Программа по специальности медицинская биохимия

ПРОГРАММА
«МИКРОЭЛЕКТРОДНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК
И МЕЖКЛЕТОЧНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВОЗБУДИМЫХ ТКАНЕЙ»
Камкин А.Г. и Киселева И.С.
СПЕЦКУРС
ДЛЯ СТУДЕНТОВ 6 КУРСА МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА
РОССИЙСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
(отделение биохимии)
2009 – 2010 учебный год
Под редакцией
заведующего кафедрой фундаментальной и прикладной физиологии
МБФ ГОУ ВПО РГМУ
профессора
А.Г. Камкина
УТВЕРЖДАЮ:
Председатель ученого Совета МБФ ГОУ ВПО РГМУ
Профессор Ю.В.Балякин________________________
протокол № _____ от «____»________________2009г.
1
Общее количество часов по учебному плану
Всего
Лабораторные занятия
Лекции
560
520
40
Число контрольных мероприятий
Итоговое
занятие
Зачет
Экзамен
5 час
5 час
5 час
2
Примерный тематический план лекций
№№
Тема лекции
Количество часов
1
Методы микроэлектродной техники как способ решения
проблем, связанных с изучением функций возбудимых тканей и
высокопроницаемых контактов
2
2
Техническое обеспечение микроэлектродных исследований
2
3
Изготовление и заполнение микроэлектродов
2
4
Отведение сигналов от клетки
2
5
Обеспечение внутриклеточной поляризации
2
6
Ионофорез
2
7
Многоканальные электроды
2
8
Практическое применение метода микроэлектрофореза
2
9
Устройства для осуществления микроионофореза
2
10
Аппликация вещества на поверхности клетки
2
11
Металлический микроэлектрод
2
12
Молекулярная организация биологических мембран
2
13
Структура и функции ионных каналов
2
14
Потенциалзависимые калиевые каналы
2
15
Пассивный ионный транспорт
2
16
Электрическая активность соматической мембраны нервной
клетки. Параметры возбудимости мембраны
2
17
Электрическая активность миокардиальных клеток
2
18
Межклеточное взаимодействие как один из способов обмена
информацией между клетками организма
2
19
Высокопроницаемые контакты в разных тканях
2
20
Проницаемость контактных мембран
2
3
Лекционный курс
Строение
биологических
мембран.
Формирование
теории
молекулярной
организации биологических мембран. Состав биологических мембран.
Липиды мембран. Типы липидов. Текучесть бислоя липидов и вращательная
диффузия молекул. Фосфолипидный бислой. Текучесть двойного слоя (градиент текучести,
направленный против двойного слоя, текучесть липидов в плоскости двойного слоя,
подвижность двойного слоя, подвижность мембранных белков в плоскости двойного слоя).
Липиды мембран. Цепи жирных кислот. Фазовые переходы (переход гель – жидкий
кристалл, факторы, влияющие на температуру фазового перехода, мозаика «липид внутри
липида», фазовые переходы и гетерогенность в плоскости биологических мембран).
Асимметрия двойного слоя (асимметрия биологических мембран, асимметрия модельных
мембран,
возникновение
и
поддержание
асимметричного
расположения
липидов).
Искусственные мембраны.
Белки мембран. Белки мембран. Первичная структура белка. Пространственная
структура белка (конформация белка). Интегральные мембранные белки. Подвижность
мембранных белков в плоскости бислоя. Интегральные белки (методы солюбилизации
интегральных мембранных белков, общие свойства, топография белков, белки, сходные с
гликофорином, антигены, другие мембранные белки, однократно пересекающие двойной
слой.
Белки,
выступающие
с
цитоплазматической
поверхности
двойного
слоя,
зигзагообразные белки, белки, ковалентно связанные с липидом). Периферические белки
мембран
(цитоскелет,
цитоскелет
различных
клеток).
Обмен
белков
мембран.
Внемембранные поверхностные структуры.
Пассивные электрические свойства мембраны клетки. Общая характеристика
пассивных электрических свойств мембраны. Сопротивление мембраны клетки. Вольтамперная характеристика. Емкость мембраны. Постоянные времени и длины.
Пути перемещения веществ через мембрану. Пути перемещения веществ без
помощи специфического переносчика. Основные представления о диффузии. Диффузия
через мембрану клетки. Пути перемещения веществ при помощи специфического
переносчика. Облегченная диффузия. Активный транспорт.
Общие представления о ионных каналах. Принципы структурной организации
ионных каналов. Каналы утечки.
Потенциал-управляемые ионные каналы. Общие
представления о потенциал-управляемых ионных каналах. Активация и инактивация
потенциал-управляемых
каналов.
Лиганд-управляемые
ионные
каналы.
Общие
представления о лиганд-рецепторном взаимодействии. Общие представления о лиганд4
управляемых ионных каналах. Токи через два типа ионных каналов. Механо-управляемые
ионные каналы. Общие представления о механосенситивности и механосенситивном ионном
канале. Механосенситивный канал. Активация механосенситивных каналов.
Пассивный ионный транспорт через ионные каналы мембраны. Размещение
ионов относительно мембраны. Ионное равновесие. Мембранный потенциал при простом
ионном равновесии. Доннановское равновесие. Роль пассивного ионного транспорта в
формировании потенциала покоя. Поток ионов через мембрану. Диффузионный потенциал.
Равновесный потенциал ионов. Потенциал покоя. Уравнение гольдмана. Электродвижущая
сила для ионов и ионные токи.
Электрофизиологические
методы
исследования
клеток
возбудимых
и
невозбудимых тканей. Общий обзор методов (микроэлектродная техника отведения
биопотенциалов, микроэлектродная техника внеклеточного отведения потенциалов, техника
сахарозного мостика, клеточный диализ, фиксация тока, фиксация потенциала, patch-clamp,
применение потенциалчувствительного красителя). Проблемы, которые решаются этими
методами. Методы микроэлектрофореза (ионофореза) и аппликации в электрофизиологии.
Их использование. Перспективы электрофизиологии на современном уровне.
Потенциалы клетки, определяемые пассивным ионным транспортом. Методы
измерения
потенциала
мембраны.
Потенциал
покоя
клетки.
Потенциалы
клетки,
возникающие при деполяризации ее мембраны и принцип искусственного смещения
потенциала. Пассивный электротонический потенциал. Локальный ответ. Потенциал
действия. Фазы потенциала действия. Типы биоэлектрической активности на примере
нервных клеток. Влияние коротко длящейся поляризации на биоэлектрическую активность
клеток. Влияние долго длящейся поляризации на биоэлектрическую активность клеток.
Ионные токи. Фиксация потенциала у аксонов. Фиксация потенциала у клеток.
Фиксация потенциала при диализе клеток. Метод patch clamp. Конфигурации patch-пипетка
– мембрана. Patch-пипетки. Принципы измерений тока в конфигурации whole-cell.
Принципы измерений тока, протекающего через одиночные каналы. Связь различных
потенциалов действия с ионными токами. Потенциалы действия нервных клеток. Основные
типы потенциалов действия клеток сердца.
Электрическая активность соматической мембраны нервной клетки. Параметры
возбудимости мембраны. Особенности возникновения потенциала действия. Характер
потенциала действия. Количественная оценка ионных токов через мембрану сомы при
возникновении потенциала действия. Ионные механизмы возникновения потенциала
действия у различных типов нейронов. Электрическая активность миокардиальных клеток.
5
Ионная основа мембранного потенциала, потенциала действия. Автоматия сердца. Ее
мембранные механизмы.
Потенциал-управляемые
натриевые
каналы.
Молекулярная
организация
натриевого канала. Общие представления. Первичная структура и общая топология.
Классификация натриевых каналов и номенклатура. Гены натриевых каналов. Молекулярная
фармакология натриевых каналов. Молекулярная организация ворот канала. Роль
модификации
управляемых
потенциал-управляемых
Na+-каналов.
Na+-каналов.
Фосфорилирование
Гликозилирование
потенциал-управляемых
потенциалNa+-каналов.
Участки связывания потенциал-управляемых Na+-каналов. Центр связывания 1 (TTX, STX и
конотоксин). Центр связывания 2 (Вератридин, аконитин и BTX). Центр связывания 3
(Токсины морских анемон, α-токсины скорпиона и
токсины
паутины
паука).
Центр
связывания 4 (β - токсины скорпиона). Центр связывания 5 (Бреветоксины и CTX).
Инсектициды (центр связывания 6). DPI 201-106: синтетический модификатор Na+-каналов.
Центр связывания местных анестетиков. Терапевтическое использование модуляторов Na+каналов. Терапевтические возможности блокаторов Na+-каналов. Виды натриевых каналов.
Натриевый канал NaV1.1. Натриевый канал NaV1.2. Натриевый канал NaV1.3. Натриевый
канал NaV1.4. Натриевый канал NaV1.5. Натриевый канал NaV1.6. Натриевый канал NaV1.7.
Натриевый канал NaV1.8. Натриевый канал NaV1.9.
Потенциал-управляемые кальциевые каналы. Кальциевые токи. Молекулярная
организация кальциевого канала. Общие представления. 1 субъединицы.  субъединицы. 
субъединицы.
Регуляция
Ca2+-каналов
протеинкиназами.
Регуляция
Ca2+-каналов
посредством протеинкиназы-G (PKG). Регуляция Ca2+-каналов посредством протеинкиназыА (PKA). Регуляция Ca2+-каналов посредством протеинкиназы-С (PKC). Молекулярная
фармакология кальциевого канала. Анализ селективной проницаемости каналов. Мультиионные основы селективной проницаемости в Са2+ каналах. Молекулярная организация
селективного фильтра. Функциональная асимметрия среди глутаматов селективного
фильтра. Функциональные группы, которые связывают Ca2+ в селективном фильтре. Теории
проницаемости Са2+ канала. Проницаемость каналов на основе теории скоростей реакции
(Rate Theory). Ограничения теории скоростей реакции. Модели, использующие структурные
приближения. Модели, использующие предсказанные структуры. Активация и инактивация
кальциевых каналов.
Аналитическое описание. Молекулярные механизмы. Кальциевые
каналы CaV1. Кальциевый канал CaV1.1. Кальциевый канал CaV1.2. Кальциевый канал
CaV1.3. Кальциевый канал CaV1.4. Кальциевые каналы CaV2. Кальциевый канал CaV2.1.
Кальциевый канал CaV2.2. Кальциевый канал CaV2.3. Кальциевые каналы CaV3. Кальциевый
канал CaV3.1. Кальциевый канал CaV3.2. Кальциевый канал CaV3.3.
6
Калиевые каналы. Характеристики K+-каналов. Номенклатура, предложенная
Human Genome Organisation (HUGO). Стандартная номенклатура системы K+-каналов.
Обоснование рациональной классификации. Потенциал-управляемые K+ -каналы — KV. Ca2+активируемые K+-каналы — KCa. K+-каналы аномального выпрямления с током входящего
направления — Inwardly rectifying potassium channels — Kir. K+-каналы с двумя петлями в
домене —Two-P potassium channels — (К2Р).
Механосенситивность клеток и тканей. Механосенситивные ионные каналы. Силы,
вовлеченные в изменение состояния МСК. Бислой. Методы механической стимуляции.
Изучение единичных каналов.
Липидрастворимые соединения и возможность открытия
SAC. Изучение токов в конфигурации whole-сell. Молекулярно-биологический подход к
изучению МСК. Роль цитоскелета в регуляции воротного механизма МСК. Ингибиторы и
активаторы МСК.
Функциональная классификация МСК. Могут ли МСК могут
продуцировать значительные токи в клетке. Роль МСК в формировании электрического
ответа клетки. Инактивация механочувствительных токов. Механосенситивные каналы, токи
и потенциалы кардиомиоцитов. Основные методы растяжения фрагментов ткани сердца и
механической
деформации
изолированных
клеток
сердца.
Исследование
механосенситивности кардиомиоцитов предсердий. Исследование механосенситивности
кардиомиоцитов желудочков. Изучение одиночных МСК при механическом воздействии на
мембрану. Механосенситивные каналы, токи и потенциалы фибробластов сердца.
Исследования механосенситивности фибробластов в ткани предсердий здоровых животных.
Исследования механосенситивности изолированных фибробластов предсердий здоровых
животных. Исследования фибробластов в ткани предсердий с патологией.
Межклеточное взаимодействие как один из способов обмена информацией между
клетками
организма.
Методы
обнаружения
высокопроницаемых
контактов
(ВПК).
Электрические измерения. Коэффициент электрической связи. Экспериментальные подходы
к обнаружению электрической связи. Электрическая структура тканей с ВПК. Методы
внутриклеточных меток: флюорисцентные метки, изотопные метки.
Высокопроницаемые контакты (ВПК) – gap junctions – в разных тканях (возбудимые
ткани: сердечная мышца, гладкая мышца, нервная ткань). ВПК в невозбудимых тканях.
Проницаемость контактных мембран. Электрические модели контактов (контакт без утечки
и диффузионных каналов, контакт с утечкой без диффузионных каналов). Связь
рассмотренных моделей контактов и вопросов проведения электротонических потенциалов.
Щелевой контакт. Сопоставление удельной проводимости контактных и поверхностных
мембран. Особенности диффузии ионов и молекул через контактные мембраны.
Распространение через ВПК ионов и красителей. Распространение через ВПК некоторых
7
органических соединений. Избирательность ВПК. Интенсивность межклеточного обмена
через ВПК. Факторы, модифицирующие деятельность ВПК. Бескальциевая среда. Трипсин.
Повышение токсичности среды. Изменения рН. Внутриклеточные инъекции Са 2+.
Метаболические яды. Уабаин. Частичная блокада ВПК. Олигопептиды как регуляторы ВПК.
Гормоны. Новокаин. Устойчивость ВПК к ряду биологически активных факторов.
Колхицин. Цитохалазин В. Инъекции К+ и Cl- . Влияние на мембранные липиды. Возможные
механизмы регуляции ВПК. Регуляция свойств отдельного канала. Регуляция числа каналов.
Структура ВПК. Классификация типов клеточных контактов. Щелевой контакт. Плотный
контакт. Септированный контакт. Десмосома. Щелевой контакт – структурная единица ВПК.
Взаимодействие клеток с помощью ВПК. Классические представления о клеточнолй
организации ткани и их взаимодействии через ВПК. Роль ВПК в возбудимых тканях.
Пассивные электрические свойства. Активные электрические свойства. Особенности
взаимодействия клеток с химическими и электрическими синапсами.
Методы микроэлектродной техники как способ решения проблем, связанных с
изучением функций возбудимых тканей и ВПК. Применение различных методов в решении
той или иной проблемы.
Техническое
обеспечение
микроэлектродных
исследований:
микроэлектроды,
усилители, регистраторы, микроманипуляторы. Другие приборы. Открытая система
перфузии
биологических
объектов.
Типы
перфузионных
камер.
Принципы
их
конструирования и расчеты.
Физика микроэлектродов. Размеры и форма. Механические свойства, электрическое
сопротивление, емкость. Потенциал кончика электрода. нелинейные электрические
характеристики электродов.
Изготовление
и
заполнение
микроэлектродов.
Стекло.
Вытягивание
микроэлектродов. Заполняющие растворы. Способы выполнения. Заточка. Измерение
сопротивления микроэлектродов.
Усилители для отведения биопотенциалов. Ток утечки. Входное сопротивление.
Входное сопротивление. Время нарастания и частота. Абсолютное максимальное входное
напряжение. Динамический диапазон напряжений. Динамический диапазон установки
напряжений смещения. Дрейф и стабильность. Отведение сигналов от клетки: способы
присоединения микроэлектродов. Обеспечение контакта с внеклеточной средой. Регулировка
постоянной составляющей потенциала. Заземление и помехи, калибровка. Электрические
шумы. Фильтр низких частот. Обеспечение внутриклеточной поляризации. Источники тока.
Измерители тока. Попеременное подведение тока и регистрация потенциала. Одновременное
измерение потенциала.
8
Ионофорез. Физические основы ионофореза. Транспортные процессы; связь между
током
и
высвобождением
микроэлектродов.
веществ.
Многоканальные
Изготовление
электроды.
и
Методы
заполнение
заточки
многоканальных
и
обламывания.
Коаксиальные микроэлектроды и их сборка. Способы заполнения. Требования к растворам.
Примеры
практического
применения
метода
микроэлектрофореза:
идентификация
синаптических медиаторов. Нейрофармакологические исследования. Применение метода для
модификации свойств нейронов. Применение внутриклеточных инъекций. Применение в
морфологических исследованиях. Устройства для осуществления микроионофореза.
Аппликация
веществ
на
поверхность
клетки
под
давлением.
Примеры
практического применения. Техническое исполнение.
Металлический микроэлектрод, его виды и изготовление. Изоляция микроэлектрода.
Показатели качества.
9
Курс лабораторных занятий.
№№
Тема занятия
Количество часов
1
Электронно-измерительная аппаратура для микроэлектродных
исследований.
Генераторы,
осциллографы,
цифровые
вольтметры, источники питания, шлейфные осциллографы.
Подготовка электронно-измерительной аппаратуры к работе.
20
2
Промышленные приборы для микроэлектродных исследований:
манипуляторы типа КМ-1 и КМ-2, приборы для вытяжки
капилляров ПВК-1, прибор для изготовления микроэлектродов
МЭ-4. Принципы их работы. Устройство основных узлов
приборов. Подготовка приборов к работе.
20
3
Изготовление структурированных капилляров для дальнейшей
работы из специальных стеклянных заготовок при помощи
прибора ПВК-1.
20
4
Изготовление микроэлектродов различных типов. Их
заполнение. Измерение сопротивления, емкости и собственного
потенциала микроэлектродов.
20
5
Изготовление многоканальных микроэлектродов
20
6
Изучение устройства для заточки микроэлектродов. Заточка
микроэлектродов. Измерение сопротивления и потенциала
заточенных микроэлектродов.
20
7
Разработка
простейшего
усилители
биопотенциалов на основе микросхем.
20
8
Травление печатных плат. Сборка усилителя.
20
9
Сборка усилителя.
20
10
Регулировка усилителя.
20
11
Сборка электронно-измерительной схемы, позволяющей
регистрировать биопотенциалы и одновременно осуществлять
поляризацию мембраны клетки.
20
12
Продолжение сборки электронно-измерительной схемы и ее
регулировка.
20
13
Методика препаровки нервной системы беспозвоночных и
подготовки препарата.
20
для
регистрации
10
14
Методика препаровки сердца лягушки и подготовка препарата
(изолированное бьющееся сердце, изолированное бьющееся
сердце с блуждающим нервом).
20
15
Регистрация биоэлектрических параметров нейронов
20
16
Регистрация биоэлектрических параметров миокардиальных
клеток.
20
17
Изучения
влияния
искусственной
биоэлектрические параметры нейронов
поляризации
на
20
18
Изучение
влияния
искусственной
поляризации
биоэлектрические параметры миокардиальных клеток
на
20
19
Изучение межклеточного взаимодействия в нервной системе
20
20
Изучение межклеточного взаимодействия в нервной системе
20
21
Изучение межклеточного взаимодействия в миокарде
20
22
Изучение межклеточного взаимодействия в миокарде
20
23
Влияние одного биологически активного соединения на
биоэлектрические параметры и межклеточное взаимодействие
возбудимой ткани (по выбору)
20
24
Влияние одного биологически активного соединения на
биоэлектрические параметры и межклеточное взаимодействие
возбудимой ткани (по выбору)
20
25
Влияние одного биологически активного соединения на
биоэлектрические параметры и межклеточное взаимодействие
возбудимой ткани (по выбору)
20
26
Оформление работы и ее защита
20
11
Необходимая литература
1. Камкин А.Г., Киселева И.С. Техническое обеспечение
исследования клеток. Москва, 1989. 174 страницы.
микроэлектродного
2. Камкин А.Г., Киселева И.С., Ярыгин В.Н. (2003) Механоелектрическая обратная связь
в сердце. Монография. Москва, 1-351.
3. Фундаментальная и клиническая физиология. Под редакцией Андрея Камкина и
Андрея Каменского. Москва, 2004. Москва, «Академия». 1600 стр.
4. Mechanosensitivity in Cells and Tissues 1. Mechanosensitive Ion Channels (2007). Andre
Kamkin and Irina Kiseleva (eds) SPRINGER. 380 рp.
5. Камкин А.Г., Киселева И.С., (2008) Физиология и молекулярная биология мембран
клеток Москва, «Академия». 586 стр.
Заведующий кафедрой фундаментальной
и прикладной физиологии ГОУ ВПО РГМУ
профессор
А.Г.Камкин
12