МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ДЛЯ СТУДЕНТОВ К занятию по цитологии Тема занятия: Роль цитологических исследований в гематологии. Структура и особенности функционирования костного мозга. Нормальный гемопоэз. Гемопоэтические факторы. Гематология – это раздел медицины, изучающий кровь, органы кроветворения, и заболевания крови. Гематология изучает этиологию, диагностику, лечение, прогнозирование и предотвращение заболеваний системы крови, которые влияют на производство крови и ее компонентов, а именно клетки крови, гемоглобин, белки крови, и механизм коагуляции (свертывание крови). Предметы и области изучения гематологии 1. Кровь Венозная кровь Венозная пункция Гемопоэз Клинический анализ крови пуповинная кровь 2. Красные кровяные клетки Формирование эритроцитов Эритропоэтин Метаболизм железа Гемоглобин Гликолиз Пентозофосфатный путь 3. Белые кровяные клетки 4. Тромбоциты 5. Ретикуло-эндотелиальная система Костный мозг человека Селезенка Печень 6. Лимфатическая система 7. Переливание крови Плазма крови Донорство крови группы крови 8. Гемостаз Свертывание крови Витамин K 9. Система комплемента Антитела 10.Аномалии молекулы гемоглобина или скорости синтеза гемоглобина Анемии (нехватка эритроцитов и гемоглобина) Гемобластозы коагулопатии (нарушения кровотечения и коагуляции) Серповидноклеточная анемия Талассемия Цель занятия: Знать структуру и особенности функционирования костного мозга, основные цитологические характеристики гемопоэтических элементов. Ознакомиться с основными гемопоэтическими факторами, а также причинами и следствием их недостаточности. Знать: Расположение костного мозга в организме плода и взрослого человека Основные клеточные элементы костного мозга Стадии созревания клеток крови в костном мозге Основные гемопоэтические факторы и состояния, связанные с их недостаточностью Уметь: Интерпретировать результаты миелограмм в норме и при различных заболеваниях системы кроветворения Ассоциировать изменения в организме с возможными изменениями в миелограмме и периферической крови Кроветворением, или гемопоэзом, называют образование клеток крови. Различают эмбриональный гемопоэз, который происходит в эмбриональный период и приводит к развитию крови, как ткани, и постэмбриональный гемопоэз, который представляет собой процесс физиологической регенерации крови. Костный мозг — это составляющая часть костей скелета, которая заполняет внутреннюю полость кости и осуществляет в организме функцию образования клеток крови. Существует 2 вида костного мозга: красный костный мозг, состоящий в основном из кроветворной миелоидной ткани и желтый, основой которого являются клетки жировой ткани. Красный костный мозг образуется в организме человека в период эмбрионального развития. В этот период все кости организма содержат красный костный мозг, который активно функционирует. В подростковом возрасте кроветворная ткань в полостях трубчатых костей меняется на жировую, соответственно, костный мозг становится желтым. У взрослого человека красный костный мозг в норме содержится в плоских костях, позвонках, эпифазах и диафизах трубчатых костей. Красный костный мозг — важнейший орган кроветворной системы, осуществляющий гемопоэз, или кроветворение — процесс создания новых клеток крови взамен погибающих и отмирающих. Костный мозг — единственная ткань взрослого организма, в норме содержащая большое количество незрелых, недифференцированных и низкодифференцированных клеток, так называемых стволовых клеток, близких по строению к эмбриональным клеткам. Все другие незрелые клетки, например незрелые клетки кожи, всё же имеют большую степень дифференцировки и зрелости, чем клетки костного мозга, и имеют уже заданную специализацию. Красный костный мозг состоит из фиброзной ткани (стромы) и собственно кроветворной ткани. В кроветворной ткани костного мозга выделяют несколько ростков гемопоэза, количество которых увеличивается по мере созревания. Зрелых ростков в красном костном мозге пять: Эритроцитарный Гранулоцитарный Лимфоцитарный Моноцитарный Мегакариоцитарный Каждый из этих росков даёт, соответственно, следующие клетки и постклеточные элементы: эритроциты; эозинофилы, нейтрофилы и базофилы; лимфоциты; моноциты; тромбоциты. Развитие ростков гемопоэза представляет собой сложный процесс дифференцировки клеток. Родоначальники всех ростков названы полипотентными клетками за их способность дифференцироваться в клетки всех ростков гемопоэза под действием цитокинов. Так же эти клетки называют колониеобразующими элементами (КОЭ) за их локальное расположение в костном мозге или стволовыми клетками крови (СКК). Количество полипотентных стволовых клеток, то есть клеток, которые являются самыми первыми предшественниками в ряду кроветворных клеток, в костном мозге ограничено, и они не могут размножаться, сохраняя полипотентность, и тем самым восстанавливать численность. Ибо при первом же делении полипотентная клетка выбирает путь развития, и её дочерние клетки становятся либо мультипотентными клетками, у которых выбор более ограничен (только в эритроцитарный или лейкоцитарный ростки), либо мегакариобластами и затем мегакариоцитами — клетками, от которых отшнуровываются тромбоциты. Под действием цитокинов КОЭ начинают специализироваться, переходя на следующий этап — олигопотентные клетки, вариантов дифференцировки у них уже меньше. Второе название этих клеток — колониеобразующие единицы (КОЕ), поскольку они расположены более мелкими группами, чем КОЭ. КОЕ неоднородны между собой: выделяют колониеобразующие единицы гранулоцитарно-эритроцитарно-миелоцитарно-макрофагального (КОЕ-ГЭММ) и колониеобразующие единицы лимфоцитарного (КОЕ-Л) ростков. Дальнейшее развитие КОЕ ещё более специфично. Под действием цитокинов КОЕ-ГЭММ даёт следующие три типа клеток: колониеобразующая единица гранулоцитов и моноцитов (КОЕ-ГМ), колониеобразующая единица эритроцитов (КОЕ-Э) и колониеобразующая единица мегакариоцитов (КОЕ-МГЦ). Эти переходы инициируются лейкопоэтином, эритропоэтином и тромбопоэтином соответственно. Эти КОЕ — последние, дальнейшие клетки ростков называются бластами, поскольку они уже становятся на один путь дифференцировки в одну конечную клетку. Так, КОЕ-ГМ развивается либо в промонобласт, либо в програнулобласт; КОЕ-Э развивается в эритробласт; КОЕ-МГЦ развивается в мегакариобласт. Таким образом, вкупе с лимфоидным ростков, получаются 5 вышеперечисленных ростков гемопоэза. Клеточный состав костного мозга (миелограмма) и периферической крови в норме. Клеточный состав костного мозга оценивается по результатам исследования пунктата грудины или подвздошной кости, полученного с помощью иглы И. А. Кассирского. В костномозговом пунктате клеточные элементы представлены кроветворными и некроветворными клетками, клетками ретикулярной стромы и паренхимы. На долю представителей стромальных клеток (фибробласты, остеобласты, жировые и эндотелиальные клетки) приходится не более 2%. Общее количество клеток паренхимы костного мозга составляет 98-99%, причем в их число входят как морфологически нераспознаваемые родоначальные элементы, так и морфологически распознаваемые, начиная с бластных (миелобластов, эритробластов и др.) и заканчивая зрелыми клетками. Все ростки кроветворения начинаются с бластных элементов, продолжаются промежуточными формами созревания и заканчиваются зрелыми клетками; при этом количество бластных элементов каждого ростка варьирует в пределах от 0,1 до 1,1-1,7%. Темп созревания костномозговых элементов отражает соотношение созревающих и зрелых клеток. В миелограмме определяют также абсолютное количество различных клеток миелокариоцитов (клеток, содержащих ядро), в сумме оно варьирует от 41,6 до 195 в 1 мкл (в тысячах) и мегакариоцитов - в норме 50-150 в 1 мкл. Процентное соотношение различных клеточных элементов в миелограмме составляет в норме: лимфоцитов - 4,3-13,7%, моноцитов - 0,7-3,1%, плазматических клеток - 0,1-1,8%. Важно отметить, что родоначальные клетки всех ростков кроветворения (бласты), как правило, имеют сходные морфологические черты: крупное ядро с ядрышками, которое окружено узким ободком цитоплазмы. Вместе с тем имеются и отличия, которые позволяют отнести бласты к определенному ростку. Так, например, все виды миелобластов (нейтрофильные, базофильные, эозинофильные) содержат в цитоплазме зернистость, которая в нейтрофильных - мелкая и в небольшом количестве, в базофильных крупная и почти черного цвета, в эозинофильных - коричневатого цвета. Эритробласт отличается ярко-базофильной цитоплазмой без зоны просветления вокруг ядра, отсутствием зернистости в цитоплазме; мегакариобласт - более грубой структурой ядра, ярко-базофильной отростчатой цитоплазмой без признаков зернистости; монобласт бобовидной формой ядра с нежной сетчатой структурой, нежно-голубой цитоплазмой; лимфобласты обеих популяций (Т и В) - округлым или овальным ядром с 1-2 ядрышками, нежно-базофильной цитоплазмой с перинуклеарной зоной просветления, причем Т-лимфобласты содержат в цитоплазме небольшое количество азурофильных зерен. Для более точной идентификации бластов проводят цитохимические и иммунофенотипические исследования. В созревающих клетках структура ядра более грубая, ядрышки отсутствуют или присутствуют их остатки, размеры ядра меньше, чем у родоначальной клетки, площадь цитоплазмы увеличена. В гранулоцитарном ростке изменяется форма ядра, которая из круглой сначала становится бобовидной, из бобовидной - палочковидной, из палочковидной сегментированной. Зернистость в цитоплазме различается по цвету: в эозинофилах она оранжевая, в базофилах - черная, в нейтрофилах - розовофиолетовая. Таким образом, костномозговая пункция позволяет определить цитологический состав кроветворных клеток. Клеточный состав костного мозга в норме, % Показатель миелограммы Ретикулярные клетки Бласты Миелобласты Нейтрофильные клетки: промиелоциты миелоциты метамиелоциты Среднее значение 0,9 0,6 1,0 2,5 9,6 11,5 Пределы нормальных колебаний 0,1-1,6 0,1-1,1 0,2-1,7 1,0-4,1 7,0-12,2 8,0-15 палочкоядерные сегментоядерные Все нейтрофильные элементы Эозинофилы (всех генераций) Базофилы Эритробласты Пронормоциты Нормоциты: базофильные полихроматофильные оксифильные Все эритроидные элементы Лимфоциты Моноциты Плазматические клетки 18,2 18,6 60,8 3,2 0,2 0,6 0,6 12,8-23,7 13,1-24,1 52,7-68,9 0,5-5,8 0-0,5 0,2-1,1 0,1-1,2 3,0 12,9 3.2 1,4-4,6 8,9-16,9 0,8-5,6 20,5 9,0 1,9 0,9 14,5-26,5 4,3-13,7 0,7-3,1 0,1-1,8 Для диагностики гипопластических состояний, выявления лейкозных инфильтратов и раковых метастазов, а также миелодиспластического синдрома и некоторых видов костной патологии используют трепанобиопсию подвздошной кости, которую проводят с помощью специального троакара. Она позволяет более точно установить тканевые соотношения «паренхима/жир/костная ткань», которые в норме составляют 1:0,75:0,45. В патологических условиях эти соотношения изменяются, иным становится клеточный состав паренхимы и костной ткани. При действии больших доз ионизирующего излучения, как известно, в первую очередь страдают ткани, обладающие наибольшей пролиферативной активностью в организме. К таким тканям относится костный мозг человека. Таким образом, при острой лучевой болезни высокой степени тяжести большинство кроветворных клеток погибает, образуя картину малоклеточного (пустого) костного мозга. В препарате видны соединительнотканные септы и незначительное количество зрелых клеточных элементов. По мере восстановления в костном мозге появляются разнообразные бластные формы. Картина периферической крови при этом заболевании характеризуется панцитопенией и агранулоцитозом. Рис. 1 Схема гемопоэза Регуляция гемопоэза Кроветворение регулируется: факторами роста, обеспечивающими пролиферацию и дифференцировку СКК и последующих стадий их развития, факторами транскрипции, влияющими на экспрессию генов, определяющих направление дифференцировки гемопоэтических клеток, витаминами, гормонами. Факторы роста включают колониестимулирующие факторы (КСФ), интерлейкины и ингибирующие факторы. Они являются гликопротеинами, действующими и как циркулирующие гормоны, и как местные медиаторы, регулирующие гемопоэз и дифференцировку специфических типов клеток. Почти все факторы роста действуют на СКК, КОЕ, коммитированные и зрелые клетки. Однако отмечаются индивидуальные особенности действия этих факторов на клетки-мишени. КСФ действуют на специфические клетки или группы клеток на различных стадиях дифференцировки. Например, фактор роста стволовых клеток влияет на пролиферацию и миграцию СКК в эмбриогенезе. В постнатальном периоде на гемопоэз оказывают влияние несколько КСФ, среди которых наиболее изучены факторы, стимулирующие развитие гранулоцитов и макрофагов (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ), а также интерлейкины. Большинство указанных факторов выделено и применяется для лечения различных болезней. Для получения их используются биотехнологические методы. Дифференцировка полипотентных клеток в унипотентные определяется действием ряда специфических факторов, поэтинов — эритропоэтинов (для эритробластов), гранулопоэтинов (для миелобластов), лимфопоэтинов (для лимфобластов), тромбопоэтинов (для мегакариобластов). Большая часть эритропоэтина образуется в почках. Его образование регулируется содержанием в крови кислорода, которое зависит от количества циркулирующих в крови эритроцитов. Снижение числа эритроцитов и соответственно парциального давления кислорода, является сигналом для увеличения продукции эритропоэтина. Эритропоэтин действует на чувствительные к нему КОЕ-Э, стимулируя их пролиферацию и дифференцировку, что в конечном итоге приводит к повышению содержания в крови эритроцитов. При хронической болезни почек выработка эритропоэтина снижается, поэтому такие пациенты нуждаются в медикаментозном его введении. Тромбопоэтин синтезируется в печени, стимулирует пролиферацию КОЕМГЦ, их дифференцировку и образование тромбоцитов. Ингибирующие факторы дают противоположный эффект, т.е. тормозят гемопоэз; их недостаток может быть одной из причин лейкемии, характеризующейся значительным увеличением числа лейкоцитов в крови. Выделен ингибирующий лейкемию фактор (ЛИФ), который тормозит пролиферацию и дифференцировку моноцитов-макрофагов. Витамины необходимы для стимуляции пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток. Витамин В12 поступает с пищей и соединяется с внутренним фактором (Касла), который синтезируется париетальными клетками желудка. Образуемый при этом комплекс, в присутствии ионов Са2+, соединяется с рецепторами эпителиоцитов подвздошной кишки и всасывается. При всасывании в эпителиоциты поступает лишь витамин В12, а внутренний фактор освобождается. Витамин В12 поступает с кровью в костный мозг, где влияет на гемопоэз, и в печень, где может депонироваться. Нарушение процесса всасывания при различных заболеваниях желудочно-кишечного тракта может служить причиной дефицита витамина В12 и нарушений в гемопоэзе. Пернициозная анемия это синдром, связанный с недостатком B12 и фолиевой кислоты в организме. Характеризуется наличием в костном мозге большого количества крупных незрелых предшественниковэритроцитов (мегалобластов). Наблюдается также нарушение сегментации нейтрофилов (вплоть до полного отсутствия сегментации) и деформация ядер других гранулоцитов. При дефиците витамина B12 на фоне анемической клинической картины (или без неё) могут возникнуть и неврологические расстройства из-за связанного с дефицитом витамина B12нарушения синтеза жирных кислот. Может наблюдаться демиелинизация и необратимая гибель нервных клеток. Симптомами такой патологии являются онемение или покалывание конечностей и атаксия. ВОПРОСЫ ДЛЯ ОБСУЖДЕНИЯ 1. Предмет и области изучения гематологии 2. Костный мозг: виды, локализация, строение, функционирование 3. Стволовая клетка крови и ее дифференцировка 4. Колониеобразующие единицы костного мозга, их дифференцировка и взаимосвязь 5. Принципиальная схема костномозгового кроветворения 6. Способы взятия биологического материала миелограммы: преимущества и недостатки для оценки 7. Миелограмма в норме 8. Миелограмма при остром и хроническом лейкозах 9. Миелограмма при острой лучевой болезни 10.Регуляция гемопоэза: факторы роста 11.Регуляция гемопоэза: факторы транскрипции 12.Регуляция гемопоэза: витамины и гормоны САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ 1. Записать протокол практического занятия с указанием его цели и задачи. Дать определение гематологии, красного костного мозга, миелограммы. Внести в протокол принципиальную схему костномозгового кроветворения. 2. Расшифровать миелограммы при различных кроветворения. Дать заключение с внесением в протокол. патологиях