Далее…

реклама
Изучение потенциальных противоопухолевых свойств биологически активных
добавок lentinus edodes (шиитаке), fomitopsis officinalis (трутовика
лиственничного) и phallus impudicus (веселка)
Филиппова И. А., Разин А. Н., Волков М. Ю., Дерягина В. П., Рыжова Н. И.
Задачей настоящего исследования является:
1) изучение противоопухолевых свойств грибов Lentinus edodes (Шиитаке),
Fomitopsis officinalis (Трутовика лиственничного) и Phallus impudicus (Веселка)
на модели перевивной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) у мышей;
2) исследование возможных механизмов ингибирующего действия грибов:
определение функциональной активности нейтрофилов крови и перитонеальных моноцитов и макрофагов, определение видового клеточного состава этих
биологических жидкостей;
3) выявление возможной связи между объемом растущей опухоли и активностью одного из важных медиаторов роста опухоли – оксида азота.
Методика исследования. Работа проведена на 129 мышах-гибридах F1
(С57ВlxCBA) и Balb/c разводки питомника «Столбовая» РАМН. Мыши F1
(С57ВlxCBA) в количестве 89 особей были разделены на 6 групп: 1 гр. – интактная группа (здоровые мыши), n=15; 2 гр. – здоровые мыши, получавшие
перорально водную суспензию грибов Lentinus edodes –Шиитаке (188 мг/кг),
n=15. Контролем служили мыши с подкожно перевитой аденокарциномой Эрлиха (106 клеток в 0,5 мл Хенкса), n=15 – 3-я гр. Остальные три опытные группы
по 14 и15 мышей в каждой (4, 5 и 6 гр.) включали мышей с перевитой АКЭ.
Мыши этих групп получали 5 раз в неделю в течение двух недель до перевивки
и на протяжении всего эксперимента водную суспензию грибов в разовой дозе
15 мг/кг Трутовика или Веселки (табл. 1), или 188 мг/кг Шиитаке. Следует подчеркнуть, что мышам 4 и 5 групп первые два дня эксперимента вводили максимально переносимую разовую дозу грибов Трутовика лиственничного и Веселки, которая составляла 188 мг/кг.
Действие грибов на рост перевитой опухоли по другой схеме введения действующего продукта исследовали на примере Трутовика (табл. 1а). Опыт проводили на мышах Balb/c, с общим количеством 20 животных. Контролем служили
мыши с перевитой АКЭ, n=10. Мышам опытной группы, численностью 10
животных, вводили перорально водную суспензию Трутовика в дозе 18,3 мг / кг,
начиная со второго дня после перевивки АКЭ и в течение всего последующего
периода.
Наличие возможной связи между размером опухоли в процессе ее роста
и образованием нитросоединений в организме проводили также на мышах
Balb/c, с общим количеством 20 животных (табл.6).
Ингибирующее рост опухоли действие грибов оценивали по торможению роста
опухоли (ТРО) у животных опытных групп в сравнение с контрольной группой:
ТРО = [ (Vк-Voп)/Vк] x 100%; где Vк – средний объем опухоли в контрольной
группе, Voп – средний объем опухоли в опытной группе (м м³). Принимая
во внимание, что форма опухоли представляет собой не чисто сферическую
форму и более напоминает элипсоид, объем опухоли определяли по формуле
для расчета объема элипсоида: V= AxBxCx p /6, где А, В, С – длины большой,
средней и малой оси.
Выделение активных форм кислорода фагоцитами крови и перитонеальной
жидкости (нейтрофилами, моноцитами и макрофагами) определяли по люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ), регистрируемой прибором Биолюмат, модель 9500 ( «Berthoold, Германия). Резидентные клетки перитонеальной
жидкости получали промыванием брюшной полости раствором Хенкса в объеме 2 мл. Перитонеальные клетки осаждались на предметном стекле
в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин. После фиксации
в метаноле и окрашивания их по Романовскому-Гимза определяли клеточный
состав перитонеальной жидкости по морфологическим критериям.
Для постановки реакции определения спонтанной (СХЛ) и фагоцитозависимой
хемилюминесценции (ФЗХ) крови и клеток перитонеального содержимого
смешивали 0,2 мл Хенкса + 0,1 мл люминола (0,56 мМ) + 0,1 мл крови
(предварительно разведенной в 4 раза р-ром Хенкса) или 0,1
мл перитонеальной жидкости. В качестве активатора фагоцитоза использовали
зимозан (0,05 мл), опсонизированный сывороткой 10-12 здоровых доноров.
ХЛ измеряли в течение 30 мин, с интервалом в 5 мин. Известно,
что хемилюминесцентный ответ крови и перитонеальной жидкости
определяется, в основном, фагоцитирующими клетками: нейтрофилами,
моноцитами и макрофагами, способными продуцировать активные формы
кислорода. Учитывая это, а также исходя из клеточного состава изучаемого
объекта, можно принять, что в крови уровень АФК определяется, в основном,
нейтрофилами. Моноциты, присутствующие в крови в меньшем количестве
и проявляющие более низкую хемилюминесцентную активность (до 10 раз),
вносят меньший вклад в общий хемилюминесцентный отклик крови. Принимая
это соотношение, приходим к выводу, что хемилюминесцентная активность
перитонеальной жидкости, содержащей m макрофагов и n нейтрофилов
эквивалентна активности m + 10 n макрофагов. Отсюда активность одного макрофага a может быть оценена (по хемилюминесцентному отклику) как частное
от деления величины ХЛ/ m + 10 n.
Содержание нитритов (НИ) в моче определяли методом Грисса. Нитраты (НА),
при их определении, предварительно восстанавливали до НИ пористым
кадмием и анализировали тем же методом. Для сбора мочи мышей помещали
по 5 шт. в обменные клетки на сутки, лишив корма при свободном доступе
к дистиллированной воде. Во избежание разрушения НИ в емкости для сбора
мочи вносили 0,3 мл 30% гидроксида натрия. Для удаления белковоуглеводной составляющей в экстракте опухолевой ткани, перитонеальном содержимом и моче использовали водные растворы калия
железистосинеродистого и цинка сернокислого.
Статистическую обработку данных, представленных как среднее арифметическое значение + стандартное отклонение, проводили, используя критерий
Стьюдента.
Результаты и обсуждение.
В табл. 1 представлены результаты действия водной суспензии грибов Трутовика, Веселки и Шиитаке на рост АКЭ в течение 31 дня наблюдения после
индукции опухоли. Как видно из приведенных данных, на ранних сроках наблюдения (6-11 сутки) клетки АКЭ были чувствительны к введению всех видов
грибов: Трутовика, Веселки и Шиитаке, причем Веселка вызывала наиболее
выраженный ингибирующий эффект, который составил 71,0%. Ингибирующее
действие Трутовика и Шиитаке на ранней стадии развития опухоли более
умеренное, максимальное снижение объема опухоли составляет 63,2 и 50,2%
соответственно. Через две недели после индукции опухоли тормозящее действие грибов Веселки и Трутовика в значительной мере сглаживается и в течение последующего периода наблюдения составляет около 10%. В то же время,
в этот период ингибирующее действие грибов Шиитаке на рост АКЭ проявляется более отчетливо, объем опухоли у мышей этой группы меньше на 14,317,8%, чем в контроле. Обращает на себя внимание выраженная межиндивидуальная чувствительность мышей к действию всех видов грибов. Так, формирование опухолевого узла на ранней стадии роста опухоли у некоторой части
опытных мышей было замедленным, затем скорость роста опухоли опережала
этот показатель, характерный для других животных и затем стабилизировалась
на их уровне.
Результаты взвешивания опухолей у мышей F1 (С57ВlxCBA), забитых на 31 сутки
после индукции АКЭ, показывают, что среднеарифметическое значение массы
опухолей у мышей, которым вводили грибы Трутовик, Веселку, Шиитаке, было
меньшим по сравнению с контролем на 14,3%, 12,7% и 26,2%, соответственно
(табл. 1). Но статистически достоверным снижение массы опухоли было лишь
у мышей с АКЭ, которым вводили грибы Шиитаке (р=0,02).
Анализ данных лейкоцитарного состава клеток крови у мышей в конце эксперимента (табл.2) показывает, что мыши с АКЭ характеризуются более высоким уровнем количества лейкоцитов по сравнению с мышами интактной группы, причем у мышей, потреблявших грибы, этот показатель близок к показателю интактной группы. Наряду с этим, в крови животных с опухолью наблюдается достоверное увеличение относительного количества нейтрофилов
и снижение доли лимфоцитов, а введение грибов практически не меняет
эту тенденцию.
Данные определения функциональной активности нейтрофилов в крови
по выделению активных форм кислорода в хемилюминесцентном тесте (табл.
3) показывают выраженное возрастание активности клеток при стимулировании их зимозаном у мышей с АКЭ. Введение грибов Шиитаке мышам
с АКЭ приводит к существенному достоверному снижению в 3,4 раза
активности полиморфноядерных лимфоцитов в направлении уровня
ее как у здоровых мышей. Введение Шиитаке здоровым мышам не изменяло
активность нейтрофилов в спонтанном состоянии и при их стимулировании
зимозаном.
Определение клеточного состава перитонеального содержимого мышей (табл.
4) показывает, что введение здоровым мышам грибов Шиитаке (188 мг/кг)
на протяжении 45 дней приводит к достоверному в 2,4 раза повышению
общего количества клеток. Увеличение количества клеток в перитонеальной
жидкости здоровых мышей при введении грибов происходил, в основном,
за счет возрастания доли и абсолютного количества лимфоцитов, а также
моноцитов и макрофагов. Увеличение общего количества клеток в 2,1 раза
в сравнении с животными интактной группы присуще и мышам с АКЭ,
не потреблявших грибы. В то же время, у мышей с АКЭ, которым регулярно
вводили суспензию грибов Шиитаке, наблюдали нормализацию этого
иммунологического показателя до уровня как у здоровых мышей. У животных
с АКЭ видовой состав клеток перитонеального содержимого (соотношение
макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, лимфоцитов) отличается
существенным возрастанием относительного количества нейтрофилов в 26,7
раза и одновременным снижением относительного количества лимфоцитов
в 1,2 раза. Введение грибов снижало долю нейтрофилов и достоверно
увеличивало долю моноцитов и макрофагов в перитонеальном содержимом
мышей с АКЭ (табл. 4).
Измерение ХЛ макрофагов перитонеального содержимого у мышей (табл. 5)
выявило снижение активности моноцитов и макрофагов в спонтанном состоянии у мышей с АКЭ (в 4 раза) и у здоровых мышей, получавших грибы (в 2,9
раза). Наряду с этим, при стимуляции клеток перитонеальной жидкости зимозаном у мышей с АКЭ отмечается достоверный рост активности моноцитов
и макрофагов. Мыши с АКЭ, потреблявшие грибы, имели повышенную
активность моноцитов и макрофагов перитонеального содержимого как в спонтанном состоянии, так и при их стимуляции, соответственно, в 5,1 и 1,7 раза
по сравнению с этим показателем для мышей с АКЭ.
Результаты определения нитритов (НИ) и нитратов (НА) в моче мышей Balb/c
в течение роста перевитой АКЭ (табл. 6) отражают интенсивность
их эндогенного образования в организме. Источником эндогенного
образования НИ и НА является оксид азота, продукт активности NO-cинтаз
(конститутивной и индуцибельной). Оксид азота, окисляясь, образует более
стабильные соединения – НИ и НА. Полагают, что интенсивность образования
оксида азота в организме может характеризовать скорость опухолевого роста.
Как видно из данных табл. 6, наблюдается прямая корреляционная зависимость
между уровнем суточного выделения нитритов и нитратов с мочой и объемом
АКЭ. За 28 суток наблюдения с момента появления оформленных опухолевых
узлов (4 сутки) содержание нитритов и нитратов в моче возросло, соответственно, в 3,6 и 65,3 раза, а объем опухоли увеличился в 67,3 раза.
В табл. 1а приведены данные действия водной суспензии Трутовика на рост
АКЭ у мышей Balb/c. Схема введения суспензии Трутовика отличалась от предыдущей. Суспензию Трутовика в дозе 18,3 мг/кг м.т.ж. стали вводить на второй
день после перевивки АКЭ и вводили в течение всего эксперимента с частотой 5
раз в неделю. Как видно, объем опухоли у мышей, получавших грибы Трутовик,
был на уровне контроля, либо несущественно ниже его (на 5,1- 17,5%).
Следовательно, при такой схеме введения и такой дозе, грибы не оказывают
тормозящего действия на рост опухоли.
Таким образом, результаты экспериментального исследования показывают,
что гриба Веселки, Дождевик и Шиитаке, введенные до перевивки АКЭ, вызывают на ранней стадии развития АКЭ торможение роста опухоли и этот эффект
более отчетливо проявляется при введении грибов Веселка 71% по объему опухоли). Следует обратить внимание на то, что доза грибов (Веселка и Трутовик),
вводимых в течение первых 2 дней эксперимента, была максимально переносимой (188 мг/кг), в дальнейшем она была снижена до 15 мг/кг. На первой стадии рост опухоли у мышей F1, получавших грибы, независимо от их вида,
был неравномерен, отмечалась выраженная межиндивидуальная
чувствительность к действию грибов. Но в дальнейшем, ингибирующий эффект
действия Веселки и Трутовика слабел, в то время как умеренное ингибирующее
действие Шиитаке сохранилось до конца наблюдения (31 сутки) и составило
26,2%.
Рост опухоли у мышей всех групп сопровождается увеличением количества
лейкоцитов в крови с одновременным увеличением относительного количества
нейтрофилов. У животных с опухолями усилены свободнорадикальные процессы: стимулировано образование активных форм кислорода нейтрофилами крови, моноцитами и макрофагами перитонеальной жидкости и нитросоединений:
НИ и НА в организме.
Введение грибов Шиитаке здоровым животным приводило к увеличению общего количества клеток в перитонеальном содержимом, прежде всего, за счет
лимфоцитов, моноцитов и макрофагов. Поступление грибов Шиитаке
в о ганизм мышей с АКЭ снижает активность нейтрофилов крови, повышенный
у животных с опухолью, практически до уровня активности этих клеток у здо-
ровых животных. Одновременно у мышей с АКЭ действие грибов Шиитаке
привело к нормализации показателя уровня общего количества иммунокомпетентных клеток в перитонеальном содержимом и скорректировало его видовой
состав в сторону, характерную для здоровых животных. В то же время, введение грибов Шиитаке мышам с АКЭ приводит к усилению активности моноцитов
и макрофагов перитонеальной жидкости.
Выводы. Результаты исследований на мышах-гибридах F1 (С57ВlxCBA)
по выявлению ингибирующего действия грибов Шиитаке на рост перевитой
АКЭ согласуются с результатами, полученными ранее в эксперименте на мышах
линии C57Bl (отчет № 1). Полученные новые данные подтверждают наличие
умеренных ингибирующих свойств у грибов Шиитаке. Грибы Веселка и Трутовик
также проявляют способность ингибировать рост АКЭ на ранних стадиях роста
опухоли, однако в дальнейшем влияние грибов на рост опухоли в существенной
мере убывает.
На основании проведенных исследований можно полагать, что грибы Шиитаке обладают иммуномодулирующим действием: активируют звено
неспецифической противоопухолевой защиты – усиливают активность
моноцитов и макрофагов без стимуляции и при стимуляции этих клеток
активаторами, имеющими разную природу. Наряду с этим, при опухолевом
росте грибы Шиитаке способны регулировать в сторону нормализации такие
показатели, как общее количество иммунокомпетентных клеток
в перитонеальном содержимом и функциональную активность
полиморфноядерных лейкоцитов крови. Данные экспериментов дают
основание предположить, что действие грибов Шиитаке, Веселки и Трутовика
эффективно лишь при схеме, включающей обязательное введении грибов
в течение определенного времени до перевивки АКЭ.
Скачать