Кариология в теории и на практике Сценарий видеофильма

Кариология в теории и на практике
Сценарий видеофильма
Корниенко О.С., Высоцкая Л.В.
Аннотация
Первая часть – вводная теоретическая, описывает особенности и
предмет кариологии. Вторая часть иллюстрирует необходимые реактивы и
инструменты на рабочем столе, манипуляции, связанные с приготовлением
хромосомных препаратов, наиболее распространенные методики
окрашивания хромосом, флуоресцентное микроскопическое оборудование,
а также знакомит с автоматизированной компьютерной программой для
анализа кариотипов Icaros (Zeiss, Германия). Третья часть включает
современные данные о цитогенетике человека, молекулярных методов, с
описанием хромосомных аномалий человека, приводящих к выраженным
клиническим синдромам.
Заглавный титр, заставка Digital radius: «Кариология в теории и на
практике».
Титр: «Авторы: Корниенко О.С., Высоцкая Л.В.».
Титр: «Содержание».
Титр: «Часть первая. Введение в Кариологию».
Слайд. «Кариология — ...».
Текст.
Кариология это наука, которая изучает строение и функции клеточного ядра в целом и
отдельных его структур, таких как хромосомы, ядрышко, ядерная оболочка и другие.
Слайд «Кариотип».
Текст.
Кариология изучает также кариотипы, а это хромосомные наборы клеток.
Слайд «Что такое кариотип».
Текст.
Кариотип — это совокупность признаков (число, размеры, форма, и другие)
полного набора хромосом, присущая клеткам данного вида, данного организма, или
линии, клона клеток.
Слайд «Характеристики кариотипов».
Текст.
Известно, что различные клетки в организме могут содержать разное хромосомное
количество. Причем, у каждого вида существует минимальный набор хромосом,
состоящий из одной копии аутосомы и, как правило, одной половой хромосомы. Этот
набор называется гаплоидным. Двойной набор, содержащий по две копии каждой
хромосомы называется диплоидным, тройной — триплоидным, и так далее. В организме
человека, например, яйцеклетки и сперматозоиды имеют гаплоидный набор хромосом,
большинство соматических клеток диплоидны, а клетки печени — полиплоидны.
При описании кариотипа всегда указывают точное количество хромосом. У всех
организмов разное количество хромосом в клетках. У растений самое маленькое число
2n=4, а самое большое 2n=1440 у некоторых видов папаратников. У животных
рекордсменом по минимальному количеству хромосом 2n=6 стал олененок мунжак, а по
максимальному 2n=102 — один из грызунов.
Далее, при описании кариотипа указывают относительный размер хромосом, в
кариотипах встречаются длинные, средние и короткие хромосомы. Обязательно
указывают форму хромосом, бывают одноплечие и двуплечие хромосомы. Если плечи
равны по длине, то такую хромосому называют метацентриком. Если одни плечи чуть
короче других — это субметацентрик. И хромосома, у которой короткие плечики
слишком маленькие, чтобы их увидеть, называется одноплечей или акроцентриком.
Слайд «Окраски хромосом».
Текст.
Детальное описание кариотипа включает в себя также данные об особенностях
окраски хромосом.
Рутинная окраска дает равномерное окрашивание хромосом по всей длине.
Преимущество этого способа в том, что хромосомы имеют четкие очертания, мы можем
легко посчитать их количество. Можем увидеть первичные перетяжки — это
центромерные районы, и, таким образом, определить морфологию хромосом. Кроме того,
видны вторичные перетяжки — а это районы ядрышковых организаторов. Недостаток
рутинной окраски в том, что она не позволяет распознавать хромосомы разных пар, если
они похожи по длине и морфологии. Это привело к поиску и открытию нескольких видов
дифференциальных окрасок, которые отличаются от рутинной окраски тем, что они дают
неравномерное окрашивание, выявляя уникальный рисунок каждой хромосомы.
Слайд: «Дифференциальное окрашивание».
Текст.
На этом слайде схематично показано, как примерно выглядят хромосомы при
дифферециальном окрашивании, когда одни районы выкрашиватся более ярко, другие,
наоборот, бледнее. Итак, С-окраска. Она выявляет конститутивный гетерохроматин.
Таким образом обязательно окрашиваются центромерные районы, и другие районы,
содержащие плотные блоки гетерохроматина. AgNO3-окрашивание позволяет выявить
районы ядрышковых организаторов. Сам хроматин при этом окрашен бледно-желтым
цветом, а в районах ядрышковых организаторов наблюдаются черные точки, симметрично
на сестринских хроматидах. G-окраска превращает хромосомы в полосатые носочки. Вы
видите чередование светлых и темных полос на хроматине. R-окраска дает исчерченность
хромосом, обратную G-окраски. Q-окраска — это окраска флуоресцентными красителями.
Флуоресцентные красители связываются непосредственно с ДНК, и тяготеют к разным
районам.
Титр: «Часть вторая. Методики и оборудование».
Слайд «Митоз».
Текст.
Для анализа кариотипов прежде всего используют метафазные митотические
хромосомы. К началу
метафазы хроматин сильно конденсируется и хромосомы
становятся компактные, что позволяет их сосчитать и рассмотреть их морфологию. У
животных самым лучшим источником метафазных хромосом являются
клеточные
культуры, которые получают из лимфоцитов крови, тканей эмбрионов или кожи взрослых
животных.
Фото «Ламинар».
Текст.
Работы с первичными клеточными культурами позволяет получать неограниченное
количество делящихся клеток. Для этого при помощи различных веществ лейкоциты
сначала стимулируют к делению, а потом синхронизируют деления во всех клетках. К
сожалению, возможность культивирования есть не всегда. В этом случае цитогенетики
используют ткани животного, обладающие высокой митотической активностью,
например, костный мозг или семенники.
Титр: «Рабочий стол студента на практике по кариологии».
Фото: «Рабочий стол студента».
Текст.
Это рабочий стол студента. Здесь есть листы бумаги, на которых проводится
препарирование мыши. Перчатки. Есть пинцет, чтобы держать бедренную косточку,
ножницы. Шприц для вымывания костного мозга, препаровальные иголки для
препарирования семенников. Также есть большая и маленькая чашки Петри, и пробирка,
куда вымывается костный мозг и затем обрабатывается. На столе есть груша с трубкой,
куда нужно вставить пастеровскую пипетку, и не забыть при этом засунуть кусочек ватки,
чтобы не потерять клетки при суспензировании. На столе есть планшет для препаратов,
маркер и простой карандаш для подписей.
Фото: «Реактивы для работы 1».
Текст.
Это реактивы, которые используются в работе при приготовлении препаратов из
костного мозга. Раствор колхицина, который вкалывается животному. Колхицин
останавливает клеточное деление, и, таким образом, способствует накоплению клеток на
стадии метафазы. Хлорид калия — это гипотонический раствор, в нем клетки набухают,
что в дальнейшем улучшает разброс хромосом на препарате. Уксусно-кислый фиксатор —
стандартный фиксатор, состоящий из смеси уксусной кислоты и этилового спирта.
Фиксатор, проникая в клетку, стабилизирует структуру хромосом.
Фото: «Реактивы для работы 2».
Текст.
Для приготовления препаратов из семенников мыши используются другие
реактивы. Физиологический раствор необходим для получения суспензии живых клеток,
которая потом раскапывается на предметные стекла. В гипотоническом растворе —
цитрате натрия, клетки семенников набухают, что уменьшает число наложений хромосом
друг на друга на препаратах. Уксусная кислота используется для получения суспензии из
фиксированных клеток семенника.
Титр: «Приготовление прапарата их костного мозга домовой мыши (Mus musculus)».
Текст.
Давайте подробно рассмотрим как сделать суховоздушный препарат из костной
ткани домовой мыши.
Слайд: «Манипуляции для приготовления препарата».
Текст.
Берем мышь возрастом 1-2 месяца, вводим ей внутрибрюшинно 0,04 % раствор
колхицина. Колхицин препятствует сборке микротрубочек веретена деления, из-за чего
метафазные хромосомы остаются на экваторе и не расходятся к полюсам. Через 1,5–2 часа
мышь забивают методом цервикальной дислокации. Это наиболее быстрый и наименее
болезненный способ, в результате которого шейные позвонки смещаются относительно
друг друга, и происходит разрыв спинного мозга. Далее необходимо как можно скорее
извлечь бедренные косточки, очистить их от прилегающей мышечной ткани и отрезать
костные эпифизы, это расширенные концы кости. После этого необходимо набрать в
медицинский шприц 1–1,5 мл теплого гипотонического раствора, и вымыть костный мозг
из бедренной кости в центрифужную пробирку. Разбить ткань при помощи пипетки до
получения суспензии. И инкубировать в термостате при 37°С в течение 10 мин. В
гипотоническом растворе клетки набухают, и это способствует в дальнейшем лучшему
разбросу хромосом на препаратах.
После инкубации добавляем немного уксуснокислого фиксатора. Фиксатор состоит из смеси
этанола и уксусной кислоты в соотношении три к одному. Очень осторожно перемешиваем
или, другими словами, суспендируем! После этого центрифугируем.
Видео. Показываем центрифугу.
Текст.
Берем пробирку с костным мозгом и пробирку с таким же объемом воды, ставим друг
напротив друга и центрифугируем 5 минут.
Слайд: «Манипуляции для приготовления препарата».
Текст.
Сливаем осторожно надосадочную жидкость в раковину и добавляем 1 мл холодного
фиксатора, не перемешивая. И далее оставляем пробирку в холодильнике (+4°С) не
меньше 30 мин. После этого центрифугируем суспензию 5 мин, и сливаем осторожно
надосадочную жидкость. Осторожно имеется ввиду, без резких движений, чтобы случайно не
вытряхнуть осадок из пробирки. И наконец добавляем 200–300 мкл фиксатора и суспендируем.
Итак, мы получили суспензию из фиксированных клеток костного мозга.
Для приготовления препаратов нам понадобятся чистые стекла, которые пролежали
хромпике около часа. Чистота стекол необходима прежде всего для того, чтобы клетки
прилипли к стеклу и в дальнейшем не отклеивались при окрашивании препаратов. Итак,
мы берем влажное и холодное стекло, стряхиваем излишек воды, располагаем стекло
матировкой наверх. Матировка — это шероховатость на краю стекла для нанесения
надписи. С высоты примерно 15–20 см капаем одну две капли суспензии клеточной на
стекло и помещаем стекло над водяной баней. Эти приемы улучшают распластывание
хромосом на стекле. Через 1–2 минуты стекло снимаем, ставим вертикально для
высушивания на воздухе. Обязательно подписываем стекла, храним их в холодильнике до
этапа окрашивания.
Титр: «Приготовление распластанного и суховоздушного препаратов из семенников
мыши».
Текст.
Семенники — это богатый материал для цитогенетика, потому что в семеннике много
разных клеток, делящихся как митозом, так и мейозом. Из семенников мы можем
приготовить суховоздушные препараты для наблюдения хромосом на различных стадиях.
А также можем получить распластанные препараты для анализа синаптонемных
комплексов, которые дают много дополнительной и уточняющей информации о
кариотипе.
Слайд: «Манипуляции с семенниками».
Текст.
Итак, на этом слайде показаны пути приготовления препаратов из семенников. Для
приготовления суховоздушного препарата мы берем семенник, обязательно надрезаем его
капсулу, и помещаем в гипотонический раствор, чтобы клетки набухли. Через 15 минут
семенник переносим в уксуснокислый фиксатор. Фиксируем как минимум 30 минут. После
этого в капле фиксатора измельчаем семенник, добавляем 60% уксусную кислоту и с
помощью пипетки готовим суспензию. Раскапываем суспензию на чистое сухое стекло,
высушиваем и препарат готов для дальнейшего окрашивания. Чтобы получить
распластанный препарат для изучения синаптонемных комплексов мыши, необходимо
семенник измельчить в физиологическом растворе, и при помощи пипетки приготовить
суспензию из живых клеток. На чистое стекло капнуть каплю сахарозы, и затем аккуратно
наслоить на нее каплю суспензии. Далее препарат высушивается, фиксируется
формалином, и только после этого окрашивается.
Титр: «Препараты».
Текст.
Итак, мы сделали несколько видов препаратов из одного объекта. Это
суховоздушные препараты из костного мозга и семенников, а также распластанные
препараты из семенников. Далее мы будем окрашивать эти препараты разными
способами.
Слайд: «Подписи к прапаратам».
Текст.
Поскольку препаратов много, то хорошо и правильно их подписывать сразу после
приготовления. Обязательно указывают название объекта. Есть общепринятое научное
правило, указывать сокращенное видовое название, где первая буква — это первая буква
названия рода, а две других — первые буквы названия вида. Например, домовая мышь —
это Mus musculus, сокращенное название MMU. Homo sapiens — сокращенное название
HSA. Так как в работе используются одинаковые красители, то по внешнему виду
готового препарата невозможно судить об окраске. Поэтому обязательно указывают
название окраски. Чтобы точно идентифицировать авторство препарата, неплохо было бы
указать свое имя. И случаях, когда приходится переделывать препараты или делать их в
большом количестве необходимо подписывать еще дату приготовления.
Титр: «Способы окраски».
Текст.
В этой таблице представлены особенности рутинной и дифференциальных окрасок.
Процесс окрашивания можно разделить на два этапа, это предобработка и собственно
окрашивание красителем. Используя один и тот же краситель, но избегая предобработки
или изменяя ее условия, можно получать совершенно разные результаты. Рутинная
окраска не требует предобработки, используется краситель Гимза, который связывается
непосредственно с ДНК. Рутинная окраска хорошо выявляет первичные перетяжки или
центромерные районы, а также вторичные перетяжки или районы ядрышковых
организаторов. Для получения С-окраски препараты необходимо инкубировать в горячей
щелочи и солевом растворе, окрашивать красителем Гимза. Районы конститутивного
гетерохроматина ярко окрашиваются, эухроматин остается бледно окрашенным. Таким
способом обязательно окрашивается прицентромерный гетерохроматин, а также другие
блоки, если они есть, например, интерстициальный гетерохроматин и теломерный
гетерохроматин.
G-окраска
получается
при
инкубации
несколько
минут
в
депротеинизирующем растворе, и затем в красителе Гимза. Хромосомы выглядят как
полосатые носочки. Темные районы называются G-позитивными полосами или Gпозитинвыми бэндами, а светлые районы — G-негативными полосами, или Gнегативными бэндами. Эти районы обладают противоположными свойствами. Gпозитивные бэнды характеризуются поздней репликацией, ранней конденсацией ДНК в
клеточном цикле, и обогащены АТ-парами оснований. G-негативным бэндам присущи
обратные свойства, в них чаще встречаются GC-пары, в этих районах активно идет
транскрипция,
и
ранняя
репликация.
В
качестве
предобработки
используют
протеолитические ферменты, чаще трипсин, который удаляет белки, связанные с
хроматином. Краситель
Гимза. Для получения
R-окраски
достаточно провести
предобработку в солевом растворе при высокой температуре. Краситель тот же — Гимза.
В результате достигаем исчерченность хромосом, обратную G-окраски. AgNO3окрашивание не требует предобработки, краситель — нитрат серебра. Эта окраска
выявляет районы ядрышковых организаторов. Сам хроматин окрашен бледно-желтым
цветом, а в районах ядрышковых организаторов наблюдаются черные точки, симметрично
на сестринских хроматидах. Это места, где атомы серебра восстанавливаются засчет
белков нуклеолинов. Нуклеолины частично остаются на метафазных хромосомах после
стадии профазы, когда ядрышки еще активно функционировали в клетке. Еще нитратом
серебра выкрашиваются синаптонемные комплексы, это белковые структуры, которые
образуются в мейозе между гомологичными хромосомами. Q-окраска — это окраска
флуоресцентными красителями, часто без предобработки. Флуоресцентные красители
связываются непосредственно с ДНК, и тяготеют к разным районам. Например, синий
краситель DAPI больше связывается с гетерохроматином, и поэтому ярче выкрашивает
центромерные районы. А зеленый краситель хромомицин, наоборот, тяготеет к
эухроматину, из-за чего центромерные районы остаются неокрашенными.
Титр: «Окрашенные хромосомные препараты из костного мозга и семенников домовой
мыши Mus musculus».
Текст.
Далее будут представлены хросомные препараты из костного мозга и семенников
домовой мыши.
Слайд: «Рутинная окраска»
Текст.
Рутинная окраска. На этих препаратах легко посчитать количество хромосом и
определить, что все хромосомы — одноплечие.
Слайд: «Дифференциальные окраски».
Текст.
На этом слайде представлены три вида дифференциальных окрасок. Благодаря Gокраске и уникальному рисунку для каждой хромосомы, мы можем разложить все
хромосомы точно по парам. С-окраска выявила прицентромерный гетерохроматин на всех
хромосомах мыши. На окрашенных серебром митотических хромосомах мы можем
видеть яркие точки и по ним определить число хромосом, несущих ядрышковые
организаторы. Синаптонемные комплексы, окрашенные серебром, позволяют уточнить
число хромосом, а также выявить хромосомные перестройки, если они есть.
Слайд «Мейоз у мыши».
Текст.
Дополнительную информацию о кариотипе можно получать, изучая мейотические
хромосомы. Например, в метафазе I, когда на экваторе выстраиваются биваленты
гомологичных хромосом, их количество, как правило, равно гаплоидному числу.
Титр: «Введение во флуоресцентную микроскопию».
Текст.
Перед тем, как смотреть препараты, окрашенные флуресцентными красителями,
необходимо
ознакомиться
с
особенностями
флуоресцентной
микроскопии.
Флуоресцентная микроскопия является разновидностью световой микроскопии, где
используются особые красители — флуорохромы. Флуорохромы способны за короткое
время поглащать свет, а затем снова испускать его.
Титр: «Восприятие цвета».
Текст.
На этом слайде показано, как человек воспринимает свет разной длины волны.
Коротковолновый
ультрафиолетовый свет около 400 нанометров и длинноволновый
инфракрасный свет более 700 нанометров невидимы для нашего глаза. Свет с
определенной длиной волны в промежутке от 400 до 700 нанометров мы воспринимаем
как цветной. Цвета расположены по правилу, которое вы, наверное, знаете с детства,
«каждый охотник желает знать, где сидит фазан». Красный, оранжевый, желтый, зеленый,
голубой, синий, фиолетовый. Смешение всех цветов дает белый цвет, а весь диапазон
световых спектров от 400 до 700 нанометров воспринимается как белый свет, каковым
является излучение солнца или ртутной лампы флуоресцентного микроскопа.
Слайд «Флуорохром».
Текст.
Итак, молекулы флуорохрома химически возбуждаются, поглащая свет одной
волны, а затем испускают свет другой волны — со смещением в красную сторону.
Например, если флуорохром хромомицин возбуждается в синем спектре, то испускает
свет, или, другими словами, светится в зеленом спектре. Разница между поглощаемой
длиной волны и испускаемой составляет в среднем 20-50 нанометров и носит название
смещения Стокса, по имени первооткрывателя. Суть смещения заключается в том, что при
поглощении часть энергии рассеивается в виде тепла, а излучение света большей длины
волны требует меньше энергии.
Слайд: «Устройство флуоресцентного микроскопа».
Текст.
Рассмотрим схематично устройство флуоресцентного микроскопа, и перемещение
света внутри него. Белый свет от ртутной лампы попадает в светоделительный блок.
Светоделительный блок состоит из возбуждающего фильтра, дихроматического зеркала и
запирающего фильтра. Возбуждающий фильтр пропускают только определенную длину
волны, например, мы выбрали, только синий свет. Дихроматическое зеркало или
дихроматический светоделитель представляет собой фильтр, двуслойный, который
отражает коротковолновый свет и пропускает длинноволновый свет, например, в нашем
случае синий отражает, а зеленый пропускает. Отраженный синий свет попадает через
объектив на препарат, флуорохром возбуждается и испускает по правилу Стокса зеленый
свет. Зеленый свет попадает сначала обратно в объектив, проходит через дихроматическое
зеркало, потом через запирающий фильтр, который пропускает отраженный свет и
отсеивает остатки ненужного возбуждающего света. И в конечном итоге через окуляр мы
наблюдаем микроскопическое изображение зеленого цвета.
Видео. Показываем флуоресцентный микроскоп, и его устройство.
Текст.
Это флуоресцентный микроскоп, он совмещен с обычным световым микроскопом,
внизу находится обычная лампа накаливания. Здесь располагается ртутная лампа. Она
испускает широкий спектр света от ультрафиолетового до инфракрасного, и пригодна для
возбуждения большинства флуорохромов. Ртутная лампа является взрывоопасной,
поэтому защищена прочным кожухом. Свет от лампы проходит здесь, и в этом месте
располагаются фильтры и диафрагма, с помощью которых можно регулировать
интенсивность светового потока. Далее свет попадает в светоделительный блок. У нас
здесь стоят три светоделительных блока, рассчитанных на три красителя. DAPI синего
цвета, FITC — зеленого, и Родамина — красного. Светоделительный блок, как уже
говорилось,
состоит
из
возбуждающего
фильтра,
дихроматического
зеркала
и
запирающего фильтра. Возбуждающий и запирающий фильтр снаружи расположены,
дихроматическое зеркало внутри по диагонали. Отраженный свет попадает через объектив
на препарат, флуорохром возбуждается и испускает по правилу Стокса свет, смещенный в
сторону длинноволнового. Этот свет попадает сначала обратно в объектив, проходит
через дихроматическое зеркало, потом через запирающий фильтр, который отсеивает
остатки ненужного возбуждающего света. И в конечном итоге через окуляр мы
наблюдаем микроскопическое изображение. Это изображение с помощью цифровой
камеры можно передать на монитор компьтера, достаточно открыть шторку внутри
микроскопа. Можно производить фотосъемку изображения. Так как флуорохромы быстро
и необратимо выгорают во время анализа препарата, то в флуоресцентной микроскопии
придумали использовать специальные цифровые камеры накопления сигнала (CCD).
Основная их особенность состоит в том, что кристалл матрицы способен накапливать
сигнал в течение некоторого времени, то есть выдавать изображение не только в реальном
времени, но и в условиях продолжительных выдержек. Благодаря этому, можно не только
получить яркое изображение, а потом уже беспрепятственно анализировать и
обрабатывать его, но также можно усилить светящийся сигнал при изначально очень
слабой флуоресценции. Необходимо помнить, что ртутная лампа испускает очень
мощный свет, который при неосторожном обращении может приводить к облучению и
ожогам глаз и рук, поэтому для дополнительной защиты необходимо использовать
светозащитную шторку. В флуоресцентной микроскопии используются специальные
объективы, с очень хорошими оптическими свойствами. Также для препаратов
применяется специальное иммерсионное масло, которое не обладает собственной
флуоресценцией. Препараты, окрашенные флуоресцентными красителями хранят в
темноте и в холодильной камере для избежания выгорания флуорохромов.
Слайд: «Дифференциальная Q-окраска».
Текст.
Вот так выглядит дифференциальная Q-окраска. На этом слайде видно, что
флуоресцентный краситель DAPI ярче окрашивает прицентромерный гетерохроматин на
всех хромосомах. А краситель хромомицин, напротив, прицентромерные районы
окрашивает бледнее по сравнению с хромосомными плечами.
Титр: «Анализ хромосомных препаратов и кариотипирование».
Слайд: «Этапы».
Текст.
Приготовив все необходимые препараты, начинаем кариотипический анализ.
Готовый хромосомный препарат кладем на предметный столик, капаем иммерсионное
масло и под 100-кратным увеличением просматриваем препарат, двигаясь челночным
путем. Игнорируем хромосомные пластинки, в которых хромосомы лежат плотной кучкой
и их невозможно посчитать, и наоборот, обращаем пристальное внимание на кариотипы с
хорошим разбросом хромосом и понятной морфологией. Если находим достойную
пластинку, мы можем записать ее координаты, используя шкалы на предметном столике и
препаратоводителе микроскопа. Это позволит в дальнейшем легко найти повторно это
место. Красными стрелками помечены шкалы предметного столика, а зелеными — шкалы
препаратоводителя. Для определения координаты по оси Х мы смотрим, где находится
рисочка с кружком относительно шкалы препаратоводителя, мы видим что-то где-то
между 80 и 81. Чтобы определить с точкостью до десятой доли, замечаем, какая из
рисочек
на
шкале
предметного
столика
совпадает
с
рисочкой
на
шкале
препаратоводителя. Это пятая рисочка. Значит координата по оси Х - 80 целых пять
десятых. Точно также определяем координату по оси Y. Смотрим на пересечение рисочки
с кружком, это примерно одна целая. А десятые доли — это пересечении седьмой рисочки
на шкале предметного столика с рисочкой на шкале препаратоводителя. Итого, одна целая
семь десятых. Полностью запись выглядит таким образом. Третий этап включает в себя
раскладку хромосом в кариограмму. Для этого выбираем самую подходящую
хромосомную пластинку, в которой хромосомы достаточно разбросаны, без наложений
друг на друга, с хорошей морфологией. Производим фотосъемку этой пластинки на
цифровую камеру. А далее, мы можем распечатать хромосомы на бумаге, вырезать их
вручную и разложить, либо сделать раскладку при помощи программы Icaros.
Титр:
«Программа
Icaros
(Metasystems,
Германия)
для
автоматического
кариотипирования».
Слайд: «Заставка Icaros».
Текст.
Программа Icaros позволяет автоматически раскладывать любой хромосомный
набор в кариограмму, опираясь на относительную длину хромосом. Программа также
способна распознавать и раскладывать мышинные и человеческие хромосомы, опираясь
на их G-рисунок. Изображения с хромосомами можно загружать с внешних носителей,
либо провести фотосъемку с хромосомного препарата при помощи цифровой камеры.
Видео: Монитор компьютера, показана последовательность раскладки хромосом в
кариограмму.
Текст.
Вы видите пластинку с хромосомами мыши. Окраска рутиной. И сейчас я
продемонстрирую
последовательные
этапы
подготовки
хромосом
к
раскладке,
непосредственно раскладку, а также некоторые другие возможности это программы.
Работаем при помощи левой и правой кнопок мыши.
Итак, первое действие. Осветляем фон вокруг каждой хромосомы при помощи
кнопки «Objective threshold». Это необходимо для того, чтобы обозначить границы между
отдельными хромосомами, чтобы программа воспринимала их как отдельные объекты.
Кликаем на кнопку и двигаем мышью вправо. При этом вы видите, что появляется желтый
цвет. И нужно добиться того, чтобы вокруг всех хромосом был желтый фон. Если
продолжать двигать мышью и дальше вправо, то начинают исчезать сами хромосомы.
Поэтому необходимо соблюсти баланс, чтобы и фон вокруг хромосом был желтый, и
хроматин остался цел. Выбранный вариант фиксируем правой кнопкой мыши. Далее, при
помощи кнопки «Check objects» проверяем количество хромосом. И видно, что некоторые
хромосомы распознались как один объект. Их необходимо разделить при помощи кнопки
«Separate». Неразделенные хромосомы показаны одним цветом. И чтобы их разделить
нужно кликнуть левой кнопкой мыши рядом с этими хромосомами. Появляется маленькое
окошко, в котором проводим непрерывную линию, разделяющую две или более
хромосом. После разделения хромосомы приобретают разные цвета. Затем снова
проверяем количество хромосом, нажав функцию «Check objects». Вот вы видите в
нижнем правом углу показано количество — 40 хромосом. Теперь нажимаем на
кариограмму. Это схема раскладки мышинных хромосом. Внизу наши хромосомы
расположены по длине. Левой кнопкой мыши делаем двойной клик на каждую
хромосому, и они автоматически раскладываются на кариограмме. Вы видите, что
программа нашла мышинную Х-хромосому по длине. Х-хромосома по размерам между
третьей и четвертой парой аутосом. Что мы можем сделать дальше. По правилам
акроцентричные хромосомы располагаются центромерными районами наверх. Мы можем,
нажав функцию «rotate 180/900», перевернуть хромосомы в нужном направлении. Просто
наводим курсор на хромосому и нажимаем левую кнопку мыши. Корректируем все
перевернутые хромосомы. Если нажать на одну и ту же хромосому несколько раз, она
перевернется на 900. Итак, перевернули. Еще с помощью функции «rotate Х0» можно
повернуть хромосому на любой градус. Например, вот эта хромосома криво лежит. Жмем
левую кнопку мыши и поворачиваем ее. Функция «Clean» позволяет убрать мусор вокруг
хромосомы. При нажатии левой кнопки мышки рядом с хромосомой появляется окошко с
резинкой, и вот так стираем аккуратно все ненужное. Функция «Magnify» позволяет
сделать хромосомы более крупными, а функция «Reduce», наоборот — их уменьшить.
Функция «Staining» изменяет интенсивность окраски хромосом, от черных до очень
бледных. При помощи функции «Shift»хромосому можно сместить чуть выше или чуть
ниже. Вот мы получили раскладку мышинных хромосом, окрашенных рутинным
способом. Это можно распечатывать на принтере, сохранять на внешних носителях.
Титр: «Часть третья. Цитогенетика человека».
Текст.
Цитогенетика человека — это наиболее развитая область цитогенетики, которая
изучает отдельные хромосомы и кариотип человека в целом. Именно благодаря
цитогенетике человека появляется все новое количество методик, позволяющее все
глубже заглянуть в тайны природы хромосом.
Фотослайд: «Загрязнение окружающей среды».
Текст.
Активное загрязнение окружающей среды приводит к тому, что повышается
мутационная изменчивость в популяции человека, а это постепенно приводит к
увеличению частоты и количества наследственных заболеваний. Такие отрасли, как
медицинская
цитогенетика
и
медицинская
генетика
занимаются
разработками
хромосомной диагностики, лечения и профилактики наследственных болезней. Для
получения хромосомных препаратов человека чаще всего используют клетки костного
мозга, лимфоциты крови, амниотическую жидкость.
Слайд: «ISCN».
Текст.
В 1960 году была создана первая Международная система цитогенетической
номенклатуры хромосом человека (An International System for Human Cytogenetic
Nomenclature – ISCN). C тех пор цитогенетики регулярно собираются, обсуждают и вносят
дополнительные данные в номенклатуру хромосом человека.
Фотослайд: «Кариотип человека. Окраска рутиной».
Текст.
Эта классификация была построена на основе анализа хромосом, окрашенных рутинным
способом. У человека 46 хромосом в диплоидном наборе. Ученые цитогенетики
разложили хромосомы на семь групп и обозначили их буквами от А до G. Группы А и В
составляют большие метацентрики. Группа С содержит средней длины субметацентрики,
включая также Х-хромосому. Группа D состоит из средних акроцентриков. В группе Е
объединены короткие метацентрики и пара субметацентриков. Группа F включает
короткие метацентрики. А группа G – две пары акроцентриков и Y-хромосому.
Фотослайд: «G-окраска хромосом человека».
Текст.
Со временем все больше накапливалось цитогенетических данных о кариотипе
человека. Благодаря G-окраске, которая выявляет уникальный рисунок темных и светлых
полос, удалось идентифицировать каждую хромосому.
Фотослайд: «Идиограмма хромосом человека».
Текст.
На основании G-окраски хромосом человека была построена идиограмма — это схема
гаплоидного набора, где каждая хромосома изображается вертикальным стобиком, высота
которого пропорциональна длине хромосомы, точно указано положение центромеры, и в
данном случае особенность окраски, темные и светлые полосы.
Фотослайд: «Х-хромосома».
Текст.
Для подробного описания хромосом и хромосомных районов были введены правила
нумерации полос. Рассмотрим эти правила на примере Х-хромосомы человека. Слева
расположена идиограмма короткой хромосомы, а справа — идиограмма хромосомы чуть
более растянутой, с большим количеством полос. Такую растянутую хромосому можно
получить, используя специальные вещества, которые препятствуют конденсации хромосом
на стадии метафазы. Короткое плечо двуплечей хромосомы называется — p-плечом, а
длинное — q-плечом. Нумерация в каждом плече начинается с центромерного района и
идет по направлению к теломерному концу. Каждое плечо для удобства разбито на
районы. Вот, районы 1 и 2 в p-плече. И районы 1 и 2 в q-плече. Каждый район включает в
себя сегменты, или бэнды, светлоокрашенные, либо темно-окрашенные, они тоже
помечены цифрами. Нумерация очень пригождается в медицинской цитогенетике при
описании конкретных точек хромосом, где произошли изменения, случились хромосомные
перестройки.
Слайд: «2p34».
Текст.
Для обозначения конкретного бэнда используют четырехзначную символику, например,
2p34. Это означает, что бэнд расположен во второй хромосоме, в p-плече, в 3 районе и
четвертый по счету. Нередко бэнды рападаются еще на суббэнды, они обозначаются
цифрами после точки. Например, так. Суббэнд 1 в составе бэнда 3.
Слайд: «Хромосомные заболевания человека».
Текст.
Хромосомные заболевания человека бывают по двум причинам. Либо они обусловлены
анеуплоидией, то есть изменением числа хромосом в кариотипе. Либо вызваны
хромосомными перестройками. Анеуплоидии в свою очередь могут затрагивать аутосомы
или половые хромосомы, а в редких случаях и те, и другие. Крайне редко встречается
полиплоидизация, когда в каждой клетке кариотип 3n=69, или 4n=92. Хромосомные
перестройки бывают внутрихромосомные и межхромосомные.
Слайд: «Анеуплоидии».
Текст.
Анеуплоидии — это изменения в числе хромосом. В норме в каждой диплоидной
клетке присутствует по две хромосомы каждой пары. При нарушениях в ходе деления
клеток, при неправильном расхождении хромосом, в митозе или мейозе, происходит
образование моносомиков и трисомиков. Аутосомные моносомии записываются таким
образом, общее количество хромосом минус номер той хромосомы, которая потерялась.
Эти моносомии летальны еще на стадии раннего эмбриогенеза. Аутосомные трисомии
приводят к множественным порокам развития и высокой смертности ребенка на первом
году жизни. Смертность тем выше, чем длиннее добавочная аутосома, и тем больший
вклад она вносит в клеточный дисбаланс. Анеуплоидии по половым хромосомам не так
фатальны, как аутосомные. Отсутствие или добавление половых хромосом отражается в
основном на развитии половых органов и половых функций, а уровень жизнеспособности
и умственного развития при этом может оставаться в норме. И приведем самые известные
примеры хромосомных заболеваний.
Слайд: «Синдром Патау».
Текст.
Хромосомная природа этого синдрома была описана в 1960г. доктором Патау.
Синдром вызван трисомией по 13 аутосоме. Дети редко доживают до года, потому что у
них множественные пороки. Недоразвитие головы и мозга, деформация ушей, губ, носа,
пороки внутренних органов, многопальцевость, умственная отсталость.
Слайд: «Синдром Эдвардса».
Текст.
Синдром Эдвардса назван по имени первооткрывателя, описан в 1960г. Причина
заболевания
—
трисомия
по
18
аутосоме.
У
новорожденных
присутствуют
множественные аномалии развития мозгового и лицевого черепа, пороки сердца,
умственная отсталость. Как правило, ранняя смерть до года.
Слайд: «Синдром Дауна».
Текст.
Синдром Дауна наиболее часто встречаемая и потому наиболее изученная
хромосомная болезнь человека. Причиной синдрома является трисомия по 21 аутосоме,
описан синдром еще в 19 веке. Частота среди новорожденных 1 больной ребенок на 7-8
сотен здоровых. Характерные признаки носителей: монголоидный разрез глаз, круглое
уплощенное лицо, крупный язык, деформированные уши. Часто порог сердца, сниженная
иммунная система. Задержка умственного развития с возможной коррекцией в ходе
специальных обучающих программ.
Слайд: «Синдром Шеришевского-Тернера».
Текст.
При этом синдроме у женщин отсутствует одна из половых хромосом, и в клетках
не обнаруживается тельце Барра. Это приводит к проявлению рецессивных генов в Ххромосоме, что является, например, причиной дальтонизма. Отсутствие половой
хромосомы приводит к нарушению развития половых желез и бесплодию. Внешне
синдром проявляется низкорослостью, избыточным весом, складками кожи вокруг шеи.
Встречаются аномалии развития внутренних органов и скелетной системы. Интеллект
сохранен, хорошо адаптируются в социуме.
Слайд: «Синдром Клайнфельтера и трипло-Х».
Текст.
Синдром Клайнфельтера описан в 1942г., и назван по имени первооткрывателя.
Наиболее часто встречается набор ХХY, реже XXXY и другие варианты. Развитие идет по
мужскому типу, но добавочная Х-хросома вносит дисбаланс, который проявляется
недоразвитием половых желез и вторичных мужских признаков. Носители высокого
роста, с женоподобными фигурами, бесплодны, с легкой степенью умственной
отсталости. Коррекция возможна в виде терапии препаратами тестостерона пожизненно.
Синдром трипло-Х встречается у женщин, в кариотипе которых вместо двух — три Х-
хромосомы. Носительницы имеют нормальное физическое и психическое развитие.
Поэтому синдром был открыт случайно при обнаружении в клетках двух телец Барра
вместо одного. Как правило, отклонений в развитии нет, остается только риск
хромосомных нарушений у потомства.
Слайд «Структурные аберрации».
Текст.
Структурные изменения или аберрации хромосом часто приводят нарушению
нормального развития. Различают внутрихромосомные перестройки хромосом, это
делеции, инверсии, инсерции, дупликации, и межхромосомные перестройки, они
включают транслокации, реципрокные, нереципрокные и робертсоновские.
Слайд: «Синдром Лежена и синдром Вольфа-Хиршхорна».
Текст.
Эти два синдрома встречаются при делециях. Синдром Лежена или кошачьего
крика развивается при делеции короткого плеча пятой хромосомы. У детей характерный
плач, напоминающий кошачье мяуканье, множественные пороки развития, умственная
отсталость. Для синдрома Вольфа-Хиршхорна характерна делеция короткого плеча 4
хромосомы. Также множественные пороки, умственная отсталость.
Слайд: «Синдром Дауна и филадельфийская хромосома».
Текст.
Эти два синдрома возникают при реципрокных транслокациях хромосом. Синдром
Дауна в этом случае проявляется типичным образом. При синдроме филадельфийской
хромосомы нарушается структура важного гена и появляется химерный белок, который
способствует избыточной клеточной пролиферации, что приводит к возникновению рака
крови — лейкозу.
Титр: «Молекулярные методы для анализа кариотипа».
Текст.
Опираясь на обычную дифференциацию хромосом после G-окраски далеко не все
межхромосомные и внутрихромосомные перестройки можно выявить. Поэтому были
разработаны молекулярные методы для обнаружения аномалий кариотипа человека.
Несколько слов о некоторых из них.
Слайд: «Флуорохромы и псевдоцвета».
Текст.
В основе молекулярных методов лежит выделение ДНК из целых хромосом
человека или отдельных районов хромосом. Далее создание ДНК-библиотек и ДНК-проб
и мечение их разными флуорохромами. После этого проводят флуоресцентную in situ
гибридизацию,
а
результаты
снимают
на
цифровую
камеру
и
автоматически
обрабатывают при помощи компьютерных программ. Так как существуют ограничения на
одновременное использование многих флуорохромов, а гаплоидное количество хромосом
человека равно 24, то придумали использовать разные комбинации нескольких
флуорохромов, и вводить псевдоцвета. Так, использование трех флуорохромов (синего,
красного и зеленого) позволяет ввести 7 псевдоцветов. Чтобы подсчитать сколько нужно
флуорохромов для окрашивания 24 хромосом человека, воспользуемся формулой 2n-1, где
n-количество флуорохромов. Итак, четырех флуорохромов будет недостаточно, а пяти —
в самый раз.
Фотослайд: «24-цветная FISH».
Текст.
Так выглядит кариотип человека после двадцатичетырехцветной флуресцентной in
situ гибридизации. Такая псевдоокраска достигается благодаря комбинаторному мечению
хромосом пятью флуорохромами. Этот метод хорошо подходит для выявления
межхромосомных перестроек, например реципрокных и робертсоновских транслокаций.
И этот подход абсолютно бесполезен для детекции делеций, инсерций и инверсий.
Фотослайд: «Многоцветный бэндинг».
Текст.
Если использовать ДНК-пробы не целых хромосом, а их отдельных районов, то
можно получить многоцветный уникальный бэндинг для каждой хромосомы. Естественно
анализ полученных изображений проводится при помощи компьютерных программ,
которые учитывают свечение и его интенсивность при комбинации шести флуорохромов.
Разным районам каждой хромосомы присваивается своя комбинация из разных
псевдоцветов. При данном подходе легко выявлять делеции, инверсии, дупликации.
Фотослайд: «Спектральное кариотипирование».
Текст.
Спектральное кариотипирование — это кариотипирование при помощи прибора,
который измеряет спектральные характеристики каждой хромосомы. Хромосомы также
окрашивают несколькими флуорохромами, и каждая из хромосом приобретает свои
уникальные характеристики свечения. При сравнении полученных данных со стандартами
можно выявлять индивидуальные хромосомы.
Слайд: «Профилактика хромосомных патологий».
Текст.
Несмотря на активное развитие цитогенетики человека, на сегодняшний день мы не
способны исправлять и устранять хромосомные дефекты, лежащие в основе заболевания.
Единственное, что возможно, это профилактика хромосомных болезней. Одной из мер
является улучшение окружающей среды человека и устранение вредоносных мутагенных
факторов. Другой мерой является пренатальная диагностика и прерывание беременности в
случае подтверждения диагноза. И еще одним из подходов является коррекция лечебными
препаратами. В случае анеуплоидий по половым хромосомам это пожизненная
гормонотерапия для поддержания нормального развития. В случаях микроделеций
важных генов — заместительная терапия продуктов патологического гена.
Слайд: «Литературные источники».
Слайд: «Электронные источники фото и изображений».
Слайд: «В фильме использован музыкальный фрагмент».