obshchaya_i_inzhenernaya_enzimologiya-bib

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского
Биологический факультет
УТВЕРЖДАЮ
Проректор по учебно-методической работе
_________________ Е.Г. Елина
"____" ______________ 2012 г.
Рабочая программа дисциплины
Общая и инженерная энзимология
Специальность
020501 - Биоинженерия и биоинформатика
Квалификация выпускника
Специалист
Форма обучения
очная
Саратов
2012
1
1. Цели освоения дисциплины
Цель курса – дать современные представления о принципах функционирования
белковых катализаторов биохимических реакций, лежащих в основе биологических
процессов, показать значение науки о ферментах – движущей силе всех химических
превращений в живом организме, о структуре, свойствах, функциях, механизме,
специфичности и регуляции действия энзимов в живой клетке, рассмотреть способы
получения и применения иммобилизованных ферментов и возможности практического
использования ферментов в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве, различных
отраслях промышленности.
2. Место дисциплины в структуре ООП специалитета
Цикл С.3, базовая часть, дисциплина изучается в 5 и 6 семестрах.
Для успешного освоения курса необходимы знания по неорганической,
органической, физической, коллоидной, биоорганической и биологической химии,
молекулярной биологии и биологической физике. Требуется умение работать на
персональном компьютере и пользоваться расчетными программами. В свою очередь,
знание энзимологии служит фундаментом для понимания многих разделов других
общебиологических дисциплин – микробиологии, анатомии и физиологии человека,
животных, растений, геномики и протеомики.
3. Компетенции обучающегося, формируемые в результате освоения дисциплины.
В процессе освоения дисциплины формируются компетенции: ОК-11, ПК-12, ПК16-21:
- способен самостоятельно или в составе группы вести научный поиск, реализуя
специальные средства и методы получения нового знания (ОК-11);
- способен к проведению лабораторных работ и знает требования техники
безопасности и приемов оказания первой помощи при несчастных случаях (ПК-12);
- способен к проведению экспериментальных работ с клетками и культурами
клеток, и владеет методами исследования и анализа живых систем, а также
математическими методами обработки результатов биологических исследований (ПК-16);
- способен применять методы биоинженерии и биоинформатики для получения
новых знаний и для получения биологических объектов с целенаправленными
измененными свойствами, применять современные методы исследования; проводить
анализ результатов и методического опыта исследования применительно к общей
фундаментальной проблеме в избранной области (ПК-17);
- способен ориентироваться в основных проблемах и задачах биологии, физикохимической биологии, биоинженерии и биоинформатики и использовать эти знания в
экспериментальной и теоретической деятельности (ПК-18);
- способен получать и грамотно использовать информацию, накопленную в базах
данных по структуре геномов, белков и другой биологической информации (ПК-19);
- способен проводить наблюдения, описания, идентификации, классификации,
культивирования биологических объектов, выделять и исследовать субмикроскопические
структуры, использовать методические приемы для целенаправленного изменения
природных генов и геномов (ПК-20);
- способен владеть приемами экспериментальной работы с клетками и культурами
клеток, физико-химическими методами исследования макромолекул, методами
исследования и анализа живых систем, математическими методами обработки результатов
биологических исследований, опытом лабораторных работ, основам биоинженерии,
необходимыми для создания биоинженерных объектов (ПК-21).
В результате освоения дисциплины обучающийся должен:
Знать:
- общие представления о химическом и ферментативном катализе;
2
- молекулярные основы специфичности ферментов; принципы классификации и
номенклатуры ферментов;
- кинетические закономерности действия ферментов; механизмы активации и
ингибирования ферментов; принципы и методы определения активности ферментов;
- способы выделения и очистки ферментов; представление об экономической
эффективности применения ферментов в биотехнологическом производстве;
- способы получения и использования биокатализаторов в тонком органическом синтезе,
производстве новых лекарственных средств, ферментативном получении сахаров и других
продуктов из целлюлозосодержащих отходов.
Уметь:
- эффективно использовать в научно-исследовательской и практической работе
современные методы биохимических исследований;
- пользоваться измерительными приборами и оборудованием, применяемыми в
ферментативных исследованиях; подбирать концентрации субстратов и условия
проведения ферментативных реакций;
- рассчитывать кинетические параметры ферментативных реакций, определять активность
ферментов в биологическом материале и пищевых продуктах;
- критически анализировать полученные данные, грамотно представлять данные
экспериментальных исследований в лаконичной форме;
-осуществлять перспективное планирование биотехнологических процессов на основе
последних научных достижений.
Владеть:
- экспериментальными приемами исследования компонентов живой материи в модельных
системах и на биологическом материале; широким спектром аналитических методов и
подходов биоорганической и биологической химии, молекулярной биологии, методами
выделения, очистки и анализа энзимов;
- должен быть подготовлен для работы в области медицинской и ветеринарной биохимии,
иммунологии, биотехнологии.
1
1.1.
1.2.
2
2.1.
2.2.
3
4
5
6
7
Модуль 1 «Общая энзимология»
Раздел 1. Введение в энзимологию
История развития энзимо- 5
1
1
логии. Связь энзимологии
с другими науками
Сравнительная биохимия
5
1
1
ферментов. Строение
ферментов
Раздел 2. Коферменты
Разнообразие химической 5
2
1
природы коферментов
1-2
4
Биохимия коферментов
5
2
1
алифатического ряда
Самостоятельная
работа
Практические
2
Семинары
1
Виды учебной работы, включая
самостоятельную работу студентов
и трудоемкость (в часах)
Лекции
Раздел дисциплины
Неделя семестра
№
п/п
Семестр
4. Структура и содержание дисциплины.
Общая трудоемкость дисциплины составляет 6 зачетных единиц 216 часов.
4.1. Структура дисциплины
Формы текущего
контроля
успеваемости (по
неделям семестра)
Формы
промежуточной
аттестации (по
семестрам)
8
9
2
опрос
2
опрос
2
коллоквиум
2
опрос
3
1
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
2.7.
2.8.
3
3.1.
3.2
3.3.
3.4.
4
4.1.
4.2.
1
1.1.
1.2.
1.3.
2
2.1.
2.2.
2
3
4
5
6
7
8
9
Биохимия коферментов
5
3
1
2
опрос
ароматического и
гетероциклического ряда
Пиридоксалевые
5
3
1
2
2
опрос
коферменты, их роль в
4
2
метаболизме аминокислот
Биохимия железопорфи5
4
1
2
опрос
риновых коферментов.
Биотин, фолиевые
кислоты, их значение
Биохимия коферментов5
4
1
2
опрос
нуклеотидов
5-6
4
НАД, ФАД, Коэнзим А,
5
5
1
2
коллоквиум
их биологическая роль
7-8
4
Общая характеристика
5
5
1
2
опрос
гидролаз
Раздел 3. Классификация и номенклатура и механизм действия ферментов
Ключ к классификации
5
6
1
2
опрос
9-10
4
Специфичность действия
5
1
2
опрос
ферментов, виды
11-12
4
специфичности
Кинетика
5
7
2
2
коллоквиум
ферментативных реакций
13-14
4
Физико-химические
5
8
2
2
контрольное
механизмы
тестирование
ферментативного катализа
Раздел 4. Регуляция действия ферментов в живом организме
Регулирование действия
5
9
2
2
опрос
ферментов в живом организме
15-16
4
Индукция и репрессия
5 17-18
4
2
контрольное
биосинтеза ферментов.
тестирование
Изоферменты.
Промежуточная аттестация 5
4
Зачет
Всего по 1 модулю:
18
20
16
36
90 ч.
Модуль 2 «Инженерная энзимология»
Раздел 1. Методы выделения и очистки ферментов
Основные принципы
6
1
2
2
2
опрос
выделения и очистки
2
2
ферментов
Электрофорез белков
6
2
2
2
опрос
3-4
4
Кинетические параметры
6
3
2
2
тест
и физико-химические
5-6
4
свойства очищенных
форм ферментов
Раздел 2. Ферменты в аналитической химии
Методы определения
6
4
2
2
опрос
активности ферментов
7-8
4
Ферментативные методы
6
5
2
2
контрольная
определения субстратов
9-10
4
работа
4
1
2.3.
3
3.1.
3.2.
3.3.
4
4.1.
4.2.
4.3.
5
5.1.
5.2.
6
7
2
3
4
5
6
7
8
9
Ферменты в нетрадицион- 6
6
2
опрос
ных средах. Мицеллярная
энзимология
Раздел 3. Способы получения и применения иммобилизованных ферментов
Гетерогенные катализаторы 6
7
2
2
опрос
на основе иммобилизованных ферментов и клеток
Промышленные процессы 6
8
2
3
опрос
с использованием
11
2
иммобилизованных
ферментов и клеток
Иммобилизованные
6
9
2
2
опрос
ферменты в микроанализе
12
2
Раздел 4. Медицинские аспекты энзимологии
Использование ферментов 6
10
2
2
опрос
в медицине
13-14
4
Иммобилизованные
6
11
2
2
опрос
ферменты и белки как
лекарственные средства
Иммуноферментный
6
12
2
2
тест
анализ и его использование в медицине
Раздел 5. Синтез и модификация органических соединений
Биокатализ в тонком
6
13
2
2
рецензироваорганическом синтезе
ние научных
статей
Ферментативное превра6
14
2
2
тест
ение целлюлозы в сахара
Биокаталитические
6
15
2
2
2
коллоквиум
методы защиты
16
2
окружающей среды
Современные методы конст- 6
16
2
2
опрос
руирования ферментов с
необходимыми свойствами
Промежуточная аттестация 6
36
Экзамен
Всего по 2 модулю:
6
32
6
26
62
126 ч.
ИТОГО:
50
26
42
98
216 ч.
4.2. Содержание дисциплины
Модуль 1 «Общая энзимология»
Раздел 1. Введение в энзимологию
История развития энзимологии. Связь энзимологии с другими науками. Задачи,
методы энзимологии. Определение науки энзимологии. Учёные, которые внесли
существенный вклад в формирование энзимологии как науки. История открытия и
изучения ферментов. Роль ферментов в живых системах и в пищевом сырье. Условия
функционирования ферментов в клеточных и бесклеточных биологических системах.
Роль ферментов в организме и их возможности по сравнению с химическими
катализаторами. Связь энзимологии с философией, физикой, химией, математикой.
Место энзимологии среди других научных направлений и ее связь с химическими и
биологическими дисциплинами. Значение достижений энзимологии для биохимии,
молекулярной биологии, биотехнологии, медицины. Энзимопатии. Применение
5
ферментов в медицине. Энзимодиагностика. Использование ферментов-маркеров в
диагностике и научных исследованиях.
Сравнительная биохимия ферментов. Локализация ферментов в клетках и тканях
живых организмов. Тканевое, региональное, клеточное и субклеточное распределение
ферментов. Цитология ферментов. Методика фракционирования ткани по субклеточным
структурам. Изучение субклеточной локализации ферментов. Ферменты – маркеры
субклеточных структур: ядерные, митохондриальные, лизосомальные, цитозольные
ферменты. Органная специфичность распределения ферментов. Изучение органного
распределения ферментов. Специфичность распределения ферментов в тканях: нервной
ткани, мышцах, печени, соединительной ткани (крови), пищеварительной системе.
Строение ферментов. Простые и сложные ферменты. Холофермент, апофермент,
коферменты: кофакторы и простетические группы. Принципы пространственной
организации молекулы фермента, проблемы сворачивания полипептидной цепочки в
нативную конформацию, ее важность для энзимологии; современные представления о
механизмах формирования пространственной структуры белка; иерархический принцип
сворачивания; промежуточные состояния в процессе организации нативной
конформации; современное состояние знаний о белках теплового шока и структуре
шаперонов; домены, их структурные и функциональные характеристики; роль
мультидоменной организации молекулы фермента в определении ее функциональных
свойств, формирование активного центра на границе между доменами. Роль
подвижности доменов в катализе, структурные основы реализации феномена
индуцированного соответствия, регуляторные домены, домены, обеспечивающие
связывание с мембранами.
Раздел 2. Коферменты
Разнообразие химической природы коферментов. Химическая природа ферментов.
Молекулярная структура ферментов. Активный и аллостерический центры. Контактный
и каталитический участки активного центра. Проферменты. Апоферменты и
простетические группы сложных ферментов. Коферменты, кофакторы и их роль в
каталитическом процессе. Классификация коферментов. Витамины и коферменты.
Металлы в роли коферментов и кофакторов, их роль в действии ферментов.
Полифункциональность металлов в реализации активности ферментов. Механизм
реакций с участием киназ.
Биохимия коферментов алифатического ряда. Роль глутатиона и липоевой
кислоты в окислительно-восстановительных процессах. Структурно-функциональные
особенности и роль процессов перекисного окисления и окислительного
декарбоксилирования кетокислот.
Биохимия коферментов ароматического и гетероциклического ряда. Убихиноны,
их роль в процессах биологического окисления и окислительного фосфорилирования.
Процессы переноса электронов и протонов с участием коферментов ароматического ряда.
Тиамин и его производные, роль тиаминпирофосфата (ТПФ) в обмене углеводов. ТПФ в
процессах декарбоксилирования кетокислот. Роль этого процесса в метаболизме клетки.
Кофермент транскетолаз – тиаминдифосфат (ТДФ).
Пиридоксалевые коферменты, их роль в метаболизме аминокислот. Пиридоксаль,
пиридоксин, пиридоксамин, их участие в катаболизме аминокислот. Основные пути
катаболизма аминокислот с участием пиридоксалевых кофакторов. Реакции
переаминирования с участием аминотрансфераз. Декарбоксилирование аминокислот –
образование биогенных аминов. Примеры реакций. Рацемазы и эпимеразы, их
каталитическая роль. Пиридоксальфосфат как кофермент рацемаз α-аминокислот.
Биохимия железопорфириновых коферментов. Биотин, фолиевые кислоты, их
значение. Кобаламин, его роль в метаболизме карбоновых кислот. Коферменты каталазы,
пероксидазы, цитохромоксидазы и их роль в окислительно-восстановительных процессах.
Фолиевые кислоты, их значение. Фолиевая кислота, распространение в природе: в животных,
6
растительных и микробных клетках. Тетрагидрофолиевая кислота и её производные, участие в
синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, аминокислот (серина, метионина,
гистидина), холина и др. Участие биотина в карбоксилировании различных соединений.
Биохимия коферментов-нуклеотидов. Роль адениловой, гуаниловой, уридиловой и
цитидиловой кислот в обмене веществ. Фосфорилированные нуклеотиды как
универсальные носители энергии в природе. Коэнзим А, процессы образования, его роль
в обмене веществ. Ацетилкоэнзим А – кофермент трансфераз: особенности строения,
биологическая роль. Ацилтрансферазы, особенности их каталитического действия.
Характеристика трансфераз, переносящих сульфосодержащие группы. Участие 3фосфоаденазин-S-фосфосульфата в реакциях переноса сульфогруппы.
НАД, ФАД, Коэнзим А, их биологическая роль. НАД как универсальный акцептор
водорода в окислительно-восстановительных реакциях. Роль НАД в гликолитической
оксидоредукции, анаэробном обмене углеводов, окислительном фосфорилировании
АТФ.
Характеристика
оксидоредуктаз.
НАД-зависимые
дегидрогеназы
(лактатдегидрогеназа, глицероальдегидфосфатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа).
ФАД – основной источник водорода в укороченной цепи окислительного
фосфорилирования. Образование ФАД. Флавиновые дегидрогеназы (НАДНдегидрогеназа,
сукцинатдегидрогеназа).
Флавинзависимые
оксидазы
(полифенолоксидаза, аскорбинатоксидаза, глюкозооксидаза).
Общая характеристика гидролаз. Классификация гидролаз, области практического
использования. Ферменты, относящиеся к подклассу эстераз (липазы, холестеринэстеразы),
их биологические особенности. Фосфомоноэстеразы и фосфодиэстеразы, особенности
катализа. Гликозидазы, общая характеристика и отдельные представители (амилаза,
лактаза, мальтаза, сахараза). Характеристика пептидгидролаз: протеаз на примере
пепсина, трипсина, химотрипсина и катепсинов, экзопептидаз на примере
карбоксипептидаз и аминопептидаз.
Раздел 3. Классификация, номенклатура и механизм действия ферментов
Классификация и номенклатура ферментов. Ключ к классификации.
Характеристика отдельных представителей классов ферментов, история создания
универсальной международной классификации ферментов. Деление ферментов на
классы, подклассы, подподклассы. Шифр фермента (КФ или ЕC). Современная
международная номенклатура EC – enzyme code. Организации, занимающиеся вопросами
классификации и номенклатуры – IUBMB, IUPAC. Значение и недостатки единой
системы номенклатуры.
Специфичность действия ферментов, виды специфичности. Понятие об
относительной специфичности. Примеры ферментов с групповой (относительной)
специфичностью. Значение ферментов групповой специфичности для обмена веществ в
клетке. Ферменты с абсолютной специфичностью. Примеры, значение для клетки.
Кинетика ферментативных реакций. Теории катализа. Отличительные черты
ферментативного катализа. Эффективность действия ферментов. Образование ферментсубстратных комплексов. Использование энергии связывания фермента с субстратом в
катализе; природа сил, стабилизирующая различные конформационные состояния
системы фермент-субстрат (водородные связи, гидрофобные взаимодействия и др.); типы
катализа, используемые в ферментативных реакциях; функциональные группы
ферментов. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. Теория
Михаэлиса–Ментен. Константы скоростей образования и распада фермент-субстратных
комплексов (малые константы). Интегральные константы ферментативной реакции:
максимальная скорость реакции, константа сродства и константа Михаэлиса. Уравнения
ферментативной реакции Михаэлиса–Ментен и Холдейна–Бриггса. Численное значение
константы Михаэлиса и ее практическое значение. Определение константы Михаэлиса и
максимальной скорости реакции по методу Лайнуивера–Берка. Понятие ферментативной
активности. Способы выражения ферментативной активности.
7
Физико-химические механизмы ферментативного катализа. Активные центры
ферментов, их топография. Методы выявления функциональных групп активных центров.
Физико-химические механизмы ферментативного катализа. Гипотеза «индуцированного
соответствия» Кошленда. Энергия химической реакции. Уравнение Аррениуса.
Энергетический барьер реакции и энергия активации неферментативных и
ферментативных реакций. График зависимости активности фермента от температуры
раствора. Анализ кривой. Температурный оптимум ферментативной реакции.
Термостабильные и термолабильные ферменты. Активность ферментов при низких
температурах. Влияние кристаллизации воды на активность ферментов. Активность
ферментов в замороженных средах. Зависимость скорости реакции от значения рН
раствора. Влияние рН на заряд ионогенных групп в молекулах белка. Изменения
структуры фермента и реакционноспособности активного центра при разных значениях
рН. Оптимальное значение рН для ферментов и его биологическое значение.
Раздел 4. Регуляция действия ферментов в живом организме
Регулирование действия ферментов в живом организме. Разные типы регуляции
активности ферментов; полифункциональные ферменты, функциональные преимущества,
возникающие в результате белок-белковых взаимодействий в составе молекулы
полифункциональных ферментов; четвертичная структура ферментов, роль четвертичной
структуры в стабилизации молекулы фермента и регуляции активности ферментов. Уровни
регуляции ферментативной активности. Аллостерические ферменты. Роль субклеточных
структур в регулировании действия ферментов. Регуляция путём изменения количества
ферментов и путём изменения их индивидуальной каталитической активности. Нековалентная
и ковалентная модификация. Способы контроля разветвлённых метаболических путей.
Индукция и репрессия биосинтеза ферментов. Активность нативных ферментов.
Роль третичной и четвертичной структур молекулы фермента. Специфические факторы,
повышающие активность ферментов. Классификация, механизмы действия. Роль анионов
и катионов металлов в активации ферментов. Механизм активирующего действия
восстановленного глютатиона на тиоловые ферменты. Аллостерическая регуляция
активности фермента, действие промежуточных и конечных продуктов реакции.
Регуляция скорости многоэтапных биохимических процессов путем обратной
отрицательной связи. Ингибиторы ферментов: классификация, механизмы действия.
Обратимые и необратимые ингибиторы. Константы ингибирования. Конкурентное и
аллостерическое ингибирование ферментов. Белковые ингибиторы ферментов.
Ковалентная модификация структуры и активности ферментов. Изоферменты. Рибозимы.
Модуль 2 «Инженерная энзимология»
Раздел 1. Методы выделения и очистки ферментов
Основные принципы выделения и очистки ферментов. Классические методы.
Экстрагирование ферментов из биологического материала. Кислотная обработка,
термическая обработка, фракционирование солями, органическими растворителями,
метод избирательной адсорбции. Обессоливание с помощью сефадекса G-25.
Ионообменная хроматография, гель-фильтрация. Применение ДЭАЭ-целлюлозы для
разделения
белков.
Аффинная
хроматография,
носители
и
лиганды.
Ультрацентрифугирование, кристаллизация. Комбинирование различных методов для
очистки ферментов на примере глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы печени крыс. Критерии
чистоты ферментных препаратов.
Электрофорез белков. Принципы электрофореза. Нативный ступенчатый
электрофорез. Физический принцип метода. Электрофорез белков с ДДС по Лэммли.
Универсальное окрашивание белков в ПААГ. Специфическое проявление белков в ПААГ.
Специфическое проявление дегидрогеназ. Выявление протеаз. Изоэлектрофокусирование.
Кинетические параметры и физико-химические свойства очищенных форм
ферментов. Общие правила работы с ферментами. Определение молекулярной массы
нативного фермента с помощью гель-хроматографического метода. Исследование
8
каталитических свойств ферментов. Определение константы Михаэлиса. Условия
проведения ферментативной реакции. Измерение скорости ферментативной реакции.
Измерение «по конечной точке» (end point method). Измерение двухточечное (two point
metod). Измерение многоточечное, или кинетическое (kinetic measure-ment). Способы
определения концентрации продукта реакции или субстрата. Прямое фотометрирование,
окрашивание субстрата или продукта красителем, тест Варбурга.
Раздел 2. Ферменты в аналитической химии
Методы определения активности ферментов. Препаративная энзимология.
Способы количественного выражения ферментативной активности. Общая активность,
удельная активность, молекулярная активность, активность каталитического центра.
Современные
методы
определения
активности
ферментов:
химические,
электрохимические, фотометрические, спектрофотометрические, флюориметрические.
Основные абсорбционные (спектрофотометрические) методы определения активности
ферментов. Колориметрический метод Райтмана-Френкеля определения активности
аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ). Кинетический УФ
метод определения активности АЛТ и АСТ, креатинкиназы, лактатдегидрогеназы,
альдолазы. Энзиматический колориметрический метод определения активности липазы,
альдолазы. Расчет ферментативной активности по калибратору, калибровочной кривой и
коэффициенту экстинкции продукта или кофермента.
Ферментативные методы определения субстратов. Основные абсорбционные
(спектрофотометрические) методы определения субстратов. Мочевина: уреазный/салицилатгипохлоритный,
уреазный/фенолгипохлоритный,
уреазный/глутаматдегидрогеназный метод. Глюкоза: глюкозооксидазный/пероксидазный,
гексокиназный метод. Холестерин: холестериноксидазный/пероксидазный метод.
Креатинин:
креатининиминогидролазный/глутаматдегидрогеназный,
саркозиноксидазный/пероксидазный метод. Этанол: алкогольдегидрогеназный метод.
Ферменты в нетрадиционных средах. Мицеллярная энзимолоrия. Возможность
проведения химических реакций в органических растворителях, в мицеллах, в твердых
фазах, на гpанице раздела фаз металл-раствор электролита. Подходы, обеспечившие
возможность проведения ферментативных реакций в оргaнических растворителях.
Особенности систем с органическими растворителями. Солюбилизация фермента в
обращенные мицеллы. Регуляция каталитической активности фермента с помощью
размера мицеллы.
Раздел 3. Способы получения и применения иммобилизованных ферментов
Гетерогенные катализаторы на основе иммобилизованных ферментов и клеток.
Методы иммобилизации. Носители. Иммобилизованные клетки микроорганизмов.
Иммобилизованные
ферменты:
новые
свойства.
Регyлирование
активности
иммобилизованноrо фермента фазовым переходом носителя. Стабилизация ферментов
при иммобилизации. Реакторы с иммобилизованными ферментами. Особенности
кинетики ферментативных реакций в открытых системах. Проточный реактор идеального
вытеснения. Проточный реактор идеального перемешивания. Сравнение эффективности
проточных реакторов. Множественность стационарных состояний открытых систем.
Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и
клеток. Получение глюкозо-фруктозных сиропов. Получение L-аминокислот. Получение
L-аспарагиновой кислоты. Получение L-яблочной кислоты. Получение безлактозного
молока. Получение сахаров из молочной сыворотки. Получение 6-аминопенициллановой
кислоты. Процессы на уровне опытных установок.]
Иммобилизованные ферменты в микроанализе. Ферменты – идеальные
аналитические реагенты. Применение в анализе сопряженных ферментативных систем.
Кинетические основы ферментативных методов анализа. Методы детекции в
ферментативном анализе. Преимущества использования в анализе иммобилизованных
ферментов. Первые работы по аналитическому применению иммобилизованных
9
ферментов. Ферментные микрокалориметрические датчики. Ферментные электроды.
Биолюминесцентный анализ. Соиммобилизованные полиферментные системы в
биолюминесцентном анализе. Области применения биосенсоров с иммобилизованными
ферментами. Определение супертоксинов и боевых отравляющих веществ.
Раздел 4. Медицинские аспекты энзимологии
Использование ферментов в медицине. Причины гиперферментемий. Применение
ферментов в медицине: для скрининг-диагностики (выборочные тесты); для диагностики
заболеваний (аспарагиновая трансаминаза – для диагностики инфаркта миокарда,
аланиновая трансаминаза – для диагностики заболеваний печени); для дифференциальной
диагностики (кислая фосфатаза – рак предстательной железы, щелочные фосфатазы –
костная ткань, метастазы рака); для лечения заболеваний: заместительная терапия, для
лечения заболеваний и устранения патологических процессов. Использование ферментов
в стоматологии. Использование рибозимов в лечении вирусных инфекций и рака.
Иммобилизованные ферменты и белки как лекарственные средства.
Иммобилизация белков. Антигенность и иммуногенность иммобилизованных белков.
Введение иммобилизованных препаратов. Ферментные препараты типа «контейнер».
Терапия иммобилизованными ферментами.
Иммуноферментный анализ и его использование в медицине. Структура антител.
Антиген. Получение антител. Принципы иммунохимического анализа. Маркеры в
иммунохимическом анализе. Получение конъюгатов с ферментами. Разделение свободных
и связанных маркеров. Основные методы ИФА. Применение ИФА.
Раздел 5. Синтез и модификация органических соединений
Биокатализ в тонком органическом синтезе. Ферментативная модификация βлактамных антибиотиков. Ферментативное превращение рацематов в энантиомеры.
Синтез с использованием гидролаз. Увеличение выхода продуктов в термодинамически
неблагоприятных условиях. Регенерация кофакторов ферментативной реакции. Перенос
ацильных групп при помощи ферментов. Биокаталитическое получение простаноидов.
Синтез аминокислот лиазами. Ферментативная модификация нуклеиновых кислот, синтез
олиго- и полинуклеотидов. Синтез меченых соединений. Ферментативный синтез сахаров.
Ферментативные реакции в безводной среде. Перспективы ферментативного
органического синтеза.
Ферментативное превращение целлюлозы в сахара. Целлюлолитические
микроорганизмы и ферменты. Механизм действия целлюлаз. Влияние структуры
целлюлозы на эффективность ее гидролиза. Адсорбция целлюлаз на целлюлозе и ее роль в
катализе. Основы биотехнологии ферментативного гидролиза целлюлозы.
Раздел 6. Биокаталитические методы защиты окружающей среды
Создание новых технологических процессов с минимальным уровнем отходов
ксенобиотиков. Разработка высокоэффективных процессов деструкции кceнобиотиков с
образованием продуктов, нетоксичных для среды обитания. Особенности кинетики
биокаталитических процессов. Адаптация микроорганизмов к ксенобиотикам.
Ассоциации микроорганизмов. Реализация «невозможных» химических реакций.
Раздел 7. Современные методы конструирования ферментов с необходимыми свойствами
Химическая модификация. Комбинаторные методы, rенетическая и белковая
инженерия. Mетоды направленной эволюции. Генетическая инженерия ферментов.
Выделение и амплификация гена. Библиотека reнов. Ферменты - инструменты
генетической инженерии. Векторы. Кинетика репликации плазмид. Трансформация,
трансфекция. Клоны и клонирование. Оптимизация экспрессии и выделение rенноинженерных белков. Сайт-направленный мyrаrенез. Белковая инженерия. Фолдинг белка,
протеолиз – разрушение белков. Уменьшение вероятности неправильного фолдинга белка
в биоинженерных системах. Создание белков с помощью рДНК-технологии в
бактериальных, дрожжевых клетках и клетках млекопитающих. Альтернативы для
белковой терапии – новые технологии.
10
1.
2.
3.
4.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Темы лабораторных работ
Модуль 1 «Общая энзимология»
Исследование свойств кофакторов и коферментных витаминов в каталитической
активности ферментов. Качественные реакции на витамины В1, В2, В6. Количественное
определение витамина С в моче.
Определение фолиевой кислоты. Идентификация фолиевой кислоты спектрофотометрическим методом. Количественный анализ таблеток фолиевой кислоты. Определение
никотиновой кислоты и никотинамида. Идентификация никотиновой кислоты.
Количественный анализ раствора никотиновой кислоты 1%-ного для инъекций.
Количественное определение субстанции никотиновой кислоты. Идентификация
никотинамида. Количественное определение субстанции никотинамида
Специфичность действия сахаразы дрожжей. Исследование свойств амилазы.
Ферментативный гидролиз крахмала. Влияние рН среды. Влияние температуры.
Определение оптимального значения рН среды. Влияние активаторов и ингибиторов на
активность амилазы. Количественное определение активности амилазы.
Холинэстераза и биохимическая реакция. Влияние температуры. Влияние рН среды.
Влияние количества субстрата. Влияние количества фермента. Исследование
ингибирующего действия фосфорорганических соединений и ионов кальция на
фермент холинэстеразу. Сравнительный анализ активности холинэстеразы в разных
образцах сыворотки крови. Количественное определение активности холинэстеразы.
Модуль 2 «Инженерная энзимология»
Разрушение клеток и экстракция. Лизис клеток с применением ферментов. Лизис
клеток с помощью детергентов. Гомогенизация. Обработка клеток ультразвуком.
Фракционирование солями. Фракционирование сульфатом аммония.
Фракционирование белков методом гель-фильтрации. Обессоливание с помощью
сефадекса G-25. Осуществление ионообменной хроматографии для фракционирования
белков. Применение ДЭАЭ-целлюлозы для разделения белков. Приготовление
ионообменной колонки.
Проведение нативного ступенчатого электрофореза белков. Проведение электрофореза
белков с додецилсульфатом натрия (ДДС) по Лэммли. Предварительная обработка
белков концентрированным раствором ДДС в присутствии β-меркаптоэтанола.
Универсальное окрашивание белков в полиакриламидном геле (ПААГ). Проявление
белков с помощью кумасси бриллиантового синего R-250. Проявление протеинов с
помощью амидо-черного 10В. Окрашивание белков нитратом серебра. Специфическое
проявление белков в ПААГ. Специфическое проявление дегидрогеназ. Выявление протеаз.
Определение молекулярной массы нативного фермента с помощью гельхроматографического метода. Приготовление хроматографической колонки.
Измерение скорости ферментативной реакции. Действие амилазы, Измерение
активности малатдегидрогеназы. Определение константы Михаэлиса. Подбор условий
для проведения ферментативной реакции.
Количественное
определение
активности
аминотрансфераз:
аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке
крови в целях клинико-диагностического значения. Количественное определение
активности щелочной и кислой фосфатазы в сыворотке крови.
5. Образовательные технологии
В процессе реализации учебной дисциплины предусмотрено использование
мультимедийных и проблемных лекций, деловых и ролевых игр, разбор конкретных
ситуаций, творческие задания, рецензирование научных статей, тестовый анкетный и
автоматизированный контроль в сочетании с внеаудиторной работой с целью
формирования и развития профессиональных навыков обучающихся.
Предусмотрены встречи с представителями государственных и общественных
организаций, мастер-классы экспертов и специалистов.
11
6. Учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы студентов.
Оценочные средства для текущего контроля успеваемости, промежуточной
аттестации по итогам освоения дисциплины.
6.1. Темы докладов к семинарским занятиям
Модуль 1 «Общая энзимология»
1. Принципы международной классификации и номенклатуры ферментов.
2. Олигомерные белки-ферменты, мультиэнзимные комплексы.
3. Мембранно-ассоциируемые ферменты.
4. Методы выделения ферментов из биообъектов.
5. Термодинамические закономерности ферментативного катализа.
6. Активные центры ферментов. Отличия строения активных центров у простых и
сложных ферментов.
7. Константа Михаэлиса-Ментен, её смысловое значение.
8. Регуляция ферментативных процессов.
9. Физиологически-активные соединения и ксенобиотики как обратимые и необратимые
ингибиторы ферментов.
10. Протеиназы, протеиназные ингибиторы.
11. Изоферменты – множественные молекулярные формы белков, результат экспрессии
разных генов.
12. Проферменты, их биологическая роль и значение.
13. Характеристика и свойства коферментных форм витаминов В2, РР и В6.
14. Коферменты – производные витамина В12. Витамин В12 (кобаламин), биологические
свойства, механизм действия.
15. Роль витамина С в метаболизме соединительной ткани.
Литература для подготовки к семинарам:
1. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Медицинское информационное агентство,
2004. – 565 с.
2. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. – М.: Дрофа, 2004. – 637 с.
3. Алейникова Т.Л. и др. Руководство к практическим занятиям по биохимии / Под ред.
Е.С. Северина. – М.: Медицина, 2000. – 126 с.
4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия Учеб. для хим., биол. и мед. спец.
вузов 3-е изд., испр. – М: Высшая школа, 2003. – 479 с.
5. Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. – М.: Изд. НИИ
Биомедхимии РАМН. – 2000. – 372 с.
6. Пустовалова Л.М. Практические работы по биохимии. – Ростов н/Д: Феникс, 2004.
7. Биохимия. Тесты и задачи / Под ред. Е.С. Северина. – М.: Веди, 2005. – 366 с.
8. Володина Г.Б., Якунина И.В. Лабораторный практикум по органической химии: Учеб.
пособие. – Тамбов.: Изд-во Тамб. гос. техн. ун-та, 2004. – 80 с.
Модуль 1 «Инженерная энзимология»
1. Комбинирование различных методов для очистки ферментов.
2. Иммобилизованные ферменты: новые свойства
3. Иммобилизованные клетки микроорганизмов.
4. Биосенсоры на основе ферментов, принципы их конструирования и использования.
5. Ферментативный анализ метаболитов.
6. Ферменты противоопухолевой терапии.
7. Ферменты коррекции пищеварения.
8. Анализ нуклеиновых кислот с использованием полимеразной цепной реакции.
9. Основы биолюминесцентного анализа.
10. Биоэлектроанализ и использование ферментов в электрохимических системах.
11. Промышленный способ получения аспартама.
12. Синтез β-лактамных антибиотиков.
13. Синтез простагландинов ферментативными методами.
12
14. Иммунотерапия.
15. Использование рибозимов в лечении вирусных инфекций и рака.
16. Фолдинг и рефолдинг белков.
17. Оптимизация экспрессии генно-инженерных белков.
Литература для подготовки к семинарам:
1. Бендер М., Бергерон Р., Комияма М. Биоорганическая химия ферментативного
катализа. – М.: Мир, 1987. – 352 с.
2. Филиппович Ю.Б., Коничев А.С., Севастьянова Г.А., Кутузова Н.М. Биохимические
основы жизнедеятельности человека: учеб пособие для студентов вузов. – М.:
Гуманитар. изд. центр ВЛАДОС, 2005. – 407 с.
3. Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии. – М.: Мир, 1972. – 468 с.
4. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. – М.: Фаир-Пресс, 1999. – 720 с.
5. Старостина В. К. Ферменты в биохимическом анализе // Методическое пособие
«Совершенствование качества работы клинико-диагностических лабораторий».
Кольцово: Вектор-Бест, 2000.
6. Варфоломеев С.Д. Физическая и структурная химия ферментативного катализа.
системный подход: от первичной структуры до элементарного акта // Кинетика и
катализ. – 2007. – Т. 48, № 4. – С. 499-509.
7. Варфоломеев С.Д., Мевх А.Т. Простагландины – молекулярные биорегуляторы. – М.:
Изд-во МГУ, 1985. – 308 с.
8. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий
Ю.Л. Биотехнология. Т.7. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987.
9. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. – М.: Наука, 1986. – 332 с.
10. Ройтберг Г.Е., Струтынский А.В. Лабораторная и инструментальная диагностика
заболеваний внутренних органов. – М.: «Бином». 1999. – 622 с.
11. Arnold F.H. Optimizing industrial enzymes by directed evolution / Advances in biochemical
engineering / biotechnology. New enzymes for organic synthesis. (Scheper Th., Ed.). Verlag;
Berlin, Heidelberg; New York: Springer, 1997. – Vol. 58. – Р. 1-14.
12. Rubingh D.N. Protein engineering from a bioindustrial point of view // Current Opinion in
biotechnology. – 1997. – Vol. 8. – P. 417-422.
6.2. Тесты для проведения текущего контроля
Модуль 1«Общая энзимология»
1. В цитозоле эукариотов локализованы ферменты:
Тканевого дыхания
Синтеза жирных кислот
β–окисления
Цикла трикарбоновых кислот
2. Рибозимами называют:
Катализаторы нуклеотидной природы
Производные рибозы
Витамины
Гликопротеины
3. Ферменты не содержатся в:
Клеточных ядрах
Аппарате Гольджи
Плазматических мембранах
Выдыхаемом воздухе
4. Источниками ферментов не являются:
Стенки растительных клеток
Внутренние органы животных
Культуры микроорганизмов
Соки растений
13
5. Ферментам свойственно:
Ускорять реакции
Вызывать новые реакции
Смещать равновесие
Входить в состав конечных продуктов
6. Высокая эффективность действия фермента обусловлена:
Адсорбцией субстрата
Образованием фермент-субстратных комплексов
Повышением свободной энергии в системе
Снижением ∆S
7. Образование какого из участников реакции является обратимым?
E
S
ES
P
8. Переходное состояние фермент-субстратного комплекса соответствует:
Более высокой энергии активации
Более низкой энергии активации
Более высокой ∆Н
Более высокому энергетическому барьеру
9. Уравнение Михаэлиса-Ментен:
Выражает зависимость действия фермента от концентрации субстрата
Учитывает все стадии реакции
Описывает вторую стадию реакции – образование Е и Р
Не учитывает стадию образования комплекса ES
10. Константа Михаэлиса численно равна:
Скорости реакции
Отношению констант прямой и обратной реакции
Молекулярной активности фермента
Концентрации субстрата при v=Vmax / 2
11. Константа диссоциации комплекса ES:
Является мерой сродства фермента к субстрату
Определяет скорость реакции
Характеризует стадию необратимого распада комплекса ES
Зависит от продукта реакции
12. Уравнение Холдейна-Бриггса:
Учитывает влияние образующихся продуктов на скорость реакции
Противоречит положениям Михаэлиса-Ментен
Не принимает во внимание образование свободных Е и Р
Не учитывает Km
13. Уравнение Лайнуивера-Берка применяется для определения:
Активности фермента
Скорости реакции
Образования ES-комплекса
Численных значений Km и Vmax
14. Концентрация фермента:
Не влияет на скорость реакции
Оказывает существенное влияние на скорость реакции
Не связана с начальной скоростью реакции
Определяет величину Km
15. Начальная скорость реакции:
Является мерой количества фермента
Не зависит от количества фермента
14
Зависит только от концентрации субстрата
Определяется величиной Ks
16. Активаторами называются:
Вещества, повышающие активность фермента
Факторы, инактивирующие субстрат
Вещества, без которых реакция не протекает
Коферменты
17. К числу активаторов ферментов не относится:
Глутатион
Рибофлавин
Са2+
Cl –
18. Активаторы действуют путем:
Участия в формировании активного центра
Связывания субстрата
Ковалентной модификации фермента
Инактивации кофермента
19. Активаторы не могут:
Стабилизировать фермент-субстратный комплекс
Стабилизировать конформацию фермента
Катализировать реакцию
Аллостерически повышать активность фермента
20. Ингибирование не бывает:
Обратимым
Необратимым
Конкурентным
Относительным
21. Ингибирование фермента не происходит при действии ингибитора на:
Активный центр
Аллостерический центр
Продукт реакции
Фермент-субстратный комплекс
22. Необратимым может быть ингибирование:
Конкурентное
Бесконкурентное
Неконкурентное
Ковалентное
23. Конкурентным ингибитором может служить:
Ион металла
Аналог субстрата
Продукт реакции
Репрессор синтеза
24. Неконкурентный ингибитор может связываться с:
Активным центром
Фермент-субстратным комплексом
SH-группами остатков цистеина
Коферментом
25. При конкурентном ингибировании:
Повышается Km
Снижается Km
Повышается Vmax
Cнижается Vmax
15
26. При неконкурентном ингибировании:
Повышается Km
Снижается Km
Повышается Vmax
Cнижается Vmax
27. Конкурентные ингибиторы:
Вытесняются из активного центра субстратами
Не используются в качестве лекарственных средств
Необратимо связывают активный центр
Обратимо связывают кофермент
28. Ферменты выделяют путем:
Кипячения
Высаливания
Высокоэффективной газо-жидкостной хроматографии
Электролиза
29. В пищевой промышленности ферменты не применяют для:
Синтеза белков
Осветления напитков
Мягчения мяса
Выработки сыра
30. Наибольшее промышленное применение находят:
Трансферазы
Гидролазы
Синтетазы
Лиазы
Модуль 2 «Инженерная энзимология»
1. Иммуноферментный твердофазный анализ:
а) это метод сортировки клеток;
б) это количественный метод оценки содержания специфических антител в образце;
в) это метод клонирования лимфоцитов;
г) это метод анализа антигенного потенциала молекулы;
д) ответы б) и г) верны.
2. Каковы проблемы в разработке антител к опухолевым клеткам:
а) опухолевые клетки не имеют антигенов;
б) опухолевые клетки могут иметь антигены, общие с другими тканями;
в) опухолевые клетки опознаются как «свои»;
г) ответы б) и в) верны;
д) все верно.
3. Неспецифическая иммунотерапия включает:
а) использование биоинженерных антител;
б) инъекции интерферона;
в) инъекции адъюванта;
г) инъекции гаммаглобулинов;
д) ответы а), б) и в) верны
е) ответы б), в) и г) верны.
4. Фолдинг белка:
а) заканчивается, когда полипептидная цепь сворачивается вокруг себя;
б) определяется аминокислотным составом белка;
в) заканчивается ко времени отсоединения белка от рибосомы;
г) все верно;
д) все неверно.
16
5. Регуляторы фолдинга:
а) связываются с гидрофобным участком белка;
б) специфичны к определенным белкам;
в) устойчивые к стрессу молекулы;
г) обнаружены только в эукариотических клетках;
д) ответы б) и в) верны.
6. Белки с неправильной конформацией:
а) часто подвергаются рефолдингу, что позволяет принять правильную конформацию;
б) могут являться причиной заболеваний в результате либо потери свойственной им
функции, либо образования белковых агрегатов в клетке;
в) распознаются по наличию гидрофобной поверхности;
г) обычно не узнаются секреторными шаперонами и не могут встраиваться в мембрану
или выводиться из клетки;
д) все верно.
7. Рибозимы:
а) являются молекулами мРНК;
б) участвуют в процессе переноса генетического кода к рибосомам;
в) имеют ферментативную активность, направленную на мРНК;
г) связываются с комплементарным участком молекулы ДНК;
д) ответы а), б) и г) верны.
8. Использование микроорганизмов для очистки почв, загрязненных химическими соединениями:
а) требует, чтобы бактерии были генетически модифицированными для потребления
токсичных соединений или металлов;
б) требует, чтобы бактерии и загрязненная почва были помещены в биореактор, где
поддерживаются анаэробные условия и соответствующая влажность почвы;
в) требует, чтобы ферменты использовались снаружи клетки, так как опасные отходы
убивают бактерии;
г) позволяет использовать существующие в природе микроорганизмы;
д) все верно.
9. Биореакторы:
а) обеспечивают оптимальные для находящихся в реакторе клеток условия среды:
количество и тип питательных веществ, необходимое количество кислорода и других
факторов среды, что позволяет клеткам расти и производить нужные вещества;
б) устройства для убийства клеток и получения из них нужных нам продуктов;
в) устройства для удержания пациентов во время введения им биологических веществ;
г) представляют собой большую емкость для проведения химического процесса;
д) ответы а) и г) верны.
10. Ферменты, полученные при использовании рекомбинантных технологий:
а) занимают более низкое положение по сравнению с ферментами, созданными в ходе эволюции;
б) могут сочетать в себе функции, наблюдаемые у ферментов из разных видов организмов;
в) могут выдерживать высокую температуру и экстремальные значения рН;
г) могут сочетать функции нескольких ферментов в одной молекуле;
д) все верно;
е) ответы б), в) и г) верны.
11. Решение, проводить ли промышленно важный процесс с использованием инактых клеток или же экстрагировать и использовать ферменты вне клетки, зависит от того:
а) смогут ли клетки выжить в условиях, необходимых для получения нужного нам вещества;
б) должны ли регенерироваться кофакторы;
в) должны ли использоваться ферменты, полученные из нескольких типов клеток;
г) имеется ли подходящая среда для выращивания, например клеточные линии мыши;
д) являются ли важными несколько ферментов из одной и той же клетки;
е) все верно.
17
6.3. Вопросы для промежуточной аттестации
Модуль 1 «Общая энзимология»
1. Задачи энзимологии, используемые в энзимологии методы.
2. Локализация ферментов в клетках и тканях живых организмов. Органная
специфичность распределения ферментов.
3. Принципы пространственной организации молекулы фермента, современные
представления о механизмах формирования пространственной структуры белка.
4. Химическая природа ферментов. Молекулярная структура ферментов.
5. Коферменты, кофакторы и их роль в каталитическом процессе. Классификация коферментов.
6. Металлы в роли коферментов и кофакторов, их роль в действии ферментов.
7. Биохимия коферментов алифатического ряда.
8. Биохимия ароматических коферментов.
9. Коферментные функции тиамина.
10. Коферментные функции витамина B6.
11. Коферментные функции биотина.
12. Коферментные функции нуклеотидов (АТФ, АДФ и их аналогов).
13. Коферментные функции НАД и НАДФ. Функции КоА.
14. Железопорфириновые коферменты.
15. Коферментные функции гуаниловой кислоты.
16. Коферментные функции цитидиловой кислоты.
17. Коферментные функции уридиловой кислоты.
18. Флавиновые нуклеотиды – строение и коферментные функции.
19. Коферментные функции кобаламина.
20. Коферментные функции фолиевых кислот.
21. Общие принципы классификации и номенклатура ферментов, ключ к классификации.
22. Характеристика ферментов первого класса.
23. Характеристика ферментов второго класса.
24. Характеристика ферментов третьего класса.
25. Характеристика ферментов четвертого класса.
26. Характеристика ферментов пятого класса.
27. Характеристика ферментов шестого класса.
28. Специфичность действия ферментов, виды специфичности.
29. Доказательство существования фермент-субстратного комплекса.
30. Активные центры ферментов.
31. Физико-химические механизмы ферментативного катализа.
32. Регулирование активности ферментов метаболитами.
33. Аллостерические ферменты.
34. Регуляция действия ферментов.
35. Влияние рН и температуры на активность ферментов.
36. Механизм действия ферментов.
37. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции.
38. Константа Михаэлиса, методы её определения.
39. Биосинтез ферментов и его регуляция. Теория индукции и репрессии биосинтеза ферментов.
40. Изоферменты.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Модуль 2 «Инженерная энзимология»
Основные правила работы с ферментами.
Методы определения активности ферментов.
Способы количественного выражения ферментативной активности.
Методы выделения и очистки ферментов.
Способы фракционирования белковых молекул.
Виды хроматографии и использование их для фракционирования белков.
Принципы электрофореза белков. Виды электрофореза.
18
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
1.
2.
1.
2.
3.
Изоэлектрофокусирование.
Определение молекулярной массы нативного фермента.
Кинетические параметры и физико-химические свойства очищенных форм ферментов.
Измерение скорости ферментативной реакции: «по конечной точке», двухточечное и
многоточечное.
Проведения химических реакций в нетрадиционных средах.
Солюбилизация фермента в обращенные мицеллы, регуляция в них каталитической
активности фермента.
Ферментативные методы определения субстратов.
Способы получения иммобилизованных ферментов.
Свойства иммобилизованных ферментов.
Характеристика биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов и клеток.
Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток.
Получение L-аминокислот, органических кислот и сахаров ферментативным способом.
Синтез β-лактамных антибиотиков.
Перенос ацильных групп при помощи ферментов.
Биокаталитическое получение простаноидов.
Ферментативная модификация нуклеиновых
кислот, синтез
олиго- и
полинуклеотидов. Синтез меченых соединений.
Основы биотехнологии ферментативного гидролиза целлюлозы.
Использование иммобилизованных ферментов в качестве аналитических реагентов.
Кинетические основы ферментативных методов анализа.
Антигенность и иммуногенность иммобилизованных белков.
Методы детекции в ферментативном анализе.
Принципы биолюминесцентного анализа.
Биосенсоры. Области применения биосенсоров с иммобилизованными ферментами.
Иммобилизованные ферменты и белки как лекарственные средства.
Использование ферментов в клинико-диагностической практике.
Применение ферментов для дифференциальной диагностики.
Использование ферментов в качестве заместительной терапии, для лечения
заболеваний и устранения патологических процессов.
Иммуноферментный анализ и его использование в медицине.
Принципы иммунохимического анализа.
Биокаталитические методы защиты окружающей среды.
Химическая модификация ферментов.
Комбинаторные методы конструирования ферментов с необходимыми свойствами.
Ферменты – инструменты генетической инженерии.
Принципы белковой инженерии. Белковая терапия.
7. Учебно-методическое и информационное обеспечение дисциплины
Модуль 1 «Общая энзимология»
а) основная литература
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. 3-е изд. перераб. и доп.,
М.: Медицина, 2007. – 704 с.
Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия Учеб. для хим., биол. и мед. спец.
вузов 3-е изд., испр. – М: «Высшая школа», 2003. – 479 с.
б) дополнительная литература
Биологическая химия с упражнениями и задачами (+ CD-ROM) / Под редакцией С.Е.
Северина. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 624 с.
Биссвангер Х. Практическая энзимология. – М.: Бином. Лаборатория знаний, 2010.
Клетки / Под ред. Б. Льюина и др.; пер. с англ. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний,
2011. – 951 с.
19
Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. – М.: Изд. НИИ
Биомедхимии РАМН. – 2000. – 372 с.
5. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. – М.: Академия, 2005. – 480 с.
6. Плакунов В.К. Основы энзимологии. – М.: Логос, 2002. – 128 с.
7. Смирнов В.А. Витамины и коферменты: учеб. пособ. Ч. 2 / В.А. Смирнов, Ю.Н.
Климочкин. – Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2008. – 91 с.
8. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи. – М.: Де Ли принт, 2002. – 236 с.
9. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии: Учеб. для хим. и биол. спец. ун-тов. – 4-е изд.,
перераб. И доп. – М. изд-во «Агар», 1999. – 512 с.
10. Ферменты и витамины. Лабораторный практикум по биохимии: Пособие / А.Г.
Шлейкин, В.И. Шаробайко, А.Н. Бландов, В.А. Смирнов. – СПб.: СбГУНиПТ, 2004.
11. Проблемы аналитической химии. Том 12. Биохимические методы анализа. – М.:
Наука, 2010. – 392 с.
12. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Ред. Герман
Спайнк, Адам Кондороши, Пауль Хукас // Русск. пер. И.А. Тихонович, Н.А.
Проворов. – Сант-Петербург.-.2002. – 567 с.
в) интернет-ресурсы:
1. Классификация ферментов www.xumuk.ru/biologhim/057.html
2. Биотехнология:
технология
ферментных
препаратов
www.biotechnolog.ru/prombt/prombt8_1.htm
3. Лекции по энзимологии. Учебник для студентов четвертого курса факультета
медицинской биотехнологии УдГУ. http://distedu.ru/edu2
4. Интегрированная система информационных ресурсов российской академии наук
http://isir.ras.ru/
5. База
научных
данных
в
области
биомедицинских
наук
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed
4.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Модуль 2 «Инженерная энзимология»
а) основная литература
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. 3-е изд. перераб. и доп.,
М.: Медицина, 2007. – 704 с.
Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия Учеб. для хим., биол. и мед. спец.
вузов 3-е изд., испр. – М: «Высшая школа», 2003. – 479 с.
б) дополнительная литература
Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. – М.: Академия, 2005. – 480 с.
Плакунов В.К. Основы энзимологии. – М.: Логос, 2002. – 128 с.
Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий
Ю.Л. Биотехнология. Т.7. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987.
Загребельный С.Н. Биотехнология. Ч.2. Инженерная энзимология / С.Н.
Загребельный. – Новосибирск, 2001. – 138 с.
Климова М.А., Епринцев А.Т. Очистка ферментов и методы исследования их
каталитических свойств. Учебно-методическое пособие для вузов (Практикум). –
Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета,
2008. – 35 с.
Яковлева Г.Е. Ферменты в клинической биохимии. – Новосибирск: «Вектор-Бест»,
2005. – 44 с.
Камышников В.С. Справочник по клиническо-биохимической лабораторной
диагностике: в 2 т. – Минск: Беларусь, 2000.
Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. – М.: Изд. НИИ
Биомедхимии РАМН. - 2000. – 372 с.
Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи. – М.: Де Ли принт, 2002. – 236 с.
20
10. Муратова, Е.И. Биотехнология органических кислот и белковых препаратов:
учебное пособие / Е.И. Муратова, О.В. Зюзина, О.Б. Шуняева. – Тамбов: Изд-во
Тамб. гос. техн. ун-та, 2007. – 80 с.
11. Кленова Н.А. Биохимия патологических состояний: учебное пособие. – Самара:
Изд-во «Самарский университет», 2006 – 216 с.
12. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В.,
Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.; Под ред. В.В. Меньшикова. – М.:
Медицина, 1987. – 368 с.
13. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология принципы и применение / Пер.
с англ. М.: «Мир», 2003. – 589 с.
в) интернет-ресурсы:
1. Рекомендации по биохимической классификации и номенклатуре ферментов,
символам, терминологии и т.д. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb
2. Биотехнология:
технология
ферментных
препаратов
www.biotechnolog.ru/prombt/prombt8_1.htm
3. «Биомир сегодня». Всемирная биотехнологическая информация. http://bioworld.com/
4. «Химия и индустрия». http://biotech.mond.org/
5. Интегрированная система информационных ресурсов российской академии наук
http://isir.ras.ru/
6. База
научных
данных
в
области
биомедицинских
наук
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed
7. Свободный доступ к международной базе данных по первичным и 3D структурам
ферментов.www.swissprot.com
8. Материально-техническое обеспечение дисциплины
Спектрофотометры, фотоэлектроколориметры, центрифуги на 7000 об/мин и 15
тыс. об/мин, аналитические и торсионные весы, рН-метры, термостаты, сушильные
шкафы, аквадистиллятор, вытяжные шкафы, микробиологический бокс, стерилизатор
паровой, роторный испаритель, камеры для электрофореза.
Программа составлена в соответствии с требованиями ФГОС ВПО № 66 от
17.03.2011 г. с учетом рекомендаций и Примерной ООП ВПО по специальности 020501
Биоинженерия и биоинформатика.
Автор:
профессор кафедры биохимии
и биофизики, д.б.н.
____________________ Е.В. Плешакова
Программа одобрена на заседании кафедры биохимии и биофизики от «____»
_____________ 2012 года, протокол №____.
Подписи:
Зав. кафедрой биохимии и
биофизики, д.б.н., профессор
_______________________ С.А. Коннова
Декан биологического факультета
д.б.н., профессор
_______________________ Г.В. Шляхтин
21