ФЕРМЕНТЫ Ферме́нты ка) — обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или...

ФЕРМЕНТЫ
Ферме́нты или энзи́мы (от лат. fermentum, греч. ζύμη, ἔνζυμον — дрожжи, закваска) — обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или их комплексы,
ускоряющие (катализирующие) химические реакции в живых системах. Возможно, в ходе
эволюции органического мира рибозимы служили биокатализаторами до того, как ферментативная функция перешла к белкам, более приспособленным к выполнению этой задачи. Реагенты в реакции, катализируемой ферментами, называются субстратами, а получающиеся вещества — продуктами. Ферменты специфичны к субстратам (АТФаза катализирует расщепление только АТФ, а киназа фосфорилазы фосфорилирует только фосфорилазу). Ферментативная активность может регулироваться активаторами и ингибиторами (активаторы — повышают, ингибиторы — понижают активность). Белковые ферменты синтезируются на рибосомах, а РНК — в ядре. Ферменты присутствуют во всех
живых клетках и способствуют превращению субстратов в продукты. Ферменты выступают в роли катализаторов практически во всех биохимических реакциях, протекающих в
живых организмах — ими катализируется более 4000 разных биохимических реакций.
Ферменты играют важнейшую роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и
регулируя обмен веществ организма.
Первые данные о ферментах были получены при изучении процессов брожения и
пищеварения. Большой вклад в исследование брожения внес Л.Пастер, однако он полагал,
что соответствующие реакции могут осуществлять только живые клетки. В начале 20 в.
Э.Бухнер показал, что сбраживание сахарозы с образованием диоксида углерода и этилового спирта может катализироваться бесклеточным дрожжевым экстрактом. Это важное
открытие послужило стимулом к выделению и изучению клеточных ферментов. В 1926
Дж.Самнер из Корнеллского университета (США) выделил уреазу; это был первый фермент, полученный в практически чистом виде. С тех пор обнаружено и выделено более
700 ферментов, но в живых организмах их существует гораздо больше. Идентификация,
выделение и изучение свойств отдельных ферментов занимают центральное место в современной энзимологии.
Подобно всем катализаторам, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакцию, понижая энергию активации процесса. Химическое равновесие при этом не смещается ни в прямую, ни в обратную сторону. Отличительной особенностью ферментов по
сравнению с небелковыми катализаторами является их высокая специфичность — константа связывания некоторых субстратов с белком может достигать 10−10 моль/л и менее.
Каждая молекула фермента способна выполнять от нескольких тысяч до нескольких миллионов «операций» в секунду. Например, одна молекула фермента ренина, содержащегося
в слизистой оболочке желудка теленка, створаживает около 106 молекул казеиногена молока за 10 мин при температуре 37 °C. При этом эффективность ферментов значительно
выше эффективности небелковых катализаторов — ферменты ускоряют реакцию в миллионы и миллиарды раз, небелковые катализаторы — в сотни и тысячи раз.
Размеры ферментов и их строение
Молекулярная масса ферментов, как и всех остальных белков, лежит в пределах 10
тыс. — 1 млн. (но может быть и больше). Они могут состоять из одной или нескольких
полипептидных цепей и могут быть представлены сложными белками. В состав последних наряду с белковым компонентом (апоферментом) входят низкомолекулярные соединения — коферменты (кофакторы, коэнзимы), в том числе ионы металлов, нуклеотиды,
витамины и их производные. Некоторые ферменты образуются в форме неактивных
предшественников (проферментов) и становятся активными после тех или иных изменений в структуре молекулы, например, после отщепления от нее небольшого фрагмента. К
их числу относятся пищеварительные ферменты трипсин и химотрипсин, которые синтезируются клетками поджелудочной железы в форме неактивных предшественников
(трипсиногена и химотрипсиногена) и обретают активность в тонком кишечнике в составе
поджелудочного сока. Многие ферменты образуют так называемые ферментные комплексы. Такие комплексы, например, встроены в мембраны клеток или клеточных органелл и
участвуют в транспорте веществ.
Подвергающееся превращению вещество (субстрат) связывается с определенным
участком фермента, его активным центром, который формируется боковыми цепями аминокислот, находящимися часто в значительно удаленных друг от друга участках полипептидной цепи. Например, активный центр молекулы химотрипсина образуют остатки гистидина, находящегося в полипептидной цепи в положении 57, серина в положении 195 и
аспарагиновой кислоты в положении 102 (всего в молекуле химотрипсина 245 аминокислот). Таким образом, сложная укладка полипептидной цепи в молекуле белка — ферменте
обеспечивает возможность нескольким боковым цепям аминокислот оказаться в строго
определенном месте и на определенном расстоянии друг от друга. Коферменты также
входят в состав активного центра (белковая часть и небелковый компонент в отдельности
ферментативной активностью не обладают и приобретают свойства фермента, лишь соединившись вместе).
Кофакторы ферментов
Некоторые ферменты выполняют каталитическую функцию сами по себе, безо всяких дополнительных компонентов. Однако есть ферменты, которым для осуществления
катализа необходимы компоненты небелковой природы (кофакторы). Кофакторы могут
быть как неорганическими молекулами (ионы металлов, железо-серные кластеры и др.),
так и органическими (например, флавин или гем). Органические кофакторы, прочно связанные с ферментом, называют также простетическими группами. Кофакторы органической природы, способные отделяться от фермента, называют коферментами.
Фермент, который требует наличия кофактора для проявления каталитической активности, но не связан с ним, называется апофермент. Апофермент в комплексе с кофактором носит название холофермента. Большинство кофакторов связано с ферментом нековалентными, но довольно прочными взаимодействиями. Есть и такие простетические
группы, которые связаны с ферментом ковалентно, например, тиаминпирофосфат в пируватдегидрогеназе.
Механизм действия фермента.
Активность ферментов определяется их трёхмерной структурой. Как и все белки,
ферменты синтезируются в виде линейной цепочки аминокислот, которая сворачивается
определённым образом, и получающаяся молекула (белковая глобула) обладает уникальными свойствами. Несколько белковых цепей могут объединяться в белковый комплекс.
Чтобы катализировать реакцию, фермент должен связаться с одним или несколькими субстратами. Белковая цепь фермента сворачивается таким образом, что на поверхности глобулы образуется щель, или впадина, где связываются субстраты. Эта область
называется сайтом связывания субстрата. Обычно он совпадает с активным центром
фермента или находится вблизи него. Некоторые ферменты содержат также сайты связывания кофакторов или ионов металлов.
Фермент, соединяясь с субстратом:



очищает субстрат от водяной «шубы»
располагает реагирующие молекулы субстратов в пространстве нужным для протекания реакции образом
подготавливает к реакции (например, поляризует) молекулы субстратов.
Обычно присоединение фермента к субстрату происходит за счет ионных или водородных связей, редко — за счет ковалентных. В конце реакции её продукт (или продукты) отделяются от фермента. В результате фермент снижает энергию активации реакции.
Это происходит потому, что в присутствии фермента реакция идет по другому пути (фактически происходит другая реакция), например:
В отсутствии фермента:
А+В = АВ
В присутствии фермента:
А+Ф = АФ
АФ+В = АВФ
АВФ = АВ+Ф
где А, В — субстраты, АВ — продукт реакции, Ф — фермент.
Ферменты не могут самостоятельно обеспечивать энергией эндергонические реакции (для протекания которых требуется энергия). Поэтому ферменты, осуществляющие
такие реакции, сопрягают их с экзергоническими реакциями, идущими с выделением
большего количества энергии. Например, реакции синтеза биополимеров часто сопрягаются с реакцией гидролиза АТФ.
Специфичность
Ферменты обычно проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам (субстратная специфичность). Это достигается частичной комплементарностью
формы, распределения зарядов и гидрофобных областей на молекуле субстрата и в центре
связывания субстрата на ферменте. Ферменты обычно демонстрируют также высокий
уровень стереоспецифичности (образуют в качестве продукта только один из возможных
стереоизомеров или используют в качестве субстрата только один стереоизомер), региоселективности (ообразуют или разрывают химческую связь только в одном из возможных положений субстрата) и хемоселективности (катализируют только одну химическую
реакцию из нескольких возможных для данных условий). Несмотря на общий высокий
уровень специфичности, степень субстратной и реакционной специфичности ферментов
может быть различной. Например, эндопептидаза трипсин разрывает пептидную связь
только после аргинина или лизина, если за ними не следует пролин, а пепсин гораздо менее специфичен и может разрывать пептичную связь, следующую за многими аминокислотами.
Модель «ключ-замок»
В 1890 г. Эмиль Фишер предположил,
что специфичность ферментов определяется
точным соответствием формы фермента и
субстрата. По образному выражению, нередко употребляемому в биохимической литературе, фермент подходит к субстрату, как
ключ к замку. Такое предположение называется моделью «ключ-замок». Фермент соединяется с субстратом с образованием короткожи-
вущего фермент-субстратного комплекса. Однако, хотя эта модель объясняет высокую
специфичность ферментов, она не объясняет явления стабилизации переходного состояния, которое наблюдается на практике.
Модель индуцированного соответствия
В 50-е годы нашего столетия это статическое представление было заменено
гипотезой Д. Кошланда об индуцированном
соответствии субстрата и фермента. Сущность ее сводится к тому, что пространственное соответствие структуры субстрата
и активного центра фермента создается в
момент их взаимодействия друг с другом,
что может быть выряжено формулой "перчатка - рука". При этом в субстрате уже деформируются некоторые валентные связи и
он, таким образом, подготавливается к дальнейшему каталитическому видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные перестройки. Боковые
группы аминокислот активного центра принимают такое положение, которое позволяет
ферменту выполнить свою каталитическую функцию. В некоторых случаях молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре. Гипотеза Кошланда, основанная на допущении гибкости активного центра фермента, удовлетворительно объясняла активирование и ингибирование действия ферментов и регуляцию их активности при воздействии различных факторов. В частности, конформационные перестройки в ферменте в процессе изменения его активности Кошланд сравнивал с колебаниями
паутины, когда в нее попала добыча (субстрат), подчеркивая этим крайнюю лабильность структуры
фермента в процессе каталитического акта. Вот как писал ученый о своем открытии: «Важную эвристическую
роль при разработке новых представлений сыграла пришедшая мне в голову аналогия с перчаткой: в исходном
виде этот предмет туалета может быть свернут или смят
и, только будучи надет на руку, совпадает с ней по форме. Я предположил, что между энзимом (эластичной
перчаткой) и субстратом (умеренно податливой кистью)
имеют место похожие отношения: вместо контакта
жестких болванок идет взаимная подгонка лабильных
молекул, при этом фермент сильно изменяет свою форму, а субстрат переходит в напряженное состояние. Я
был воодушевлен успехами «перчаточной» модели, которую назвал «теорией индуцированного соответствия». Ферменты, в основном, — не жесткие, а гибкие молекулы. В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответствия объясняет не только
специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния.
Влияние условий среды на активность ферментов
Структурные особенности ферментов, необходимые для их функционирования,
легко утрачиваются. Третичная структура белков разрушается при нагревании или воздействии некоторых химических веществ. Поэтому активность ферментов зависит от
условий в клетке или организме — давления, кислотности среды, температуры, концентрации растворенных солей (ионной силы раствора) и др.
Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоких значениях к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны,
оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и
на все последующие этапы преобразования субстрата, что ведет к усилению катализа.
Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается
типичной кривой. До некоторого значения температуры (в среднем до 5О°С) каталитическая активность растет, причем на каждые 10°С примерно в 2 раза повышается скорость преобразования субстрата. В то же время постепенно возрастает количество
инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части. При температуре выше 50°С денатурация ферментного белка резко усиливается и, хотя скорость реакций преобразования субстрата продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного субстрата, падает.
Детальные исследования роста активности ферментов с повышением температуры, проведенные в последнее время, показали более сложный характер этой зависимости,
чем указано выше: во многих случаях она не отвечает правилу удвоения активности
на каждые 10°С в основном из-за постепенно нарастающих конформационных изменений в молекуле фермента.
Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна,
называется его температурным оптимумом. Температурный оптимум для различных
ферментов неодинаков. В общем для ферментов животного происхождения он лежит
между 40 и 50°С, а растительного - между 50 и 60°С. Однако есть ферменты с более высоким температурным оптимумом, например, у папаина (фермент растительного происхождения, ускоряющий гидролиз белка) оптимум находится при 8О°С. В то же время у
каталазы (фермент, ускоряющий распад Н2О2 до Н2О и О2) оптимальная температура
действия находится между 0 и -10°С, а при более высоких температурах происходит
энергичное окисление фермента и его инактивация.
Поскольку белки в сухом состоянии денатурируются значительно медленнее, чем
белки оводнённые (в виде белкового геля или раствора), инактивирование фермента в сухом состоянии происходит гораздо медленнее, чем в присутствии влаги. Поэтому сухие
споры бактерий или сухие семена могут выдержать нагревание до гораздо более высоких
температур, чем те же споры или семена в увлажнённом состоянии.
Зависимость активности фермента от значения рН среды была установлена свыше
50 лет назад. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при
котором он проявляет максимальную активность. В резко кислой или резко щелочной среде хорошо работают лишь некоторые ферменты. Так, например, пепсин, содержащийся в желудочном соке, наиболее активен в сильнокислой среде (pH 1–2); трипсин –
протеолитический Ф., выделяемый поджелудочной железой, имеет оптимум действия в
слабощелочной среде (pH 8–9); оптимум действия папаина – протеолитического Ф. растительного происхождения – находится в слабокислой среде (pH 5–6). Большинство ферментов лучше всего «работают» в растворах, pH которых близок к 7, когда концентрация
ионов H+ и OH- примерно одинакова. Связано это с тем, что структура белковых молекул,
а следовательно, и активность ферментов сильно зависят от концентрации ионов водорода
в среде.
Классификация ферментов.
Исторически многим ферментам присваивались тривиальные названия, часто не
связанные с типом катализируемой реакции. Для преодоления возникших трудностей в
середине 20 в. были разработаны классификации и номенклатура ферментов. По рекомендации Международного биохимического союза, все ферменты в зависимости от типа катализируемой реакции делят на 6 классов: 1-й - оксидоредуктазы, 2-й - трансферазы, 3-й гидролазы, 4-й - лиазы, 5-й - изомеразы и 6-й - лигазы. Каждый класс делится на подклассы, в соответствии с природой функциональных групп субстратов, подвергающихся хим.
превращению. Подклассы, в свою очередь, делятся на подпод-классы в зависимости от
типа участвующего в превращении фермента. Каждому достаточно охарактеризованному
ферменту присваивается классификационный номер из 4 цифр, обозначающих класс, подкласс, подподкласс и номер самого фермента. Например, a-химотрипсин имеет номер
3.4.21.1.
Название фермента формируется из следующих частей:
1.
название субстрата с которым он взаимодействует
2.
характер катализируемой реакции
3.
наименование класса ферментов (но это необязательно)
4.
суффикс -азапируват - декарбоксил - аза, сукцинат - дегидроген - аза
К оксидоредуктазам относятся ферменты, катализирующие окислительновосстановительные реакции. Ферменты этого типа переносят атомы H или электроны.
Многие оксидоредуктазы являются ферментами дыхания и окислительного фосфорилирования.
Трансферазы катализируют перенос функциональных групп (CH3, COOH, NH2,
CHO и др.) от одной молекулы к другой.
Гидролазы катализируют гидролитическое расщепление связей (пептидной, гликозидной, эфирной, фосфодиэфирной и др·)·
Лиазы катализируют негидролитическое отщепление групп от субстрата с образованием двойной связи и обратные реакции. Эти ферменты могут отщеплять CO2, H2O,
NH3 и др.
Изомеразы катализируют образование изомеров субстрата, в т. ч. цис-, трансизомеризацию, перемещение кратных связей, а также групп атомов внутри молекулы.
Лигазы - ферменты, катализирующие присоединение двух молекул с образованием
новых связей (С — С, С — S, С — О, С — N и др.), как правило, сопряженное с расщеплением пирофосфатной связи, напр. у АТФ.
Медицинское значение
Если происходит мутация в гене, кодирующем определенный фермент, может измениться аминокислотная последовательность фермента. При этом в результате большинства мутаций его каталитическая активность снижается или полностью пропадает. Если
организм получает два таких мутантных гена (по одному от каждого из родителей), в организме перестает идти химическая реакция, которую катализирует данный фермент.
Например, появление альбиносов связано с прекращением выработки фермента тирозиназы, отвечающего за одну из стадий синтез темного пигмента меланина. Фенилкетонурия
связана с пониженной или отсутствующей активностью фермента фенилаланин-4гидроксилазы в печени.
Связь между ферментами и наследственными болезнями обмена веществ была
впервые установлена А. Гэрродом в 1910-е гг. Гэррод назвал заболевания, связанные с дефектами ферментов, «врожденными ошибками метаболизма». Передаваемое по наследству заболевание детей — галактоземия (приводит к умственной отсталости) — развивается вследствие нарушения синтеза фермента, ответственного за превращение галактозы в
легко усваиваемую глюкозу. Причиной другого наследственного заболевания — фенилкетонурии, сопровождающегося расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности синтезировать фермент, катализирующий превращение
аминокислоты фенилаланина в тирозин. В настоящее время известны сотни наследственных заболеваний, связанные с дефектами ферментов. Разработаны методы лечения и профилактики многих из таких болезней.
Практическое использование
Так как ферменты сохраняют свои свойства и вне организма, их успешно используют в различных отраслях промышленности. Например, протеолитический фермент папайи (из сока папайи) — в пивоварении, для мягчения мяса; пепсин — при производстве
«готовых» каш и как лекарственный препарат; трипсин — при производстве продуктов
для детского питания; реннин (сычужный фермент из желудка теленка) — в сыроварении.
Каталаза широко применяется в пищевой и резиновой промышленности, а расщепляющие
полисахариды целлюлазы и пектидазы — для осветления фруктовых соков. Ферменты
широко используются в фармакологии. Еще шире область использования ферментов в
научных исследованиях и в медицине.
В неочищенном состоянии ферменты с древнейших времен используют для многих производств: хлебопечения, виноделия, пивоварения, сыроделия, производства спир-
та, чая, уксуса. С начала 20 в. по предложению японского учёного Д. Такамине в спиртовой и др. отраслях промышленности началось применение ферментных препаратов, получаемых из плесневых грибов или бактерий. В ряде стран этот способ широко используется
для осахаривания с помощью амилаз крахмалистого сырья с целью получения кристаллической глюкозы или его сбраживания на спирт. Концентрированные амилолитические
препараты Ф. из плесневых грибов при добавке в тесто приводят к улучшению качества
хлеба и ускорению технологического процесса. Препараты протеолитических ферментов,
получаемых из микроорганизмов, употребляются в кожевенной промышленности для
удаления волос и умягчения сырья, а в сыродельной промышленности – для замены дефицитного сычужного фермента (реннина). Препараты микробных пектолитических ферментов широко используют при производстве соков (выход плодового сока повышается
на 10–20%).
Достаточно очищенные ферменты применяют в производстве аминокислот и их
смесей для искусственного питания, в производстве сахарных сиропов из углеводсодержащего сырья, для удаления лактозы из молока и в производстве ряда лек. средств (некоторые очищенные ферменты сами используются как лекарственные средства). Особенно
перспективно применение в промышленности иммобилизованных ферментов на полимерных носителях (напр., для получения полусинтетич. пенициллинов применяют иммобилизованную пенициллинамидазу).
Ферментативные методы анализа, методы количественного определения химических веществ в растворе, основанные на использовании ферментов. С помощью ферментативных методов определяют вещества, способные участвовать в химических реакциях,
катализируемых ферментами, а также являющиеся активаторами либо ингибиторами
ферментов. Эти методы характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью,
поскольку ферменты катализируют превращения веществ с большой скоростью и высоко
избирательно, даже если анализируемое соединение находится в смеси с др. близкими по
химическому строению веществами.
При определении субстрата ферментативной реакции к анализируемой пробе прибавляют фермент и другие необходимые для реакции компоненты. По окончании реакции
тем или иным удобным методом устанавливают в растворе содержание продукта реакции.
Например, определение этилового спирта в растворе с помощью фермента алкогольдегидрогеназы (АДГ) производится при участии кофермента АДГ – никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Последний в ходе ферментативной реакции количественно превращается
в восстановленный НАД, обладающий, в отличие от окисленной формы, способностью к
поглощению ультрафиолетового света при длине волны 340 нм. Измеряя это поглощение,
можно установить концентрацию восстановленного НАД и рассчитать концентрацию этилового спирта. Метод позволяет определить 1 мкг спирта в 1 мл раствора..
Широкое распространение получили методы, основанные на использовании ферментов, прочно связанных с твёрдыми носителями, которыми могут быть полимеры, неорганические сорбенты, гели. Такие «твёрдые ферменты», помещенные на электрохимические датчики (стеклянные, платиновые и др. электроды), представляют собой ферментные электроды, служащие инструментами для измерения скорости ферментной реакции в
растворе анализируемого вещества. С помощью ферментных электродов определяют мочевину, аминокислоты, пенициллин, глюкозу и т.д. с чувствительностью 0,1–0,01 мкг в
пробе.
Ферменты необходимы при установлении структуры белков, нуклеиновых кислот и
полисахаридов, в генетической инженерии и т. д. С помощью ферментов получают лекарственные препараты и сложные химические соединения.