отчет - Центр защиты леса Воронежской области

МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
ФИЛИАЛ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ
«РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ ЛЕСА»
«ЦЕНТР ЗАЩИТЫ ЛЕСА КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ»
УТВЕРЖДАЮ
И.о. директора Филиала ФБУ «Рослесозащита»
«Центр защиты леса Красноярского края»
______________ В.Г. Разнобарский
“14” ноября 2014 г.
ОТЧЕТ
о выполнении НИР по Договору № 4/гн от «17» октября 2014 г.
с Федеральным государственным бюджетным учреждением «Новосибирская
межобластная ветеринарная лаборатория»
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСЫ НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА
МЕТОДАМИ РЕСТРИКЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК
И АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР
Ответственный исполнитель
начальник отдела лесной генетики
Красноярск 2014
Е.А. Шилкина
1. Объекты и цель работы
Объектами исследований были образцы особей непарного шелкопряда
Lymantria dispar (имаго и яйцекладки), предоставленные для генетического
анализа ФГБУ «Новосибирская межобластная ветеринарная лаборатория» в
Филиал ФБУ «Рослесозащита» «Центр защиты леса Красноярского края»
посредством почтовой пересылки.
Образцы поступили в высушенном виде, упакованными в
маркированные пробирки с резьбовой крышкой, в общем количестве – 32
штуки. Место и время отбора, согласно сопроводительной записке к
образцам, указаны в таблице 1.
Таблица 1
Маркировка на
пробирке с
биологическим
материалом
(образцом)
Присвоенная
маркировка
Тип образца
Пробирка №505
Н-1
имаго
Пробирка №505
Н-2
имаго
Пробирка №506
Н-3
имаго
Пробирка №506
Н-4
имаго
Пробирка №507
Н-5
имаго
Пробирка №507
Н-6
имаго
Пробирка №508
Н-7
имаго
Пробирка №508
Н-8
имаго
Пробирка №509
Н-9
имаго
Пробирка №509
Н-10
имаго
Пробирка №511
Н-11
имаго
Пробирка №511
Н-12
имаго
Пробирка №522
Н-13
имаго
Пробирка №522
Н-14
имаго
Пробирка №474
Н-15
яйцекладка
Место сбора
образца
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Новосибирская
область
Дата сбора
образца
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Пробирка №474
Н-16
яйцекладка
Пробирка №1
Т-1
имаго
Пробирка №2
Т-2
имаго
Пробирка №3
Т-3
имаго
Пробирка №4
Т-4
имаго
Пробирка №5
Т-5
имаго
Пробирка №6
Т-6
имаго
Пробирка №7
Т-7
имаго
Пробирка №8
Т-8
имаго
Пробирка №9
Т-9
имаго
Пробирка №10
Т-10
имаго
Пробирка №11
Т-11
имаго
Пробирка №12
Т-12
имаго
Пробирка №13
Т-13
имаго
Пробирка №14
Т-14
имаго
Пробирка №15
Т-15
имаго
Пробирка №16
Т-16
имаго
Новосибирская
область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Тюменская область
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Август 2014 г.
Цель работы – определение расы непарного шелкопряда на основе
генетического анализа, поскольку их фенотипическое различие является
зачастую затруднительным или невозможным. Работа имеет практическую
значимость, так как азиатская раса непарного шелкопряда является
карантинным объектом.
2. Методика генетических исследований
2.1.
Подготовка образцов и выделение ДНК
Для анализа головогрудь имаго или яйцекладки растирали в буфере с
рН 8,0 (2% бромид цетрилтриметиламмония (СТАВ), 0,1 М трис, 1,4 М
хлорид натрия, 20 мМ ЭДТА натриевая соль). ДНК выделяли СТАВ-методом
[2]. Очистку от белков производили хлороформом, для осаждения ДНК из
раствора использовали изопропиловый спирт, осадок ДНК троекратно
отмывали 70% этиловым спиртом. После высушивания полученный осадок
ДНК растворяли в 50 мкл деионизированной воды. Раствор ДНК
использовали для дальнейшего анализа.
2.2.
Метод рестрикционного анализа митохондриальной ДНК
Метод основан на определении мутации митохондриального гена COI
непарного шелкопряда, отвечающего за синтез фермента цитохром С
оксидазы.
Современные электронные генетические базы данных, открытые для
прямого доступа, содержат информацию по секвенированию данного гена в
различных популяциях непарного шелкопряда [1].
В нуклеотидной позиции 196, относительно начала региона Фолмера
выявлен полиморфный вариант A196G, представленный в 98% популяций
азиатской расы. В тоже время у всех депонированных образцов европейской
расы в 196 положении был выявлен нуклеотид А. То есть в исследуемом
участке у азиатской расы аденин (А) заменен на гуанин (G).
Исходя из этого, SNP A196G может быть использован как генетический
маркер для определения рас L. dispar с помощью технологии
рестрикционного анализа ампликонов – ПЦР-ПДРФ.
В качестве рестриктирующей эндонуклеазы может быть использован
фермент
TaqI
(сайт
рестрикции
TCGA).
Рестриктаза
режет
последовательность ДНК TCGA только между G и A и не режет
последовательность TCGG. В результате получаются либо два ампликона
(европейская раса), либо один (азиатская раса). То есть ампликон,
характерный для европейской расы, будет подвержен рестрикции, в то же
время «азиатский» вариант останется в нативной форме.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 2 раунда. ПЦРсмесь для обоих этапов была основана на применении коммерческого набора
ПЦР-смесь 2-bluе (ООО «ЕВРОЛАБ», РФ).
1
раунд:
амплификация
с
праймерами,
LdF
–
ATTCAACCAATCATAAAGATATTG
и
LdR
–
TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA, позволяющими амплифицировать
регион COI гена размером 709 пар нуклеотидов (п.н.). Полученный ампликон
гена (фото 1) разводили деионизированной водой в 1000 раз и использовали
для второго раунда ПЦР.
М
709
Фото 1. Электрофореграмма ампликона фрагмента COI гена после 1
раунда ПЦР (праймеры LdF и LdR). 709 – количество пар нуклеотидов в
ампликоне, М – маркер молекулярного веса (сверху вниз) 1000, 900, 800, 700,
600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50 п.н. Горизонтальный электрофорез,
агароза 1,5%.
2 раунд: амплификация с мисматч-праймерами оригинальной
структуры, missF – ATTGGAGGATTTGGTAATCG и missR –
ACAGTTCATCCTGTTCCTG, позволяющими амплифицировать регион COI
гена размером 161 п.н. Электрофореграмма ПЦР-продукта второго этапа
представлена на фото 2.
М
161
Фото 2. Электрофореграмма ампликона фрагмента COI гена с мутацией
после 2 раунда ПЦР (праймеры missF и missR). 161 – количество пар
нуклеотидов в ампликоне, М – маркер молекулярного веса (сверху вниз)
1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50 п.н.
Горизонтальный электрофорез, агароза 1,5%.
Полученный ампликон 161 п.н. резали рестриктазой Tag 1 (Thermo
scientific). Рестрикционный анализ проводили согласно протоколу
производителя. После рестрикции проводили электрофорез в 2% агарозном
геле параллельно с исходным ампликоном. Визуализацию производили
окрашиванием фрагментов ДНК в 0,02% растворе бромистого этидия.
Съемка сделана с помощью монохромной видеокамеры. Фотографии
представлены в виде негатива.
Определение происходит следующим образом:
Европейская раса – от исходного ампликона рестриктаза отрезает 18
п.н. и появляется ампликон длиной 143 п.н., что хорошо видно на
электрофореграмме. Ампликон 18 п.н. очень легкий, двигается с фронтом и
виден не всегда.
Азиатская раса – участок с мутацией для работы рестриктазы не
доступен, поэтому на электрофореграмме и до, и после рестрикции
присутствует только ампликон 161 п.н. (фото 3).
Методика разработана Институтом леса НАН Беларуси и апробирована
Российским центром защиты леса на 976 образцах насекомых из 27 тестовых
участков 9 регионов РФ [3, 4].
М
М
161
143
1
2
161
1
2
Фото 3. Слева электрофореграмма Европейской (западной) расы
непарного шелкопряда, справа – азиатской (восточной) расы. 1 - образец
ДНК до рестрикции; 2 - образец ДНК после рестрикции; М - маркер
молекулярного веса (сверху вниз) 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250,
200, 150, 100, 50 п.н.; 143 и 161 – ампликоны с указанным молекулярным
весом (п.н). Горизонтальный электрофорез, агароза 1,5%.
2.3.
Метод аллель-специфичной полимеразной цепной реакции
Вследствие того, что оригинальная нуклеотидная последовательность
(в районе 196 позиции) для азиатской расы содержит G (гуанин), а для
европейской расы содержит А (аденин), были подобраны доминантные
аллель
специфические
праймеры,
способные
различать
L.
dispardispar f. Asiaticaот
L.
dispardispar f. Europe.
Праймеры
были
оптимизированы таким образом, чтобы можно было определить
Европейскую
расу
в
одну
стадию
ПЦР
(missF-endA
ATTGGAGGATTTGGTAATCGA,
missF-endG
ATTGGAGGATTTGGTAATCGG,
missR-HRM
-
gtaataatcaAAATCttataTTATTTATAC). Образцы, показывающие отсутствие
ПЦР продукта, подвергают проверке на наличие Азиатского аллеля.
Европейская раса – определяется по наличию ПЦР продукта при
амплификации с праймерами missF-endA и missR-HRM.
Азиатская раса – определяется по отсутствию ПЦР продукта при
амплификации с праймерами missF-endA и missR-HRM и наличии продукта
при амплификации с праймерами missF-endG и missR-HRM. Отсутствие
продукта ПЦР с обоими наборами праймеров говорит об отсутствии
подходящей матрицы в образце ДНК или о плохом ее качестве.
3. Результаты и обсуждение
Исследовано 32 образца особей непарного шелкопряда Lymantria dispar
(имаго, яйцекладки) методом рестрикционного анализа и аллельспецифичной полимеразной цепной реакции. В ходе проделанной работы
получены следующие электрофореграммы (фото 4-6), заключительные
результаты представлены в таблице 2.
1
1*
2
2*
3
3*
4
4*
М
5
5*
6
6*
7
7*
8
8*
9
9*
10
10*
11
11*
12
12*
М
13
13*
14
14*
15
15*
16
16*
Фото 4. Электрофореграммы распределения фрагментов гена COI до и
после рестрикции в образцах 1-16 Тюменской области (ампликоны после
рестрикции обозначены добавлением к номеру образца знака «*»). М –
маркер молекулярного веса. Все образцы принадлежат европейской расе
непарного шелкопряда.
1
1*
2
2*
3
3*
4
4*
М
5
5*
6
6*
7
7*
8
М
16
8*
9
9*
10
10*
11
11*
М
12
12*
13
13*
14
14*
15
15*
16*
Фото 5. Электрофореграммы распределения фрагментов гена
COI до и после рестрикции в образцах 1-16 Новосибирской
области (ампликоны после рестрикции обозначены
добавлением к номеру образца знака «*»). М – маркер
молекулярного веса. Все образцы принадлежат европейской
расе непарного шелкопряда.
Фото 6. Электрофореграммы ампликонов образцов особей непарного
шелкопряда. Справа – наличие ПЦР-продукта при амплификации с
праймерами missF-endA и missR-HRM (характерно европейской расе). Слева
– отсутствие ПЦР продукта при амплификации с праймерами missF-endG и
missR-HRM (характерно европейской расе).
Таблица 2
Результаты определения расы непарного шелкопряда
исследованных образцов.
Маркировка на
пробирке с
биологическим
материалом
(образцом)
Присвоенная
маркировка
Тип образца
Пробирка №505
Н-1
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №505
Н-2
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №506
Н-3
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Место сбора образца
Раса непарного
шелкопряда
Пробирка №506
Н-4
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №507
Н-5
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №507
Н-6
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №508
Н-7
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №508
Н-8
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №509
Н-9
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №509
Н-10
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №511
Н-11
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №511
Н-12
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №522
Н-13
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №522
Н-14
имаго
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №474
Н-15
яйцекладка
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №474
Н-16
яйцекладка
Новосибирская
область
Европейская
Пробирка №1
Т-1
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №2
Т-2
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №3
Т-3
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №4
Т-4
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №5
Т-5
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №6
Т-6
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №7
Т-7
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №8
Т-8
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №9
Т-9
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №10
Т-10
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №11
Т-11
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №12
Т-12
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №13
Т-13
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №14
Т-14
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №15
Т-15
имаго
Тюменская область
Европейская
Пробирка №16
Т-16
имаго
Тюменская область
Европейская
Таким образом, в ходе анализа двумя методами установлено, что все
исследуемые образцы
принадлежат европейской расе непарного
шелкопряда.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Электронная база данных секвенирования митохондриального гена синтеза
цитохром С оксидазы (электронные ресурсы). Сайт:
http://phylota.net/cgi-in/sql_getcluster.cgi?ti=13122&cl=9&ntype=1&db=184
2.
Падутов, В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В.Е.
Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. – Мн.: Юнипол, 2007. – 176 с.
3.
Шишкина О.К., Завистяева М.А. Баранов О.Ю. Установление расовой
принадлежности непарного шелкопряда (Lymantria dispar) на основании
ПЦР-ПДРФ анализа гена субъединицы 1 цитохром-С-оксидазы
/
Современное состояние и перспективы охраны и защиты лесов в системе
устойчивого развития: материалы международной научно-практической
конференции, Гомель, 09-11 октября 2013 г. / Институт леса НАН Беларуси,
2013. С. 148-151.