Программа по курсу "Молекулярная биология". ФББ, 2009 г.

Программа по курсу "Молекулярная биология". ФББ, 2009 г.
1. Структура нуклеиновых кислот.
Отличие РНК от ДНК (химическая структура и конформация). Строение нуклеотидов.
Конформации фуранозного кольца и гликозидной связи. Фосфодиэфирная связь.
Химические формулы оснований. Химические модификации оснований (метилирование,
гликозилирование, 5-оксиметилцитозин). Метилирование 2’-гидроксила рибозы.
Псевдоуридин. А- и В-формы нуклеиновых кислот, уотсон-криковские пары, параметры
спиралей. Стэкинг-взаимодействия. Кооперативность взаимодействия между цепочками
ДНК. Большая и малая бороздки. Специфические взаимодействия ДНК с белками. ZДНК, параметры спирали, особенности последовательности. Роль Z-ДНК в процессе
редактирования РНК. Образование Z-ДНК, как следствие отрицательной
сверхспирализации. Неканонические взаимодействия. Тройки оснований и квадруплексы.
H-ДНК. Хугстиновские и обратные хугстиновские взаимодействия, тройные спирали
ДНК. Особенности последовательностей ДНК, образующих Н-форму. Топология участков
ДНК с Н-формой. Инициация рекомбинации на участках Н-ДНК. TFO в терапии. Gквадруплексы. Топология внутримолекулярных и межмолекулярных квадруплексов. Gквадруплексы в теломерах. Вторичная структура нуклеиновых кислот. Элементы
вторичной структуры: шпильки, симметричные и асимметричные выпетливания,
соединения трех и более спиралей. Третичные взаимодействия. Псевдоузлы.
Канонические (уотсон-криковские) и неканонические («воббл» и другие) нуклетидные
пары. Пары, соответствующие параллельной и антипараллельной ориентации цепей РНК.
Четырехнуклеотидные петли (tetraloop) и их рецепторы. Slipped strands, особенности
последовательностей. Механизм увеличения числа тандемных повторов, значение для
патологии. Методы определения вторичной структуры РНК. Термодинамический
подход. Химическая модификация. Ковариационный анализ. Третичная
(пространственная) структура РНК. Коаксиальный стекинг. Топология ДНК. Число
витков, как топологический инвариант. Отрицательная и положительная
сверхспирализация. Роль отрицательной сверхспирализации в плавлении ДНК и
образовании неканонических структур. Топологические проблемы репликации, катенаны.
Роль топоизомераз в репликации. Топоизомеразы первого и второго типа.
2. Вилка репликации у про- и эукариот
Химия репликации. Проверка корректности пришиваемого нуклеотида.
Полуконсервативность репликации. Опыт, доказывающий полуконсервативный
механизм(15N, 14N). Вилка репликации. Лидирующая и отстающая цепь. Фрагменты
Оказаки. Ферменты: полимераза, праймаза, лигаза, хеликаза, топоизомераза. ssb-белки.
Разнообразие ДНК-зависимых-ДНК-полимераз про- и эукариот и их функции (кратко).
Полимеразы, принимающие участие в репликации (про-, эу-). Роль Pol I и Pol III в
репликации прокариот. 5'-3' и 3'-5' экзонуклеазные активности. Удаление затравки
(праймера) у про- и эукариот. Субъединичная структура Pol III прокариот, функции
отдельных субъединиц. Процессивность ДНК-полимераз. Зажим (sliding clamp) и грузчик
(clamp loader). Координация синтеза ДНК: модель "тромбона", реплисома.
3. Инициация и контроль репликации
Общие понятия. Однонаправленная и двунаправленная репликация. Ориджин
репликации. Сайт терминации репликации. Репликон. Репликация хромосомы E. coli.
Особенности строения OriC: DnaA-сайты, АT-повторы, GATC-последовательности, сайты
связывания архитектурных белков. Роль белка DnaA в инициации репликации: связывание
с OriC, привлечение белков репликативной вилки (DnaB, DnaC, DnaG). Роль
архитектурных белков (HNS, Fis, IHF) в инициации репликации. Контроль частоты
раундов репликации: роль метилирования ДНК, роль GATC-сайтов. Терминация
репликации: образование катенанов и кольцевых димеров. Роль топоизомераз класса II и
белкового комплекса XerCD. Репликация плазмид. Инициация репликации плазмиды
ColE1. Роль РНКII в инициации репликации. Альтернативные структуры РНКII, влияние
РНКI в выборе структуры РНКII. Различия в репликации плазмид и хромосом:
сопряженность репликации хромосом с клеточным циклом. Репликация у эукариот.
Множественность ориджинов. Ориджины Saccaromyces cerevisiae: понятие об ARS
(autonomously replicating sequence) и ORC (origin-recognition complex).
4. Репарация ДНК
Типы повреждений ДНК и вызываемые ими мутации. 3'-5' экзонуклеазная (proofreading)
активность полимераз. Прямая репарация: фотореактивация тиминовых димеров,
удаление метильной группы с O6mG. Однонитевые разрывы, лигаза. Репарация
неспаренных оснований (mismatch repair). Роль белков MutS, MutL и MutH, 3'-5' и 3'-5'
экзонуклеаз, хеликазы и Pol III в репарации неспаренных оснований в E.coli. Механизм
обнаружения поврежденной цепи у E.coli. Особенности репарации неспаренных
оснований эукариот. Эксцизионная репарация оснований (BER). Типы повреждений,
репарируемые с помощью BER. Разнообразные гликозилазы. Образование АП-сайта. Роль
гликозилазы, pol I (прокариоты)/pol beta (эукариоты), АП-эндонуклеазы и лигазы.
Эксцизионная репарация нуклеолидов (NER) и типы репарируемых повреждений.
Распознавание повреждения. Белки UrvA, UrvB и UrvC. Pol I и лигаза. Понятие о
репарации, сопряженной с транскрипцией (transcription-coupled repair) и связь с NER.
Репарация двунитевых разрывов. Негомологичное соединение концов (NHEJ).
Пострепликативная репарация путем рекомбинации. Сравнение NHEJ с репарацией путем
рекомбинации.
5. Структура хроматина.
Расположение хромосом в интерфазном ядре. Компактизация ДНК. Гетеро- и
эухроматин. Факультативный и конститутивный гетерохроматин. Уровни структурной
организации хроматина в интерфазном ядре. Нуклеосомы. Гистоновый кор. Строение
гистонов. Модификации гистонов (метилирование, ацетилирование,
убиквитинилирование). Влияние модификаций гистонов на транскрипционную
активность. Гистоновый код. Связь модификаций гистонов с метилированием ДНК. Более
высокие уровни организации хроматина. Различные модели строения 30 nm фибриллы.
100 nm фибрилла.
6. Мобильные генетические элементы без РНК-стадии в жизненном цикле
Определение мобильного элемента. Принцип эгоистичной ДНК. Общие принципы
организации геномный копий транспозонов. Мобильные элементы бактерий: IS-элементы,
бактериальные транспозоны – структура, кодируемые белки, принцип репликативной и
нерепликативной транспозиции, функции транспозазы и резольвазы. ДНК-транспозоны
эукариот: автономные и неавтономные мобильные элементы, Ac/Ds кукурузы, P-элемент
дрозофилы, гибридный дисгенез.
7. Ретроэлементы в геноме эукариот
Обратная транскриптаза (ревертаза). Классификация мобильных ретроэлементов
эукариот. LINE- и SINE-элементы – структура, жизненный цикл, реакция TPRT. LTRсодержащие ретротранспозоны, ретровирусы и эндогенные ретровирусы – структура
ДНК-копии и полногеномной РНК, мРНК ретровирусов и кодируемые ими белки. Схема
образования кДНК. Эволюционная роль мобильных элементов, воздействие на геном.
Ретропсевдогены. Другие примеры использования мобильных элементов клеткой для
своих целей.
8. Инициация и регуляция транскрипции у прокариот.
РНК-полимераза. РНК-полимераза – основной компонент транскрипции. Структура
РНК-полимеразы: главный компонент и сигма-фактор. Главный компонент: бета, беташтрих, и альфа-субъединицы. Сигма-фактор: доменная структура, функции. Связывание
сигма-фактора с промотором, элементы последовательности промотора: -10 и –35 боксы,
UP-элемент. Основной и альтернативный сигма-факторы. Регуляция транскрипции.
Понятие о факторах транскрипции. Механизмы активации факторов транскрипции:
взаимодействие с лигандом, ковалентная модификация (фосфорилирование). Факторы
транскрипции: активаторы и репрессоры. Механизмы действия активаторов:
взаимодействие с альфа-субъединицей, взаимодействие с сигма-фактором, изменение
конформации промотора. Механизмы репрессии: стерическое препятствие посадке сигмафактора, запетливание ДНК. Примеры положительной и отрицательной обратной связи.
Роль кооперативного связывания факторов транскрипции: смысл палиндромов и
повторов.
9. Семейства белков-регуляторов транскрипции у эукариот.
Базальные факторы транскрипции и дополнительные белки-регуляторы. Активаторы,
репрессоры, коактиваторы, корепрессоры. Основные семейства белков регуляторов (по
типу ДНК-связывающего домена) эукариот. Способы активации транскрипционных
факторов. Цинковые пальцы. Взаимодействие иона Zn++ c остатками гистидина и
цистеина. Варианты цинковых пальцев: C2H2, C4 и С6. Взаимодействие цинковых пальцев
с ДНК. Специфичное распознавания гуанина остатками аргинина. Ядерные рецепторы
гормонов: определение, общие структурные особенности. Глюкокортикоидные и
эстрагеновые рецепторы, образование гомодимеров. Тиреоидные и ретиноидные
рецепторы, гетеродимеры. Роль расстояния между сайтами при взаимодействии
гетеродимеров с ДНК. Транскрипционный фактор GAL4: структура, роль длины
линкерного участка в распознавании сайтов посадки. Гомо- и гетородимеры, как
иллюстрация комбинаторного принципа регуляции транскрипции у эукариот. Мотив
спираль-поворот-спираль (helix-turn-helix) и гомеодомены. Мотив спираль-петля-спираль
(helix-loop-helix). Димеризация и взаимодействие с ДНК. Пример регуляции с участием
HLH белков. Лейциновая молния и её роль в димеризации. Понятие о передаче сигналов с
рецепторов на поверхности клеток к транскрипционным факторам.
10. Элонгация и терминация транскрипции у прокариот.
Этапы транскрипции: инициация, элонгация, терминация. Элонгация транскрипции.
Этапы начала элонгации: отделение сигма-фактора, первая транслокация фермента вдоль
матрицы, стабилизация транскрипционного комплекса. Состав транскпипционного
комплекса: главный компонент РНК-полимеразы, ДНК, растущая цепь РНК. Движение
РНК-полимеразы по матрице. События в ходе элонгации: пауза, арест элонгации,
элонгации в случае присутствия тиминовых димеров. Терминация транскрипции. Rhoнезависимая терминация, роль вторичной структуры (шпильки) и polyU-участка. Rhoзависимая терминация. Аттенюация: терминация как регуляторный механизм. Механизм
аттенюации на примере аттенюатора триптофанового оперона, роль альтернативных
вторичных структур.
11. Регуляция генов фага лямбда.
Лизис и лизогения. Белки Cro и CI - регуляторы стадий жизненного цикла фага.
Связывание CI с операторными участками, различие в степени афинности, роль
кооперативного связывания. Связывание белка Cro с операторными участками.