Автореферат Мушенковой Н.В. - Институт биоорганической химии
реклама
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН На правах рукописи МУШЕНКОВА НАТАЛИЯ ВАЛЕНТИНОВНА ЭКСПРЕССИЯ ФРАГМЕНТОВ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННОГО ГЕНА МУЦИНА 1 МЫШЕЙ И ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ЭТИХ ФРАГМЕНТОВ 03.00.03 – молекулярная биология 14.00.36 - аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2009 г. 1 Работа выполнена в лаборатории клеточных взаимодействий Учреждения Российской академии наук Институте биоорганической химии РАН (ИБХ РАН) Научный руководитель: кандидат биологических наук Елена Викторовна Свирщевская Официальные оппоненты: 1. Доктор биологических наук, Юрий Борисович Лебедев 2. Доктор биологических наук, профессор Людмила Алексеевна Захарова Ведущая организация ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию» Защита состоится диссертационного 25 ноября 2009 года совета при Учреждении в 10 часов на заседании Российской академии наук Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. МиклухоМаклая, 16/10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Автореферат разослан 22 октября 2009 года. Ученый секретарь диссертационного совета: доктор физико-математических наук 2 В.А.Олейников ХАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В настоящее время активно изучаются возможности иммунотерапии раковых заболеваний. Описано большое количество раковых антигенов; в крови больных обнаруживают антитела к онкобелкам, что говорит о возможности распознавания опухолевых клеток. Иммунизация с использованием раковых антигенов позволяет получить хороший протективный ответ в мышиных моделях неоплазии, однако эффективность ее применения у раковых больных низка и составляет не более 1015%. Низкая противоопухолевая эффективность терапевтической вакцинации раковых больных объясняется формированием механизмов опухолевой устойчивости, а также общей иммуносупрессией, наблюдаемой на поздних стадиях болезни. В этой связи превентивная вакцинация предрасположенных к развитию неоплазии людей представляется более перспективной. Формирование клеточного ответа до начала трансформации дает наибольшие шансы иммунной системе контролировать высокий уровень заболевание. Превентивная вакцинация показала протекции в трансплантируемых моделях опухолевого роста, однако эти модели физиологически сильно отличаются от реальной ситуации онкогенеза. Модели спонтанного роста опухолей являются более близкими условиям нормального развития неоплазии. Использование именно спонтанной модели развития неоплазии наиболее хорошо имитирует естественную ситуацию развития опухоли - длительное формирования, развитие в результате трансфорации единичных клеток, естественный процесс коэволюции опухоли и иммунных механизмов контроля. Существующие данные по превентивной противоопухолевой вакцинации получены исключительно в генетически-модифицированных мышах и сильно различаются от модели к модели от полной противоопухолевой протекции до небольшого увеличения латентного периода заболевания. Эти модели также не лишены недостатков, затрудняющих оценку вакцинации у человека. 3 перспективности превентивной Существует острая необходимость в мышиных моделях спонтанного онкогенеза, соответствующих реальной ситуации развития опухоли, что подразумевает экспрессию аутологичного антигена в нормальном генетическом окружении и длительное формирование опухоли. Анализ противоопухолевого эффекта превентивной вакцинации в таких моделях позволит правильно оценить перспективность иммунизации человека. В качестве антигена в данной работе использован муцин гликопротеин, играющий важную роль в физиологии 1, мембранный нормальных и трансформированных эпителиальных клеток. Гиперэкспрессия муцина детектируется практически во всех аденокарциномах человека, включая более 90% карцином молочной железы, поджелудочной железы, яичников, легких, желудка. В клетках карциномы молочной железы наблюдается более чем 10-кратное повышения количества мРНК муцина 1. Высокий уровень экспрессии в раковых клетках и непосредственное участие муцина 1 в трансформации, метастазировании, выживании трансформирванных клеток в условиях стресса делают его хорошей мишенью для иммунотерапии. Вакцины на основе Муцина 1 человека широко изучаются в моделях роста опухоли на мышах и считаются перспективными для иммунотерапии злокачественных болезней человека. Цель работы - разработка ДНК-белковой вакцины на основе мышиного муцина 1 и оценка противоопухолевого эффекта превентивной иммунизации в трансплантируемой и спонтанной моделях рака молочной железы у мышей. В рамках работы были поставлены следующие задачи: 1. Клонировать фрагменты мышиного гена муцина1 в плазмидный вектор для экспрессии в тканях млекопитающих. 2. Получить рекомбинантные белки на основе клонированных фрагменов муцина1. 3. Разработать протокол индукции ответа на муцин 1 у мышей различных линий и сравнить эффективность активации гуморального иммунизации ДНК и комплексом ДНК-белок. 4 и клеточного ответа при 4. Оценить противоопухолевый эффект ДНК-вакцины на основе муцина 1 в трансплантируемой модели рака молочной железы у мышей. 5. Оценить противоопухолевый эффект превентивной иммунизации ДНК-белок вакциной в спонтанной модели рака молочной железы у мышей. 6. Изучить влияние локального воспаления, вызванного введением бактериальных антигенов в места формирования опухоли, на частоту возникновения опухолей и выживание мышей, иммунизированных ДНК-белок вакциной. Научная новизна 1. Впервые была создана комбинированная ДНК-белковая вакцина на основе муцина 1. 2. Впервые был изучен противоопухолевый эффект превентивной иммунизации мышей вакциной на основе муцина 1 мыши. 3. Впервые в исследованиях по противоопухолевой вакцинации была использована BYRB линия мышей, для которой характерно спонтанное формирование множественных карцином молочных желез, по многим параметрам воспроизводящих семейных рак молочной железы человека. 4. Впервые изучали совместный эффект индукции локального воспаления и иммунизации вакциной на основе муцина 1 на формирование опухолей в спонтанной модели карциномы молочной железы. Практическая значимость Нами показано, что двухкомпонентная вакцина, включающая ДНК и белковые фрагменты муцина 1, оказывается более эффективной в индукции как гуморального, так и клеточного звеньев иммунного ответа по сравнению с иммунизацией ДНК. ДНК-белковая вакцина является перспективной для иммунотерапевтических исследований. Обнаружено, что индукция иммунного ответа на раковый антиген (муцин 1) на стадии, предшествующей неоплазии, приводит к значительному ускорению формирования опухолей у животных (2-х кратному у мышей, иммунизированных с 2 месяцев), в спонтанной модели карциномы молочной железы. Проканцерогенный 5 эффект иммунизации значительно возрастает в сочетании с дополнительной индукцией воспаления в месте трансформации клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что противоопухолевая вакцинация, как профилактическая, так и терапевтическая, может иметь обратный эффект. Индукция иммунного ответа у предрасположенных к раку пациентов может привести к увеличению риска развития неоплазии. В работе обнаружено исчезновение популяции антиген-специфичных ИНФгамма продуцирующих Т клеток и поляризация гуморального ответа по Тх2 типу по мере развития неоплазии в спонтанной модели канцерогенеза. Одним из направлений развития современной иммунотерапии рака является поиск механизмов усиления иммунного ответа на раковые антигены. Данная работа показывает, что одной из основных причин описанной низкой эффективности потивоопухолевого иммунного ответа является анергизация опухоль-специфичных CD8 Т-клеток в процессе развития опухоли. Низкий уровень ответа на лечение свидетельствует, скорее всего, о необходимости принципиального изменения подходов в иммунотерапии рака от получения и поддержания пула антигенспецифичных цитотоксических лимфоцитов к стимулированию их миграции в опухолевую среду и обеспечению устойчивости к супрессирующим их активность опухолевым механизмам. Долгий период наблюдения (15 месяцев) в используемой нами спонтанной модели канцерогенеза позволил оценить влияние индукции иммунного ответа к собственному белку на жизнеспособность мышей. Наблюдалось значительное ухудшение выживания иммунизированных мышей и признаки аутоиммунного процесса (непроходимость кишечника, морфологические изменения печени и почек). Апробация работы и публикации Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отдела иммунологии ИБХ РАН, на Всероссийской конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2003 и 2004, зимней молодежной научной школе «Перспективные биотехнологии», 2004 и направления физико-химической биологии и 2005, 7th John Hamphrey advanced summer programme in 6 immunology, 2005, 16th European Congress of Immunology, Paris, 2006, 2-d European Immunology Congress, 13-16 September, 2009, Berlin. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ в центральной печати и материалах российских и зарубежных научно-практических конференций и съездов. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков, 4 таблицы. Список литературы включает 147 источников, из которых 143 иностранные. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные. В исследовании использовали мышей линий BALB/cJCitMoise (далее B/c), CBRB-Rb(8.17)1Iem (CBRB), BYRB-Rb(8.17)1Iem (BYRB), полученных в ИБХ РАН. Клонирование фрагментов муцина 1. Для синтеза кДНК использовали суммарную РНК, выделенную из опухолевых клеток. РНК транскрибировали MMuLV ревертазой (Бионем, Москва) с помощью олиго-dT праймера 1 час при 37ºС. Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР с mucI специфичными праймерами, включающими сайты рестрикции для BamHI и XhoI рестриктаз. Нами было клонировано два участка mucI, соответствующих экзонам 2-4 (muc234) и 4-6 (muc456). Оба фрагмента были клонированы по сайтам BamHI и XhoI в вектор pET22b(+) (Novagen). Последовательности были переклонированы в вектор pBK-CMV (Stratagene). Выделение плазмид. Для выделения плазмид использовали Wizard Plus Minipreps DNA purification System (Promega, Madison, USA). Экспрессия гена muc234 в E.Coli. Экспрессию белков MUC234 и MUC456 в штамме E. Coli BL-21 провели по стандартному протоколу (PET system manual). Рекомбинантные белки очищали на Ni- 7 агарозе (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Полученные белки диализовали против PBS, разливали на аликвоты и хранили на - 20С. Гель-электрофорез. Для определения гомогенности выделенных препаратов, а также для определения молекулярной массы белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в соответствие с методикой (Coligan et al., 1994) Инактивированные бактерии. Грам-положительные бактерии Micrococcus lyzodeikticus (ML) наращивали в LB среде, дополненной 2% глюкозой при 28°C до достижения плотности культуры ОП600=0,6. Инактивировали при 60°C, 30 мин. Отмывали в фосфатном буфере (ФБ), растворяли в прежнем объеме. Мышам вводили 50 мкл такой суспензии подкожно. Иммуно-ферментный анализ. Определение IgG1 и IgG2a, специфичных к MUC1, проводили по стандартной методике (Pharmingen). Смесь MUC234 и MUC456 по 2 мкг/мл каждого в ФБ наносили на планшеты (Costar) на ночь. Все дальнейшие инкубации выполнены в 1% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в ФБ при комнатной температуре. Между инкубациями планшеты отмывали в 0.05% растворе Tween 20 в ФБ. Использовали биотинированные изотип-специфичные антитела, конъюгат ExtrAvidin-пероксидаза (Sigma Co, USA). Реакцию проявляли ортофенилендиамином и оценивали на ридере планшетов Multiscan MCC/340. Данные представлены как оптические плотности. Окраска внутриклеточных цитокинов. Спленоциты после гипотонического шока в 0,83% NH4Cl, инкубировали при 37oC и 5% CO2 в течение 18 ч в RPMI-1640 (Sigma Co.) с 10% фетальной телячьей сывороткой (ФС) (BioClot Ltd, Germany), 300мкг/мл L-глютамина, 50 мМ меркаптоэтанола и антибиотиками (Sigma Co.) в присутствии смеси MUC234 и MUC456 по 5мкг/мл каждого. В последние 6 ч инкубации добавляли брефелдин A (Sigma) по 50мкг/мл. Клетки отмывали в ФБ, содержащем 4% ФС и 0,1% NaN3 (ФБ-цито), и метили анти-CD4 or CD8 антителами, конъюгированными с FITC (Caltag, USA), в течение часа. После отмывки свободные FcR блокировали 10% мышиной сывороткой в течение 30 мин, отмывали и фиксировали в 1% параформальдегиде в ФБ-цито в течение 30 мин при 37оС. После 8 отмывки клетки обрабатывали свежеприготовленным 0.2% сапонином (Sigma Co.) в течение 1 ч. После однократной отмывки клетки метили антителами к ИФН- мыши, конъюгированными с фикоэритрином в течение 2 ч при 4oC. В качестве изотипического контроля использовали смесь мышиных IgG1 и IgG2a антител, меченных FITC и PE. После окончания инкубации клетки отмывали в ФБ с 1 mM EDTA и переносили в пробирки для дальнейшего анализа на цитометре. Цитофлюорометрия. Анализ субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN- оценивали на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, USA) с использованием программы CELLQuest. В работе использовали антитела: анти-CD3-FITC, -CD220-FITC, -CD4-FITC, -CD8-FITC, -ИФН-- фикоэритрин (PE), и изотипический контроль (Caltag, San Francisco, Calif). Статистический анализ проводили с использованием пакета MS Office Excell по t-критерию Стъюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Создание ДНК-белковой вакцины на основе мышиного гена муцина 1 Для клонирования фрагментов гена муцина 1 были подобраны две пары праймеров, комплементарных последовательностям экзонов 2, 4, 6 гена муцина мыши. Структура гена и расположение праймеров приведена на рисунке 1. Такой набор праймеров позволяет амплифицировать фрагменты гена, кодирующие как внеклеточные, так и внутриклеточные участки молекулы муцина 1. ДНК, кодирующую MUC1, получили из опухоли мышей линии В/с методом ПЦР-ОТ. muc234-f 1 2 3 muc456-f 4 5 6 muc234-r 7 muc456-r Рис.1. Структура гена muc1 и расположение полученных фрагментов muc234 и muc456. Штриховкой выделена область тандемных повторов. 9 Нами были амплифицированы два участка гена муцина 1, соответствующих экзонам 2-4 (muc234) и 4-6 (muc456). Ожидаемые размеры продуктов реакции ПЦРамплификации составляли 420 (mucin234) и 370 п.о. (mucin 456). На рисунке 2 представлены результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-ОТ с использованием подобранных пар праймеров. Видно, что оба продукта соответствуют расчетной длине. Рис 2. Разделение продуктов ПЦР-ОТ с парами муцин-специфичных праймеров. Матрица-кДНК, полученная из аденокарцином Balb/c. Сконтроль, соответствующей продукту амплификации гена бетаактина. Полученные фрагменты были клонированы по сайтам BamHI/XhoI в рET-22(b+) вектор. Скрининг плазмид проводили методом ПЦР с соответствующими парами муциновых праймеров, наличие вставки подтверждали рестрикцией с использованием BamHI, XhoI (Рис.3). Рис.3 Скрининг плазмид рЕТ22b(+) после лигирования muc234 фрагмента.(А) Разделение продуктов ПЦР рекомбинантных плазмид с muc234специфичными праймерами. (Б) Электрофоретическое разделения продуктов рестрикции положительной плазмиды (р3). В качестве маркера (М) длин нанесен амплифицированный фрагмент muc234. Во второй дорожке нерестрицированная плазмида, в 3 дорожке плазмида, обработанная BamHI, XhoI 10 Соответствующие белки MUC234 и MUC456 были получены в бактериях E.Coli (Рис.4). Ожидаемый размер белков составляет 20 кДа, что соответствует нижней полосе. Верхняя полоса соответствует димеру MUC1 белков. В данной работе использовали пулированные белки, содержащие как 20, так и 40 кДа фракцию. Клонированные в рET-22(b+) фрагмены муцина 1 были переклонированы в плазмиду pBK-CMV, содержащую цитомегаловирусный промотор, необходимый для экспрессии этих генов в тканях млекопитающих. Специфичность вставки подтверждали секвенированием. В дальнейшем эти конструкты использовали для ДНК- иммунизации. Анализ гуморального ответа на иммунизацию ДНК, ДНК/белок ДНК иммунизация высокоэффективным методом является индукции Рис.4 Электрофореграмма белков MUC234 (вторая дорожка) и MUC456 (третья дорожка) в 15% полиакриламидном геле. M- маркеры молекулярного веса (кДа) сверху вниз: бычий сывороточный альбумин, овальбумин, щелочная ангидраза и ингибитор трипсина. иммунного ответа на антигены (Doria-Rose, 2003). Клетки млекопитающих способны фагоцитировать экзогенную ДНК и сохранять высокий уровень экспрессии трансфецированных конструкций в течение нескольких недель. В исследовании использовали мышей линий BALB/cJCitMoise (далее B/c), CBRB-Rb(8.17)1Iem (CBRB), BYRB-Rb(8.17)1Iem (BYRB), полученных в ИБХ РАН. Мыши каждой линии были разделены на 3 группы (по 5 мышей в группе). Эксперименты с B/c мышами повторили 3 раза, с CBRB 2 раза, с BYRB проводили один раз. 11 б а B/c BYRB CBRB Control О.П.492 0,8 0,6 0,4 1,5 О.П. 492 1 1 0,5 0,2 0 0 10 100 10 1000 100 1000 Разведение сыворотки Разведение сыворотки в 3 O.П. 492 O.П. 492 1 0,5 0 г 2 1 0 10 100 1000 10 100 1000 Разве де ние сыворотки Разведение сыворотки Рис.5. Продукция IgG1 (а и в) или IgG2a (б и г), специфичных к муцину 1, мышами линий B/c, BYRB и CBRB, иммунизированных ДНК (muc234 и muc456) (а и б) или ДНК+белок (MUC234 и MUC456) (в и г). Сыворотку получали через неделю после второй иммунизации. Мышей 1-ой группы иммунизировали дважды с интервалом в одну неделю подкожно в основание хвоста смесью плазмид muc234 и muc456 по 5мкг каждой в адъюванте Gerbu LQ. Вторую группу иммунизировали смесью плазмид и белков MUC234 и MUC456 также по 5мкг каждого компонента в адъюванте. Контрольную группу иммунизировали ФБ с адъювантом. Кровь забирали через неделю после второй иммунизации. Иммунизация ДНК привела к появлению антител как IgG1, так и IgG2a субклассов только у мышей B/c (Рис.5). Переключение класса иммуноглобулинов зависит от взаимодействия В клеток и Т-хелперов и контекста цитокинов и связано с поляризацией иммунного ответа по типу Тх1 либо Тх2. Наличие антител IgG1 и IgG2a соответствует формированию 12 смешанного типа ответа Тх1/Тх2. Иммунизация ДНК+белок вызывала формирование исключительно IgG2a субкласса антител, специфичных к MUC1, у мышей CBRB и BYRB и IgG1/IgG2a ответ у B/c. Таким образом, иммунизация смесью ДНК и белка вызывала выраженный ответ по типу Тх1 у мышей CBRB и BYRB и смешанный ответ у B/c. При этом титры IgG2a антител у B/c также возрасли при комбинированной вакцинации по сравнению с иммунизацией ДНК. Индукция клеточного иммунного ответа на иммунизацию ДНК, ДНК/белок Для характеристики клеточного ответа на муциновые антигены мы проводили определение внутриклеточной продукции ИФН- в CD4+ и CD8+ спленоцитах иммунизированных мышей. Клеточный ответ на MUC1 оценивали в линиях мышей B/c и CBRB. Индукцию специфичной к MUC1 продукции ИФН- проводили in vitro стимуляцией спленоцитов, полученных от иммунизированных мышей, смесью MUC1 белков. В таблице представлены усредненные результаты трех экспериментов (в сумме от 9 до 12 мышей на каждую точку). Наибольший уровень экспрессии ИФН- наблюдался в группах, иммунизированных ДНК+белок. Среди CD8+ T-клеток от 4,3 (B/c) до 4,8% (CBRB) (от 0,8% до 1,3 от общего числа клеток) отвечали повышенной продукцией ИФН- на стимуляцию in vitro MUC1 (Рис.6 и Таблица 1). Таблица 1. Спонтанная и антиген индуцированная внутриклеточная продукция ИФН CD4+ и CD8+ T-клетками из селезенок мышей B/c и CBRB, иммунизированных ДНК (muc234 и muc 456) или ДНК+белок (MUC234 и MUC456) Иммунизация CD4+ T-клетки Спонтанная MUC1 + % среди CD4 T-клеток 1,810,80 1,620,17 1,730,15 2,560,82 (+0,8)* 3,051,25 4,621,15 (+1,6) CD8+ T-клетки Спонтанная MUC1 + % среди CD8 T-клеток 3,801,31 3,471,02 5,912,84 7,732,37 (+1,8) 10,62,5 14,93,4 (+4,3) B/c Контроль ДНК ДНК+белок CBRB Контроль 2,731,15 2,970,95 4,432,19 4802,85 ДНК 10,93,7 5,672,57 11,64,15 12,33,74 ДНК+белок 7,722,25 6,633,15 9,323,33 14,24,15 (+4,8) *В скобках приведена разница между долей ИФН-+ клеток в спонтанных и стимулированных муцином культурах. 13 Спонтанная продукция ИФН- была также выше у иммунизированных мышей по сравнению с контрольной группой. У мышей B/c, но не CBRB, выявлялись CD4 + Tклетки, секретирующие ИФН- после стимуляции MUC1 in vitro. Таким образом, двухкомпонентная вакцина, включающая ДНК и белковые фрагменты муцина 1, оказывается более эффективной в индукции как гуморального, так и клеточного звеньев иммунного ответа по сравнению с иммунизацией ДНК. Рис.6 Анализ внутриклеточной MUC1 специфичной продукции ИФН- CD8+ T-клетками мышей линий CBRB (верхняя панель) and B/c (внизу), иммунизированных плазмидами (muc234 и muc456) и соответствующими белками (MUC234 и MUC456), стимулированных (справа) либо нестимулированных (слева) ) in vitro ночной инкубацией со смесью белков MUC234 и MUC456 Оценка противоопухолевого эффекта иммунизации муцином 1 в трансплантируемой модели аденокарциномы молочной железы мышей Трансплантируемые модели обладают целым рядом недостатков, однако широко используются для первичной оценки эффективности противоопухолевых вакцин. В эксперименте использовали спонтанные опухоли CBRB и BYRB самок и 14 пассируемую in vitro аденокарциному В/с. Аденокарциномы переносили сингенным иммунизированным мышам. Суспензии клеток в количестве 106 клеток на мышь вводили подкожно в правый бок и еженедельно оценивали размер опухоли и выживание мышей. Опухоли развивались на 14 день после перевивки у мышей В/с, на 28 день у мышей остальных линий, что согласуется с гистологической характеристикой опухоли В/с как агрессивной и быстрорастущей. Не были обнаружены статистически значимые различия в размере опухолей CBRB и BYRB иммунизированных и контрольных мышей, в то время как у мышей В/с опухоли росли немного быстрее в обоих иммунизированных группах (Рис.7). Динамика роста опухолей отличается у мышей выбранных линий, что отражается на скорости гибели животных. Так быстрое развитие опухоли у мышей В/с сопровождалось гибелью 100% животных к 60 дню после введения опухоли. У мышей линии CBRB скорость роста опухолей была ниже, животные погибали к 84 дню. Мыши линии BYRB отличались промежуточной динамикой роста опухолей. группа I (ДНК) группа II (ДНК+белок) контроль Средний диаметр - опухоли в мм 25 20 15 10 5 0 25 20 20 15 15 10 10 5 0 0 A 25 Средний диаметр , опухоли в мм Средний диаметр опухоли . в мм 30 20 40 60 День после инъекции суспензии опухолевых клеток 0 0 Б 5 20 40 60 День после инъекции суспензии опухолевых клеток В 0 20 40 60 День после инъекции суспензии опухолевых клеток Рис.7 Рост опухоли у мышей линий BALB/c (А), CBRB (Б), and BYRB (В) , иммунизированных плазмидами (muc234 and muc456), либо плазмидами и рекомбинантными белками (MUC234 and MUC456). Мыши В/с и BYRB линий, иммунизированные комбинированной (ДНК+белок) вакциной, показали тенденцию к лучшему выживанию по сравнению с контрольными 15 группами. В/с и CBRB мыши, иммунизированные только ДНК, погибли раньше контрольных, этот эффект не был обнаружен у BYRB мышей. Таким образом, было показано, что превентивная иммунизация вакциной, созданной на основе белка муцин 1 и его кодирующей ДНК, вызывает клеточный иммунный ответ, но незначительно влияет на формирование опухолей молочных желез и выживание мышей трех линий в трансплантируемой модели. Эффективность ДНК вакцины на основе муцина 1 в спонтанной модели рака молочных желез у мышей В работе использовали мышей линии BYRB, являющихся носителями робертсоновской транслокации Rb(8.17)Iem. Хромосомные перестройки и инсерционный мутаганез, связанный с MMTV инфекций, приводят к высокой частоте развития неоплазий молочных желез, яичников, ЖКТ, лимфом. У 75% самок BYRB, не вступавших в размножение, формируются пальпируемые опухоли молочной железы, при этом первые признаки гиперплазии появляются уже к 6 месячному возрасту. У размножавшихся самок частота формирования КМ достигает 95%, при этом частота метастазирования в легкие составляет 100%. Мышей BYRB иммунизировали в холку раз в месяц, начиная с возраста 2-6 месяцев ДНК-белок вакциной в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) в объеме 100 мкл. Группа контроля получала иммунизацию фосфатным буфером (ФБ) в ПАФ в те же сроки. ДНК-белок вакцина состояла из смеси плазмид muc234 и muc456 по 10 мкг каждой, белков MUC234 и MUC456 по 5мкг каждого компонента в ПАФ. Наблюдение проводили в течение 15 месяцев по достижении мышами возраста 17-21 месяцев. Всего провели 10 иммунизаций. Известно, что уже с 6 месяцев у этих мышей начинают накапливаться гистологические изменения в тканях молочной железы, свидетельствующие о начале процесса трансформации. Таким образом, было интересно проследить зависимость превентивного эффекта иммунизации от того, формировался ли иммунный ответ до трансформации или на ранних стадиях неоплазии. Например, известно, что ИНФ-γ способен предотвращать рост опухоли только на самых ранних стадиях ее 16 формирования. Поэтому можно было ожидать, что превентивный эффект окажется более выражен в группе молодых животных. В данном исследовании мы пытались также ответить на вопрос, каким образом индукция воспаления в потенциальном месте формирования опухоли влияет на формирование опухоли у иммунизированных животных. Для этого проводили инъекции инактивированных бактерий Micrococcus Lyzodeikticus (ML) в четыре точки в область подмышечных и паховых лимфоузлов (наиболее частые места роста опухоли). Инъекции начинали с 5-ой иммунизации, всего провели 5 инъекций. Анализ результатов показал проканцерогенный эффект введения бактерий, который был наиболее выражен у мышей младшей группы (Рис.8). 100% 100% 100% Выживание Опухоли 100% 80% 80% 75% 67% 60% 50% 40% 40% 40% 25% Процент, % Процент, % 80% 60% 60% 60% 60% 50% 40% 40% 25% 20% 20% 10% 0% 0% Contr Contr+ML Muc Contr Muc+ML Contr+ML Muc Muc+ML Рис.8. Влияние активации врожденного иммунитета и иммунизации муциновой ДНКбелок вакциной на выживание мышей BYRB и формирование спонтанных опухолей к концу 15 месяца после начала иммунизации. Представлены данные для двух возрастных групп: 17- (левая диарамма) и 21-месячных мышей (правая). При этом количество опухолей значительно возрастало при введении бактерий иммунизированным мышам. Так, инъекции ML приводили к 2,5 кратному повышению количества опухолей в контрольной группе, 4-х кратному - в группе иммунизированных (1,3 и 1,25, соответственно, у мышей, иммунизированных с 6 месяцев). Был обнаружен также проканцерогенных эффект иммунизации мышей вакциной на основе муцина 1. Так, в группе иммунизированных животных опухоли формировались у 25% мышей (10% в контроле) через 15 месяцев после начала 17 иммунизации (Рис.8). Опухоль-стимулирующий эффект активации иммунного ответа к муцину 1 отсутствовал у животных, иммунизированных с 6 месяцев. Отрицательный эффект иммунизации муцином 1 на выживание мышей также оказался сильнее выражен в более молодой группе. Выживание иммунизированных мышей было снижено в 2 раза, иммунизированных мышей, получавших бактерии, в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой (аналогичные показатели для старшей группы составляют 1,7 и 1,3, соответственно). Таким образом, оба протокола лечения мышей не только не оказывали противоопухолевого эффекта, но и вызывали стимуляцию возникновения и роста опухоли, сильнее выраженную в более молодой группе . Влияние иммунизации на экспрессию муцина 1 Поскольку иммунизация индуцирует клеточный и гуморальный ответа на муцин 1, то, возможно, что в процессе роста элиминируются клетки, экспрессирующие муцин 1, и замещаются неэкспрессирующей популяцией. Для проверки данного предположения провели оценку экспрессии муцина 1 в контрольной и иммунизированной муцином 1 группах после восьмой иммунизации, когда у части мышей уже сформировались опухоли размером 5х5 мм. Анализ экспрессии муцина 1 проводили методом ПЦР-ОТ, анализируя появление продуктов реакции начиная с 10 цикла. Оказалось, что в результате иммунизации не наблюдалось снижения экспрессии муцина в опухолевой ткани по сравнению с контролем (Рис.9). Как в контрольной, так и в иммунизированной группах специфичный продукт амплификации муцина появлялся, начиная с 13 цикла, и был экспрессирован на уровне сопоставимом с экспрессией бета-актина (Рис.9). Интактные Рис 9. Анализ экспрессии муцина I в опухолевой ткани контрольных (левая 3 дорожки) и иммунизированных мышах BYRB (правые 3 дорожки) с помощью метода ПЦР-ОТ. Использованы пары праймеров muc234, muc456. Контрольамплификация бета-актина мыши. Агароза 1.5 %. Вакцинированные 18 Анализ гуморального ответа на муцин 1 Поскольку иммунизация муцином не привела к противоопухолевому ответу, то необходимо было понять, с чем это связано. Ранее мы показали, что двухкратная иммунизация ДНК-белок вакциной приводила к появлению преимущественно IgG2a в титре 1:1000 у трех линий мышей. Увеличение количества иммунизаций не привело к повышению титра антител IgG2a класса. Так, после 10 иммунизаций титр попрежнему был равен 1:1000 (Рис.10). При этом появлялись антитела IgG1 субкласса, ассоциированные с активацией Т-хелперов 2 типа. Титр IgG1 антител достигал 20002500. В контрольной группе наблюдалась достоверная продукция антител IgG1 к муцину 1 (титр 450), а в группе, получившей ML, наоборот, наблюдали стимуляцию продукции IgG2a (титр 620). В целом, низкий титр антител к муцину свидетельствует о наличии негативной регуляции данного процесса. Таким образом, в процессе формирования опухоли происходит поляризация иммунного ответа по Тх2. Этот тип ответа ассоциирован с активацией преимущественно гуморального ответа, неэффективного в плане противоопухолевой протекции, и подавлением активности цитотоксических лимфоцитов. Из клинических данных известна связь между возрастанием титров опухоль-специфичных антител и плохим прогнозом развития болезни. Данные, полученные в этой работе, подтверждают этот факт, поскольку мы видим возрастание суммарного титра муцин-специфичных антител иммунизированных и контрольных животных в процессе опухолевой прогрессии. Титр антител к муцину 1 4000 IgG1 IgG2a 3000 2000 1000 0 Контроль ML MUC1 MUC1/ML НМС Группы Рис. 10 Продукция антител IgG1 и IgG2a субклассов к муцину 1 после 10ти ежемесячных иммунизаций. На рисунке приведены усредненные титры антител для 5 мышей и стандартные отклонения. НМС- нормальная сыворотка мыши. 19 у Анализ клеточного ответа на муцин 1 Однако известно, что антитела не являются протективными при ответе на опухолевые антигены. Поэтому далее анализировали продукцию ИФН- цитотоксическими лимфоцитами в ответ на стимуляцию муцином 1 in vitro. Ранее мы показали, что в результате двухкратной иммунизации данной вакциной наблюдается продукция ИФН- СD8+ Т-лимфоцитами, стимулированными in vitro муцином 1. р=0,01 1 А (среднее 0.16%) Б (среднее 0,24%) р>0,05 В (среднее 0,16%) Г (среднее 0,09%) Рис.11. Анализ внутриклеточной MUC1 специфичной продукции ИФН- CD8+ Tклетками мышей линий BLRB, иммунизированных ДНК+белок после 2-х (А и Б) и после 8-ми (В и Г) иммунизаций. Спленоциты мышей стимулировали (Б и Г) или нет (А и В) in vitro MUC1. Представлены репрезентативные данные. Процент ИФН- продуцирующих CD8+ T клеток указан в квадрантах. Средние значения по трем мышам приведены под гистограммами. Вероятность стимулированной продукцией и контролем (t-test) указана справа. 20 различий между Популяция функционально активных Т-клеток практически полностью исчезала к 8 месяцу после начала эксперимента (Рис.11), что свидетельствует, с большой вероятностью, об индукции толерантности в клетках, специфичных к муцину 1, по мере прогрессии опухолей. Снижение количества муцин-специфических ИНФ-γ продуцирующих эффекторных Т клеток в процессе опухолевой прогрессии наблюдали и в другой модели спонтанной карциномы молочной железы. Этот эффект считается одной из основных причин неэффективности иммунотерапии рака . Инфильтрация опухолей лимфоцитами Анализ инфильтрации опухолей лимфоцитами провели с помощью проточной цитометрии. Полученные данные показали повышение числа В-клеток во всех трех экспериментальных группах (MUC1, ML, ML+MUC1) (Таблица 2). Учитывая литературные данные об участии В клеток в прогрессии опухолевых заболеваний, повышение инфильтрации опухолей В лимфоцитами во всех экспериментальных группах можно считать негативным последствием иммунизации мышей. Таблица 2. Изменение состава лимфоцитов (%), инфильтрующих опухоли, у мышей, иммунизированных муцином 1 или получивших инъекции ML. CD3 CD4 CD8 СD4/8 NK1.1 NKT CD19 СD11b CD44hа контроль 48б 38 13 2,9 10 3,0 38 3,0 17 ML 44 35 11 3,2 9 3,3 44 2,9 15 MUC1 36 21 13 1,6 11 3,6 47 3,1 11 MUC1/ML 42 32 11 2,9 11 4,1 49 3,0 13 а Измеряли число клеток памяти с фенотипом CD44hыighCD62Llow б Данные приведены в процентах от общего числа лимфоцитов. Признаки аутоиммунных процессов Как было показано выше, в группах мышей, иммунизированных муцином 1, наблюдали в два раза большую летальность, чем в контрольных группах. При этом 21 часть мышей иммунных групп погибала без опухолей. Анализ прироста веса мышей в процессе эксперимента также показал, что иммунизированные мыши хуже набирали вес (Рис.12). 5 месяцев 13 месяцев Вес мышей, г 26 24 22 20 Контроль ML MUC1 MUC1/ML Группы Рис.12. Вес мышей различных групп до иммунизации (5 месяцев) и после 8-ой иммунизации (13 месяцев) Кроме этого, у 30% мышей иммунизированных групп наблюдали признаки непроходимости кишечника, у одной мыши наблюдали патологию почки и желудка. Поскольку муцин экспрессируется эпителиальными клетками этих органов, то, с определенной вероятностью, ранняя летальность, снижение веса, а также признаки заболеваний внутренних органов свидетельствуют о наличии аутоиммунных процессов. Данные проявления отсутствовали в контрольных группах. 22 ВЫВОДЫ: 1. Клонированы фрагменты мышиного гена муцина1, соответствующие экзонам 234 и 456, и получены соответствующие рекомбинантные белки. 2. Разработана вакцина на основе комплекса ДНК-белок и липосомального адъюванта, способная вызывать у мышей формирование ответа на Муцин 1 по типу Тх1. 3. В модели перевиваемой аденокарциномы молочной железы показано отсутствие противоопухолевого эффекта ДНК-белок вакцины. 4. Развитие опухоли в спонтанной модели аденокарциномы молочной железы сопровождалось формированием анэргии муцин-специфичных CD8+ T клеток и продукцией IgG1 антител, ассоциированных с активацией Тх2. 5. Иммунизации ДНК-белок вакциной на стадии, предшествующей малигнизации, значительно ускоряет формирование спонтанных опухолей молочных желез у мышей и ухудшает их выживание. 6. Локальное воспаление достоверно стимулирует рост спонтанных опухолей молочной железы, но не влияет на выживание мышей. Проканцерогенный эффект воспаления наиболее выражен у молодых мышей. 7. Сочетание иммунизации и стимуляции врожденного иммунитета вызывает суммирование и усиление эффектов, приводя как к снижению выживания мышей, так и ускорению формирования опухолей. 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи: 1. Мушенкова Н.В., Моисеева Е.В., Чаадаева А.В., Свирщевская Е.В. Индукция гуморального и клеточного ответа на муцин 1 с использованием ДНК иммунизации. Иммунология, 2006, 27, №4, 216-221. 2. Мушенкова Н.В., Моисеева Е.В., Чаадаева А.В., Вискова Н.Ю., Свирщевская Е.В. Эффективность ДНК вакцины на основе муцина 1 в спонтанной модели рака молочных желез у мышей. Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2006, №2, 16-23. 3. Мушенкова Н.В. Возможности иммунного контроля опухолей. Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2006, №2, 2-15 4. Mushenkova N., E.Moiseeva, A.Chaadaeva, W. Den Otter, E.Svirshchevskaya. Antitumor effect of double immunization of mice with mucin 1 and its coding DNA. Anticancer research, 2005, 25, 3893-3898. Тезисы: 1. Svirshchevskaya E.V., Mushenkova N.V. Tumor growth in vivo depends directly on soluble factors. Eur J Immunol, Supplement 1/09, 2009, 39, S1, PD10/29. 2. Mushenkova N., E.Moiseeva, A.Chaadaeva, E.Svirshchevskaya. Effect of preventive mucin I vaccination on spontaneous breast cancer in BLRB mice. 16th European Congress of Immunology, Paris, 2005, PD-3808 3. Мушенкова Н.В, Свирщевская Е.В, ., Моисеева Е.В., Чаадаева А.В. Исследование противоопухолевого эффекта вакцинации мышей ДНК и белком муцина I . Тезисы докладов и стендовых сообщений XVII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2005. 4. Mushenkova N., E.Moiseeva, A.Chaadaeva, E.Svirshchevskaya. Local activation of innate immunity at the site of tumor growth enhances protective effect of anti-mucin 1 immunization in the transplantable model of mouse breast carcinoma. 7th John Hamphrey advanced summer programme in immunology, 2005. 24 5. Свирщевская ЕВ, Моисеева ЕВ, Чаадаева А.В., Мушенкова НВ, Коцарева ОД. Противоопухолевый эффект иммунизации мышей неассоциированным с опухолью белком десмоглеином 3. Медицинская иммунология. 2004, 6, 3-5, 251. 6. Мушенкова НВ, Моисеева Е.В., Чаадаева А.В., Свирщевская Е.В. Противоопухолевый эффект иммунизации мышей ДНК и белком муцином I. Медицинская иммунология. 2004, 6, 3-5, 245. 7. Лысенко АА, Коцарева ОД, Мушенкова Н.В., Дзуцева И.Р., Матушевская, Свирщевская. Создание модели пузырчатки на мышах. Медицинская иммунология. 2004, 6, 3-5, 238. 8. Лысенко АА, Коцарева ОД, Мушенкова Н.В, Свирщевская Е.В. Создание модели пузырчатки на мышах. Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2004 9. Масленникова Н.А., Мушенкова Н.В., Свирщевская Е.В. Упрощенный метод получения дендритных клеток мышей. Медицинская иммунология. 2003, 5, 3-4, 206. 25