Сравнительное изучение

Изучение влияния
фуллеренаминокапроновой кислоты (препарат Киллевир)
на морфогенез и репродукцию вируса простого герпеса (ВПГ-1)
в культуре клеток Vero
Введение.
Перспективной
группой
соединений
с
разнообразной
биологической
активностью, в частности, противовирусных препаратов, являются производные
фуллеренов. Одним из таких соединений является фуллеренаминокапроновая кислота
(препарат «Киллевир»). Ранее была показана высокая протективная активность Киллевира
в отношении экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей.
Вместе
с
тем
механизмы
противовирусного
действия
препарата
исследованы
недостаточно.
Целью настоящего исследования было сравнительное изучение действия
Киллевира и ацикловира как препарата сравнения на репродукцию и морфогенез вируса
простого герпеса 1 типа (ВПГ - 1) в культуре клеток Vero.
Цикл репликации ВПГ хорошо изучен и имеет отчетливо выраженные стадии,
определяемые при помощи электронной микроскопии по морфологическим изменениям в
инфицированной клетке. На поверхности вириона представлены 11 белков, 10 из которых
гликозилированы (gB – gM). Гликопротеины gB, gD и gE взаимодействуют с
иммуноглобулиноподобными молекулами рецепторов на наружной мембране различных
типов клеток. В результате слияния вирусной и клеточной мембран в цитоплазму
высвобождаются белки тегумента, содержащиеся между наружной вирусной оболочкой и
капсидом. Один из них, VHS, подавляет трансляцию клеточных белков, другой – альфаTIF проникает в ядро и инициирует транскрипцию ранних (альфа) генов ВПГ. Капсиды
транспортируются к ядерным порам, где вирусная ДНК высвобождается из капсидов,
проникает в ядро и замыкается в кольцо. На первом этапе транскрипции мРНК ранних
генов транспортируются в цитоплазму и транслируются. Белки – продукты трансляции
проникают обратно в ядро и запускают следующий раунд транскрипции. Таким же
образом синтезируются белки бета-генов ВПГ. На этой стадии инфекции хроматин
деградирует и распределяется вдоль внутренней поверхности ядерной мембраны.
Ядрышки распадаются. Вирусная ДНК реплицируется по механизму катящегося кольца,
что приводит к образованию конкатемеров. Гамма-цикл репликации приводит к синтезу
структурных белков вирионов и образованию пустых капсидов. Вирусная ДНК нарезается
на мономеры длиной в геном и упаковывается в капсиды. Капсиды, содержащие
вирусную ДНК, покрываются рецепторным белком и отпочковываются от внутренней
ядерной мембраны в перинуклеарное пространство. После этого оболочка капсида
сливается с наружной ядерной мембраной, высвобождая капсиды в цитоплазму. Капсиды
покрываются вторичной оболочкой при почковании в аппарат Гольджи, аккумулируются
в его цистернах и транспортируются во внеклеточное пространство (Roizman B. The
Human Herpesviruses, N.Y. 1993; Granzow et al., J. Virol., 2001, 75:3675-3684).
Материалы и методы
Клетки. В исследованиях использовались клетки Vero (почка зеленой мартышки)
из коллекции клеточных культур НИИ гриппа РАМН. Клетки, зараженные ВПГ-1 в дозе
102 CTD50 культивировали на среде DMEM с 2% эмбриональной телячьей сыворотки.
Вирус. Для заражения клеток использовали вирус простого герпеса ВПГ-1 (штамм
ЕС) из музея вирусов НИИ гриппа РАМН.
Препараты: Киллевир – фуллеренпроизводное аминокапроновой кислоты – был
предоставлен
заказчиком.
Препарат
разводили
в
минимальном
объеме
диметилсульфоксида и затем до необходимых концентраций в физиологическом растворе.
В опытах по определению вирусингибирующей активности использовали Киллевир в
конечной концентрации 3-100 мкг/мл, в опытах по изучению морфогенеза вирусной
инфекции при помощи электронной микроскопии использовали концентрации препарата
10 и 20 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали Ацикловир (2-Амино-9-[(2гидроксиэтокси)метил]-1,9-дигидро-6H-пурин-6-он,
Зовиракс)
производства
Glaxo
Welcome (UK). Ацикловир использовали в концентрации 3-30 и 20 мкг/мл в опытах по
определению
вирусингибирующей
активности
и
электронной
микроскопии
соответственно.
Препараты в соответствующих концентрациях вносили в лунки планшетов в
объеме 0,1 мл на лунку. Из исходного вируссодержащего материала готовили серию
десятикратных разведений от 10-1 до 10-6 на среде DМЕМ. Спустя 1 час после внесения
препаратов клетки инфицировали вирусом герпеса в объеме 0,1 мл на лунку. Зараженные
клетки культивировали при 36°С в атмосфере 5% СО2 в газопроточном инкубаторе Sanyo175. Срок культивирования зараженных клеток составлял 96 часов. По истечении этого
срока клетки были промыты 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буфером, и количество
живых
клеток
было
оценено
при
помощи
микротетразолиевого
теста
(МТТ),
характеризующего интенсивность митохондриального дыхания живых клеток (1). С этой
целью в лунки планшетов было добавлено по 100 мкл раствора (0,5 мг/мл) 3-(4,5диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio)
на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 37ºС в атмосфере 5% СО2 в
течение 2 часов и промывали в течение 5 минут фосфатно-солевым буфером. Осадок
растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО, после чего оптическую плотность в лунках
планшетов измеряли на многофункциональном ридере Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland)
при длине волны 535 нм. По результатам теста определяли 50% цитотоксическую дозу
препарата (CTD50), т.е. концентрацию препарата, вызывающую гибель 50% клеток в
культуре и 50% эффективную дозу, т.е. концентрацию препарата, снижающую продукцию
вируса герпеса вдвое.
Электронно-микроскопические исследования. Опытные культуры обрабатывали
препаратами в указанных концентрациях за 1 час до заражения вирусом. Через 36 часов
после заражения контрольные и опытные культуры клетки фиксировали 1,5% раствором
глутаральдегида на среде DMEM (рН 7,2), центрифугировали 20 мин при 2000 об./мин и
фиксировали 2,5% раствором OsO4 Клетки обезвоживали ацетоном в возрастающей
концентрации и заливали в смесь эпон/аралдит. Ультратонкие срезы, полученные на
ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), контрастировали уранилацетатом и цитратом
свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Japan) при
инструментальном увеличении 5000 - 50000. Фотосъемку производили на пленку ФТ41МД.
Результаты исследования.
Вирусингибирующее действие фуллеренаминокапроновой кислоты.
Токсичность Киллевира была определена ранее и составила >300 мкг/мл. Данные
по действию Киллевира на репликацию вируса простого герпеса 1 типа представлены в
табл.1.
Таблица.1. Влияние Киллевира на репликацию герпесвируса 1 типа В культуре клеток
Vero
Препарат
Концен-
Оптическая плотность в лунках при разведении
Титр
трация,
вируса
вируса,
мкг/мл
10-1
10-2
10-3
10-4
log10CTD50
100
199±3,9
194±5,5
180±4,7
179±2,3
<1,0
30
251±13,0
251±7,8
247±18,6
242±8,9
<1,0
10
41±0,3
102±5,9
212±14,5
221±7,6
2,3
3
41±0,5
59±12,7
166±23,8
185±20,0
2,7
1
41±0,3
44±0,3
56±9,3
214±2,8
3,7
30
46±0,4
195±4,2
219±4,6
213±8,5
1,5
3
53±0,0
205±3,2
194±6,7
201±3,5
1,5
41±0.3
44±2,1
52±3,9
203±6,0
3,7
Киллевир
Ацикловир
Контроль вируса без
препарата
Контроль клеток
310±13,5
----
Как следует из приведенных в таблице данных, Киллевир оказывал выраженное
противовируcное действие при герпетической инфекции in vitro. Исходя из полученных
результатов, 50% эффективная доза препарата составила 2 мкг/мл (с учетом молекулярной
массы около 1,4 мкМ). Таким образом, с учетом показателей токсичности соединения,
индекс селективности составляет >150, что свидетельствует о высоком противовирусном
потенциале Киллевира в отношении герпесвирусов.
Электронно- микроскопические исследования.
Клетки интактной культуры Vero имели округлую или овальную форму и
содержали крупное центрально расположенное ядро. В цитоплазме находились
многочисленные округлые или овальные митохондрии, вакуоли гранулярной и
агранулярной эндоплазматической сети. В вакуолях определялись рыхлые округлые тела
умеренной электронной плотности. Аппарат Гольджи был представлен скоплениями
уплощенных цистерн, вакуолями и микропузырьками. Ядерный хроматин в нуклеоплазме
в виде конденсатов располагался по всему объему ядра, в центре которого
обнаруживались крупные ядрышки (Рис.1).
Рис.1. Клетка интактной культуры Vero. Ув. 10 000.
Клетки контрольной культуры, инфицированные ВПГ-1, через 18 часов
инфекции были увеличены в размерах. Клеточные органеллы в цитоплазме выглядели
интактными. Кариоплазма в центральной части ядра была светлой, хроматин располагался
вдоль внутреннего слоя ядерной мембраны, ядрышки были разрушены. В кариоплазме
обнаруживались светлые “пустые” капсиды ВПГ-1 размером 80 - 90 нм и отдельные ДНКсодержащие нуклеокапсиды с электронноплотной сердцевиной (Рис.2). Капсиды обоих
типов локализовались преимущественно по периферии ядра и не образовывали
скоплений. В процессе почкования от внутреннего слоя ядерной мембраны вирионы
приобретали внешнюю гладкую оболочку и накапливались в цистернах перинуклеарного
пространства (Рис.3). После слияния внешней оболочки капсида с оболочкой цистерны
полученные безоболочечные капсиды транспортировались к клеточной поверхности и
почковались от плазматической мембраны, приобретая вторичную шероховатую оболочку
(Рис.4).
Рис.2. ДНК- содержащие (черные стрелки) и «пустые» (белые стрелки) капсиды
вируса герпеса 1 типа в ядре клетки Vero через 18 часов после инфицирования. Ув. 15000.
Рис.3. Накопление промежуточных капсидов вируса герпеса в цистернах
перинуклеарного пространства клеток Vero через 18 часов после инфицирования. N– ядро
с безоболочечными капсидами, C – цитоплазма. Ув. 50000.
Рис.4. Почкование вирионов герпесвируса от плазматической мембраны клетки
Vero через 18 часов после инфицирования. Ув. 50 000.
Через 36 часов после инфицирования клетки округлялись, ядра их существенно
увеличивались в размерах. Некоторые клетки были разрушены полностью (Рис.5).
Количество вирионов, находящихся на всех стадиях морфогенеза, резко возрастало (Рис.6,
a,
b).
Большинство
вирусных
капсидов
на
этом
сроке
инфекции
содержали
электронноплотную сердцевину, что свидетельствовало о нормальной упаковке ДНК
внутрь капсидов (Рис.7).
Рис.5. Деструкция клеток Vero в ходе репликации герпесвируса. Внизу –
разрушенная клетка с увеличенным ядром и вакуолизированной цитоплазмой, вверху –
интактная клетка с сорбировавшимися дочерними вирионами. Ув. 5 000.
a
b
Рис.6. Формирование ДНК-содержащих вирионов в кариоплазме клетки Vero и их
накопление в перинуклеарном пространстве клетки Vero через 36 часов после
инфицирования. Ув. 10 000 (a), 30 000 (b).
Рис.7. Безоболочечные ДНК-содержащие капсиды вируса простого герпеса 1 типа
в цитоплазме клетки Vero через 36 часов после инфицирования. Ув. 30 000.
Клетки, зараженные ВПГ-1 в условиях применения ацикловира на обоих сроках
исследования имели сохранные органеллы, идентичные по количеству и структуре
таковым в контроле без вируса. Вирусных капсидов не было обнаружено ни в ядре, ни в
перинуклеарном пространстве, ни в цитоплазме, ни во внеклеточном пространстве.
Ультраструктура клеток через 18 часов после инфицирования в условиях
применения Киллевира в дозе 10 мкг/мл не отличалась от организации интактных клеток.
Клетки имели сохранные органеллы, идентичные по количеству и структуре таковым в
контроле без вируса. Отдельные клетки имели несколько увеличенные ядра и содержали в
цитоплазме миелиноподобные структуры (Рис.8a). Количество таких структур возрастало
с увеличением концентрации Киллевира (8b), что позволяет говорить о дозозависимом
эффекте препарата. Подобные образования характерны для клеток, обработанных
химиопрепаратами, и свидетельствуют о токсических эффектах соединений.
a
b
Рис.8. Миелиноподобные структуры в цитоплазме клеток Vero через 18 часов
после инфицирования вирусом простогогерпеса 1 типа в условиях применения Киллевира
в дозе 10 (a) и 20 (b) мкг/мл. Вирусных капсидов и вирионов не отмечается. Ув. 10 000.
Киллевир в дозе 10 мкг/мл приводил к задержке морфогенеза вируса герпеса.
Вирусных капсидов через 18 часов после инфицирования не было обнаружено ни в ядре,
ни в перинуклеарном пространстве, ни в цитоплазме, ни во внеклеточном пространстве
(Рис.8). Через 36 часов после заражения количество вирусных капсидов было существенно
меньше по сравнению с зараженными клетками без препаратов. На всех стадиях
вирусного
морфогенеза
подавляющее
большинство
капсидов
не
содержало
электронноплотной сердцевины (Рис.9a-c). Морфологически ультраструктура зараженных
клеток, культивированных с вирусом в присутствии Киллевира в течение 36 часов, была
сходной с организацией зараженных клеток без препарата, в которых развитие вирусной
инфекции проходило в течение 18 часов.
a
b
c
Рис.9. Не содержащие генома капсиды вируса герпеса в ядре (a), перинуклеарном
(b) и внеклеточном пространстве клеток Vero через 36 часов после заражения в условиях
применения Киллевира (10 мкг/мл). Ув. 30 000.
Применение Киллевира в дозе 20 мкг/мл приводило к полному подавлению синтеза
капсидов в клетках как на раннем (18 часов), так и на позднем (36 часов) сроках развития
инфекции.
Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что Киллевир
обладает способностью существенно задерживать размножение вируса герпеса. Исходя из
условий постановки эксперимента, срок задержки можно определить как минимум 18
часами. Однако с учетом данных, полученных при титровании вируса в присутствии и
отсутствии Киллевира, можно говорить о необратимости такого ингибирования,
поскольку в этом эксперименте клетки культивировались в течение 96 часов, и по
окончании этого срока эффект подавления вирусспецифического цитопатогенного
действия был ярко выражен (Табл.1).
Помимо этого, исходя из факта, что вирионы в клетках, культивированных в
присутствии Киллевира, не содержат ДНК, можно предполагать, что этот препарат
способен взаимодействовать с вирусной ДНК и/или белками, принимающими участие в
упаковке вирусного генома в сердцевинные структуры вирусного капсида.
Принимая во внимание результаты экспериментов, в которых была показана
протективная
активность
представляется
Киллевира
целесообразным
при
летальной
проведение
гриппозной
экспериментов
по
пневмонии,
изучению
противогерпетической активности этого соединения на модели летального герпетического
энцефалита. В таких условиях могут быть реализованы как прямые противовирусные
эффекты препарата, как показано в настоящем исследовании, так и опосредованные
эффекты,
следствием
которых
является
высокая
защитная
активность
фуллеренаминокапроновой кислоты при гриппе, поскольку прямых противовирусных
свойств в отношении гриппа у препарата не было обнаружено.
Выводы.
1. Проведено сравнительное вирусологическое и ультраструктурное исследование
морфогенеза герпетической инфекции в клетках Vero в присутствии Киллевира и
Ацикловира.
2. При помощи титрования вируса в присутствии препарата показано, что Киллевир
обладает выраженным прямым противовирусным действием. Исходя из
полученных данных, 50% эффективная концентрация препарата составила 2 мкг/мл
(около 1,4 мкМ), а индекс селективности – 150.
3. Показано, что применение Киллевира приводит к резкому дозозависимому
снижению продукции вирионов и задержке развития инфекционного процесса.
4. Показано, что Киллевир вызывает нарушения процесса упаковки вирусной ДНК в
сердцевинные структуры вирусного капсида, что морфологически проявляется в
образовании дефектных вирионов, неспособных вызвать повторные циклы
вирусной репликации в клетке.
Ответственный исполнитель
Заведующий лабораторией
молекулярных основ
химиотерапии вирусных инфекций
канд. биол. наук
В.В. Зарубаев