Санкт-Петербургское Государственное Бюджетное Учреждение Здравоохранения Городской противотуберкулезный диспансер АЛГОРИТМ ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ В СИСТЕМЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ПОМОЩИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА 2014г. 1 «АЛГОРИТМ ЭТИОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ В СИСТЕМЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ПОМОЩИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА» Под редакцией заведующего кафедрой фтизиопульмонологии и торакальной хирургии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный университет им. И.И. Мечникова Министерства здравоохранения России» А.В. Елькина, профессор, д.м.н. Разработка рациональной схемы обследования пациентов, проходящих лечение от туберкулёза, позволяет не только улучшить эффективность диагностики и лечения больных но и сократить число анализов, не дающих никакой дополнительной информации лечащему врачу, уменьшить нерациональные экономические расходы в бюджетной сфере городского здравоохранения. Данные методические рекомендации предназначены для руководителей противотуберкулезных учреждений и учреждений общей лечебной сети, а также фтизиатров, инфекционистов. Коллектив авторов: В.Ф.Жемков, профессор, д.м.н.; Н.Г. Матвеева; Л.Р. Шпаковскаяк.м.н; К.В. Шалыгин, к.м.н. 2 Оглавление Методология Методика валидизации исследований 6 7 7 Выявление микобактерий туберкулеза 7 7 Методы микроскопического исследования (из осадка) Молекулярно-генетические методы 8 8 1 10 Культуральные исследования 1 10 Видовая идентификация возбудителя 1 12 Определение лекарственной чувствительности 1 12 Алгоритмы диагностических тестов 1 15 Обследование больных впервые выявленных, с рецидивами заболевания и пациентов нуждающихся в определении активности процесса в ПТД(Пациент предварительно не обследовался в других учреждениях) Обследование больных впервые выявленных, с рецидивами заболевания и пациентов нуждающихся в определении активности процесса в ПТД. (Пациент предварительно обследовался в других учреждениях и имеет на руках результаты обследования (СПб НИИ ФП, ЛОПТД, ПТД, ПТК, ПТО Санкт-Петербурга) Обследование больных поступивших на лечении в ПТД, стационар Обследование больных находящихся на лечении - контроль химиотерапии Список используемой литературы 17 20 2 22 24 2 28 3 Список принятых сокращений ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота КДЛ – клиника - диагностическая лаборатория ЛУ – лекарственная устойчивость МЛУ – множественная лекарственная устойчивость МБТ – микобактерии туберкулеза НТМ – нетуберкулезные микобактерии ПТД – противотуберкулезный диспансер ПЦР – полимеразная цепная реакция ЦБЛ ГПТД – централизованная бактериологическая лаборатория СПБ ГБУЗ “Городской противотуберкулезный диспансер” LED – светодиодная люминесцентная микроскопия 4 МЕТОДОЛОГИЯ Для выявления МБТ используются как традиционные микробиологические методы, основанные на фенотипических особенностях возбудителя (ростовые характеристики), так и молекулярно-генетические методы (по наличию в структуре ДНК видоспецифических последовательностей). Централизованная бактериологическая лаборатории СПб ГБУЗ «Городского противотуберкулезного диспансера» (ЦБЛ ГПТД) относится к III уровню лабораторий ( по Приказу МЗ РФ от 21.03.2003№ 109). В целях верификации диагноза и назначения адекватных схем химиотерапии в ЦБЛ применяется следующая диагностическая схема: Выявление возбудителя туберкулеза в двух образцах диагностического материала, собранного до начала лечения методами микроскопии, ПЦР, посева на жидкие или плотные питательные среды; Дифференциация (идентификация) культур, выросших на питательных средах микобактерий туберкулеза (МБТ) от нетуберкулезных микобактерий (НТМ); Определение лекарственной чувствительности возбудителя к противотуберкулезным препаратам микробиологическим и/или молекулярногенетическими методами. Методика валидизации исследований Внешняя экспертная оценка (участие в Федеральной системе оценки качества исследований); Внутренняя экспертная оценка (на регулярной основе). 5 Выявление микобактерий туберкулеза Для выявления МБТ в ЦБЛ ГПТД используются методы: Микроскопии (микроскопия по Цилю-Нельсену, микроскопия из осадка, люминесцентная микроскопия); Культуральные (культивирование на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финна-II, автоматическая детекция роста МБТ на аппарате BactecMGIT 960, BactecMGIT 9050); Молекулярно-генетические (ПЦР в режиме реального времени, ДНК-стриповые технологии HainLifescience, картриджные технологии GeneXpertMTB/RIF -определения МБТ и ЛУ к рифампицину). Методы микроскопического исследования (из осадка) Микроскопия из нативного мазка мокроты по ЦилюНельсену может проводиться в лабораториях всех уровней. Люминесцентная микроскопия требует значительной технической компетенции и технического рекомендуется для лабораторий выполняющих более 30 подобных исследований в день. Методы бактериоскопии не позволяет дифференцировать микобактерии туберкулеза (МБТ) от нетуберкулезных микобактерий (НТМ), а также отличить живые клетки от неживых. Микроскопическое исследование методом Циля-Нильсена 6 из осадка (осуществляется в ЦБЛ ГПТД для специализированных ЛПУ) Микроскопия мазков мокроты окраской по ЦилюНильсену из осадка является простым и недорогим методом, позволяет быстро обнаружить наиболее эпидемически опасных больных туберкулезом и выделяющих большое количество микобактерий. Это исследование особенно актуально на первичных этапах обследования больных при динамическом наблюдении за состоянием микобактериальной популяции в процессе лечения. В отличие от прямой бактериоскопии нативного мазка, которая обладает низкой чувствительностью (положительный результат при наличии, по крайней мере, 5000 микобактериальных клеток в одном миллилитре мокроты) микроскопия из осадка позволяет обнаружить микобактерии в 42-45% случаях положительных культуральных исследований. Люминесцентная микроскопия / (Светодиодная LED люминесцентная микроскопия) Прямая бактериоскопия люминесцентным методом (LED) повышает выявляемость микобактерий на 10% по сравнению с прямой бактериоскопией препаратов, окрашенных по Цилю-Нильсену. Молекулярно-генетические методы Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяют быстро (от 2– 4 часов до 48 часов) установить наличие МБТ в диагностическом материале и определить лекарственную чувствительность. Капиталовложения и расходы на данные технологии значительно превышают традиционные методы. 7 Культуральные исследования Метод посева диагностического материала на питательные среды является основным методом выявления микобактерий туберкулеза. По специфичности культуральный метод значительно превышает микроскопический метод, а чувствительность значительно выше (для детекции МБТ достаточно несколько десятков живых микробных тел). Культивирование на плотных питательных средах В ЦБЛ ГПТД культуральные исследования традиционно осуществляются на двух плотных яичных средах – Левенштейна-Йенсена и Финна II. Культивирование на жидких средах Считается, что культивирование на жидких средах повышает выявляемость на 10% по сравнению с плотными средами. В ЦБЛ ГПТД широко используются системы автоматической детекции роста микобактерий BACTECGIT960 и BactecMGIT 9050, которые позволяют ускорить получение результата. До 75% обнаружение МБТ регистрируется к 14 дню исследования, отрицательные результаты выдаются на 45 сутки. BactecMGIT 9050 позволяет определять МБТ в крови пациента. При отрицательных исследованиях мокроты методами микроскопии и ПЦР необходимо повторное исследование с использованием раздражающих ингаляций Видовая идентификация возбудителя В ЦБЛ ГПТД для видовой идентификации МБТ используются методики: 8 Учета культуральных особенностей роста (скорость роста, пигментация); Биохимические тесты; Молекулярные (иммунохроматографический тест, ПЦР на ДНК МБТ, ПЦР на НТМ); Посев на кровяной агар. Определение лекарственной чувствительности. Для определения лекарственной чувствительности в ЦБЛ ГПТД используются фенотипические и генотипические методы: Фенотипические Культивирование МБТ в присутствии противотуберкулезных препаратов. Фенотипические методы определения лекарственной чувствительности проводятся с чистой культурой микобактерий на плотных или жидких питательных средах, содержащих препараты. Генотипические Выявляют специфические мутаций в генах, связанные с резистентностью к определённым препаратам. Генотипические методы проводятся с помощью молекулярно-генетических тест-систем на определение лекарственной устойчивости: ПЦР в режиме реального времени, ДНК-стриповая технология Hain, картриджная технология /набор Xpert МБТ/ RIF. Основным достоинством всех молекулярногенетических методов тестирования ЛУ микобактерии туберкулеза является быстрота получения результатов и оперативное выявление больных туберкулезом с МЛУ. 9 Конечной целью молекулярных анализов является быстрая первичная идентификация множественной ЛУ микобактерий туберкулеза. Однако применение молекулярно-генетических методов не устраняет необходимости проведения традиционных культуральных тестов. Часто в диагностическом материале оказывается недостаточное для детекции ЛУ прямым молекулярно-генетическим методом количество микобактерий туберкулеза. В этом случае возможно непрямое определение ЛУ с использованием культур, полученных на плотных или жидких питательных средах. Определять ЛУ к изониазиду и рифампицину позволяют такие молекулярно-генетические технологии как проведение ПЦР в режиме реального времени, ДНК- стриповая технология Hain , а также тест, выполняемый на анализаторе GeneXpert Использование системы GeneXpert позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки одновременно проводить выявление ДНК микобактерий туберкулеза и определяет ЛУ микобактерий туберкулеза к рифампицину, являющемуся маркером МЛУ. К препаратам второго ряда ЛУ может определятся на плотной питательной среде Левенштейн-Йенсена и с помощью системы BACTEC МGIT960 BACTEC МGIT 960 и технологии ДНК-Hain позволяют определить ЛУ к фторхинолонам, аминогликозидам и цикличеким пептидам. Однако необходимо помнить, что критические концентрации препаратов на плотных и жидких средах разные, что может приводить к разным результатам ЛУ. А определение ЛУ на BACTEC МGIT 960 к канамицину, циклосерину, ПАСК сомнительно, поскольку критические 10 концентрации данных препаратов на жидких средах официально не утверждены. Автоматизированная система BACTEC МGIT 960 позволяет определить чувствительность к пиразинамиду, что невозможно при использовании любой другой технологии. АЛГОРИТМЫ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ. Основной задачей микробиологических исследований является постановка диагноза, назначение адекватной терапии и контроль за эффективностью лечения (абациллирование больных в процессе химиотерапии). В зависимости от клинического статуса пациента условно можно выделить несколько алгоритмов микробиологических тестов: Обследование больных впервые выявленных, с рецидивами заболевания и пациентов нуждающихся в определении активности процесса в ПТД (Пациент предварительно не обследовался в других учреждениях); Обследование больных впервые выявленных, с рецидивами заболевания и пациентов нуждающихся в определении активности процесса в ПТД (Пациент предварительно обследовался в других учреждениях и имеет на руках результаты обследования (СПб НИИ ФП, ЛОПТД, ПТД, ПТК, ПТО Санкт-Петербурга); Обследование больных поступивших на лечение в ПТД; Обследование больных находящихся на лечении контроль химиотерапии. 11 Алгоритм обследования больных впервые выявленных, с рецидивами заболевания и пациентов нуждающихся в определении активности процесса в ПТД Клинический статус пациента пациент предварительно не обследовался в других учреждениях Первый день Материал забирается на: 1. микроскопию по Циль –Нильсену (1 проба на приеме) выполняется КДЛ учреждения; 2. посев на жидкие среды и ПЦР (2 пробы на приеме) выполняется ЦБЛ ГПТД. Второй день Материал забирается на: 1. микроскопию по Циль–Нильсену-2 образца (1 образец дома, 1образец в диспансере)– выполняется КДЛ учреждения; 2. посев на твердые среды -2 образца (1 образец дома, 1образец в диспансере) – выполняется ЦБЛ ГПТД Материал на микроскопию и ПЦР, посев собирается в разные стерильные контейнеры. На второй день обследования 12 пациент должен самостоятельно дома (утром) собрать мокроту в 2 контейнера (1 на микроскопию и 1 на посев). В учреждении под контролем медицинского персонала у пациента забираются образцы в 2 контейнера (1 на микроскопию и 1 на посев). (Следует отметить, что в соответствии с Приказом МЗ ФР от 21.03.2003г. №109, Приложение №9 забор мокроты на посев на твердые среды и микроскопию производится из одного контейнера, но учитывая, что материал в ЦБЛ ГПТД доставляется не сразу значительно повышается риск контаминации). Кровь для исследования молекулярногенетическими методами забирается: - у пациентов с ВИЧ-инфекцией при отсутствии выделения кислотоупорных микобактерий методом микроскопии у пациентов с выраженной клинической симптоматикой туберкулеза, при отсутствии бактериовыделения методом микроскопии – по решению врачебной комиссии. Образцы для посева на жидкие среды собирают в специальные пробирки на 50 мл. Пробирки выдают в ЦБЛ ГПТД Образцы крови (5 мл.) для посева на жидкие среды забирают в специальные флаконы, которые выдают под заказ по звонку в лабораторию. Телефоны: 251-60-93; 251-41-91; 727-87-12. 13 Направления заполняются на бланке посевов с обязательным указанием исследуемого материала и метода исследования (жидкие среды, ПЦР,GeneXpertMTB/RIF). Материал, для исследования по технологии GeneXpertMTB/RIF доставляется курьером в КДЛ ГПТД по адресу: СПб, ул. Звездная 12. Рекомендуется при обследовании больных хроническим бронхо-легочными заболеваниями с целью диагностики, наряду с цитологическими исследованием мокроты, следует выполнять трехкратное исследование мокроты методом Циль-Нильсена. В случае подозрения диагноза «Туберкулез», необходимо проводить полноценное обследование пациента в противотуберкулезных учреждениях. Для нетранспортабельных больных целесообразно заменить обследование методом посева на трехкратное микроскопическое исследование мокроты в КДО общелечебной сети. Микроскопическое исследование и культуральные исследования такого диагностического материала, как моча, назначаются в случае подозрения на туберкулез мочеполовых органов (жалобы пациента на заболевания моче-выделительной системы, изменения в анализах мочи, других исследований указывающих на патологию моче-выделительной системы). Решение о таком обследовании должен принимать фтизиоуролог. Алгоритм обследование больных впервые выявленных, с рецидивами заболевания и пациентов нуждающихся в определении активности процесса в ПТД. 14 Клинический статус пациента - пациент предварительно обследовался в других учреждениях и имеет на руках результаты обследования (СПб НИИ ФП, ЛОПТД, ПТД, ПТК, ПТО Санкт-Петербурга); Первый день Материал забирается на: 1. микроскопию по Циль –Нильсену (1 проба на приеме) – выполняется КДЛ учреждения; 2.посев на твердые среды (1 проба на приеме) – выполняется ЦБЛ ГПТД Второй день Материал забирается на: 1. микроскопию по Циль –Нильсену (1 проба на приеме) – выполняется КДЛ учреждения; 2.посев на твердые среды (1 проба на приеме) – выполняется бактериологической ЦБЛ ГПТД Материал на микроскопию и на посев собирается в разные стерильные контейнеры. При обследовании пациента в обязательном порядке учитываются результаты обследования в следующих учреждениях: СПб НИИ ФП, ЛЛПТД. Учитываются результаты анализов сроком менее месяца. При направлении в стационар необходимо в обязательном порядке указать даты забора материала, в том числе в выше перечисленных учреждениях. 15 Если пациент, на этапе исследования, переводится из одного противотуберкулезного диспансера СанктПетербурга в другой, то обследование пациента микробиологическими методами не повторяются! Алгоритм обследования больных поступивших на лечении в противотуберкулезные стационары и больницы города. Первый день Материал забирается на: 1. микроскопию по Циль – Нильсену (1 проба при поступлении) – выполняется КДЛ учреждения; 2.молекулярно-генетическая диагностика GeneXpertMTB/RIF(дает возможность одновременного выявления возбудителя и определения чувствительности микобактерии туберкулеза к рифампицину) – выполняется КДЛ ГПТД по адресу: СПб, ул. Звездная 12. Второй день Материал забирается на: 1. посев на жидкие среды – выполняется ЦБЛ ГПТД; 2. ПЦР-исследование – выполняется ЦБЛ ГПТД. Материал на микроскопию, как на твердые, так и на жидкие среды и ПЦР собирается в разные стерильные контейнеры. На второй день обследования пациент под контролем медицинского персонала, должен собрать мокроту в 2 контейнера (1 на микроскопию и 1 на посев – на твердые). В 16 учреждении под контролем медицинского персонала у пациента забираются образцы в 2 контейнера (1 на микроскопию и 1 на посев – на твердые и жидкие среды). При обследовании пациента в обязательном порядке учитываются результаты обследования в следующих учреждениях: СПб НИИ ФП, ЛОПТД, ПТД Санкт-Петербурга. Учитываются результаты анализов сроком менее месяца. При направлении в стационар необходимо в обязательном порядке указать даты забора материала, в том числе в выше перечисленных учреждениях. Алгоритм обследования больных находящихся на лечении контроль химиотерапии В интенсивной фазе лечения исследования производят не реже 1 раза в месяц. В фазе продолжения – в конце 2-го месяца (20 неделя от начала лечения) и по завершении лечения. Первый день Материал забирается на: 1. микроскопию по Циль – Нильсену (1 проба на приеме/при поступлении) –выполняется КДЛ учреждения; 17 2. посев на жидкие среды (1 проба на приеме/при поступлении) – выполняется ЦБЛ ГПТД Второй день Материал забирается на: 1. микроскопию по Циль – Нильсену (1 проба на приеме/при поступлении) –выполняется КДЛ учреждения; 2. посев на плотные среды (1 проба на приеме/при поступлении) – выполняется ЦБЛ ГПТД Материал как на твердые, так и на жидкие среды собирается в разные стерильные контейнеры. На второй день обследования пациент должен самостоятельно дома (утром) собрать мокроту в 2 контейнера (1 на микроскопию и 1 на посев – на твердые и жидкие среды). В учреждении под контролем медицинского персонала у пациента забираются образцы в 2 контейнера (1 на микроскопию и 1 на посев – на твердые и жидкие среды). Материал на посев – на твердые и жидкие среды забирается в один контейнер! Молекулярно генетические исследования проводятся при отсутствии бактериовыделения методом микроскопии. Кровь для исследования молекулярно- генетическими методами BactecMGIT 9050 забирается: - у пациентов с ВИЧ инфекцией при отсутствии выделения КУМ методом микроскопии - у пациентов с выраженной клинической симптоматикой туберкулеза, при отсутствии бактериовыделения методом микроскопии – по решению врачебной комиссии. 18 Разработка рациональной схемы обследования пациентов, проходящих лечение от туберкулёза, позволяет не только улучшить эффективность диагностики и лечения больных но и сократить число анализов не дающих никакой дополнительной информации лечащему врачу, уменьшить нерациональные экономические расходы в бюджетной сфере городского здравоохранения. По всем вопросам работы ЦБЛ ГПТД можно обращаться к заведующей - Матвеевой Наталье Георгиевне: тел. 8-921-58084-59. Список используемой литературы. 1.Приказ Минздравсоцразвития России от 21.03.2003г. №109 «О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской Федерации». 19 2.Приказ Минздравсоцразвития России от 02.10.2006г.№690 «Об утверждении учетной документации по выявлению туберкулезом методом микроскопии». 3.Приказ Минздрава России от 15.11.2012г.№932н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи больным туберкулезом». 4.Методические рекомендации Учреждения Российской Академии Медицинских наук «Центрального научноисследовательского института туберкулеза РАМН», утв.04.07.2011г., Протокол №10 «Алгоритм Микробиологических исследований для диагностики туберкулезной инфекции». 20 Образец направления Для заметок 21 22