., Giddings C.W. and
Turner K.S. Association of K-l capsule smooth lipopolysaccaharidestraT gene, and
colicin V prodaction with complement resistance and virulence of avian Escherihia
coli// Avian Dis. 1993.37: 1092-1096.
206. Wooley R. E., Nolan L. K., Brown J., Gibbs P. S. and Bounous O. IPhenotypic expression of recombinant plasmids pKTI07 and pHKIl in an avirulent
avian Escherichia coli//Avian Dis. 1994. 38: 127-134.
207. Wooley R. E., Spears K. R., Brown J., Nolan L. K. and Dekich M. A.
Characteristics of conjugative R-plasmids from pathogenic avian Escherichia coli
//Avian Dis. 1992. 36: 348-352.
208. Wooley R. E., Spears K. R., Brown J., Nolan L. K. and Fletcher O. J.
Relationship of complement resistance and selected virulence factors in pathogenic
112
avian Escherichia coli// Avian Dis. 1992. 36: 679-684.
209. Wooley R. E., Nolan L. K., Brown J., Gibbs P. S., Giddings C. W. and
Turner K. S. Association of K-I capsule smooth lipopolysaccharides, traT gene,
and colicin V production with complement resistance and virulence of avian
Escherichia coli//Avian Dis. 1993. 37: L092-1096.
210. Wooley R. E., Brown J., Gibbs P. S., Nolan L. K. and Turner K. R.
Effect of normal intestinal flora of chickens on colonization by virulent colicin Vproducing, avirulent and mutant colicin V-producing avian
Escherichia coli
//Avian Dis. 1994. 38: 141-145.
211. Wray C. Laboratory diagnosis of Escherichia coli infections// In Escherihia coli in Domestic Animals and Humans [Ed. C. L. Gyles], CAB International,
Wallingford Oxen. 1994. P. 596 - 628.
212. Wray C. and Woodward M. J. Laboratory diagnosis of Escherichia
coli infections // In Escherichia coli in Domestic Animals and Humans [Ed. C L
Gyles], CAB International, Wallingford Oxen. 1994. P. 595-628.
213. Yerushalmi Z., Smorodinsky N. I., Naveh M. W. and Ron E. Z. Adherence pill of avian strains of Escherichia coli 078 // Infect Immun. 1990. 58:
1129 – 1131.
113
ПРИЛОЖЕНИЯ
Скачать