- Академия лабораторной диагностики
реклама
ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей» Министерства по здравоохранению и социальному развитию ГУЗ Иркутский областной клинический консультативно-диагностический центр Медведева Т.В., Скворцова Р.Г., Кузьменко В.В., Огарков О.Б. ПЦР-анализ в клинической лаборатории Учебное пособие Иркутск 2009 . В пособии представлены основные сведения об одном из современных методов диагностики – полимеразной цепной реакции (ПЦР). Дано описание всех его этапов – преаналитического, аналитического и постаналитического. Подробно освещены особенности использования ПЦР для диагностических целей, интерпретации результатов применения этой методики, обсуждаются ее преимущества и недостатки в сравнении с другими методами диагностики инфекций. Пособие предназначено для врачей клинической лабораторной диагностики и врачей других специальностей. Рецензенты: Доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Котловский Доктор биологических наук, профессор И.М.Устьянцева Медведева Т.В., Скворцова Р.Г., Кузьменко В.В., Огарков О.Б., 2009 УДК ББК 616-078 53.45 П91 2 Оглавление ОГЛАВЛЕНИЕ ..................................................................................................................................................................... 3 ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................................................................... 5 ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ ПЦР И РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПЦР ............................................................................... 6 МЕХАНИЗМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ............................................................................................. 8 ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР.......................................................................................................................................... 8 Праймеры. ..................................................................................................................................................................... 8 Полимераза. ................................................................................................................................................................... 8 Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. ......................................................................................................................... 8 Ионы двухвалентных металлов. .................................................................................................................................. 8 Буферы. .......................................................................................................................................................................... 9 Анализируемый образец................................................................................................................................................ 9 Циклический температурный режим ........................................................................................................................ 9 СТАДИИ ПОСТАНОВКИ ПЦР .............................................................................................................................................. 10 Пробоподготовка (выделение ДНК/РНК) ................................................................................................................ 11 Амплификация ............................................................................................................................................................. 13 Факторы, влияющие на эффективность амплификации .........................................................................................................14 Использование «горячего старта» при постановке ПЦР ........................................................................................................15 Приборное обеспечение ............................................................................................................................................................15 Регистрация результатов ......................................................................................................................................... 16 ВОЗМОЖНОСТИ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ............................. 19 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ....................................................................................................................................... 20 ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД .......................................................................................................................................... 21 МИКРОСКОПИЯ.................................................................................................................................................................. 21 ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ МЕТОД (ПЦР) ..................................................................................................................................... 22 Преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики ................................. 23 Универсальность процедуры выявления различных возбудителей ......................................................................................23 Специфичность ..........................................................................................................................................................................24 Чувствительность.......................................................................................................................................................................24 Актуальность ответа (быстрота получения результата анализа) ...........................................................................................25 Возможность экспертизы. .........................................................................................................................................................26 Исследуемый биологический материал .................................................................................................................... 26 Локализация возбудителей ........................................................................................................................................ 26 Правила забора материала и транспортировки клинического материала для ПЦР-диагностики................... 27 Кровь, плазма, сыворотка..........................................................................................................................................................28 Соскоб с эпителиальных клеток для выявления ДНК возбудителей инфекций, передающихся половым путем .............29 Факторы, влияющие на эффективность выявления урогенитальных патогенных микроорганизмов с помощью НК. ................................................................................................................................................................................................29 Правила подготовки больного для ПЦР-диагностики урогенитальных инфекций ........................................................30 Мазок с конъюнктивы, слизистой зева и дыхательных путей ...............................................................................................31 Моча ............................................................................................................................................................................................31 Мокрота ......................................................................................................................................................................................32 Синовиальная жидкость ............................................................................................................................................................32 Другие биологические жидкости..............................................................................................................................................32 Секционный материал ...............................................................................................................................................................32 Применение метода ПЦР в медицине....................................................................................................................... 32 Диагностическое значение ПЦР-исследований в клинике инфекционных заболеваний ....................................................32 Гепатит А (HАV), Е (HЕV) ..................................................................................................................................................35 Гепатит В (HВV) ...................................................................................................................................................................35 Гепатит D (ВГD) ...................................................................................................................................................................36 3 Гепатит С (HCV) ...................................................................................................................................................................37 Использование ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии .............................................................................................................39 Применение ПЦР в урогинекологической практике. .............................................................................................................41 Основные клинические синдромы и урогенитальные инфекции .....................................................................................41 Криминология ............................................................................................................................................................................46 Установление отцовства ............................................................................................................................................................47 Персонализированная медицина ..............................................................................................................................................48 Клонирование генов ..................................................................................................................................................................49 Онкология ...................................................................................................................................................................................50 Применение ПЦР в практике службы крови ...........................................................................................................................50 УПРАВЛЕНИЕ КАЧЕСТВОМ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЙ .......................................................................................... 51 ДОКУМЕНТЫ, РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ ............................... 51 ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ПЦР-ЛАБОРАТОРИЙ ........................................................................................... 52 ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЮ РАБОТ В ЛАБОРАТОРИИ .............................................................................................................. 54 ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА В ХОДЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЙ ................................................................................................. 55 Преаналитический этап ............................................................................................................................................ 56 Аналитический этап .................................................................................................................................................. 58 Контроль качества ПЦР-исследований ....................................................................................................................................60 Контроль реакции амплификации .......................................................................................................................................61 Внутренний контроль ВКО..................................................................................................................................................63 Проблема контаминации ...........................................................................................................................................................63 Действия при возникновении контаминации нуклеиновыми кислотами ........................................................................65 Постаналитический этап ......................................................................................................................................... 66 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................................................. 70 ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ ............................................................................................................................. 70 ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ ..................................................................................................................... 75 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................ 76 ПРИЛОЖЕНИЕ.................................................................................................................................................................. 76 ВОЗМОЖНОСТИ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ В ГУЗ ИОККДЦ ................................................................................................... 76 Комплекс исследований на заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), 2Ж3001 ................................ 76 Хламидиоз, 2Ж3002 .................................................................................................................................................... 77 Туберкулез, 2ЖЗ003 .................................................................................................................................................... 78 Гепатит С, 2Ж3004 ................................................................................................................................................... 79 Микоплазма гоминис, 2Ж3005 ................................................................................................................................... 80 Трихомониаз, 2Ж3006 ................................................................................................................................................. 80 Гепатит В, 2Ж3007 ................................................................................................................................................... 81 Уреаплазма, 2Ж3009 .................................................................................................................................................. 81 Папиллома (ВПЧ с определением онкогенности), 2Ж3010 .................................................................................... 82 Гонорея, 2Ж3011 ......................................................................................................................................................... 83 Гепатит С количественный, 2Ж3012 ...................................................................................................................... 84 Генотипирование вируса гепатита С, 2Ж3013 ....................................................................................................... 85 Микоплазма гениталиум, 2Ж3015............................................................................................................................. 85 ЦМВ, 2Ж3019 .............................................................................................................................................................. 87 Вирус Эпштейна-Барр, 2Ж3020 ................................................................................................................................ 88 Вирус герпеса 1-го и 2-го типов, 2Ж3021 ................................................................................................................. 88 Вирус герпеса 6-го типа, 2Ж3022 ............................................................................................................................. 89 Токсоплазмы гондии, 2Ж3023 .................................................................................................................................... 90 Энтеровирус, 2Ж3027 ................................................................................................................................................ 91 Гепатит В количественный, 2Ж3031....................................................................................................................... 92 4 Введение Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК, содержащий специфическую генетическую информацию любого организма среди огромного количества другой ДНК и многократно размножить искомый фрагмент в случае, если он действительно присутствует в исследуемом материале. При ПЦР-диагностике размножению подвергается не бактерия, а только ее ДНК, причем не вся молекула ДНК, а только строго специфическая нуклеотидная последовательность, имеющаяся лишь у данного возбудителя. В начале 1970-х гг. норвежским ученым К. Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории Нобелевского лауреата Х.-Г. Кораны (Har Gobind Khorana) впервые были описаны основные принципы амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК-синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной, так как ёще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 г. К. Мюллисом (Kary Mullis). За разработку ПЦР-метода он был удостоен Нобелевской премии в области химии в 1993 г. Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 30 лет и позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования. Этот метод нашел применение в: диагностике инфекционных заболеваний, в том числе вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию: в клинической диагностике вирусных и бактериальных инфекций; диагностике наследственных (муковисцедоз, фенилкетонурия, гемофилия), онкологических и др. заболеваний; HLA–типировании; гражданской (определение родства) и судебной медицине (идентификация личности); генотипировании микроорганизмов, оценке их вирулентности; определении устойчивости микрофлоры к антибиотикам; пренатальной диагностике; биологическом контроле препаратов крови. 5 Кроме того, молекулярные методы используются в таких областях, как эпидемиология, фармакология, экология, сельское хозяйство, пищевая промышленность, биотехнология. Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность. История открытия ПЦР и разработка метода ПЦР Молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Схема "ДНК— >РНК —> белок" с необратимостью процессов передачи информации, обозначаемых стрелками, получила название "центральной догмы молекулярной биологии". Появление ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики. В 1953 г. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК. Эта их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией. Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды. Особенность этой полимеразы заключается в ее исключительной термостойкости, она выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а также в высокой рабочей температуре этого фермента (оптимум работы +72оС). Универсальным носителем генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Исключение составляют только некоторые микроорганизмы, например, вирусы, носителем генетической информации у которых является РНК – одноцепочечная рибонуклеиновая кислота. Хотя по своему химическому строению РНК несколько отличается от 6 ДНК, она, тем не менее, выполняет у этих вирусов роль, аналогичную роли ДНК (Табл.1). Таблица 1 Основные различия между ДНК и РНК ДНК Хранение генетической информации Стабильный компонент клетки Содержит генетическую информацию РНК Передача генетической информации Нестабильный короткоживущий компонент клетки Участвует в синтезе белка ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из последовательности химически связанных нуклеотидов. Каждый нуклеотид (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ и дУТФ в РНК) содержит гетероциклическое кольцо из атомов углерода и азота (азотистое основание), пятиуглеродное сахарное кольцо (пентозу) и фосфатную группу. Две полинуклеотидные цепи в ДНК соединяются двумя или тремя водородными связями, возникающими между азотистыми основаниями. В основу модели ДНК легли ее свойства: комплементарность, когда в двойной спирали две полимерные цепи ДНК связаны бок о бок водородными связями за счет образования пар Г–Ц, Ц–Г, А–Т и Т–А; антипараллельность комплементарных цепей – две полинуклеотидные цепи идут в противоположных направлениях: 5’-конец одной нити соответствует 3’-концу второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов – гираз – происходит раскручивание спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (“+”) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении - от 5'-конца к 3'-концу. Этот процесс осуществляется по принципу комплементарности ферментом ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока – небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК (праймера) с комплементарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-”), только в этом случае наращивание цепи происходит в обратном направлении. В результате процесса репликации из одной 7 молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить синтезируется от материнской молекулы ДНК, а вторая – дочерняя, вновь синтезированная. Механизм полимеразной цепной реакции Основные компоненты ПЦР Праймеры. Праймеры – искусственно синтезированные короткие, длиной 20–30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комплементарные 3’-концам цепей искомой ДНК-матрицы. В геноме искомого организма выбирается консервативная (редко подвергающаяся генетическим перестройкам), строго специфическая нуклеотидная последовательность. К ней синтезируются специфические праймеры. Таким образом, фрагмент молекулы, который будет фланкировать (ограничивать) праймер, должен присутствовать только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене человека и отсутствовать в ДНК других возбудителей болезней или других генах человека. Правильно подобранные праймеры играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации и обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Полимераза. Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов. Для определения РНКсодержащих вирусов используется фермент обратная транскриптаза, который по РНК-матрице синтезирует ДНК-копию, которая затем участвует в ПЦР. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Строительный материал для синтеза комплементарных цепей. (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ) Ионы двухвалентных металлов. Ионы Mg2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы. 8 Буферы. В стандартной ПЦР используются солевые буферы на основе 10–70 мМ Трис-HCl при рН 8–9 (20oC). В буфер добавляются активаторы ПЦР – соли хлорида калия или сульфат аммония и стабилизаторы ДНК-полимераза – бычий сывороточный альбумин или желатин, а также неионные детергенты Triton X100, Nonidet NP40 и Tween 20. Анализируемый образец. Подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК. Например, ДНК микроорганизмов, служащая мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНКмишени специфический продукт амплификации не образуется. Циклический температурный режим Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (Рис. 1). Рис. 1. Этапы ПЦР-анализа. 9 1. Денатурация. Расплавление спирали ДНК и расхождение нитей. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94–96°C на 0,5–2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. 2. Отжиг. Присоединение праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают. При понижении температуры одноцепочечная ДНК стремится восстановить двухцепочечное состояние и, если в реакционной смеси есть мишень (искомая ДНК), то праймеры гибридизуются с мишенью. ДНКпраймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно увеличен или амплифицирован. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50–65°С. Время отжига 20–60 сек. 3. Элонгация. Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом Тaq-полимеразой и проходит при температуре 70–72°С. Время протекания синтеза 20–40 сек. В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одного этапа реакции к другому достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93–95оС происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу – присоединению или “отжигу” праймеров – инкубационную смесь охлаждают до 50–65оС. Далее смесь нагревают до 70–72оС – оптимум работы Тaq-ДНК-полимеразы. На этом этапе происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Многократное, или циклическое, повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК (ампликона). Стадии постановки ПЦР ПЦР-диагностике состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, проведению ПЦР (амплификации) и детекции продукта ПЦР. Для РНКсодержащих вирусов дополнительно проводят реакцию обратной транскрипции (получение кДНК, являющейся комплементарной вирусной РНК-матрице). 10 Пробоподготовка (выделение ДНК/РНК) До начала работы необходимо подготовить пробы для выделения из них ДНК. Для этого сыворотку и плазму крови, мочу, синовиальную и спинномозговую жидкости, мазки и соскобы (доставленные в транспортной среде) концентрируют, мокроту разжижают, биопсийный и аутопсийный материалы аккуратно измельчают. Процедура подготовки образца (ДНК, РНК) включает очистку образца от форменных элементов, лизис микроба, экстракцию (извлечение) ДНК из биопрепарата и удаление или нейтрализацию посторонних примесей, способных оказать ингибирующее действие на процесс реакции амплификации. Высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. Комплект реагентов для выделения НК должен обеспечивать эффективность экстракции ДНК/РНК (не менее чем 80–95 %) и высокую эффективность амплификации ДНК (в 100000 — 1000000 раз). Существует два подхода при обработке проб: сложный и простой (Табл. 2). Сложный – используют с «грязными» пробами: с гемолизом и/или слизью, дебрисом и т.д. Метод направлен на выделение из образца чистых нуклеиновых кислот за счет их избирательной сорбции. Такая очистка ДНК достигается на специальных микроколонках или с помощью сорбентов, приготовленных на основе силикагеля. Выделение ДНК с помощью сорбентного метода является наиболее оптимизированной и технологичной процедурой пробоподготовки и позволяет увеличить чувствительность метода, что влечет за собой увеличение числа выявления возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах. Простой – используют при работе с «чистыми» пробами, т.е. без гемолиза, слизи, дебриса и т.д. Метод подготовки проб состоит в простом лизисе исследуемого материала в сочетании с температурной обработкой. При его использовании формируется определенный процент ложноотрицательных результатов, что объясняется неполной экстракцией ДНК и присутствием ингибиторов реакции в пробе. Существуют следующие подходы очистки нуклеиновых кислот. 1. Использование детергентов для разрушения клеточных стенок и вирусных оболочек, растворения или связывания ингибиторов ПЦР (слизи, белков и др.). 11 Таблица 2 Основные отличия методов выделения ДНК Простые Высокие требования к забору материала Быстрое исполнение Низкая эффективность выделения ДНК Низкая эффективность очистки от ингибиторов Сложные Упрощенные требования к забору клинического материала Более трудоемкое Высокая эффективность выделения ДНК/РНК Высокая эффективность удаления ингибиторов Возможность автоматизации 2. Адсорбция органических соединений и тяжелых металлов, присутствующих в крови и других клинических материалах больного, путем добавления в лизирующие растворы смол. 3. Необратимая инактивация белков путем денатурации (протеазы, кипячение, хаотропные агенты). 4. Высаливание ДНК из водного раствора в присутствии этанола (70%), изопропанола (50%), (1мкг ДНК из 50 мкл водного раствора). 5. Использование для разделения фаз вода-фенол. При этом ДНК/РНК остается в водной фазе, а белки переходят в фенольную фазу. 6. Связывание ДНК/РНК связываться с частицами силикагеля. Универсальный состав сорбента позволяет связывать максимальное количество ДНК и РНК широкого спектра молекулярных масс, гарантируя получение не менее 80% высокоактивной тотальной ДНК. Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Выбор конкретной методики особенно важен при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, так как эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени. Стандартным и ставшим уже классическим считается сорбентный метод получения чистого препарата ДНК/РНК. Сорбентный метод выделения ДНК/РНК в различных модификациях является наиболее предпочтительным для ПЦРдиагностики. Его преимуществом является возможность длительного хранения проб в замороженном состоянии, поскольку ДНК сорбируется на носителе и оттаивание проб не оказывает особого влияния на ДНК/РНК. Метод удобен, технологичен, является наиболее оптимизированной процедурой пробоподготовки, при которой достигается хорошая очистка ДНК. Этот метод позволяет увеличить диагностическую чувствительность и количество выявлений 12 возбудителей инфекций, присутствующих в биологических пробах в минимальных количествах. На этапе экстракции ДНК/РНК важно обеспечить получение максимального количества высокоочищенной нуклеиновой кислоты. Показателями эффективности экстракции являются минимальные потери ДНК/РНК в процессе экстракции, максимальное удаления ингибиторов и нейтрализации нуклеаз, низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу». Для оценки эффективности экстракции комплект реагентов для выделения НК должен содержать внутренний контрольный образец (ВКО), который вносится в пробу на этапе экстракции ДНК/РНК и обеспечивает контроль качества проведения всех этапов анализа. Амплификация Амплификация в молекулярной биологии – увеличение числа копий ДНК. В клетке амплификация происходит в результате репликации ДНК. В искусственных условиях увеличения числа копий ДНК добиваются с помощью полимеразной цепной реакции (Рис. 2). Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n – число циклов амплификации. Если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30– 40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле после соответствующего окрашивания. Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. В ходе первого цикла ПЦР цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента нуклеиновой кислоты генома вируса, бактерий или человека. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза все новых и новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в реакционном растворе в геометрической прогрессии. ПЦР дает экспоненциальное увеличение специфического участка ДНК возбудителя. 13 Рис. 2. Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94–96°C. (2) Отжиг при 68°C . (3) Элонгация при 72 °C (P-полимераза). (4) Закончен первый цикл. Факторы, влияющие на эффективность амплификации 1. Структура и концентрация праймеров. 2. Структура матрицы. 3. GC-состав. 4. Концентрация магния. 5. Активность ДНК-полимеразы. 6. Концентрация ДНК искомого инфекционного агента. 7. Неэффективный способ обработки биоматериала. Одним из перспективных направлений в модификации амплификационного этапа является разработка систем, реализующих "твердофазную" амплификацию. В таких системах один из олигонуклеотидных праймеров ковалентно иммобилизован на специально модифицированном слое пластика пробирки. 14 Получаемые в ходе ПЦР ампликоны также остаются иммобилизованными на твердой фазе, что исключает риск контаминаций и упрощает последующую процедуру их детекции. В последнее время большое внимание ученых обращено на дизайн амплификационных смесей, благодаря чему стало возможно применение мультипраймерной ПЦР, что увеличивает производительность и дает возможность выявления большего количества патогенных микроорганизмов или иных определяемых признаков и в перспективе будет иметь большое значение при использовании в современных устройствах регистрации ДНК-биочипах. Использование «горячего старта» при постановке ПЦР Для оптимизации ПЦР, для повышения эффективности прохождения реакций, уменьшения риска образования неспецифических продуктов реакции амплификации используют подход, получивший название «горячий старт» (“Hotstart”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется температурой отжига праймеров, при которой они взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя двухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной праймера и содержанием GC-пар и рассчитывается по следующей формуле: Tm =[(A+T) x 2] + [(G + C) х 4]. В зависимости от GC -состава и размера праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm), при которой образование водородных связей нестабильно. Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции. Приборное обеспечение ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, с точностью не менее 0,1 °C, который имеет совершенные характеристики переходных температурных процессов, увеличенный ресурс работы и обеспечивает значительное сокращение времени протекания реакции. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе, с возможностью «горячего старта» и последующего хранения амплифицированных молекул при 4°C. Характерной чертой современных амплификаторов является возможность поддержки пробирочного, планшетного и других форматов амплификации в одном приборе 15 Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции и занимает от 2 до 3 часов. Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, поэтому количество лабораторных ошибок во время анализа минимально, а средства контроля качества наиболее развиты и реально применяются в практике ПЦР-лабораторий. Регистрация результатов Амплифицированный фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивый комплекс: он внедряется в «стопку» остатков азотистых оснований ДНК, составляющую сердцевину двойной спирали. В результате они оказываются в гидрофобном окружении, в котором бромистый этидий начинает флуоресцировать. В водной среде он этим свойством не обладает. Поэтому ДНК выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ светом с длиной волны 290–330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР-ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5% до 2,5%. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50–60оС смесь заливают в форму слоем толщиной 4–6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5–1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5–10 мкл. Рекомендуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т.д. пар оснований. Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза (Рис. 3), заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30–45 мин при напряженности электрического поля 10–15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси должен пройти не менее 3 см. 16 Рис.3. Камера для электрофоретических разделений ПЦР-продуктов в агарозном геле. Результаты оцениваются по наличию специфических фрагментов ДНК в агарозном геле. Специфичность синтезированного фрагмента ДНК подтверждается по его положению (размерам) относительно положительного ДНК-контроля, полосы которых устанавливаются на том же уровне в геле, что и полосы в образцах с положительным контрольным препаратом ДНК, видимых в агарозном геле в присутствии бромида этидия при УФ облучении. После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете (Рис. 4) и документируют. В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать длине ампликона, указанной в инструкции. В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие специфического сигнала в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации – загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном. В последнее время особенно много внимания уделяется модификации и модернизации методов регистрации результатов ПЦР. В целом можно выделить следующие принципиальные направления. Внедрение систем, регистрирующих и анализирующих изображение геля в цифровом формате. 17 Сигнал ВКО В- В+ К- К+ Ингибирование проб Специфический сигнал В- В+ К- К+ Рис. 4. Свечение продуктов ПЦР-реакции в ультрафиолетовом свете. Гибридизационные методы регистрации результатов. В основе этих методов лежит гибридизация амплифицированной ДНК со специфичным к определяемой последовательности меченым олигонуклеотидным зондом и последующая детекция двуцепочечных ДНК. Применение гибридизационной схемы в детекции амплифицированной ДНК позволяет существенно повысить специфичность анализа, а плашечный формат выполнения делает возможным максимальную стандартизацию и автоматизацию процесса, что практически исключает субъективность оценки. Переход медицинских пользователей к гибридизационному формату регистрации будет во многом способствовать и дальнейшему внедрению диагностических систем нового поколения (Рис. 5). В основе технологии ПЦР в реальном времени лежит принцип флюоресцентной детекции продуктов ПЦР во время амплификации. Такая технология дает возможность осуществлять регистрацию непосредственно в реакционной пробирке, что исключает попадание продуктов реакции в окружающую среду и контаминацию лаборатории. Детектор амплификаторов может одновременно фиксировать свет от шести флюорофоров в 96 лунках и 18 разделять сигналы от разных красителей. Это позволяет вести наблюдение за шестью амплификациями одновременно в каждой лунке одного планшета. 106 копи 107 й 105 копи й копи й Рис. 5. График регистрации результатов ПЦР в режиме реального времени (Quantitative real-time PCR). Возможности лабораторной диагностики инфекционных болезней Лабораторная диагностика имеет определяющее значение для установления причины инфекционного заболевания. Лабораторные исследования позволяют достоверно выяснить, каким именно возбудителем вызвано инфекционное заболевание, определить вирусную нагрузку, проследить иммунный ответ организма, правильно и своевременно назначить лечение, определить тяжесть течения болезни, проконтролировать эффективность лекарственной терапии. При выборе метода для определения микроорганизмов, вызвавших инфекционный процесс, врачу-клиницисту надо хорошо ориентироваться в возможностях того или иного метода исследования, с тем, чтобы выбрать оптимальный подход (микробиологический, генодиагностичекий или иммунологический) для лабораторного исследования. Комплексное обследование пациента различными лабораторными методами дает возможность врачуклиницисту получать более полную информацию, как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе. Это позволяет более точно ставить диагноз, 19 назначать соответствующее этиотропное лечение и вести последующий контроль терапии. Условно все методы диагностики инфекций можно разделить (Табл. 3) на две большие группы: прямые методы (выявления возбудителя) и непрямые (выявление эффекта). Прямое обнаружение возбудителя в клиническом материале является бесспорным доказательством инфекции и основанием для постановки этиологического диагноза. Таблица 3 Классификация лабораторных методов в зависимости от изучаемых объектов Прямые методы Микробиологический Выявления антигена Микроскопия Генодиагностика (ПЦР) Непрямые методы Выявления антител Инструментальный Гистологический Микробиологический метод Достоинства. Возможность изучения целого ряда клинически важных фенотипических свойств микроорганизмов. Микробиологический метод попрежнему является «золотым стандартом». Такие микроорганизмы, как грампозитивные кокки (Staphylococcus spp, Streptococcus.spp), грамнегативные кокки (Neisseria spp), грампозитивные палочки (Corynebacterium spp), грамнегативные палочки (Heamophilus spp, Pseudomonas spp), грибы (Candida spp), бактерии кишечной группы (Escherichia coli, Proteus spp. и др.) выявляются с помощью традиционных, доступных и достаточно легко воспроизводимых микробиологических и микроскопических методов. Недостатки. «Некультивируемость» микроорганизмов, отсутствие адекватных сред или невозможность подбора условий культивирования для определенных микроорганизмов (вирусы и некоторые бактерии), длительность анализа, отсутствие высокопроизводительной техники идентификации и определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, низкий уровень материальной базы бактериологических лабораторий. Ряд микроорганизмов, вызывающих воспалительные процессы в организме человека, таких как микобактерии туберкулеза, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы можно выявить только с помощью очень трудоемких и дорогостоящих методов микробиологического исследования. Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки также трудно обнаружить 20 классическими лабораторными методами. Наконец, разнообразные вирусы, например, вирус папилломы человека (HPV), герпес вирусы (VG), цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV) не могут быть выявлены с помощью микробиологических методов. Для их диагностики ПЦР-метод является оптимальным выбором. Уровень развития микробиологической диагностики РФ остается одним из самых низких среди Европейских стран. Иммунологический метод Этот метод, прежде всего позволяет объективно выявлять реакцию организма человека в ответ на контакт с инфекционными агентами, выражающуюся в выработке специфических антител, обнаруживать специфический клеточный ответ, антитела IgG, IgM, IgA, а также антигены некоторых микроорганизмов. Достоинства. Быстрота анализа, низкая стоимость, возможность стандартизации и автоматизации, достаточно высокая воспроизводимость результатов, высокая пропускная способность. Для определения некоторых микроорганизмов, например, Rubella virus иммунологический подход предпочтительнее других. Недостатки. Непредсказуемая специфичность, необходимость в дублях при постановке реакции, необходимость наблюдения за титром антител в динамике для уточнения остроты процесса, низкая аналитическая чувствительность, поздняя сероконверсия, особенно актуальная для прямых методов ИФА «серологическое окно», перекрестные результаты ИФА у пациентов с циррозом печени, болезнями соединительной ткани, аутоиммунными заболеваниями, беременных и пожилых, а также (для косвенных методов ИФА) перекрестные результаты ИФА на антитела к другим микроорганизмам, ложноположительная реакция в случае циркуляции антител класса IgG у детей, рожденных от инфицированных матерей, вакцинации и при аутоиммунных заболеваниях. Микроскопия Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), прямое выявление как корпускулярных, так и растворимых антигенов при люминесцентной микроскопии. Метод является скрининговым, так как его чувствительность и специфичность при использовании моноклональных антител, содержащихся в качественных импортных наборах, может составлять 60 % и 80 % соответственно. ПИФ недостаточно чувствительна для определения малых количеств элементарных телец, возможны как ложноотрицательные, так и 21 ложноположительные результаты, поэтому этот метод предлагается использовать только как ориентировочный. Генотипический метод (ПЦР) Для установления точного диагноза заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентами, все чаще применяются современные методы молекулярной биологии. Достоинства: высокая аналитическая чувствительность и специфичность; возможность получения результатов независимо от сложности культивирования микроорганизмов (выявления персистирующих, латентных и рецидивирующих форм инфекций); специфичность и математически возможная диагностическая чувствительность; возможность контроля эффективности лечения; возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций; возможность ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов, когда лечение наиболее эффективно; возможность диагностики оппортунистических инфекций, часто протекающих на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по результатам серологических исследований затруднена из-за имеющихся несоответствий между параметрами иммунного ответа и протекания заболевания; возможность разрешения сомнительных результатов серологических и эпидемиологических исследований; возможность выявления наиболее патогенных штаммов инфекционных агентов; возможность исследования инфекционности пулированных образцов крови и ее продуктов, применяемых в терапии; возможность определения резистентности к лекарственным препаратам; возможность диагностики возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов; возможность стандартизации и автоматизации анализа; возможность увеличения исследуемого образца ДНК в сотни раз; возможность проведения объективных качественных и количественных измерений; 22 возможность проведения Multiplex ПЦР (амплификация в одной реакционной среде нескольких ДНК-матриц с использованием нескольких пар праймеров). Недостатки: перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов; контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложно-положительных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы. Преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что лишь опосредованно свидетельствует о наличии инфекции. При этом выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. У метода ПЦР существует ряд особенностей, большинство из которых являются несомненными достоинствами этого метода. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это обусловливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов и дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы, кроме того, в качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические образцы. Наконец, вне зависимости от объекта и области применения ПЦР (клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) для его проведения используется стандартный комплект приборов. 23 Специфичность Важное свойство ПЦР – ее высокая специфичность. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестнореагирующими антигенами. Выделяют аналитическую и диагностическую специфичность. Диагностическая специфичность – число отрицательных реакций при тестировании материала образцов от больных контрольной группы (лица с подтвержденным отсутствием инфекции). Аналитическая специфичность оценивается по числу совпадений результатов с референс тест-системой, предоставляемой ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Чем специфичнее данный метод исследования, тем реже он дает "ложноположительные" результаты. Ложноположительные результаты исследования могут привести к неправильному диагнозу и назначению ненужных и, возможно, ухудшающих качество жизни пациента диагностических и лечебных процедур. Чувствительность ПЦР отличается чрезвычайно высокой чувствительностью. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК (РНК) последовательности в исследуемом материале. Аналитическая чувствительность набора это предел измерения данного ПЦР-диагностикума. Определяется в копиях ДНК или РНК на мл биологической пробы или в геномных эквивалентах ГЭ/мл. Диагностическая чувствительность – число положительных реакций при тестировании образцов от больных опытной группы с подтвержденным диагнозом. Метод ПЦР позволяет выявлять единичные клетки бактерий или вирусов. Аналитическая чувствительность ПЦР-анализа составляет 1–100 клеток в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов – 103–105 клеток. Это позволяет использовать ПЦР, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра например, при количественной (концентрация) оценке содержания НК в биологической пробе, при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций. 24 Некоторые тест-системы допускают осуществление одновременного определения нескольких инфекций в одной реакции амплификации, если для определяемых инфекций совпадают программы проведения реакции. Следует отметить, что в этом случае чувствительность реакции уменьшается пропорционально разбавлению. Поэтому, рекомендуется одновременно определять не более трех инфекций за одну реакцию. Чувствительность методов исследования приобретает особенно большое значение в случаях, когда требуется исключить наличие особо опасного инфекционного заболевания. Чем чувствительнее данный метод исследования, тем реже он дает "ложноотрицательные" результаты. Ложноотрицательными называют результаты, не позволяющие выявить имеющееся у пациентов заболевание. Сравнительная оценка диагностической чувствительности различных методов, проведенная в нескольких зарубежных исследовательских центрах, показала, что экспресс-тесты имеют чувствительность 40–60%, ИФА – 50–70%, прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) – 55–75%, культуральное исследование – 60–80%, а ПЦР – 90–100%. Актуальность ответа (быстрота получения результата анализа) Скорость и высокая производительность (возможность параллельного анализа большого количества образцов) являются бесспорными преимуществами данного метода. Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Преимущество ПЦР в скорости получения результата по сравнению с культуральными методами особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов, при идентификации возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки, при определении лекарственной устойчивости у штаммов микобактерий туберкулеза. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ в течение рабочего дня. ПЦР позволяет осуществить определение возбудителя инфекции или дефектного гена в организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде (серонегативной фазе) или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном (фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства. 25 Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в неонтологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба для чувствительности или специфичности результата. Возможность экспертизы. Комплексное обследование пациента различными лабораторными методами дает возможность врачу-клиницисту получать более полную информацию, как о наличии инфекционного агента, так и об иммунном статусе. Это позволяет более точно ставить диагноз, назначать соответствующее этиотропное лечение и вести последующий контроль терапии. Исследуемый биологический материал Материалом для ПЦР могут быть соскобы эпителиальных клеток, кровь и ее компоненты, костный мозг, плевральная, синовиальная и спинномозговая жидкости, моча и ее клеточный осадок, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, слюна, плевральный выпот, сперма, секрет простаты, желудочный сок, слезная жидкость, выделения молочных желез, смывы и другие биологические жидкости, биоптаты, секционный (аутопсийный) материалы, отделяемое везикул, фиксированные или парафинированные ткани. Биологическим материалом для ПЦР-диагностики может служить бактериальная культура, сточные воды, почва, продукты питания, корма. Локализация возбудителей 1. Вирусные гепатиты В, С (кровь, биоптаты, соскобы, слюна). 2. Туберкулез (кровь, моча, секционный материал, мазки, мокрота, смывы, 3. 4. 5. 6. БАЛ, плевральный выпот). Папилломавирусы человека (эпителий слизистой, биоптаты). Трихомонады, гонококки, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, герпетические инфекции, кандиды - мазки, соскобы (со слизистых оболочек урогенитального тракта), клеточный осадок мочи. Для выявления ДНК Chlamydia trachomatis и др. инфекционных агентов, возможно, также использовать мазки с конъюнктивы, синовиальную жидкость. Для выявления ДНК из герпетической группы можно использовать отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний). Токсоплазма гондии (ликвор, кровь). Энтеровирусы (ликвор, сточные воды, носоглоточное отделяемое, моча) 26 Правила забора материала и транспортировки клинического материала для ПЦР-диагностики 1. Отбор клинического материала осуществляет медицинский персонал с 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. соблюдением правил противоэпидемического режима, только стерильными одноразовыми инструментариями (шприцы, соответствующие зонды, цитощеточки и пр.), в одноразовых перчатках. Максимально полно собрать материал из выбранного локуса, используя подходящие для этого аппликаторы – зонды, цитощетки (обеспечить адекватность клинического образца). Сохранить полученный материал (ДНК/РНК микроорганизмов), используя надежные транспортные среды и консерванты предоставляемые ПЦРлабораторией. Среда для транспортировки и хранения клинического материала обеспечивает стабильность РНК и ДНК при комнатной температуре до 28 дней. Поместить взятый материал в вакуэты с ЭДТА (кровь), в одноразовые химически чистые пробирки «эппендорф» (мазки, ликвор, биоптат и др.). Основным условием при сборе материала является предотвращение попадания в пробу ДНК-аз и рибонуклеаз, т.к. Рибонуклеазы и ДНК-азы – ферменты деградации РНК и ДНК. Они чрезвычайно стабильны в окружающей среде, выдерживают длительное кипячение. Основной источник нуклеаз – кожные покровы, частицы пыли. Пластиковые пробирки и наконечники должны иметь маркировку «DNase, RNase- free» (свободные от нуклеаз). Сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек. При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгивания и расплескивания, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей. Для исключения взаимной контаминации образцы хранить и транспортировать в отдельном полиэтиленовом пакете или штативах. При необходимости переноса образца использовать автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками с аэрозольными барьерами. До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранить при температуре 2–4° с не более 48 часов. Необходимо минимизировать 27 время от забора образца до постановки ПЦР-анализа. Транспортировка образцов осуществляется в сумках-холодильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом. Кровь, плазма, сыворотка Забор крови рекомендуется проводить с использованием вакуумных систем. Внедрение таких систем позволяет стандартизировать манипуляции с кровью, положительно сказывается на всех этапах лабораторного исследования и в целом переводит работу лаборатории на иной, более высокий уровень качества. Их использование гарантирует защиту персонала от инфицирования, сокращается время, затрачиваемое на процедуру забора крови, значительно реже сопровождается гемолизом, сохранить стерильность проб крови и позволяет герметично транспортировать пробы крови. Венепункцию рекомендуется выполнять натощак из локтевой вены в специальную вакуумную пробирку с антикоагулянтом, после чего пробирка переворачивается для перемешивания несколько раз. Пробирки с кровью хранят в холодильнике при +4°С – +8°С. Максимальный срок хранения крови – 1 сутки (не замораживать!). В случае необходимости длительного хранения необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -16о-20о С не более 2 недель. Характеристика вакуумных систем, используемых для ПЦР-диагностики: 1. Вакуэты с ЭДТА (6 %) – используется для проведения качественных и количественных исследований. ЭДТА-антикоагулянт хорошо фиксирует нуклеиновые кислоты клетки. 2. Вакуэты с цитратом натрия (3,8 %) – используется для проведения качественных и количественных исследований. Не подходят для длительной транспортировки т.к. цитрат является хорошей питательной средой для посторонней микрофлоры. 3. Вакуэты без антикоагулянтов (сыворотка крови) – используются для проведения качественных исследований. Использования сыворотки крови для количественных исследований нежелательно, т.к. часть инфекционного агента оседает в сгустке крови, при этом снижается возможность определения количественного содержания его в крови. 4. Вакуэты с гепарином - категорически не подходит для ПЦР - реакции. Гепарин является полианионом, как и ДНК, поэтому в ПЦР-реакции конкурирует с ДНК. 28 Соскоб с эпителиальных клеток для выявления ДНК возбудителей инфекций, передающихся половым путем У мужчин материалом для скрининга на ИППП служат соскобы из уретры, осадки клеток первой порции утренней мочи, помещенные в 300 мкл транспортной среды, секреты предстательной железы. Достаточно информативным является исследование у мужчин методом полимеразной цепной реакции осадка первой порции утренней мочи. У детей материал берут с наружного отверстия уретры, осадки клеток первой порции утренней мочи, мазки с конъюнктивы. Для скрининга на ИППП у женщин исследуют соскоб (мазок) из уретры, цервикального канала, нижнего свода влагалища, осадки клеток первой порции утренней мочи, которые помещаются в транспортную среду. При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на герпетическую группу). В некоторых случаях для диагностики можно использовать образцы выделений из влагалища, в том числе взятые тампоном самостоятельно без посещения кабинета забора клинического материала. Забор материала у девочек производится со слизистой оболочки преддверия влагалища, с наружного отверстия уретры, осадки клеток первой порции утренней мочи, мазки с конъюнктивы. Факторы, влияющие на эффективность выявления урогенитальных патогенных микроорганизмов с помощью НК. Причинами ингибирования ПЦР-реакции могут быть: 1. Наличие цервикальной слизи в клиническом материале (частой причиной патологических выделений могут быть воспаления, ассоциированные с бактериальным вагинозом и инфекционной патологией: кандидоз, трихомоноз, хламидийной или гонококковой инфекциями). 2. Гемоглобин 3. Гепарин 4. Слизь (мукополисахариды) 5. Ионы металлов (СА2+, Fе3+) 6. Соли 7. Билирубин и желчные кислоты 8. Гормоны 9. Ферменты 10. Иммуноглобулины 29 11. Продукты жизнедеятельности микроорганизмов Правила подготовки больного для ПЦРдиагностики урогенитальных инфекций 1. За 5–7 дней до приема необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры; 2. Рекомендуется воздерживаться от мочеиспускания в течение 1,5–2 часов и более перед взятием материала; 3. Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи; 4. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального трата рекомендуется применять провокацию. Забор материала производят после провокации и через 24–48–72 часа; 5. Взятие материала должен производить врач акушер-гинеколог при подозрении на инфекционную природу патологического процесса; 6. Контроль проведенной терапии следует проводить через 3–4 недели после окончания химиотерапии. Полная элиминация ДНК происходит в период от 2-х до 3-х недель. 7. Оптимальным для персистенции и размножения возбудителей ИППП являются определенные участки цилиндрического эпителия мочеполовых путей (передняя уретра на глубине 2,5–4 см у мужчин и слизистая оболочка цервикального канала матки 1,5 см у женщин). 8. При взятии соскоба из уретры у мужчин необходимо обработать область наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором, после чего зонд осторожно вводят на глубину 1–4 см и совершают одно–два вращательных движения, производя соскоб эпителиальных клеток, и переносят зонд в пробирку с транспортной средой. 9. Для получения материала из уретры у женщин – зонд осторожно вводят на глубину 1 см и совершают одно–два вращательных движения, после чего зонд извлекают. 10. При взятии материала из шейки матки ключевым моментом является удаление слизистой пробки. От тщательности проведения этой подготовительной процедуры во многом зависит возможность правильного соскоба из цервикального канала. Слизистую пробку удаляют стерильным ватным тампоном на стерильном пинцете, обрабатывают шейку матки стерильным физиологическим раствором и затем берут материал цитощеточкой cervex brush или voba–brush. Ее использование имеет ряд преимуществ, поскольку для получения информативного результата важно присутствие в соскобе клеток со всей поверхности шейки матки, 30 цервикального канала, зоны трансформации и наружной части шейки матки. Щеточка вводится в канал на глубину 0,5–1 см и вращается примерно 15 секунд (одно–два вращательных движения) после чего извлекается. 11. У женщин для выявления трихомонад, гонококков и гарднерелл, а также для интегральной диагностики бактериальных вагинозов также рекомендуется брать материал из заднего свода влагалища. 12. Материал рекомендуется набирать в одноразовую стерильную пробирку (Эппендорф 1,5 мл) или в пробирку с 500 мкл транспортной среды. Она содержит компоненты для растворения слизи, угнетения роста посторонних микроорганизмов, стабилизирует ДНК/РНК возбудителей, а также контролирует рН среды (женская среда). Применение транспортной среды обеспечивает качество на преаналитическом этапе, так как позволяет хранить клинический материал при +25оС в течение 28 суток. 13. По Европейским стандартам диагностики заболеваний, передаваемых половым путем, для ПЦР–методов используется материал, полученный как инвазивным – из уретры, так и неинвазивным способом – первая порция мочи. 14. Объектом исследования на наличие возбудителей ИППП могут быть также смывы со слизистой оболочки глаз, носоглотки, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж. Мазок с конъюнктивы, слизистой зева и дыхательных путей Забор материала производится рабочей частью стерильного одноразового аппликатора. Слегка проводят им 1–2 раза по слизистой в местах предполагаемой локализации инфекционного агента. После забора материала аппликатор помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой. Тщательно перемешивают, остатки жидкости на зонде отжимают о стенки пробирки, аппликатор извлекают (выбрасывают в контейнер с дезинфицирующим раствором) или отрезают, оставляя рабочую часть в пробирке с транспортной жидкости. Приготовленную таким образом пробу передают в лабораторию. Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С. Моча Первая порция утренней мочи в количестве 10 мл собирается в специальный флакон или пробирку без консервирующего раствора. Использование домашней посуды вместо специальных контейнеров и пробирок 31 приводит к контаминации проб, получению заведомо ложных результатов и невозможности стандартизации. Максимальный срок хранения отобранного материала одни сутки в холодильнике при температуре +4°С. Мокрота Мокроту собирают утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10-15 мл после проведенного инструктажа по забору материала в домашних условиях, либо в ЛПУ под контролем медперсонала. Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С. Синовиальная жидкость Забор материала производится одноразовым шприцом в количестве 1 мл. Отобранный материал помещают в сухую одноразовую пробирку типа “Эппендорф”. Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С. Другие биологические жидкости Секрет простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям стандартным способом с использованием стерильного (одноразового) инструментария в количестве 0,1–1,0 мл в стерильные разовые пробирки с плотно закрывающимися крышками. Секционный материал Кусочки органов или ткани объемом примерно 2–3 мм3 помещают в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1.5 мл. Максимальный срок хранения материала одни сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С. Применение метода ПЦР в медицине С помощью лабораторных данных 60–80% всех медицинских решений клиницисты принимают по результатам клинико-лабораторных исследований. Лабораторные данные позволяют врачу увереннее проводить разработку плана обследования и лечения пациента, вести наблюдение за эффективностью терапии. Диагностическое значение ПЦР-исследований в клинике инфекционных заболеваний Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет иногда большое значение для 32 решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии, способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных и наследственных заболеваний. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР (Табл. 4). Особое место в этом ряду занимают вирусные инфекционные агенты и микобактерии туберкулеза. ПЦР открывает поистине фантастические возможности анализа генома человека – выявления дефектных генов, определяющих наследственную предрасположенность к заболеваниям. Таблица 4 Локализация возбудителей и диагностическое значение ПЦР Показания к проведению ПЦРисследования Материал для исследования Вирусный гепатит Кровь, биоптаты печени Контроль крови и препаратов из нее в трансфузиологии и трансплантологии Кровь Цервицит, эндометрит Сальпингит, периаппендицит Бактериальный вагиноз, вагинит, вульвовагинит у девочек Уретрит, простатит Эпидидимит Проктит Цервикальный соскоб, аспират из полости матки Цервикальный соскоб, биоптаты, полученные при лапароскопии Эпителиальный соскоб из влагалища Соскоб из уретры, моча, сок простаты Сперма Соскоб из прямой кишки Возбудитель Вирусы гепатитов В, С, D, G Вирусы гепатитов В, С, D, G, ВИЧ, герпеса, ЦМВ Сhlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, Candida albicans Вирус простого герпеса I, II типов Бесплодие, невынашивание беременности, эктопическая беременность Цервикальный соскоб Синдром Рейтера Эпителиальный соскоб из уретры и конъюнктивы Герпетические поражения гениталий, слизистых оболочек, кожных покровов и др. Эпителиальный соскоб с пораженного участка, кровь Вирус простого герпеса I, II, VI типов, вирус Эпштейн-Барра, вирус Варицелла Зостер Кандиломатоз Эпителиальный соскоб с пораженного участка Папилломавирус (HPV) 33 Пневмония новорожденных, рецидивирующие хронические заболевания верхних отделов дыхательной системы Эпителиальный соскоб с задней стенки глотки, бронхоальвеолярный лаваж, мокрота Сhlamydia trachomatis, Сhlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycobacterium tuberculosis Конъюнктивит (в том числе у новорожденных) Эпителиальный соскоб из конъюнктивы Сhlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Вирус простого герпеса Цитомегаловирусная инфекция (в том числе внутриутробная у новорожденных) Кровь, моча, слюна, амниотическая жидкость, биоптаты Цитомегаловирус Туберкулез мочеполовых и др. органов Мокрота, бронхоальвеолярный лаваж Моча, соскоб с пораженного участка Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis Язва желудка, гастрит, дуоденит Биоптат слизистой Helicobacter pylori Туберкулез легких Особенности вирусной природы заболевания обуславливают определенные трудности их диагностики, лечения и профилактики. Весьма актуальной проблемой является адекватная этиологическая диагностика вирусных гепатитов. В настоящее время известно как минимум пять вирусов, способность которых вызывать поражение печени, доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. Существуют и другие вирусы, поражающие печень, однако при этом печеночная ткань не является местом первичной репликации вируса и поражения гепатоцитов. К таким вирусам относятся: цитомегаловирус (CMV), вирус простого герпеса (ВПГ), вирус Эпштейна-Барр (EBV) и многие флавивирусы, переносимые членистоногими например, вирус, вызывающий лихорадку Денге и желтую лихорадку. Этиологическая роль HGV и вируса TTV в развитии хронического гепатита сомнительна. Их способность специфически поражать гепатоциты подвергается сомнению, т.к. в литературе описаны только отдельные случаи вызванного ими гепатита, в то время как частота бессимптомного носительства этих вирусов в популяции очень высока. Наибольшую угрозу для здоровья населения представляют вирусные гепатиты с парентеральным путем передачи HCV, HВV, НDV. Эти инфекции характеризуются тяжелым клиническим течением, являясь частой причиной хронического гепатита. Установлено, что длительное персистирование этих вирусов в гепатоцитах является решающим фактором их малигнизации. Для надежного доказательства вирусного гепатита, в т.ч. “молчащих” форм инфекции, для оценки эффективности терапии применяются молекулярно34 биологические методы, обладающие высокой дискриминативной способностью, направленные на поиск специфичных молекулярных маркеров. Гепатит А (HАV), Е (HЕV) Для гепатитов HАV и HЕV не характерно развитие хронического (протекающего больше 6 мес.) заболевания печени. Вирусы гепатита А и Е передаются фекально-оральным путем и чаще всего обнаруживаются в местах с плохими санитарными условиями. РНК вируса гепатита HАV появляется в крови больного гепатитом А гораздо раньше, чем антитела (anti-HAV IgM). Для диагностики вирусного гепатита А традиционно используются ИФА тест-системы (для выявления антител к вирусу гепатита А класса IgM). Иммуноглобулины класса IgM сохраняются после перенесенного заболевания в течение нескольких месяцев (до года), что может приводить к гипердиагностике HAV при развитии в этот период поражения печени другой этиологии. Использование тест систем для выявления РНК HАV в плазме крови больных позволяет наиболее точно установить этиологию заболевания и его острую фазу и правильно интерпретировать данные серологических исследований. Кроме того, метод ПЦР позволяет эффективно выявлять HАV в концентратах проб воды из эпидемических очагов заболевания. Гепатит В (HВV) Особую ценность представляет ПЦР для обнаружения вирусов гепатита В, позволяя: 9. диагностировать его острую фазу. ДНК вируса гепатита В начинает обнаруживаться в крови больного в среднем на 20 дней раньше, чем HBsAg («Австралийский» антиген); 10. осуществлять этиологическую диагностику хронического гепатита, в т.ч. и смешанных форм HCV/ HВV, HВV/ HDV и HВV/HGV. Результатом одновременного инфицирования HВV и HDV является некровоспалительное заболевание печени различной степени тяжести, протекающее в разных формах с худшим ответом на лечение противовирусными препаратами, чем при моноинфицировании гепатита В, с большей вероятностью рецидива болезни и неблагоприятным прогнозом; 11. выявлять мутантные штаммы вируса гепатита В. В результате естественной эволюции, в процессе лечения интерфероном, вакцинацией и др. маркерными генетическими событиями, наряду с интактными (дикими), селекционировались варианты с измененным серологическим профилем. В результате мутаций в геноме НВV появились HBeAg-негативный и HBV 35 штаммы с измененной структурой HbsAg, которые приводят к более частой хронизации процесса, к фульминантному течению гепатита и резистентности к интерферонотерапии. Мутация YMDD приводит к устойчивости вируса гепатита В к ламивудину. Раннее выявление мутантного штамма вируса у пациентов, находящихся на монотерапии зефиксом (ламивудином), необходимо для назначения адекватной антивирусной терапии и своевременной коррекции лечения вирусного гепатита. Выявление ДНК HВV у мутантных штаммов может стать единственным свидетельством репликации вируса; 12. осуществлять мониторинг активности вирусной репликации; 13. контролировать эффективность противовирусной терапии; 14. выявлять виремию у доноров крови. В качестве дополнительных маркеров для объяснения тяжелой ВГВинфекции стали применяться отличительные данные по генотипу возбудителя инфекции: наличие характерных мутационных замен, вставок и делеций в геноме инфицирующих штаммов ВГВ у больного. Для гепатита В известно по меньшей мере восемь генотипов (A–H). Считается, что вероятность развития гепатоцеллюлярной карциномы при поражении печени различных генотипов гепатита В может быть различной. С этой точки зрения наиболее опасным генотипом HBV вируса считается генотип С, который ассоциирован с продолжительностью заболевания и тяжестью печеночных изменений. Гепатит D (ВГD) Возбудитель HDV является уникальным среди всех вирусов гепатита, а также самым вирулентным. Как вирус он неполноценен, т.к. не может реплицироваться и инфицировать человека, не зараженного вирусом гепатита В. Чтобы репродуцироваться в организме человека, вирусу гепатита D необходима внешняя оболочка вируса гепатита В (HВV). HDV состоит из РНК, внутреннего антигена (HDAg) и внешней оболочки, состоящей из HBsAg. HDV встречается только у улиц, инфицированных возбудителем гепатита В. Вирус гепатита HDV, так же как и вирус гепатита В, передается через кровь и жидкости организма. Симптомы гепатита HDV идентичны с проявлениями других форм вирусных гепатитов и включают в себя желтуху, лихорадку, недомогание, темную мочу и тошноту. Несмотря на то, что симптомы сходны, заболевание гепатитом HDV протекает в более тяжелой форме, чем заболевание только гепатитом В. Основной особенностью патогенеза HDV-инфекции является ведущая роль HDV по сравнению с HBV. При этом активная репликация HDV чаще приводит к подавлению репродукции HBV. 36 Существуют два типа инфицирования: коинфицирование и суперинфицирование вирусом гепатита HDV. Коинфицирование происходит, если пациент одновременно инфицируется вирусом гепатита HDV и вирусом гепатита HBV. Суперинфицирование происходит, если больной с хроническим инфицированием вирусом гепатита HBV заражается вирусом гепатита HDV. У таких пациентов, как правило, наблюдается внезапное ухудшение состояния при заболевании печени. У пациентов с гепатитом HBV, которые инфицируются вирусом гепатита HDV, течение хронического гепатита становится более агрессивным и наблюдается очень высокий уровень цирроза и развития терминальных стадии заболеваний печени, что делает такое суперинфицирование чрезвычайно опасным. Гепатит С (HCV) Инфицирование гепатитом С является одной из основных причин развития хронических (до 85%) диффузных заболеваний печени и гепатоцеллюлярной карциномы (первичного рака печени). Отличительной особенностью ВГС является многолетнее латентное или малосимптомное течение по типу так называемой медленной вирусной инфекции. В таких случаях заболевание большей частью долго остается нераспознанным и диагностируется на далеко зашедших клинических стадиях, в том числе на фоне развития цирроза печени и первичной гепатоцеллюлярной карциномы. В настоящее время наиболее распространенным методом лабораторной диагностики гепатита HСV является иммуноферментный анализ, направленный на выявления специфических антител в сыворотке крови. При использовании тест-систем даже 3-го поколения, считающихся наиболее чувствительными и специфичными, не всегда удается своевременно поставить диагноз. В большинстве случаев это связано с существованием «серологического окна». Этот период может продолжаться от 3 недель до 6 месяцев. Кроме того, наличие антител к вирусу гепатита HСV не свидетельствует о наличии заболевания. Тестсистем для выявления антигенов вируса гепатита HСV в настоящее время в практическом здравоохранении нет. Одним из основных маркеров активности патологического процесса является репликация вируса, для доказательства которой необходимо выявление самого вируса или его компонентов. РНК HCV обнаруживаются в сыворотке крови уже в течение первой недели после инфицирования 37 Учитывая неуклонный рост заболеваемости вирусным гепатитом HCV, проблема этиологической диагностики этого заболевания становится все более актуальной. ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С, позволяя: 15. установить факт инфицированности гепатитом С и выявить смешанные формы HСV/HВV и HCV/HGV. При микстинфекции вирусы гепатитов HCV и HBV оказывают взаимное влияние на течение инфекционного процесса. HВV подавляет развитие HСV за счет стимуляции в организме больного неспецифических цитокинов. С другой стороны, коровский белок HСV подавляет репликацию HВV, связываясь с прегеномной РНК HВV, препятствуя ее упаковке. При коинфекции вирусом гепатита HGV в подавляющем большинстве исследований наблюдался менее выраженный синдром цитолиза. Подобный феномен благоприятного влияния HGV описывают у пациентов с ВИЧ-инфекцией, у которых коинфекция вирусом гепатита HGV способствовала замедлению развития СПИД (дискутабельные данные); 16. установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК HCV (при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа HCV (генотип 1 хуже отвечает на противовирусную терапию по сравнению с генотипами 2 и 3). Наличие генотипа 1, высокий уровень виремии, ассоциировано с продолжительностью заболевания и тяжестью печеночных изменений; 17. оценить эффективность проводимого лечения. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на двенадцатой неделе лечения; 18. оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК HCV через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения. В настоящее время успешно реализуются количественные методы ПЦРанализа. Хорошим прогностическим признаком при назначении терапии является низкий уровень виремии – менее 30000 ME/мл. Количественный ПЦР-тест является информативным параметром отклика пациента на терапию (Рис. 6). 38 ПЦР в реальном времени HCV 70000 65236 60000 Количество геномных эквивалентов / мл 50000 40000 30000 20000 12476 9451 10000 1450 510 0 0 3 months 6 months 9 months 12 months + + + + + Качественное определение HCV Рис. 6. Преимущества выявления HCV количественным метода ПЦР в реальном времени перед качественным методом При проводимой терапии понижение вирусной нагрузки является явным маркером того, что пациент хорошо реагирует на выбранные лекарственные препараты и их дозу. В случае, когда в течение трех месяцев не происходит значимого уменьшения уровня вирусной нагрузки (в 100 и более раз), обычно рекомендуется изменение дозы или смена препарата и схемы лечения. В связи с этим важно постоянно контролировать ход лечения. Количественное определение РНК вируса гепатита С в плазме крови во время лечения является необходимым исследованием и позволяет врачам выбрать оптимальную схему лечения для каждого пациента. Использование ПЦР в пульмонологии и фтизиатрии В пульмонологии методы ДНК-анализа применяется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, рецидивирующих хронических бронхитов, туберкулеза легких. Обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в клинических образцах является одним из основных диагностических подходов во фтизиатрии. В настоящее время классические методы выявления возбудителя по своей эффективности уже не удовлетворяют клиницистов. Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью: для обнаружения микобактерий туберкулеза необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 тыс. микробных клеток. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10-30%. Чувствительность 39 бактериологического посева значительно выше – 20-100 микробных клеток, однако, исследование занимает длительное время – один – три месяца. Морфологическая диагностика сложна, так как требует получения биоптата из пораженного органа, либо заставляет идти на диагностическую операцию. В связи с этим микобактерии туберкулеза выявляют в среднем лишь у 50-60% больных активным туберкулезом. Методы диагностики с использованием серологических тестов – ИФА, РИА, РПГА, латекс-агглютинация и др. - имеют сомнительное диагностическое значение вследствие их низкой чувствительности и специфичности. Антитела к микобактериям в том или ином количестве присутствуют в крови не только больных, но и здоровых инфицированных людей. Титры антител в сыворотке крови больных активным туберкулезом и титры антител у людей с неактивным туберкулёзом зависят от состояния иммунной системы пациента и особенностями течения болезни связанной с давностью инфицирования или тяжестью заболевания. Кроме того, бактерии могут находиться в мембранной упаковке (в фагосоме), в которой антигенные детерминанты микобактерий скрыты от иммунной системы и на фоне тотальной вакцинации населения БЦЖ имеют сомнительное диагностическое значение. Поэтому все большее значение приобретают альтернативные и дополнительные методы. Совершенствуются методы культивирования микобактерий. Примером может служить радиометрический метод с использованием системы BACTEC, сокращающий время бактериологического исследования туберкулеза до 10-20 дней. Для эффективного выявления M.tuberculosis в клинических образцах применяется метод полимеразной цепной реакции. Метод ПЦР позволяет дифференцировать виды бактерий, что облегчит диагностику атипичных случаев туберкулеза (микобактериозы), часто имеющих сходную с туберкулезом клиникорентгенологическую картину. ПЦР имеет несомненное преимущество, поскольку не дает неспецифических реакций. Метод ПЦР сочетает в себе высокую чувствительность, которая не уступает культуральному методу и равна 2-50 копий генома, и высокую оперативность (время проведения анализа - 6-8 часов). В настоящее время разработаны и появились на рынке ПЦР-наборы для определения устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам и для дифференциальной диагностики микобактерий. Молекулярно-биологическим методам исследования туберкулеза придается важная роль в повышении эффективности выявления и дифференциальной диагностики туберкулеза, контроле диспансерных больных, улучшении системы эпиднадзора за туберкулезом 40 Частой причиной атипичных пневмоний, рецидивирующих хронических бронхитов являются микоплазмы, хламидии и вирусные агенты. Диагностика этих возбудителей традиционными методами микроскопии и бакпосева неэффективна. ПЦР позволяет не только диагностировать хламидиозы и микоплазмозы, но и проводить видовую идентификацию возбудителя (С. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. Pneumoniae и др.). Применение ПЦР в урогинекологической практике. Наиболее эффективно и экономически обосновано использование метода в урогинекологической практике для выявления ВПЧ, хламидиоза, микоплазмозов, хронической гонореи, герпеса, гарднереллеза. В гинекологии ПЦР-анализы – обязательная диагностическая процедура, входящая в профиль обследований различных женских заболеваний, в первую очередь, для диагностики широкого спектра заболеваний передающихся половым путем (ЗППП). Так методами ПЦР может быть диагностировано большинство инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). (Табл. 5) Таблица 5 Возбудители урогенитальных инфекций Патогенные микроорганизмы – возбудители ИППП Treponema pallidum Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis Вирусы герпеса (HSV 1,2) Условно-патогенные микроорганизмы урогенитального тракта Mycoplasma homnis Ureaplasma urealyticum Ureaplasma parvum Gardnerella vaginalis Candida spp. Другие микроорганизмы, ассоциированные с бактериальным вагинозом Вирусы папилломы человека (HPV) Большинство вышеперечисленных инфекций протекает со схожей симптоматикой и может приобретать затяжное, хроническое течение, что приводит к развитию осложнений (воспалительные заболевания органов малого таза, нарушение репродуктивной функции, осложнения в процессе беременности и др.). Воспалительный процесс урогенитального тракта может протекать с участием нескольких возбудителей. При этом этиологические агенты, вызвавшие инфекционный процесс, могут быть выявлены только на основании прямых лабораторных методов. Основные клинические синдромы и урогенитальные инфекции 41 Уретрит – воспалительное заболевание мочеиспускательного канала. За развитием уретрита стоят патогенные микроорганизмы, возбудители ИППП – гонококки, хламидии, трихомонады, вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, а также условно-патогенная флора. Традиционно при диагностике уретрита используются мазки, полученные из дистального отдела уретры, где чаще всего локализован воспалительный процесс. В тоже время, инфекция может распространяться на верхние отделы уретры, недоступные для получения с помощью стандартной процедуры. В этом случае исследование первой порции мочи с помощью высокочувствительного метода амплификации нуклеиновых кислот может способствовать выявлению возбудителя и установлению этиологии инфекции. Цервицит - воспаление слизистой оболочки шейки матки. Инфекционный цервицит чаще возникает при заболеваниях, передающихся половым путём. Его могут вызывать хламидии (Chlamydia trachomatis), гонококки (Neisseria gonorrhoeae), ВПГ, трихомонады (Trichomonas vaginalis), реже - другие микроорганизмы. Бактериальный вагиноз (БВ) – инфекционный невоспалительный синдром различной этиологии, обусловленный резким снижением перекисьпродуцирующих лактобактерий и замещением их кокко-бациллярной микроаэрофильной (G.vaginalis) и анаэробной (Bacteroides spp., Prevotella spp., Mobiluncus spp., Atopobium vaginae и др.) флорой. БВ не относится к ИППП, а является проявлением дисбиоза влагалищного биотопа. Маркерами бактериального вагиноза является снижение лактофлоры и увеличение Gardnerella vaginalis. Лактобактерии формируют своеобразный барьер на пути распространения патогенных микробов. Проблемы патологического состояния шейки матки привлекает к себе большое внимание врачей-гинекологов ввиду высокой распространенности и трудности диагностики. Вирус папилломы человека (ВПЧ) – широко распространенная и очень вариабельная группа вирусов, обладающих онкогенным потенциалом. Вирусы папилломы передаются только при тесном контакте с инфицированным или пораженным эпителием. Клетками-мишенями для ВПЧ являются эпителиоидные клетки кожи и слизистой оболочки. Вирусы могут оказывать на эпителий продуктивное и трансформирующее воздействие. При продуктивном воздействии возникают доброкачественные новообразования, при трансформирующем – дисплазии тяжелой степени, прогрессирующее развитие которых приводит к раку. Среди генитальных типов особенно актуальными являются типы вируса, 42 обладающие высокой трансформирующей активностью по отношению к эпителиальной клетке и способные провоцировать развитие злокачественных новообразований, в том числе, рака шейки матки. Не каждая инфицированная женщина заболевает раком. По литературным данным до 90% случаев инфицирования ВПЧ заканчиваются спонтанным выздоровлением, однако в 10% случаях развивается персистирующая инфекция, которая и запускает механизмы злокачественной трансформации эпителиальных клеток. Интеграцией вирусной ДНК в геном клетки хозяина и ее опухолевая трансформация чаще возникает при ослаблении иммунной системы, при взаимодействии ВПЧ с другими канцерогенными или инфекционными агентами (вирус простого герпеса 2 типа, Ch. trachomatis, цитомегаловирусы и др.). В последние годы получены новые данные на молекулярном уровне, подтверждающие онкогенность вируса папилломы. Установлено, что белки Е6 и Е7, кодируемые HPV, способны вызывать клеточную трансформацию. Показано, что белок Е7 взаимодействует с клеточным белком р53, супрессором трансформации клеток, и вызывает его деградацию, что открывает путь к перерождению инфицированной вирусом клетки, неконтролируемому делению измененных клеток и приводит к образованию обширных участков пораженного эпителия шейки матки. Наличие белка Е7 в цервикальных пробах может рассматриваться как однозначное свидетельство начавшегося процесса малигнизации эпителиальных клеток, содержащих интегрированную копию генома ВПЧ. Прогнозы по поводу онкогенной трансформации при инфицировании вирусом зависят от типа вируса и физического состояния его ДНК. Лабораторная диагностика папилломовирусной инфекции, направленная на раннее выявление носительства вируса, является важным инструментом, позволяющим контролировать распространение инфекции и своевременно назначать комплексные лечебно-профилактические мероприятия, предупреждающие развитие онкологических осложнений. Однако использование этого метода приводит к некоторой гипердиагностике, т.к. примерно в 80% случаев инфицирование ВПЧ имеет кратковременный характер и заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. В связи с этим, положительный результат при лабораторном исследовании на ДНК ВПЧ не позволяет в большинстве случаев прогнозировать развитие цервикального рака. Вирус папилломы человека подразделяется на две большие группы. Первая вызывает образование папиллом. Вторая ассоциируется с предопухолевыми 43 заболеваниями и раком шейки матки. Поэтому при наличии фоновых заболеваний шейки матки и присутствии вируса папилломы человека высокого канцерогенного типа повышается вероятность опухолевых заболеваний шейки матки. В таком случае необходимо ежегодное профилактическое обследование, включающее кольпоскопию и онкоцитологическое исследование соскоба с шейки матки. Кроме того, необходимо проведение лечения, направленного на укрепление общего и местного иммунитета и нормализацию микрофлоры влагалища. ПЦР диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций является актуальной для акушерско-гинекологической практики, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, пульмонологии, офтальмологии, неврологии. Материалом для вышеперечисленных возбудителей могут служить аспираты, носоглоточные смывы, соскобы из зева, моча, мазки из уретры, вагины и цервикального канала, соскобы клеток конъюнктивы и спинномозговая жидкость. Chlamydia trachomatis вызывает урогенитальную хламидийную инфекцию. Первоначальным очагом инфекции чаще всего является слизистая уретры у мужчин и канала шейки матки у женщин. Кроме того, Ch.trachomatis может поражать и другие слизистые, покрытые цилиндрическим эпителием (прямая кишка, конъюнктива глаза и глотка). Ch.trachomatis могут обнаруживаться в синовиальной жидкости. Для женщин хламидийная инфекция представляет наибольшую угрозу из-за слабо выраженной симптоматики и связанными с этим поздней диагностикой и несвоевременным назначением лечения. Ch.trachomatis может являться одной из причин развития вторичного бесплодия у женщин. Показано, что выделяемый хламидиями при хроническом течении заболевания белок теплового шока, сходный по своему аминокислотному составу с человеческим, способен вызывать аутоиммунные процессы в области органов малого таза и развитие бесплодия. Кроме того, Ch.trachomatis может привести к появлению антиспермальных антител, что является еще одной причиной бесплодия. У новорожденных от матерей, больных урогенитальным хламидиозом, может развиваться хламидийный конъюнктивит, уретрит, вульвовагинит, артрит и поражения других органов. Гонорея – инфекционное заболевание, передаваемое половым путем, возбудителем которого является гонококк (Neisseria gonorrhoeae). В большинстве случаев заражение происходит при половом контакте. Как правило, источником заражения бывают женщины, т.к. у них заболевание может протекать 44 бессимптомно и трудно диагностируется. Бытовой способ заражения заражение (через белье, полотенце, мочалку, посуду, воду в бассейне) встречается крайне редко, т.к. гонококковая инфекция не может существовать вне организма человека и, кроме того, бытовой способ заражения не дает возможности необходимому количеству гонококков попасть в организм. Все половые партнеры больного гонореей должны пройти обследование, а в случае необходимости, и лечение. Отсутствие каких-либо симптомов венерической болезни еще не означает, что ее нет. Подтвердить отсутствие гонококковой инфекции можно только лабораторно. Без соответствующего лечения возможны серьезные поражения органов малого таза. Заражение новорожденного возможно от больной матери в процессе родов. У детей, зараженных во время родов, гонококком поражаются глаза, что может приводить к слепоте. Трихомониаз – заболевание мочеполового тракта, возбудителем которого является трихомонада (Trichomonas vaginalis). В последнее время трихомониаз получил широкое распространение. Чаще всего им заболевают женщины детородного возраста от 16 до 35 лет. Большой процент больных составляют лица, страдающие другими венерическими заболеваниями и часто меняющие половых партнеров. Заражение трихомониазом происходит в основном половым путем, бытовым путем заразиться практически невозможно. Однако в сперме, моче и воде возбудитель остается жизнеспособным в течение 24 часов. У больных или у тех, кто перенес эту инфекцию, вырабатываются сывороточные и секреторные антитела, которые указывают на возбудителя, но иммунитета на трихомонадную инфекцию не развивается. Диагностика трихомониаза осуществляется на основании клинических признаков и лабораторных исследований. Для получения более точного результата применяется сразу несколько методов, а материал для изучения берется из различных очагов воспаления. Генитальный герпес вызывает вирусы простого герпеса I и II типов. Герпетическое поражение половых органов является одним из наиболее распространенных заболеваний в сфере клинической вирусологии. Вирус герпеса I типа практически идентичен вирусу герпеса II типа. Разница между ними заключается в строении поверхностных белков – гликопротеидов (gC, gG). Вирусы герпеса человека передаются при контакте через кожу, слизистые оболочки, гениталии, глаза и легкие. Вирус простого герпеса I типа обычно вызывает поражения, локализованные в верхней части тела (губы, лицо, руки, 45 туловище). ВПГ-II поражает, как правило, область гениталий. Однако в последние годы многие клиницисты наблюдают стирание границ в отношении анатомического тропизма вирусов, что проявляется в обнаружении ВПГ-II при поражении слизистых полости рта и ВПГ-I при поражении гениталий. Генитальный герпес характеризуется рецидивирующим течением и невозможностью полного исцеления. Клинически проявляющийся у матери генитальный герпес является источником инфицирования плода во время родов и вызывает развитие неонатального герпеса. Возможен и трансплацентарный путь передачи инфекции. В этом случае развивается генерализованная форма с тяжелыми поражениями не только кожных покровов, но и внутренних органов: печени, селезенки, надпочечников, головного мозга. До недавнего времени большинство методов лабораторной диагностики герпетических инфекций являлись серологическими. Однако эти методы имеют лишь относительную диагностическую ценность и не позволяют с достаточной степенью достоверности установить этиологию той или иной формы болезни. Учитывая, что симптоматика герпеса может быть схожа с симптоматикой других инфекций, передающихся половым путем, одной из главных задач является идентификация заболевания. Материалом для исследования может служить содержимое везикул, взятое из очага поражения, пробы из уретры или цервикального канала, кровь или слюна. Криминология ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Метод геномной идентификации личности основан на том, что в ДНК человека имеются полиморфные локусы, часто имеющие 8–10 аллелей. Определение набора этих аллелей для нескольких полиморфных локусов (7–15) у конкретного индивида позволяет получить для него своего рода "геномную карту", характерную только для этого человека. Необходим образец генетического материала с места преступления: кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически – одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint). Этот прием используется при анализе экологических проблем, когда требуется знать точный характер родственных связей в популяции. Например, использование генетического фингерпринта может позволить оценить число основателей 46 достаточно молодой популяции. Благодаря этому приему стало возможно исследовать характер взаимоотношений между поколениями: происходит ли преимущественно конкуренция между предками и их прямыми потомками, или наоборот, усиленное расселение на далекие расстояния делают такую конкуренцию менее вероятной. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов. Установление отцовства В генотипе каждого ребенка присутствуют аллели, унаследованные от биологических родителей. В основе метода геномной идентификации личности лежит изучение аллелей, уникально наследуемых ребенком от биологических родителей (ряд не сцепленных между собой полиморфных локусов, представленные в геноме человека дискретным числом тандемно повторяющихся единиц ДНК-последовательности VNTR, Variable Number of Tandem Repeat). У каждого человека клетки крови и различных тканей (костей, слюны, кожи, зубов, спермы и т.д.) содержат абсолютно одинаковую ДНК, которая остается постоянной на протяжении всей жизни, не подвергаясь изменениям. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) по исходной матрице ДНК происходит высокоспецифичная амплификация аллелей исследуемых локусов. Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК позволяет идентифицировать аллели полиморфных локусов. (Рис. 7) Рис. 7. Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) – отец, (2) – ребенок, (3) – мать. Ребенок унаследовал некоторые генетические особенности родителей Только результат анализа ДНК позволяет окончательно дать заключение о достоверности отцовства. Точность данного метода определяется характером и количеством анализируемых полиморфных локусов. 47 Персонализированная медицина Известно, что большинство лекарств действуют не на всех пациентов, для которых они предназначены, а лишь на 30–70 % от их числа. Кроме того, многие лекарства оказываются токсичными или аллергенными для части пациентов. Причины этого – отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Персонализация применения лекарственных средств на основе генетических исследований является наиболее перспективным направлением в молекулярной биологии. В будущем индивидуальную генетическую информацию будут использовать при подборе оптимальных профилактических мер и методов лечения и принятии других важных решений, касающихся состояния здоровья человека. Изучением влияния генетических особенностей на развитие фармакологического ответа у пациентов при применении тех или иных лекарственных средств занимается раздел клинической фармакологии, называемый клинической фармакогенетикой. Клиническая фармакогенетика активно развивается и уже вплотную подошла к внедрению в реальную клиническую практику, в т.ч. в России. В США одобрено для применения несколько фармакогенетических тестов: 19. выявление аллелей генов CYP2D6 и CYP2C19 для выбора антидепрессантов и нейролептиков, а также их доз; 20. выявление аллелей гена CYP2D6 для выбора дозы атомоксетина у детей с синдромом дефицита внимания; 21. выявление аллелей TPMT для выбора дозы 6-меркаптопутрина у детей с лейкозами; 22. определение экспрессии гена HER2 для выбора трастузумаба (херцептина) у женщин с раком молочной железы; 23. выявление полиморфизмов гена CYP2C9 для выбора дозы варфарина (одобрено в августе 2007 г.). Ряд компаний занимается разработкой препаратов, действующих с учетом половых и расовых различий. Примером такого является аспирин, который предотвращает инфаркт миокарда исключительно у мужчин. Разрабатывается препарат для лечения рака легких, который оказывает более выраженное влияние на женщин. Существует препарат, предназначенный для лечения людей определенной расы. Препарат BiDil применяют для лечения сердечной недостаточности у пациентов с черным цветом кожи. 48 Клонирование генов Клонирование генов – используется, в частности, для исследования генов, вызывающих наследственные болезни. В результате генно-инженерных манипуляций можно получить большое количество продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать кДНК, которую затем вставляют в вектор – фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. (Рис. 8).Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена – РНК или белка. Таким образом, в промышленных количествах получают многие белки для использования в медицине, сельском хозяйстве и др. Рис. 8. Клонирование гена с использованием плазмиды. (1) – хромосомная ДНК организма A; (2) – ПЦР; (3 ) – множество копий гена организма А; (4) – вставка гена в плазмиду; (5) – плазмида с геном организма А; (6) – введение плазмиды в организм В; (7) – умножение количества копий гена организма А в организме В. Молекулярное клонирование явилось движущей силой биотехнологической революции. Применение этого метода сделало возможным идентификацию, локализацию и описание генов, создание генетических карт и секвенирование целых геномов, проведение параллелей между генами и характеристиками организма и определение молекулярных основ этих характеристик. Примерами использования этого подхода является идентификация генов муковисцидоза, болезни Хантингтона и нейрофиброматоза и др. В последнее время активно развиваются ДНК-технологии, которые позволяют не только определять признак, но и одновременно определять точечные мутации или полиморфизм в известных участках генома, быстро получать разнообразную информацию о геноме, экспрессии и мутациях генов, используя большое количество олигонуклеотидных проб в ДНК-чипе. Эти 49 технологии предоставляют большую информацию исследователям и врачам, что, несомненно, важно для диагностики и лечения заболевания. Онкология До недавнего времени диагностика и прогноз в онкологии основывались в основном на оценке косвенных показателей, позволяющих составлять лишь наиболее общую классификацию гистологических и морфологических подтипов. Одновременный анализ экспрессии и характеристика множества генов открывает беспрецедентные возможности формирования молекулярного портрета опухоли, благодаря развитию технологии биологических микрочипов. Микрочипы представляют бесценную информацию о патогенезе заболевания, его прогрессии, восприимчивости к терапии. Получаемый при этом массив информации может стать основой для уточнения классификации опухолей, совершенствования ранней диагностики и разработки инновационных подходов к терапии рака. Применение ПЦР в практике службы крови Проблема вирусной безопасности препаратов донорской крови приобретает особую актуальность в связи с эпидемической ситуацией, сложившейся в отношении вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции. Вероятность вирусной контаминации многих сотен литров плазмы в результате попадания одной или нескольких доз плазмы от доноров в серонегативном периоде становится весьма значительной. Инкубационный период острого гепатита С длится от 6 до 12 и более недель. Время появления anti-HCV различно: в одних случаях – через 2–4 недель после начала гепатита, в других – через месяцы после повышения уровня аминотрансфераз. У ряда больных с самоограничивающимся течением инфекции anti-HCV никогда не появляются, возможно, вследствие низкой концентрации циркулирующих вирусных антигенов. При этом в сыворотке у них выявляется HCV РНК методом ПЦР. У больных с посттрансфузионным отсутствием РНК HCV кратковременное выявление anti-HCV непосредственно после трансфузии может быть обусловлено пассивным переносом anti-HCV от донора. Выявление HCV РНК с помощью ПЦР может подтвердить наличие виремии при отрицательных результатах исследования anti-HCV методом ИФА. HCV РНК появляется в крови гораздо раньше других маркеров, и обнаружить ее можно через несколько дней после инфицирования. В большинстве развитых европейских стран, с 1997 года в Нидерландах и Австралии, на известной фирме «ИММУНО», введено дополнительное генотестирование всех пулов плазмы и продуктов ее переработки. Все препараты, получаемые из этой плазмы, имеют сертификат «ПЦР-качество». 50 Генотестирование пулов плазмы и продуктов ее переработки проводится не взамен ИФА, а параллельно. Возможность генотестирования плазмы крови на вирусы не одного донора, а минипула, в котором объединены аликвоты плазмы от нескольких десятков или сотен доноров, доказана многими крупными банками крови Европы. Такое дополнительное генотестирование серонегативной крови в минипулах значительно снижает затраты, ускоряет получение результатов и реально увеличивает вирусную безопасность донорской крови и ее компонентов. При использовании крови и препаратов из нее для переливания новорожденным, больным СПИДом, лицам с пересаженными органами, получающим иммунодепрессивную терапию, необходим дополнительный контроль донорской крови на вирусы герпеса и цитомегалии. Наиболее эффективным методом анализа крови на присутствие этих возбудителей является метод ПЦР. Клиническое значение наиболее актуальных ПЦР исследований, которые выполняются в Иркутском диагностическом центре, а также правила взятия материала для этих исследований более подробно представлены в Приложении. Управление качеством ПЦР-исследований Применительно к медицинским лабораториям понятие «качество» можно сформулировать следующим образом: качество лабораторных исследований – это правильно и своевременно назначенные тесты для нуждающегося в них пациента, выполненные на достаточном аналитическом уровне с необходимой информацией для их интерпретации. ПЦР – высокотехнологический метод, требующий соблюдения строгих правил оснащения и организации работ в ПЦР-лабораториях, которые обобщены и сформулированы в нормативных документах. На основании этих документов проводится лицензирование деятельности лабораторий, занимающихся генодиагностикой. Документы, регламентирующие использование методов генодиагностики инфекций Основные документы, регламентирующие проведение ПЦР-анализа в КДЛ следующие: 1. «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарноэпидемиологических учреждений системы Министерства 51 здравоохранения СССР». № 2455-81. 2. 3. 4. 5. 6. 7. «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Постановление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 28 января 2008 г. об утверждении санитарноэпидемиологических правил. № 1.3.2322-08. «Требования к планировке помещений и режиму работы в ПЦРгенодиагностической лаборатории» // Методические рекомендации, разработанные ЦНИИЭ, РНИПЧИ, ГИСК им. Л.А. Тарасевича. «Методические указания МУ 1.3.1888-04 по организации работы при исследованиях методом ПЦР-материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности»; «Методические рекомендации по забору, транспортировке, хранению клинического материала для ПЦР-лаборатории, МЗ РФ ЦНИИЭ, 2005 г.»; «Методические указания по применению дезинфицирующего средства «ДП-2Т» МЗ РФ 2001 г.». Работа с возбудителями туберкулеза и материалом, подозрительным на инфицированность возбудителем туберкулеза, осуществляется в соответствии с «Приказом МЗ РФ от 21.03.2003 №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Основные принципы организации ПЦР-лабораторий На этапе создания лаборатории для обеспечения качества ПЦРисследований необходимы продуманные инженерно-планировочные решения, согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», методическим указаниям Следует четко разграничивать ПЦРлабораторию на "зоны" (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-реакции. Руководствуясь этими документами, лаборатория молекулярной биологии ИДЦ разделена на следующие зоны (комнаты): 1. Пре-ПЦР-помещение 1 (площадь 3,6 кв. М), которая предназначена для первичной обработки клинических образцов. Обработка клинических образцов производится в настольном боксе с ультрафиолетовыми лампами с вытяжной вентиляцией. После первичной обработки клинический материал 52 инактивируется с лизирующим буфером, обеспечивающим полное обеззараживание материала, полное разрушение клеточных мембран и лизис клеток, не повреждая ДНК и не ингибируя ПЦР. Обеззараженные пробы переносятся в закрытых пластмассовых емкостях в пре-ПЦР-помещение 2. Остатки клинического материала, использованная посуда и другие загрязненные ДНК/РНК материалы на этапах первичной обработки собираются в закрывающиеся емкости, предназначенные для транспортировки, и переносятся в автоклавную. В автоклавной для создания асептических условий приточно-вытяжная система оснащена фильтрами тонкой фиксации. 2. Пре-ПЦР-помещение 2 (площадь 34,5 кв. М) – с помощью лабораторной информационной системы (ЛИС) производится компьютерная сортировка поступивших проб на ПЦР-исследования, составление протоколов, выдача результатов лабораторных исследований. В кабинете имеется рабочая зона для выделения нуклеиновых кислот и боксированная зона для приготовления ПЦР-смеси, постановки ПЦР (внесение в подготовленные с ПЦР-смесью пробирки выделенных препаратов ДНК, РНК или кДНК). Настольные боксы оснащены ультрафиолетовыми лампами. По окончании работы все объекты-пробы убираются в холодильники. Клинические образцы и пробы, содержащие ДНК/РНК, хранятся отдельно от реагентов. На окнах предусмотрены жалюзи для защиты рабочих столов от попадания солнечного света. В кабинете установлен кондиционер в соответствии с санитарными правилами. 3. Чистая комната (площадь 2,3 кв.м.) – для приготовления реакционных смесей. 4. Пост-ПЦР-помещение. Здесь проводится электрофоретический анализ продуктов амплификации и документирование результатов с помощью видиосистемы. Комната находится в отдаленном от основных зон помещении, чтобы исключить контаминацию через движение воздуха из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения. Работа ведется в одном направлении от пре-ПЦР-помещения к пост-ПЦР-помещению. Работа производится в одноразовой рабочей одежде. После проведения и обработки фотоизображений электрофорезов ПЦР исследований и их архивации пробирки с продуктами ПЦР. Использованные наконечники для автоматических пипеток, одноразовая одежда, перчатки и другие загрязненные ДНК-ампликонами материалы обрабатываются реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1N HCI, гипохлорид Nа, 10% хлорная 53 известь, 0,2%-ный раствор ДП-2Т) с экспозицией 120 мин. Окончательную дезактивацию использованных расходных материалов и реагентов (гель, буфер для электрофореза) производят в автоклавной комнате. Порядок проведению работ в лаборатории Рабочие помещения должны быть оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м3. Лампы должны быть расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение необходимо проводить в течение одного часа до начала работы и в течение одного часа после окончания работы. Все кабинеты лаборатории оснащены в полном объеме емкостями для дезинфицирующих средств. Работа должна проводиться в лабораторной одежде. В пост-ПЦРпомещение используется разовая рабочая одежда. В пре-ПЦР и пост-ПЦР-помещениях должны работать разные сотрудники, чтобы избежать переноса продуктов амплификации на одежде и кожных покровах на этап пробоподготовки и тем самым исключить ложноположительные результаты исследований. Каждое помещение и каждый сотрудник лаборатории имеет свой набор реактивов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку. Пробирки и наконечники для автоматических пипеток при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку используются однократно. Наконечники используются только с аэрозольным барьером и обязательной сменой при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации. Во время выполнения любого вида работ с ПБА запрещается оставлять рабочее место; сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый материал и т.д.) в канализацию без предварительного обеззараживания. Текущая уборка помещений проводится ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в "чистой" зоне лаборатории с применением моющих средств, в "заразной" зоне – с применением дезинфектантов. В конце работы обработка рабочих мест производится дезрастворами в соответствии с требованиями действующих нормативных документов, с 54 последующей протиркой влажными одноразовыми салфетками для снятия остатков дезинфицирующего средства. Остатки ПБА, использованная посуда, твердые отходы из "заразной" зоны лаборатории должны собираться в закрывающиеся емкости и передаваться в автоклавную или дезинфицироваться на месте. Методы и средства обеззараживания определяются в каждом отдельном случае в зависимости от ПБА и характера обеззараживаемого материала. Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть запрещается. Перенос ПБА и использованной посуды для обеззараживания должен осуществляться в закрывающихся емкостях. По окончании работ медицинский персонал должен обработать руки дезинфицирующим раствором или 70% спиртом с последующим мытьем с мылом. Допускается использование кожных антисептиков в соответствии с инструкциями по применению. Клинические образцы следует хранить отдельно от реагентов. Для обработки и уборки рабочего места необходимо в каждом помещении иметь ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы (см. ниже). Следует отметить еще одну особенность, затрудняющую исследования ДНК и РНК, это их высокая чувствительность к нуклеазам - ферментам деградации РНК и ДНК, которые могут обнаруживаться практически везде: на кожных покровах, на предметах лабораторного оборудования, реагентах, пластике. Поэтому пластик, используемый при работе с нуклеиновыми кислотами, сертифицирован на отсутствие РНКазной и ДНКазной активности. Кроме этого, пластиковые пробирки для амплификаторов должны иметь однородные тонкие стенки (для улучшения теплопроводности и сокращения времени циклов амплификации). Обеспечение качества в ходе ПЦР-исследований В процессе ПЦР-исследования, как любого лабораторного исследования, можно выделить три этапа: преаналитический, аналитический и постаналитический. 1. Преаналитический этап включает в себя назначение врачом необходимых тестов, взятие материала, его центрифугирование и транспортировку образца в лабораторию, сортировку и аликвотирование образцов в лаборатории. 2. Аналитический – пробоподготовку и исследование образца в лаборатории. 55 3. Постаналитический – интерпретацию результатов анализа специалистом лабораторной диагностики, постановку диагноза и назначение лечения пациенту. Надежность результатов исследования обеспечивается качеством его проведения на каждом из этапов: назначение исследования —> получение материала —> проведение исследования —> отчет о результатах исследования. В настоящее время ПЦР-диагностика быстро развивается, что связано с внедрением новых технологий и обновлением приборного парка. Приборы оснащены программами, контролирующими аналитический процесс, благодаря этому количество лабораторных ошибок непосредственно во время анализа минимально. Кроме того, существует достаточно возможностей для внутри - и межлабораторного контроля качества, которые реально используются в практике ПЦР – лабораторий. При этом преаналитический этап в наименьшей мере находится под контролем лаборатории, т.к. значительная его часть проводится сотрудниками других подразделений ЛПУ. Так, причиной ошибочного диагноза, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа, могут быть: неправильная подготовка больного, нарушения процедуры взятия биологического материала у пациента, упущения при доставке материала в лабораторию, халатность или недостаточные знания при хранении и обработке проб. Преаналитический этап Зарубежная практика показывает, что важнейшим условием успешного лабораторного обследования пациентов и снижения количества лабораторных ошибок является стандартизация деятельности лаборатории и, прежде всего, процедур преаналитического этапа. Стандартизация предполагает разработку инструкций по операциям, использование которых на всех этапах ПЦР-анализа позволяет свести к минимуму вероятность возникновения ошибок. Разработка инструкций на преаналитическом этапе должна включать следующие разделы работы. 1. Показания для назначения врачом необходимых анализов. 2. Подготовка пациента к обследованию. 3. Взятие биологического материала в процедурном или смотровом кабинете (правильно выбранная стратегия забора материала обеспечивает эффективность ПЦР-диагностики). 4. Маркировка пробы и заполнение направления. 5. Условия транспортировки проб в лабораторию, сроки их доставки. 6. Температурный режим и продолжительность хранения материала. 7. Регистрацию направлений и материала. 56 8. Порядок сортировки проб в лаборатории. Существуют два вида ошибок на преаналитическом этапе при проведении ПЦР-анализа, которые ведут к неправильной постановке диагноза: ложноположительные и ложноотрицательные. Ложноположительные результаты на преаналитическом этапе (положительный результат при отсутствии возбудителя в пробе) возникают в случаях: контаминации (загрязнения) как в отдельных пробах, так и во всех пробах (тотальная контаминация). Она возникает при использовании инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных искомыми микроорганизмами, чужой ДНК или ее копиями через предметы и реагенты. В результате обнаруживается "несуществующая" инфекция. Для ее устранения следует использовать одноразовый инструментарий; неправильной тактики обследования пациента. Выявление микроорганизмов, не имеющих диагностического значения, которые могут присутствовать у здорового человека. Например, Neisseria ssp. в норме может существовать в полости рта и на других слизистых. Для уреаплазм, гарднерелл и других возбудителей значение имеют их количественные характеристики. Ложноотрицательные результаты на преаналитическом этапе (отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе) возникают в случаях: неинформированности медицинского персонала по правильности забора клинического материала. Взятие материала должен осуществлять квалифицированный специалист. Перед началом работы следует ознакомиться с «Методическими рекомендациями по взятию, транспортировке, хранению и пробоподготовке биологического материала для ПЦР-диагностики»; неосмысленного выбора биологического материала для ПЦР-исследования. Например, ДНК некоторых возбудителей неинформативно выявлять в крови (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorhoeae), осуществлять забор материала в период ремиссии (для инфекций, протекающих с периодами обострений и ремиссий) и т.д.; загрязнения пробы примесями, ингибирующими ПЦР. Гепарин, продукты гемолиза эритроцитов и некоторые препараты для местного лечения способны ингибировать (тормозить) реакцию ПЦР. Поэтому забор материала должен проводиться до лечебных манипуляций; 57 разрушения ДНК во время неправильной транспортировки и хранения пробы. Например, цельную кровь нельзя замораживать; взятия неинформативного мазка (недостаточное содержание в мазке эпителиальных клеток или содержание большого количества неинформативной слизи). Использование лабораторной информационной системы (ЛИС) позволяет существенно уменьшить процент ошибок. Целесообразно автоматизировать процесс обработки направлений. Это можно сделать, формализовав направления и используя сканер для ввода информации в ЛИС. Немаловажную роль играет форма бланка-заявки на исследование, которая должна упрощать работу клиницистов, медсестер и лабораторных регистраторов. При регистрации в лаборатории правильно заполненная форма заявки считывается специальным сканером, и перечень назначенных врачом анализов автоматически переносится в лабораторную информационную систему, формируя заявку на исследования. На рис. 9 представлена форма бланка ИОККДЦ, где для анализов методом ПЦР предусмотрены ячейки для заполнения (направляемый тип биологического материала). Аналитический этап Аналитический этап – первый этап, который осуществляется непосредственно в лаборатории. Для качественного выполнения анализов необходимо современное передовое оборудование, квалифицированные специалисты, набор реагентов, имеющих высокую диагностическую чувствительность и диагностическую специфичность. Для контролирования качества выполняемых исследований проводится внутрилабораторный и внешний контроль качества, контроль оценки качества в ФСВОК – Федеральной Системе Внешней Оценке Качества (Россия) и EQAS (США) - Международной системе оценки качества. Применение метода ПЦР требует строгого соблюдения правил в организации работы и проведении всех этапов анализа. Исследования материала от больного методом ПЦР проводят в учреждениях, имеющих разрешение на работу с патогенными биологическими агентами (ПБА) III–IV групп патогенности. Исследования разделяются на три этапа и проводятся в трех изолированных помещениях (зонах) согласно «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции». 58 Рис. 9. Формализованный бланк направления, включающий анализы методом ПЦР. Проведение ПЦР-диагностики инфекций связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств ампликонов из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки, приводит к появлению ложноположительных результатов. 59 Контроль качества ПЦР-исследований Программы контроля качества, действующие в лабораториях, не обеспечивают 100%-ной гарантии от ошибок, в них содержатся тщательно разработанные требования по квалификации персонала, текущему обслуживанию и контролю состояния оборудования, а также другим стандартным операциям. Помимо внутреннего, за лабораториями налажен внешний контроль со стороны федеральных и региональных органов контроля, а также профессиональных сертифицирующих организаций. Основные мероприятия, предусмотренные на каждом из этих трех этапов работы, представлены в таблицах ниже. Иногда, если результаты исследования не соответствуют другим данным, а состояние пациента нетяжелое и не требует экстренной помощи, врач может применить выжидательную тактику. В других случаях врач может повторить некоторые лабораторные исследования, чтобы убедиться в их соответствии исходному результату, либо в том, что результаты самостоятельно нормализовались. Подтверждение информации – путем повторения исследований, контрольных исследований через некоторое время, получения второго или даже третьего мнения – особенно важно в случаях, когда предполагается тяжелое заболевание или планируется применение сложного метода лечения. Так, ставки очень высоки при подозрении на рак, СПИД, порок развития плода. Если предполагается проведение крупной операции, применение токсичного метода лечения, либо терапия может оказаться очень тяжелой или приводящей к необратимым осложнениям, в интересах пациента провести проверку результатов обследования, даже в случаях, когда время терять нельзя. Как и в других случаях, врач должен тщательно взвесить также данные непосредственного обследования и анамнеза, чтобы понять, поддерживают ли они предполагаемый диагноз или противоречат ему. Обязательным условием для успешного применения методов молекулярной биологии является понимание возможных ошибок на всех этапах анализа, их устранение или сведение к минимуму. Для этого при проведении ПЦРисследований наряду с внутрилабораторным контролем качества проводится и внешняя оценка качества (Рис. 10), например, в Федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК, Россия). Контроль качества исследований: 60 Осуществляется постоянно путем включения в каждую постановку ПЦР- реакции положительного, отрицательного и бланк-контролей (контроль качества выделения ДНК). Периодически применяются собственные лабораторные положительные и отрицательные контроли, охарактеризованные и другими методами диагностики данной инфекции. Применяются зашифрованные контрольные образцы ФСВОК (Федеральный стандарт). Проверяется чувствительность и специфичность каждой новой серии диагностических наборов методом ПЦР, для стандартизации работы ПЦР тест-систем используются референс-панели. Преимущество имеют ПЦР-наборы, укомплектованные внутренним контролем качества. Отсутствие внутреннего контроля при рутинном клиническом ПЦРисследовании, приводит к увеличению ложноотрицательных результатов – в случае присутствия ингибиторов реакции. Контроль реакции амплификации Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные образцы положительного и отрицательного контроля. Положительный контроль – включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого возбудителя. Положительный контрольный образец, используемый в каждой постановке ПЦР должен соответствовать следующим требованиям: быть стабильным в течение срока хранения тест-системы; иметь точно измеренную концентрацию ДНК или РНК в препарате; быть стерильным; иметь аттестацию в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (наличие стандартных образцов производителя или отраслевых стандартных образцов). Отрицательный контроль – включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации, а также позволяет исключить учет ложноположительных результатов. 61 Рис. 10. Бланк ФСВОК с результатом оценки выявления вирусов гепатита С методом ПЦР. 62 Внутренний контроль ВКО ВКО – это искусственно сконструированный препарат ДНК или РНК, имеющий те же сайты узнавания праймерами, что и ДНК или РНК микроорганизма, но размер амплифицированного ВКО превышает размер специфического ампликона. ВКО не должен конкурентно ингибировать в ПЦР при минимальных количествах ДНК микроорганизма. Использование ВКО на этапе обработки клинического материала позволяет проверить качество проведения важных элементов ПЦР анализа: 1. Контроль потерь ДНК/РНК и эффективность экстракции при обработке биологического материала. 2. Контроль эффективности удаления ингибиторов ПЦР. 3. Контроль работы лабораторного персонала. Строгое соблюдение правил работы в ПЦР лаборатории позволяет обеспечить достаточную надежность лабораторных данных, что имеет огромное значение для оказания высококачественной медицинской помощи. Проблема контаминации Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. При проведении ПЦР-анализа возможны две причины возникновения контаминации: перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов; контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР – анализа ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся воздухом с пылью, с аэрозолями, а также через приборы или руки. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложнопожительных результатов. Для любой лабораторной методики основной проблемой является профилактика ложноположительных и ложноотрицательных результатов. 63 Существуют два вида ошибок на аналитическом этапе при проведении ПЦРанализа: ложноположительные и ложноотрицательные. Ложноположительные результаты на лабораторном этапе могут возникать при Контаминации (загрязнении) как в отдельных пробах, так и во всех пробах (тотальная контаминация). Это наиболее трудно выявляемый вид ошибок. Основной причиной ложноположительных результатов является так называемая перекрестная контаминация продуктами амплификации. В ходе постановки реакции амплификации происходит избирательное размножение участка ДНК (ампликона) искомого возбудителя. Количество ампликона в пробе при завершении реакции может достигать миллиардов копий. При неосторожном обращении с пробами после реакции амплификации, даже просто при открывании пробирки трудно избежать аэрозольного выброса макроколичеств реакционной смеси в атмосферу рабочего помещения. При этом может происходить контаминация воздуха, рабочей поверхности, перчаток, пипеток и т.д. Учитывая тот факт, что чувствительность реакции составляет единичные молекулы ДНК, а при аэрозольном выбросе возможно попадание в атмосферу сотен тысяч молекул, то очень высока вероятность попадания ампликона в исследуемые пробы. В этом случае получается положительный результат не вследствие наличия в пробе искомого инфекционного агента, а в результате размножения ампликона. Ложноотрицательные результаты на лабораторном этапе возникают в случаях: Потери ДНК во время неправильной транспортировки, при несоблюдении технологии выделения ДНК, при использовании некачественных реактивов. Добавление ВКО в пробу до выделения ДНК позволяет решить эту проблему. Ускоренные методы выделение ДНК также увеличивает вероятность потери ДНК/РНК, особенно заметные при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Одной из основных причин такого рода результатов является наличие в исследуемой пробе ингибиторов реакции. Чаще всего с такими результатами приходится сталкиваться при анализе клеточного осадка мочи или гнойного отделяемого, т.к. эти образцы содержат большое количество субстанций, способных ингибировать ход реакции полимеризации ДНК-мишени. Проверить наличие ингибиторов в исследуемой пробе можно путем добавления аликвоты пробы в образец с контрольной ДНК-мишенью, имеющейся в каждом наборе (ВКО). Если в результате проведенного эксперимента не получается ожидаемый фрагмент ДНК, значит исследуемый образец содержит ингибирующие компоненты. В этом случае необходимо еще раз тщательно отмыть образец, 64 убедиться в высоком качестве реагентов, используемых для выделения ДНК и повторить реакцию амплификации. Другая причина ложноотрицательных результатов это низкая активность фермента Taq-полимеразы и деградация дезоксинуклеотидтрифосфатов или олигонуклеотидных праймеров, обусловленная неправильным хранением или частым замораживанием и оттаиванием реагентов. Существует несколько способов борьбы с контаминацией: одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы. другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации. третьим – проблема ложноположительных результатов решается с помощью организационных мероприятий (см. выше). Действия при возникновении контаминации нуклеиновыми кислотами 1. Сотрудников, проводящих деконтаминацию, обеспечивают одноразовыми 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. халатами, тапочками, перчатками, одноразовой ветошью, емкостями для приготовления моющих и дезинфицирующих растворов. Каждую зону лаборатории обрабатывают работающие в ней сотрудники. Утилизируют все находящиеся в «контаминированной» зоне реактивы. Утилизируют исследуемые материалы на всех промежуточных стадиях обработки. Проводят обработку паром под давлением всей спецодежды «контаминированной» зоны. Каждую зону лаборатории разбивают на участки уборки. Для обработки каждой зоны используют новый набор уборочного инвентаря. Обработку проводят от участка к участку последовательно, каждый участок обрабатывают отдельной ветошью. Поверхности каждого участка вначале обрабатывают моющим раствором для удаления жировых загрязнений, после чего остатки моющего средства удаляют ветошью, смоченной водой. На поверхность наносят на 30 минут дезинфицирующий раствор 0.2% раствор ДП-2Т или аналогичный ему, разрешенный к применению для этих целей в установленном порядке. Остатки дезинфицирующего средства тщательно удаляют ветошью, смоченной водой. 65 10. После завершения указанной обработки проводят обеззараживание ультрафиолетовым излучением влажных поверхностей в течение одного часа. 11. Дезинфекцию дезрастворами с обработкой помещения ультрафиолетом повторяют еще раз. 12. Каждый последующий этап обработки проводят в новой одноразовой одежде с использованием новой ветоши. Для удаления остатков нанесенных на поверхность дезинфицирующих средств ветошь тщательно прополаскивают в чистой воде, обрабатываемую поверхность протирают несколько раз. После каждого этапа обработки ветошь утилизируют. 13. По завершении деконтаминации берут повторные смывы, которые исследуют на наличие НК возбудителей инфекционных заболеваний, диагностику которых осуществляют в данной лаборатории. 14. Для проведения смывов стерильный зонд смачивают в физиологическом растворе или ТЕ-буфере, после чего вращательными движениями протирают рабочие поверхности оборудования, мебели, дверных ручек и косяков, телефонов и т.п. 15. В случае получения в образцах смывов положительных результатов ПЦРанализа обработку повторяют. 16. Загрязненный расходный материал утилизируют. 17. Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля. 18. Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается. Постаналитический этап Все результаты, выходящие за пределы референсных значений, просматриваются врачом-лаборантом или врачом-аналитиком. Результаты, вызывающие подозрение или не укладывающиеся в какую-либо клиническую картину, просматриваются и в случае необходимости принимаются решения о перестановке анализа или выдаче результата с сопроводительной записью. С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа (Табл. 6). Это, прежде всего ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего 66 забор проб, т.к. именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Как показывает практика, при соблюдении правил работы и выполнении требований инструкций во время постановки ПЦР вероятность ошибок невысока. Таблица 6. Ошибки, встречающиеся при проведении ПЦР-диагностики Возможность лабораторного контроля ошибки Причина ошибки Следствие ошибки Контаминация пробы на стадии забора материала Использование при заборе пробы инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов, загрязненных “положительной” ДНК Ложнополож ительный результат Невозможен Загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР Проба содержит примеси ингибиторов ПЦР. Сильными ингибиторами являются гемоглобин, гепарин Ложноотриц ательный результат Осуществляется при использовании тест-систем с внутренним контролем Забор материала выполнен неадекватно, в пробе отсутствуют клеточные структуры. Несоблюдение правил забора материала (вместо соскоба клеток собрана поверхностная слизь) Ложноотриц ательный результат В некоторых случаях возможен при визуальном контроле Разрушение ДНК при транспортировке и хранении пробы Несоблюдение правил транспортировки и хранения проб Несоблюдение инструкции выделения ДНК; использование некачественных реактивов Нарушение правил работы в ПЦРлаборатории; использование одного наконечника при обработке разных проб; при внесении реагентов наконечник Ложноотриц ательный результат Невозможен Ложноотриц ательный результат Возможен при проведении положительного образца через все стадии пробоподготовки Ложнополож ительный результат Возможен при постановке параллельных проб Характер ошибки Потери ДНК во время пробоподготовки Контаминация в отдельных пробах 67 Способы предотвращения ошибки Использование разового инструментария и материалов; повышение образовательного уровня медицинского персонала Использование разового инструментария и материалов; соблюдение правил забора материала Соблюдение правил забора материала; использование специальных одноразовых щеточек-зондов Соблюдение правил транспортировки и хранения проб Соблюдение инструкции выделения ДНК; использование качественных реактивов Соблюдение правил работы в ПЦР-лаборатории; инструкции выделения ДНК и постановки ПЦР; использование наконечников с касается стенок пробирки; загрязнение дозатора Тотальная контаминация Загрязнение реагентов, дозаторов “положительной” ДНК фильтрами Ложнополож ительный результат Осуществляется при постановке отрицательного контроля То же Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа с результатами других исследований, например, с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа. Рассмотрим случай, когда ПЦР-анализ на хламидии дает отрицательный результат, а ИФА выявляет противохламидийные антитела. Причиной подобного расхождения может быть: “иммунологический след” – остаточный уровень IgG после ранее перенесенной хламидийной инфекции. У некоторых людей повышенный уровень антител может сохраняться многие месяцы и годы после полного выздоровления, что связано с индивидуальными особенностями иммунной системы; при проведении ИФА использовалась родоспецифическая тест-система, выявляющая все виды хламидий, в том числе, респираторные – Ch.pneumonia, Ch.pecorum, Ch.psitaci, а при проведении ПЦР-анализа – видоспецифическая на Ch.trachomatis. В случае хламидийной инфекции, вызванной Ch.pneumonia, результат ИФА будет положительным, а результат ПЦР-анализа – отрицательным; материал для ПЦР-анализа получен не из места локализации инфекционного агента. Например, при хроническом сальпингите хламидии могут быть не обнаружены в области шейки матки, а наличие инфекционного процесса будет сопровождаться выработкой антител. При туберкулёзе половых органов поражается эндометрий матки. Поэтому "привычное" для гинеколога взятие влагалищного мазка может привести к ложноотрицательному результату. При туберкулёзе данной локализации следует исследовать материал, полученный из полости матки, либо менструальную кровь. Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦРанализа не выявляются специфические антитела. Это возможно при хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией. Так, при хроническом хламидиозе до 5% больных имеют титр противохламидийных антител, не превышающий критического уровня. При первичной инфекции 68 следует также учитывать серонегативный период, когда, несмотря на клинические проявления заболевания антител еще нет. Для урогенитальных инфекций этот период может составлять до двух недель. Мировые руководства и стандарты не рекомендуют постановку диагноза «хламидиоз» по наличию антител IgA, IgM, IgG. Также не рекомендовано использовать определение антител для установления излеченности хламидиоза. Для диагностики хламидиоза, трихомониаза, микоплазмоза многолетним клиническим опытом разработаны и опробованы «классические» лабораторные методы – микробиологические (исследование мазка и посев на питательные среды), иммунологические (индикация методом ПИФ). Но под воздействием лечения морфологические и антигенные свойства возбудителей урогенитальных инфекций изменяются, и в этих случаях ПЦР-метод остается практически единственным, способным оценить результаты проведенной терапии урогенитальных инфекций. Взаимодействие лабораторной службы и врачебного персонала, является необходимым условием эффективной диагностики. Назначение тех или иных диагностических исследований целиком и полностью зависит от лечащих врачей. Стремительное развитие диагностической медицины приводит к тому, что клиницисты не могут в полной мере оценить возможности современных технологий. Часто недостаточная осведомленность или невозможность назначить нужное исследование, неправильный забор пробы приводят к тому, что уже на первом этапе допускаются ошибки, снижающие результативность использования дорогих и высокоинформативных технологий. В первую очередь необходимо отметить комплексность современной лабораторной диагностики. Сегодня вряд ли можно говорить о том, что какой-то из методов, применяемый изолированно, способен дать объективные и достоверные результаты. На начальном этапе принятия решения о подборе необходимого комплекса диагностических мер требуется ставить вопрос о разумном сочетании различных – как новейших, так и хорошо зарекомендовавших себя традиционных – методов исследования с целью верификации присутствия инфекционного агента у пациента. Исключительную важность имеет также доказательность участия инфекционного агента именно в том патологическом процессе, который наблюдают клиницисты. Проблема заключается в том, что многие инфекционные агенты, с которыми приходится сталкиваться в ежедневной практике, относятся к так называемой латентной, или оппортунистической группе. Выявление таких агентов, не всегда является свидетельством их участия в патологическом процессе. Иногда инфекционный агент может быть обнаружен, однако его участие в воспалительном процессе 69 оказывается минимальным либо вообще отсутствует, поскольку в данном случае он является сапрофитной флорой. Это касается многих как вирусных, так и бактериальных инфекций. Для того чтобы назначать этиологическое, а не синдромальное лечение, необходимо проводить мультифакторное исследование, стремясь точно определить роль того или иного патогенна в конкретной клинической картине. Использование ПЦР уже на поликлиническом этапе позволяет оперативно выявить больных пациентов и сразу после получения положительного результата анализа, в течение одних–двух суток с момента обращения, назначить антибактериальную терапию. Заключение В настоящее время ПЦР-анализ остается наиболее распространенной и динамично развивающейся диагностической технологией. Ежегодно стремительно увеличивается количество ПЦР-лабораторий, появляется множество новых тест-систем для ПЦР-анализа, предназначенных как для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов – возбудителей заболеваний, так и для исследования генов человека. При этом себестоимость ПЦР-анализа неуклонно снижается, что способствует более широкому использованию этого метода диагностики. Перспективы ПЦР-диагностики лежат в автоматизации всех процедур и совершенствовании преаналитического этапа диагностики, а также развитии мультиплексного и микрочипового подходов. ПЦР является самым чувствительным и специфичным методом прямого обнаружения возбудителей, позволяющим не только устанавливать этиологию заболевания, но и осуществлять контроль над течением инфекционного процесса и оценивать эффективность проводимой терапии. Учитывая все вышесказанное, становится очевидным, что Полимеразная цепная реакция является необходимым и обязательным методом обследования пациентов и должна находиться в арсенале каждого врача, занимающегося инфекционной и наследственной патологиями. Вопросы для самопроверки Для закрепления изученного материала по разделу контроля качества рекомендуем ответить на вопросы. Правильные ответы приведены в конце вопросов. 1. Молекулярная биология изучает: 70 1. Протекание биологических процессов на молекулярном уровне 2. Строение клетки 3. Морфологическое и физиологическое многообразие бактерий и вирусов 2. Нуклеотид – это мономер 1. Белков 2. Нуклеиновых кислот 3. Жиров 3. ДНК содержит: 1. Рибозу, остаток фосфорной кислоты, одно из четырех азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин, тимин 2. Дезоксирибозу, остаток фосфорной кислоты, одно из четырех азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин, тимин 3. Дезоксирибозу, остаток фосфорной кислоты, одно из четырех азотистых оснований: аденин, гуанин, цитозин, урацил 4. Основания, расположенные комплементарно друг другу: 1. А – Т; Г – Ц 2. А – Ц; Г – Т 3. А – Г; Ц – Т 5. Основной фермент репликации: 1. ДНК-полимераза 2. Геликаза 3. Лигаза 6. К первичной структурной организации ДНК относится: 1. Трехмерная спираль 2. Две комплементарные друг другу антипараллельные полинуклеотидные цепи 3. Полинуклеотидная цепь 7. РНК в ядре сосредоточено в: 1. Ядерной оболочке 2. Ядрышке 3. Нуклеоплазме. 71 8. При работе с контрольной сывороткой возможны погрешности: 1. Потеря вещества при открывании ампулы 2. Несоблюдение времени растворения пробы 3. Хранение контрольной сыворотки при комнатной температуре 4. Многократное замораживание контрольной сыворотки 9. Формы контроля качества: 1. Внутрилабораторный 2. Межлабораторный 3. Инспекционная проверка 10. На результат исследований влияет: 1. Центрифугирование 2. Пипетирование 3. Осаждение 4. Изменение температуры 11. Принципы проведения внутрилабораторного контроля качества: 1. Систематичность и повседневность 2. Включение положительных и отрицательных образцов 3. Включение контроля в обычный ход работы 12. Межлабораторный контроль качества дает возможность: 1. сравнить качество работы нескольких лабораторий 2. аттестовать контрольные материалы 3. стандартизировать методы и условия исследования 4. оценить качество используемых методов и аппаратуры 13. Цель внешнего контроля качества: 1. учет состояния качества проведения отдельных методов исследования в 2. лабораториях определенной территории 3. контроль состояния качества проведения методов исследования в отдельных лабораториях 4. проверка надежности внутреннего контроля качества в отдельных лабораториях 72 5. воспитательное воздействие на улучшение качества проведения методов исследования 14. Качественным исследованием можно назвать исследование, которое: 1. получило положительную оценку при проверке вышестоящей организацией 2. назначено для нуждающегося в нем пациента 3. своевременно выполнено 4. на достаточном аналитическом уровне 5. имеет информацию для интерпретации 15. Ошибки чаще всего встречаются на следующем этапе лабораторного исследования 1. Преаналитическом 2. Аналитическом 3. Постаналитическом 16. В памятке по обследованию пациентов методом ПЦР может отсутствовать информация, касающаяся: 1. Показаний для назначения необходимых анализов. 2. Подготовка пациента к обследованию. 3. Правил взятия биологического материала 4. Порядка маркировки пробы и заполнения направления. 5. Условий транспортировки проб в лабораторию и сроков их доставки. 6. Температурного режима и продолжительности хранения материала. 7. Регистрации направлений и материала. 8. Порядка сортировки проб в лаборатории. 9. Рекомендуемого лечения в случае обнаружения возбудителя. 17. У пациентки М. 25 лет в гинекологическом мазке методом микроскопии обнаружен возбудитель Trichomonas vaginalis. После проведенного лечения сделано исследование методом ПЦР на трихомониаз и гонорею. Результат ПЦР исследования трихомониаз – отрицательный, гонорея – положительный. Наиболее вероятное объяснение: 1. В лаборатории перепутали мазки 2. Больная в период лечения заразилась гонорей. 73 3. Больная была поражена двумя инфекциями, но наличие возбудитель трихомониаза в мазке маскировало присутствие Neisseria gonorrhoeae до проведения лечения. 18. У пациентки Ж. 35 лет при обследовании перед ЭКО методом ПЦР в гинекологическом мазке обнаружена ДНК возбудителя хламидиоза Chlamydia trachomatis. У пациентки в анамнезе вылеченная 10 лет назад хламидийная инфекция. У мужа аналогичное ПЦР исследование дало отрицательный результат. Наиболее вероятное объяснение: 1. Метод ПЦР является одним из наиболее чувствительных клинических методов позволяющих детектировать единичные молекулы ДНК, в мазке обнаружена ДНК возбудителей, которые погибли в результате химиотерапии 10 лет назад. 2. У пациентки хроническая хламидийная инфекция. 3. В лаборатории перепутали мазки 19. Больной П. проходит лечение по поводу вирусного гепатита С. Перед началом лечения в крови больного методом ПЦР определено количество РНК HCV в крови (вирусная нагрузка) которая составила 106 МЕ/мл. Через месяц после проведенного лечения аналогичное исследование показало 103 МЕ/мл. Интерпретация результата: 1. Лечение неэффективно 2. Лечение эффективно 3. Необходимо определить генотип вируса гепатита С 20. Пациент И. 5 лет проходит обследование как контактный по поводу вспышки энтеровирусной инфекции в детском дошкольном учреждении. При ПЦР исследовании на энтеровирусную инфекцию мазка из зева и крови пациента, РНК энтеровируса обнаружена в мазке из зева, но не обнаружена в крови. Дальнейшая тактика обследования пациента: 1. Срочная госпитализация с проведением диагностической спинномозговой пункции с последующим ПЦР исследованием ликвора на энтеровирус. 2. Результат отрицательный, больной здоров 3. У больного отсутствует вирусемия, необходимо амбулаторное наблюдение в течении инкубационного периода. 74 21. У пациентки Н. беременность 2 недели, выявлены IgM против краснухи в высоком титре. ПЦР исследование крови на краснуху возбудителя не выявило. IgG против краснухи не выявлены. Интерпретация результата. 1. Перекрестная иммунологическая реакция с другим антигеном, поскольку ПЦР отрицательна, пациентка здорова 2. Признаки начала заболевания, необходимо повторное ПЦР исследование через 2 недели для подтверждения заболевания 3. При краснухе период вирусемии очень короток и к моменту появления иммуноглобулинов вирус в крови обычно не обнаруживается. Диагноз может быть подтвержден при повторном серологическом исследовании. Ответы на вопросы для самопроверки 1. 1 2. 2 3. 2 4. 1 5. 1 6. 3 7. 2 8. все перечисленное 9. 1, 2 10. все перечисленное 11. все перечисленное 12. 1, 2, 4 13. все перечисленное 14. 2.3.4.5 15. 1 16. 9 17. 3 18. 2 19. 2 20. 3 21. 3 75 Список цитированной литературы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Бонецкий А.А., Таирова М.М., Кутукеев Т.С., Филипченко А.И., Уголбаева А.С. Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в клинической практике // Методические рекомендации.- Бишкек. - 2000.- 24 с. Гудер В.Г., Нарайанан С., Виссер Г., Цавта Б. Пробы: от пациента до лаборатории.- Git Verlag, 2001.- 106 с. Ильина Е.Н., Фомина Е.Е., Артемов Е.К., Говорун В.М., Иваников И.О., Сюткин В.Е. Хронические вирусные заболевания печени // Методическое пособие для врачей.- М., 2003.- 42 с. «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР».- № 2455-81. «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»// Постановление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 28 января 2008 г. об утверждении санитарноэпидемиологических правил.- № 1.3.2322-08. «Требования к планировке помещений и режиму работы в ПЦРгенодиагностической лаборатории» // Методические рекомендации, разработанные ЦНИИЭ, РНИПЧИ, ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Методические рекомендации по взятию, транспортировке, хранению и пробоподготовке биологического материала для ПЦР-исследований.ЦНИИЭ МЗ РФ.- 2003. Приложение Возможности ПЦР-диагностики в ГУЗ ИОККДЦ Комплекс исследований на заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), 2Ж3001 Исследуемый материал: соскоб со слизистых оболочек урогенитального тракта или соскоб из зева, мокрота, промывные воды бронхов, клеточный осадок мочи. 76 Подготовка: Полученный материал поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. При вялотекущих хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. 3а 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Одна из основных причин воспалительных заболеваний урогенитального тракта – инфекции, возбудители которых передаются половым путем (ИППП), представляющие собой достаточно разнообразную группу микроорганизмов. За развитием клинического синдрома могут стоять разные возбудители ИППП. Помимо отсутствия специфических клинических признаков, на основании которых можно установить этиологию заболевания, существенную проблему представляют полимикробные ассоциации, включающие представителей патогенной и условно-патогенной флоры, составляющих, по крайней мере, половину случаев ИППП. Современные эпидемиологические данные показывают, что уретриты у мужчин наиболее часто ассоциированы с Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Ureaplasma spp. (Ureaplasma parvum и Ureaplasma urealyticum). Эти же возбудители вызывают воспалительные процессы у женщин. Хламидиоз, 2Ж3002 Исследуемый материал: соскоб урогенитальный или соскоб из зева, конъюнктивы, мокрота, промывные воды бронхов, синовиальная жидкость. Соскоб поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. 3а 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Возбудитель урогенитального хламидиоза – Chlamydia trachomatis – облигатный внутриклеточный паразит со сложным циклом развития. C.trachomatis имеет строгую специфичность в отношении цилиндрического эпителия цервикального канала, уретры и прямой кишки. Инкубационный период хламидийной инфекции составляет от 5 до 30 дней. Клиническая картина зависит 77 от места поражения, времени с момента инфицирования и выраженности реакций макроорганизма. Из заболеваний, которые хламидии способны вызывать у мужчин, чаще всего встречается уретрит и его осложнения: эпидидимит и простатит. Для женщин хламидийная инфекция представляет наибольшую угрозу из-за слабо выраженной симптоматики и связанными с этим поздней диагностикой и несвоевременным назначением лечения. У женщин урогенитальная хламидийная инфекция может долгое время протекать с минимальными клиническими проявлениями, приводя к развитию восходящей инфекции с поражением органов малого таза. У них хламидийная инфекция чаще всего является причиной развития цервицита, а его осложнениями являются сальпингит и сальпингоофорит. У новорожденных, рожденных от матерей больных урогенитальным хламидиозом, может развиваться хламидийный конъюнктивит, уретрит, вульвовагинит, артрит, пневмония и поражения других органов. Обследование на наличие хламидий даже при отсутствии симптомов заболевания рекомендуется проводить лицам, входящим в группы риска, в том числе сексуально активным девушкам-подросткам, особо подверженным заражению хламидийной инфекцией, если они часто меняют половых партнеров и не пользуются барьерными контрацептивами. Целесообразно также ежегодно проводить обследование женщин детородного возраста, особенно тех, кто использует гормональные контрацептивные средства, меняет половых партнеров, в анамнезе которых имеются указания на внематочную беременность и воспалительные заболевания органов малого таза. Хламидии не относятся к нормальной микрофлоре человека, их обнаружение говорит о наличии инфекционного процесса. Туберкулез, 2ЖЗ003 Исследуемый материал: кровь, соскоб, моча, биоптат, мокрота, смывы, плевральный выпот, секционный материал, спинномозговая жидкость. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3, соскоб, мазок или спинномозговую 0,2 мл жидкость поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Туберкулёз, вопреки распространённому мнению – болезнь не только органов дыхания. Микобактерии могут разноситься с кровью и способны поражать практически все органы и системы. ПЦР-исследование на туберкулез является экспресс – диагностикой, позволяющей выявлять различные формы 78 туберкулеза, которые трудно диагностируются другими лабораторными методами. Показаниями к назначению анализа может быть лихорадка, характеризующаяся ежедневным двойным повышением и понижением температуры тела, острые воспалительные заболевания верхних и нижних дыхательных путей с длительным контактом с туберкулезным больным в анамнезе. Положительная реакция на туберкулиновую пробу (гиперчувствительность или анергия) на фоне обострения какого-либо системного заболевания, подозрение на системную волчанку. ПЦР – диагностика туберкулеза различных локализаций позволяет диагностировать активный туберкулез в несколько раз быстрее, чем бактериоскопический и бактериологический методы. С другой стороны, с помощью ПЦР можно осуществлять эпидемиологический контроль за бактериовыделителями, и тем самым индивидуально решать вопросы продолжения антибактериального лечения, несмотря на кажущуюся клиникорентгенологическую стабилизацию специфического процесса. Материалом для анализа может служить мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, спинномозговая жидкость, экссудаты, моча и пр. биологический материал, что позволяет эффективно выявлять как легочные, так и внелегочные формы инфекции. Гепатит С, 2Ж3004 Исследуемый материал: кровь с ЭДТА, биоптат. Забор крови осуществляется в пробирку антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3 поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Основной путь заражения вирусом - контакт с инфицированной кровью. Реже вирус передается половым путем. В группы риска входят: наркоманы, применяющие внутривенное введение наркотических веществ; лица, которым проводилось переливание крови; больные на гемодиализе (аппарат «искусственная почка»); лица, имеющие множественные незащищенные половые контакты; дети, рожденные от матерей – носителей вируса. Однако путь инфицирования возможно проследить не всегда. Заразиться можно и у стоматолога, и при выполнении пирсинга или татуировки в нестерильных условиях. Из-за особенностей вируса, «скрывающегося» от иммунной системы, острый гепатит переходит в хроническую форму у 80-85% заболевших. При этом острый гепатит часто протекает скрыто и поэтому не распознается. Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV свидетельством продолжающейся репликации HCV. В острой фазе гепатита РНК выявляется в 79 крови уже через одну–две недели после заражения, т.е. задолго до появления антител anti-HCV. По рекомендации ВОЗ установление диагноза гепатита "С" возможно на основании троекратного обнаружения HCV РНК в сыворотке крови больного при отсутствии других маркеров гепатита. Микоплазма гоминис, 2Ж3005 Исследуемый материал: мазок урогенитальный или мазок из зева, мокрота, промывные воды бронхов. Соскоб поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1.5 мл. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. 3а 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Микоплазмоз – заболевание, передающееся половым путем, вызванное микоплазмой. Не всегда наличие микоплазмы гоминис ведёт к развитию заболевания. Микоплазма гоминис может входить в естественную биологическую среду мочеполовых путей и способна вызывать заболевания лишь при определённых условиях. Необходимость ее лечения может определить только врач. Урогенитальный микоплазмоз обычно никак себя не проявляет, и диагностировать его можно только лабораторно. Трихомониаз, 2Ж3006 Исследуемый материал: мазок урогенитальный или мазок из зева, мокрота, промывные воды бронхов. Соскоб поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. 3а 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10-15 мл. 80 Трихомониаз (трихомоноз) – заболевание мочеполового тракта, возбудителем которого является трихомонада (Trichomonas vaginalis). В последнее время трихомониаз получил широкое распространение. Проникновение трихомонад происходит через межклеточные пространства или лимфатические щели. В уретре они закрепляются в клетках слизистой оболочки, вызывая воспаление. Заражение трихомониазом происходит в основном половым путем, бытовым путем (в бассейне, реке, в душе) заразиться практически невозможно. Однако в сперме, моче и воде возбудитель остается жизнеспособным в течение 24 часов. У больных или у тех, кто перенес эту инфекцию, вырабатываются сывороточные и секреторные антитела, которые указывают на возбудителя, но иммунитета на трихомонадную инфекцию у них не развивается. Диагностика трихомониаза осуществляется на основании клинических признаков и лабораторных исследований. Для получения более точного результата применяется одновременно несколько методов, а материал для изучения берется из разных очагов воспаления. Гепатит В, 2Ж3007 Исследуемый материал: кровь с ЭДТА, биоптат. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3 поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1.5 мл. Вирус гепатита В считается наиболее изученным среди остальных вирусов гепатита. Однако в последнее десятилетие его генетическая изменчивость стала оказывать значительное влияние на течение и исход болезни. Основным маркером инфицирования вирусом гепатита В является HBsAg. Однако в настоящее время накоплены данные о возможности существования «скрытой» HBsAg негативной ВГВ-инфекции. Часть случаев такой инфекции обусловлена наличием «ускользающего» варианта вируса, при котором не детектируются никакие маркеры вируса, но присутствует вирусная ДНК. Мутации в вирусном геноме, коинфицирование, а также начало или окончание инфекционного процесса могут сопровождаться снижением концентрации HBsAg в сыворотке крови до уровня ниже предела чувствительности большинства тестсистем. В этих случаях ПЦР диагностика является единственным диагностическим методом выявления мутантных агентов. Уреаплазма, 2Ж3009 Исследуемый материал: мазок урогенитальный или мазок из зева, мокрота, промывные воды бронхов. 81 Соскоб поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. За 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Уреаплазмоз – заболевание, вызываемое уреаплазмой (Ureaplasma urealyticum). Очень часто уреаплазмоз рассматривают вместе с микоплазмозом. Оба эти микроорганизма занимают промежуточное положение между вирусами и бактериями, относятся к внутриклеточным микробам и передаются половым путем. Клиническая роль уреаплазм до сих пор остается предметом жарких дискуссий. Трудности доказательства этиологической роли уреаплазм заключаются в их широкой распространенности среди клинически здоровых лиц, в связи с чем проводится поиск диагностических маркеров, позволяющих отличить здоровое носительство от инфекции. Достоверным патологическим маркером уреаплазм является плотность обсемененности или бактериальная нагрузка, оцениваемые при бактериологическом посеве и выражающиеся в значениях цвето-изменяющих единиц на 1 мл (ЦОЕ/мл). Среди врачейклиницистов сегодня сформировался определенный стереотип, согласно которому существует клинически значимый титр – более 104 ЦОЕ/мл, при котором необходимо назначать лечение, и состояние, оцениваемое как носительство, если концентрация микроорганизма находится в пределах 103 ЦОЕ/мл. Папиллома (ВПЧ с определением онкогенности), 2Ж3010 Исследуемый материал: мазок урогенитальный, биоптаты. Соскоб поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. За 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Вирусы папилломы человека (ВПЧ) являются широко распространенной и гетерогенной группой вирусов. ВПЧ имеют кольцевой ДНК содержащий геном размером порядка 8 тысяч пар оснований. Таксономически вирусы папилломы делятся на роды (обозначаются греческими буквами (a, b, g и т.д.), виды 82 (обозначаются арабскими цифрами и буквой рода), например a7, a9, b1 и др.), типы (обозначаются арабскими цифрами, например, 16, 18, 6, 11 и др.). Эпидемиологическии выделяют «кожные», тропные к ороговевающему эпителию типы (в основном роды b и g) и слизистые или аногенитальные (тропные к слизистым оболочкам) типы вируса (род a). Среди последних выделяют подгруппы низкого (в основном виды a1, a8, a10) и высокого канцерогенного риска (виды a5, a6, a7, a9) по их способности или неспособности оказывать трансформирующее воздействие на клетки эпителия. Эпидемиологическими исследованиями последних лет показано, что к группе высокого риска принадлежат типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82. Типы 26, 53 и 66 относятся к категории предположительно высокого риска. К группе низкого риска принадлежат типы 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81. Остальные типы относятся к категории неустановленного риска и чаще всего не ассоциированы с развитием патологий. Типы ВПЧ как высокого, так и низкого риска способны оказывать продуктивное воздействие на клетки эпителия, приводя к развитию классических проявлений папилломовирусной инфекции – остроконечных кондилом гениталий – и дисплазий легкой степени (L-SIL или CIN1). Типы высокого онкогенного риска отличает способность оказывать трансформирующее воздействие на эпителиоциты, приводя к развитию предрака (дисплазии средней и высокой степени тяжести, H-SIL или CIN2,3) и рака. Следует подчеркнуть, что развитие дисплазий не обязательно сопровождается появлением остроконечных кондилом. Генитальный ВПЧ поражает слизистые оболочки, передается при половом контакте или новорожденному от инфицированной матери при прохождении через родовые пути. В клинической практике очень важна ранняя диагностика заболевания. Гонорея, 2Ж3011 Исследуемый материал: соскоб урогенитальный или из конъюнктивы. Соскоб поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. 3а 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Гонорея – инфекционное заболевание, передаваемое половым путем, возбудителем которого является гонококк (Neisseria gonorrhoeae). Гонореей наиболее часто страдают лица 20–30 лет. В большинстве случаев заражение 83 происходит при половом контакте (вагинальном, анальном, оральном). Как правило, источником заражения бывают женщины, т.к. заболевание у них может протекать бессимптомно и трудно диагностируется. Бытовое заражение (через белье, полотенце, мочалку, посуду, воду в бассейне) встречается крайне редко, т.к. гонококковая инфекция не может существовать вне организма человека. Более того, бытовой способ заражения не дает возможности необходимому количеству гонококков попасть в организм. При этом заболевании поражаются слизистые мочеиспускательного и цервикального каналов, что приводит у женщин к воспалению шейки матки, а у мужчин к нарушению мочеиспускания. Независимо от пола длительное течение гонореи без соответствующего лечения приводит к бесплодию. Возможно, заражение новорожденного от больной матери в процессе родов. У детей, зараженных во время родов гонококком, поражаются глаза, что может приводить к слепоте. Neisseria gonorrhoeae является абсолютным патогенном, поэтому обнаружение этого возбудителя в биологическом материале свидетельствует о наличии инфекционного процесса и требует назначения лечения. Симптомы заболевания появляются на 3–5 сутки с момента заражения. У женщин появляются желтовато-белые выделения, боль внизу живота и межменструальные кровотечения, однако возможно и полное отсутствие каких-либо симптомов. У мужчин первичной формой инфекции является гонорейный уретрит, для которого характерны зуд и жжение наружного отверстия мочеиспускательного канала, которые усиливаются при мочеиспускании. Далее начинаются обильные гнойные выделения, а также сильное покраснение и отек наружного отверстия уретры. Все половые партнеры больного гонореей должны пройти обследование, а в случае необходимости, и лечение. Подтвердить отсутствие гонококковой инфекции можно только лабораторно. В Российской Федерации регламентированными методами диагностики гонококковой инфекции являются микроскопия (МС) окрашенного по Грамму препарата и бактериологический посев (БП), однако многочисленные зарубежные исследования показали, что диагностическая чувствительность указанных методов уступает современным молекулярнобиологическим тестам, основанным на методах амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР). Гепатит С количественный, 2Ж3012 Исследуемый материал: кровь с ЭДТА. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Наиболее информативным параметром отклика пациента на терапию является уровень вирусной нагрузки. Ее понижение в случае проводимой терапии является явным маркером того, что пациент хорошо 84 реагирует на выбранные лекарственные препараты и их дозу. В случае если проводимая терапия не дает результата и в течение 3-х месяцев не происходит значимого уменьшения уровня вирусной нагрузки (в 100 и более раз), обычно рекомендуется увеличение дозы или смена препарата и схемы лечения. Количественное определение РНК вируса гепатита С в плазме крови является абсолютно необходимым исследованием при мониторинге течения заболевания и проводимой терапии. Наблюдение уровня виремии во время лечения позволяет врачам более информировано вести пациента, что в свою очередь повышает вероятность благоприятного ответа. Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является "золотым стандартом" диагностики, свидетельствующим о продолжающейся репликации HCV. Генотипирование вируса гепатита С, 2Ж3013 Исследуемый материал: кровь с ЭДТА, биоптат. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3 поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1.5 мл. В алгоритм лабораторного обследования гепатита С включено определение генотипа ВГС (1,2,3). Важным прогностическим маркером эффективности противовирусной терапии при инфекции вирусом гепатита С (HCV) является его генотип. Генотип HCV определяет дозу препарата и продолжительность курса лечения. Пациенты, инфицированные ВГС 1-го генотипа, хуже отвечают на противовирусное лечение препаратами интерферонов, чем пациенты, инфицированные ВГС 2-го или 3-го генотипов. Факторами, обусловливающими эффективность лечения, являются генотипы 2 или 3, низкая вирусная нагрузка и незначительные гистологические изменения при биопсии печени. Для практического врача, принимающего решение о назначении этиотропной терапии, результат теста, определяющего генотип вируса, не менее важен, чем определение репликативной активности HCV и вирусной нагрузки. С целью выбора эффективной схемы лечения достаточно дифференцировать случаи инфицирования генотипом 1-м («genotype 1») от случаев инфицирования другими генотипами («genotype non-1»), не проводя при этом не только детализацию на уровне субтипов вируса, но и не уточняя к какому генотипу – 2-му или 3-му они принадлежат. Микоплазма гениталиум, 2Ж3015 Исследуемый материал: мазок урогенитальный, моча, секрет предстательной железы, сперма, синовиальная жидкость. Чаще всего материалом 85 для исследования является соскоб из урогенитального тракта (у женщин из цервикального канала, у мужчин – из уретры), при выборе другого биоматериала, проконсультируйтесь с врачом. У детей: у девочек берут соскоб с вульвы, у мальчиков – мочу. Соскоб поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять провокации (кроме химических). Исследуемый материал должен быть без примесей крови и слизи. 3а 3–5 суток до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. M. genitalium (класс молликуты) – самый мелкий из известных в природе свободно живущих микроорганизмов, размер его генома составляет 580 тыс.п. оснований является паразитом человека, колонизирующим слизистые оболочки урогенитального тракта и вызывающим развитие воспалительных процессов. M.genitalium вызывает слизисто-гнойный цервицит в отсутствие N.gonorrhoeae и C.trachomatis. При этом клинические проявления цервицита, вызванного M.genitalium практически не отличаются от цервицита хламидийной этиологии. Кроме того, было показана связь M.genitalium с воспалительными заболеваниями верхних отделов органов репродукции женщин. M.genitalium была обнаружена в биопсийном материале трубного эпителия при остром сальпингите у женщин. Инфицирование M.genitalium слизистой эндометрия сопровождается клинической и морфологической картиной острого эндометрита. У мужчин M.genitalium является этиологическим агентом острого и хронического уретрита, при этом в отличие от уреаплазм практически не встречается у здоровых людей. Более того, уретрит, вызванный M.genitalium, протекает в манифестной форме чаще, чем хламидийный уретрит. По данным разных авторов доля уретритов, вызванных M.genitalium, составляет от 10 до 25%. Диагностика M.genitalium невозможна с использованием методов, традиционно применяемых для выявления других возбудителей ИППП – микроскопии, вследствие чрезвычайно малых размеров возбудителя; бактериологического посева, вследствие низкой скорости деления клеток микоплазм и высоких требований к составу сред; ИФА, вследствие того, что M.genitalium обладает низкими иммуногенными свойствами; а кроме того несет родовые антигены, встречающиеся у других представителей молликут, колонизирующих человеческий организм. В связи с этим единственными 86 доступными методами лабораторной диагностики инфекции, вызванной M.genitalium, являются методы амплификации нуклеиновых кислот В отличие от других микоплазм и уреаплазм M.genitalium практически не встречается среди клинически здоровых лиц. В настоящее время M.genitalium рассматривается, как безусловно-патогенный микроорганизм, являющийся самостоятельным этиологическим агентом воспалительных заболеваний органов репродукции человека. ЦМВ, 2Ж3019 Исследуемый материал: кровь, соскобы (мазки) со слизистых оболочек урогенитального тракта, осадок клеток первой порции утренней мочи, биоптаты внутренних органов, мокрота, спинномозговая жидкость, слюна, грудное молоко, бронхоальвеолярный лаваж. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3, соскоб, мазок или спинномозговую жидкость 0,2 мл поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Возбудитель цитомегаловирусной инфекции (ЦВМ) принадлежит к семейству герпесвирусов 5-го типа. Вирус имеет сродство к ткани слюнных желез и при локализованных формах обнаруживается в этих железах. Заражение цитомегаловирусом происходит в быту: воздушно-капельным и контактным путем, половым путем, при переливании крови и трансплантации донорских органов, трансплацентарным путем, инфицирование ребенка в послеродовом периоде через грудное молоко от больной матери. Наиболее часто ЦМВ-инфекция проявляется как: ОРВИ, бронхиты, "беспричинные" пневмонии, плохо поддающиеся антибиотикотерапии. В этом случае больные жалуются на слабость, общее недомогание, быструю утомляемость, головные боли, насморк, воспаление и увеличение слюнных желез, с обильным отделением слюны и белесоватыми налетами на деснах и языке. Генерализованная форма ЦМВ-инфекции с поражением внутренних (паренхиматозных) органов. Наблюдается воспаление печеночной ткани, надпочечников, селезенки, поджелудочной железы, почек. Поражение органов мочеполовой системы у мужчин и женщин проявляется симптомами хронического неспецифического воспаления. Нередки поражение сосудов глаза, стенок кишечника, головного мозга и периферических нервов. Патология беременности, плода и новорожденного. Вероятность заражения ребенка цитомегаловирусом достаточно высока, если инфицирование матери 87 произошло во время беременности. Однако наступление беременности с уже имеющейся латентной инфекцией не всегда приводит к заражению плода. У таких женщин заражение плода может произойти только при обострении латентной инфекции с развитием вирусемии. ЦМВ – инфекция новорожденных может стать причиной желтухи, увеличения печени и селезенки, кровоизлияний во внутренние органы, различных симптомов поражения нервной системы. Возбудителем цитомегаловируса Cytomegalovirus hominis, попадая в организм один раз, остается там навсегда. Вирус Эпштейна-Барр, 2Ж3020 Исследуемый материал: кровь, соскоб, мазок, моча, биоптат, мокрота, спинномозговая жидкость. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3, соскоб, мазок или спинномозговую жидкость 0,2 мл поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Вирус Эпштейна-Барр (EBV) принадлежит к семейству герпесвирусов 4 (Human herpesvirus HHV- 4). EBV — острое вирусное заболевание, характеризующееся лихорадкой, поражением зева, лимфатических узлов, печени, селезенки и своеобразными изменениями состава крови. Вирус относится к ДНКсодержащим лимфопролиферативным вирусам. Вирус Эпштейна-Барр является причиной инфекционного мононуклеоза, гепатита, волосистой лейкоплакии, синдрома Стивенса – Джонсона. С этим вирусом также связывают развитие лимфомы Беркитта – рака лимфоузлов и носоглотки. Лимфогранулематоз (болезнь Ходжкина). ЭБВ может быть маркером имеющегося первичного иммунодефицита. Источником инфекции являются больной человек, в том числе со стертыми формами болезни, и вирусоноситель. Возбудитель передается воздушнокапельным путем, возможен контактный, алиментарный и трансфузионный пути передачи. Вирус герпеса 1-го и 2-го типов, 2Ж3021 Исследуемый материал: кровь, соскоб, мазок, моча, биоптат, мокрота, отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний), спинномозговая жидкость. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3, соскоб, мазок или спинномозговую жидкость 0,2 мл поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Мокрота и 88 моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Вирус герпеса 1-го типа практически идентичен вирусу герпеса 2-го типа. Тип болезни – генитальный герпес, или так называемая «простуда» на губах – зависит не от типа самого вируса (ВПГ-I или ВПГ-II), который находится в организме человека, а от того места, где он проживает. В большинстве случаев (80–85%) половой герпес вызван вирусом герпеса II типа (ВПГ-II). В 15–20% генитальный герпес вызван вирусом герпеса I типа (ВПГ-1). После инфицирования вирус попадает в "депо". Если речь идет о «простуде» на губах, то этим депо становится тройничный ганглий, который расположен в полости черепа – «верхнее депо». Во время рецидива вирус выходит по нервам от тройничного ганглия, идет к коже лица, подбородка, ушей, лба, слизистой рта и десен, губ и т.д. В этих местах и возможны рецидивы. При генитальном герпесе «депо» вируса находится в крестовых ганглиях – «нижнее депо» вируса. При рецидиве вирус по нервам от крестцового ганглия спускается к коже гениталий, ягодиц, бедер, лобка, слизистой влагалища, уретры. Внутри организма человека переход вируса из «верхнего депо» в «нижнее» невозможен. Учитывая, что симптоматика герпеса может быть схожа с симптоматикой других инфекций, передающихся половым путем, одной из главных задач является идентификация заболевания. Для диагностики ВПГ используют следующие методы исследования: полимеразная цепная реакция (ПЦР), выявление антигенов ВПГ. Путь заражения: половой, воздушно-капельный (очень редко), при первичной инфекции возможна передача вируса через плаценту. С помощью ПЦР можно определить 1-м или II-м типом вируса произошло заражение. Вирус герпеса 6-го типа, 2Ж3022 Исследуемый материал: кровь, соскоб, мазок, моча, биоптат, мокрота, спинномозговая жидкость. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3, соскоб, мазок или спинномозговую жидкость 0,2 мл поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Мокрота и моча собирается утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. В середине 80-х годов группа герпесвирусов пополнилась вирусом герпеса человека 6-го типа. Он был выделен из лимфоцитов крови больных, в связи, с чем получил название лимфотропного. ВГЧ-6 репродуцируется в Т-, В-лимфоцитах и макрофагах, в большей степени поражая Т-лимфоциты. Имеет тропизм к глиальным клеткам. Инфекция распространяется воздушно-капельным путем. 89 ВГЧ-6 постоянно обнаруживают в носоглоточной слизи и слюне инфицированных лиц. Возможно заражение при гемотрансфузиях, трансплантации органов, при использовании медицинских инструментов, контаминированных вирусом. Имеются сообщения о случаях заражения наркоманов, а также медицинских работников при случайных уколах иглой, содержащей кровь инфицированных или больных. Исследования показали, что инфекция широко распространена среди людей. От 60 до 96% здоровых взрослых являются серопозитивными. У подавляющего большинства зараженных ВГЧ-6 формируется латентная инфекция. С этиологической ролью ВПГ-6 связывают заболевания и клинические синдромы: острого лихорадочного заболевания, развитие внезапной экзантемы, мононуклеозоподобного синдрома. С ВГЧ-6 связывают развитие синдрома хронической усталости, для которого характерны: острое гриппоподобное начало с повышением температуры до 38°С, боли в горле, небольшое увеличение шейных, затылочных, подмышечных лимфоузлов, необъяснимая генерализованная мышечная слабость, мигрирующие миалгии, артралгии, расстройства сна, раздражительность, повышенная физическая утомляемость с последующей длительной усталостью. Для диагностики этой патологии используют молекулярно-биологические (ПЦР) и иммунохимические (ИФА) методы диагностики. Токсоплазмы гондии, 2Ж3023 Исследуемый материал: кровь, соскоб, моча, биоптат, мокрота, спинномозговая жидкость (ликвор). Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Кусочек ткани объемом примерно 2 мм3, соскоб, мазок или спинномозговую жидкость 0,2 мл поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Мокрота и моча собираются утром в домашних условиях в одноразовые пластиковые пробирки объемом 10–15 мл. Токсоплазмоз – паразитарное заболевание человека и животных, вызываемое токсоплазмами. В эпителии тонкого кишечника кошки и других кошачьих токсоплазмы проходят сложный жизненный цикл, завершающийся образованием мелких яйцевидных ооцист. Они могут вызывать у человека и животных тяжелое заболевание – токсоплазмоз. Источник инфекции – различные виды (свыше 180) домашних и диких животных (собаки, кошки, кролики, хищники, травоядные, грызуны и др.) и птиц. Заражение человека происходит при употреблении мясных продуктов и яиц не прошедших достаточную термическую обработку. Не исключена возможность заражения при попадании возбудителя на слизистые оболочки и поврежденные кожные покровы, трансмиссивным и 90 другими путями. Наблюдается и внутриутробное заражение. Токсоплазмоз протекает с субфебрильной температурой, головной болью, увеличением лимфоузлов и печени, понижением работоспособности, может сопровождаться поражением глаз, сердца, нервной и других систем и органов. Заболевание может протекать и в латентной форме. Для распознавания используют методы серодиагностики и внутрикожную аллергическую пробу, ПЦР диагностика позволяет определить наличие в организме живого паразита по присутствию его ДНК в клиническом образце. Энтеровирус, 2Ж3027 Исследуемый материал: кровь с ЭДТА, ликвор, соскоб. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Соскоб или спинномозговую жидкость (0,2 мл) поместить в стерильную пробирку типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Энтеровирусы относятся к семейству пикарновирусов. Энтеровирусная инфекция характеризуется многообразием клинических проявлений — от легких лихорадочных состояний до тяжелых миокардитов, менингитов, менингоэнцефалитов. Энтеровирусы кислотоустойчивы и относительно стабильны при низких значениях рН (<3,0), что позволяет им выживать в кислой среде желудка, а отсутствие оболочки делает их резистентными к действию желчных кислот. Энтеровирусная инфекция характеризуется многообразием клинических проявлений: от легких лихорадочных состояний до тяжелых миокардитов, менингитов, менингоэнцефалитов. Первичный очаг размножения локализован в эпителии рта, глотки, тонкой кишки, а также в лимфоидных тканях кольца Пирогова-Вальдейера и пейеровых бляшках. Возможно вторичное проникновение вируса из эпителия слизистых оболочек в лимфоидные ткани и кровоток (первичная вирусемия), а затем в различные органы и ЦНС. Основной путь передачи – фекально-оральный, возможен контактный путь передачи возбудителя с отделяемым носоглотки и через воду загрязненных водоемов. Для энтеровирусной инфекции характерна сезонность с подъемом заболеваемости в летние месяцы. Инфицированный человек выделяет вирус в течение пяти недель. Естественный хозяин вируса – человек. Сложность этиологической расшифровки ИФА методом обусловлена значительным числом серологических вариантов. Этот метод недостаточно чувствителен и специфичен, требует исследования парных сывороток. Перспективным направлением лабораторной диагностики энтеровирусной инфекции является прямой метод выявления вируса с помощью ПЦР. 91 Гепатит В количественный, 2Ж3031 Исследуемый материал: кровь с ЭДТА. Забор крови осуществляется в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Примечание. Прием материала на исследование в Иркутском диагностическом центре производится с 800 до 1500. Обращаться в регистратуру лабораторного отдела. 92
