АННОТАЦИЯ На диссертационную работу соискателя ученой степени... философии PhD Абельденова Сайлау Касеновича, выполненную...

АННОТАЦИЯ
На диссертационную работу соискателя ученой степени доктора
философии PhD Абельденова Сайлау Касеновича, выполненную на тему
«Роль ферментов репарации повреждений ДНК в патогенезе туберкулеза»,
по специальности «6D060700 - Биология»
Актуальность темы исследования. В 2013 году в мире по оценке
Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) заболело туберкулезом (ТБ)
приблизительно 9 млн. человек, 1,5 млн. человек умерли от данного
заболевания. За 2013 год в Республике Казахстан, по данным ВОЗ, было
выявлено около 20000 новых случаев заболевания. Борьба с ТБ является одной
из приоритетных задач здравоохранения Казахстана. ТБ приводит к огромным
человеческим потерям, а также к экономическим убыткам страны.
ТБ - заболевание, вызываемое Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis),
бактерией, которой инфицированы больше трети населения планеты. Лечение
ТБ требует длительного приема противотуберкулезных препаратов.
Возникновение мультирезистентного ТБ и ТБ с широкой лекарственной
устойчивостью является огромной опасностью, так как данные формы
полностью обходят все курсы лечения. Поэтому понимание механизма
персистирования M.tuberculosis внутри организма крайне необходимо для
планирования короткого и эффективного курса лечения заболевания.
В ходе инфицирования, M.tuberculosis встречается с разнообразием
механизмов защиты организма. Данные механизмы, которые встречаются на
ранней стадии инфекции, возможно, являются наиболее критическими для
патогена с целью выживания. Это, главным образом, составляет респираторный
взрыв, который приводит к образованию реактивных форм промежуточных
соединений кислорода и азота. В то время как, наиболее патогенные бактерии
устраняются с помощью данных антимикробных реакций в инфицированных
макрофагах, M.tuberculosis эволюционировала механизмы для уничтожения
данных форм защиты организма, а также развила активную репарацию
вызываемых повреждений.
Попадая в организм, клеточная ДНК патогена M.tuberculosis подвергается
воздействию реактивных форм кислорода и азота внутриклеточного и
внеклеточного происхождения, что в свою очередь приводит к повреждениям
ДНК. Данные повреждения приводят к мутациям. Микобактерии, находясь в
стрессовых условиях, должны поддерживать стабильность генома, поэтому,
изучение систем репарации ДНК у патогена, является очень важным для
понимания механизмов поддержания генетической стабильности, мутагенеза и
возникновения штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.
Учитывая факт, что системы репарации ДНК играют важную роль в
толерантности в отношении повреждений ДНК, вызываемых промежуточными
соединениями азота и реактивными формами кислорода, важно изучить
системы репарации ДНК, которые могут выступать в качестве потенциальных
целей. Клеточная ДНК постоянно подвергается воздействию реактивных
радикалов внутриклеточного или внеклеточного происхождения, часто
приводящих к необратимым изменениям в генетической карте. Такие
изменения приводят к мутациям.
Вследствие того, что микобактерия постоянно подвергается враждебным
факторам окружающей среды, что приводит к образованию повреждений и
модификаций ДНК, сохранность генома защищена механизмами ДНК
репарации. Эти механизмы являются очень важными, так как они могут влиять
на процессы ведущие к лекарственной устойчивости и они могут предложить
новые мишени для антибиотиков.
Цель и задачи работы. Целью исследования является биохимическая
характеризация микобактериальных ферментов репарации ДНК MtbXthA и
MtbNfo возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis.
В соответствии с поставленной целью, для ее решения, были поставлены
следующие задачи:
1.
Получить генетические конструкции способные к репликации в
клетках Escherichia coli и несущие гены Mycobacterium tuberculosis H37Rv:
nfo/end и xtha.
2.
Получить
высокоочищенные
рекомбинантные
аналоги
микобактериальных белков репарации ДНК: MtbNfo и MtbXthA.
3.
Определить константы связывания рекомбинантных белков MtbNfo
и MtbXthA с радиоактивно мечеными ДНК-зондами со структурой
неповреждённой ДНК и ДНК с повреждениями оснований с использованием
метода разделения ДНК-фрагментов в геле.
4.
Провести комплементацию гомологами Mycobacterium tuberculosis
при определении чувствительности мутантных линий Escherichia coli, у
которых удалены гены репарационных белков к окислительным повреждениям
ДНК.
Научная новизна исследования. Научная новизна работы состоит в том,
что впервые биохимически охарактеризованы ферменты репарации
повреждений ДНК MtbXthA и MtbNfo у возбудителя туберкулеза
Mycobacterium tuberculosis.
Впервые
показано,
что
при
отсутствии
металл-кофакторов,
микобактериальные AП эндонуклеазы имеют очень низкую активность
расщепления АП сайта. Добавление двухвалентных катионов в значительной
степени стимулирует активность репарации ДНК, указывая, что MtbXthA и
MtbNfo являются металл-зависимыми ферментами.
Впервые было продемонстрировано, что MtbXthA и MtbNfo обладают 3'репарационной
фосфодиэстеразной,
АП-эндонуклеазной,
3’
→
5’
экзонуклеазной и фосфатазной активностями.
Впервые были измерены стационарные кинетические параметры
микобактериальных AП эндонуклеаз-катализируемых репарационных реакций.
Впервые получены мутантные формы АП эндонуклеаз MtbXthA и MtbNfo
с заменой аминокислот в активных центрах ферментов.
Практическая ценность работы. Результаты данных исследований
помогут определить роль ферментов репарации ДНК в возникновении мутаций
в геноме микобактерии и, возможно, происхождение множественной
лекарственной устойчивости у микобактерий. Знания, полученные в ходе
выполнения диссертационной работы, имеют предпосылки к пониманию
персистенции микобактерий в организме, образованию мутантных штаммов
микобактерий, которые могут образовать основу для определения хороших
кандидатов белков в качестве лекарственных целей для эффективного лечения
туберкулеза.
Основные выводы по результатам проведенной работы:
- микобактериальные AП эндонуклеазы расщепляют ДНК-дуплекс,
содержащий синтетический AП сайт;
- обнаружено, что при pH 7,6 MtbXthA-катализируемая АП эндонуклеазная
активность стимулируется в присутствии ионов Mg2+, Mn2+ и Co2+, в то время
как активность MtbNfo была стимулирована в присутствии ионов Mg 2+ и Ca2+ и
в меньшей степени в присутствии ионов Mn2+ и Co2+. Активность MtbXthA и
MtbNfo при рН 6,5 линейно возрастает с концентрацией Mg 2+ и Mn2+ достигая
максимума при 10 мМ концентрации. Кроме того, в присутствии 10 мМ Mn2+
оба фермента обладают самой высокой АП эндонуклеазной активностью при
рН 6,5, в то время как при рН 7,5, высокая концентрация Mn2+ полностью
ингибирует MtbXthA- и MtbNfo-катализируемую активность расщепления АП
сайта;
- обнаружено, что MtbXthA, в дополнение к активности расщепления АП
сайта, обладает высокоэффективной функцией для удаления 3'-блокирующих
сахаро-фосфатов и 3'-концевых фосфатных остатков от разрывов цепей ДНК.
Полученные результаты показывают наличие у MtbXthA высокоэффективной
3'-фосфатазной активности, в то время как MtbNfo является плохой 3 'фосфатазой. Результаты свидетельствуют о том, что оба микобактериальных
фермента содержат 3'-концевые "зачищающие" активности, и что MtbXthA
является более эффективной 3'-репарационной фосфодиэстеразой, чем AП
эндонуклеазой;
- мутантные микобактериальные AП-эндонуклеазы, даже в избыточных
количествах, не показывают какой либо детектируемой активности репарации
ДНК, по сравнению с дикими типами MtbXthA и MtbNfo. Важно отметить, что
MtbXthA-D180N/MtbXthA-N182A и MtbNfoE129Q/MtbNfoEH206N мутанты
одновременно потеряли неспецифическую 3'→5' экзонуклеазную активность.
Эти результаты показывают, что аминокислотные замены D180 и N182 для
MtbXthA и E129 и H206 для MtbNfo являются существенными для репарации
ДНК Mtb AП эндонуклеазами.
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 8 печатных
работах, в том числе 1 в научном журнале с импакт-фактором, входящем в базы
данных Scopus и Thomson Reuters, 3 в республиканских научных журналах,
рекомендованным Комитетом, 4 в материалах республиканских и
международных конференций.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения и
списка использованных источников.