К.С. СЫЧЕВ МЕТОДЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И ТВЕРДОФАЗНОЙ ЭКСТРАКЦИИ При информационной поддержке: Портал ANCHEM.RU «Аналитика – Мир Профессионалов» ЗАО «Найтек Инструментс» Москва, 2006 Оглавление 1. Базовые определения жидкостной хроматографии 1.1. Устройство жидкостного хроматографа 1.2. Хроматограмма 1.3. Параметры удерживания 1.4. Разрешение как характеристика степени разделения 1.5. Селективность как физико-химическая характеристика системы 1.6. Эффективность и пиковая плотность 1.7. Связь разрешения, селективности, эффективности и фактора емкости (основная формула хроматографии) 2. Типы физико-химических взаимодействий в жидкостной хроматографии 2.1. Дипольные взаимодействия 2.2. Водородная связь 2.3. Сольвофобные взаимодействия 2.4. Ионные взаимодействия 2.5. Дисперсионные взаимодействия 2.6. π-Взаимодействия 2.7. Координационные взаимодействия 3. Типы удерживания в жидкостной хроматографии 3.1. Логическая связь между типом удерживания и видом хроматографии 3.2. Расчет количественных характеристик типов удерживания (дескрипторов удерживания) при помощи метода факторного анализа 3.3. Нормально-фазовый тип удерживания в нормально-фазовой хроматографии 3.4. Нормально-фазовый тип удерживания в гидрофильной хроматографии 3.5. Обращенно-фазовый тип удерживания 3.6. Ионообменный тип удерживания 3.7. Лигандообменный тип удерживания 3.8. Квази-нормально-фазовый тип удерживания 3.9. Эксклюзионный и ион-эксклюзионный типы 3.10. Ион-парные режимы хроматографии. Мицеллярная хроматография 4. Неподвижные фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии 4.1. Архитектура и химия неподвижных фаз для ВЭЖХ 4.2. Неподвижные фазы для нормально-фазовой и гидрофильной ВЭЖХ 4.3. Неподвижные фазы для обращенно-фазовой ВЭЖХ 4.4. Неподвижные фазы для эксклюзионной ВЭЖХ 4.5. Неподвижные фазы для ионной ВЭЖХ 4.6. Неподвижные фазы для квази-нормально-фазовой ВЭЖХ 4.7. Производители неподвижных фаз для ВЭЖХ 5. Хиральная высокоэффективная жидкостная хроматография 5.1. Основные типы хиральных неподвижных фаз 5.2. Закономерности хиральной ВЭЖХ 6. Общие подходы к хроматографическому анализу различных объектов 6.1. Фармацевтические препараты и природные алкалоиды 6.2. Природные фенольные соединения 6.3. Ароматические соединения 6.4. Сахариды и полиспирты 6.5. Аминокислоты, пептиды, белки 6.6. Липиды 7. Технические приемы в жидкостной хроматографии 7.1. Общие требования к проведению хроматографического анализа 7.2. Выбор оптимального растворителя для приготовления пробы 7.3. Техника проведения градиентного элюирования в обращенно-фазовой хроматографии 7.4. Ручная разметка хроматограммы 7.5. Количественный анализ 8. Исследование в жидкостной хроматографии 8.1. Применение комплекса хроматографических методов для исследования химического состава образца 8.1.1. Методы и условия извлечения соединений из матрицы 8.1.2. Адсорбционные методы разделения соединений на группы согласно их физикохимическим свойствам 8.1.3. Скрининговый анализ проб и идентификация интересующих соединений 8.2. Разработка аналитических методик 8.3. Исследование неподвижных фаз 8.3.1. Выявление роли физической структуры фазы 8.3.2. Выявление роли химии фазы 9. Методы твердофазной экстракции и адсорбционной очистки 9.1. Методы ТФЭ 9.1.1. Офф-лайн твердофазная экстракция 9.1.2. Он-лайн твердофазная экстракция 9.1.3. Адсорбционная очистка 9.2. Методы оценки эффективности процедуры ТФЭ 9.2.1. Методы оценки сорбционной емкости в случае ТФЭ 9.3. Адсорбенты для ТФЭ и адсорбционной очистки 9.3.1. Универсальные адсорбенты для ТФЭ 9.3.1.1. Нейтральные полимерные адсорбционные материалы 9.3.1.2. Углеродные адсорбционные материалы 9.3.1.3. Смешанные адсорбенты 9.3.1.4. Способы применения универсальных адсорбентов для твердофазной экстракции и твердофазной очистки 9.3.2. Селективные адсорбенты для ТФЭ 9.3.2.1. Бифункциональные адсорбционные материалы 9.3.2.2. Адсорбенты с ограниченно доступной поверхностью 9.3.2.3. Аффинные и импринтные адсорбционные материалы 9.3.2.4. Неорганические полярные адсорбенты: окись алюминия, флоризил, силикагель; полярные адсорбенты на основе силикагеля 9.4. Комплексные методы подготовки пробы с применением ТФЭ и адсорбционной очистки 9.4.1. Подготовка пробы с помощью офф-лайн методов 9.4.1.1. Концентрирование на универсальном адсорбенте, адсорбционная очистка на полярном неорганическом адсорбенте 9.4.1.2. Концентрирование на универсальном адсорбенте, адсорбционная очистка на ионообменных и бифункциональных адсорбентах 9.4.1.3. Концентрирование и адсорбционная очистка на селективных импринтных и аффинных адсорбентах 9.4.2. Подготовка пробы с помощью он-лайн методов 9.5. Литературные источники 10. Сборник методик анализа 10.1. С.Н. Сычев. Анализ ПАУ бенз(а)пирена 10.2. С.Н. Сычев. Определение альдегидов и кетонов в плазме крови методом ОФ ВЭЖХ в виде производных 2,4-динитрофенилгидразона (ДНФГ) 10.3. С.Н. Сычев. Определение кортикостероидных гормонов: альдостерона, кортизона, кортизола и тестостерона 10.4. К.С. Сычев, С.Н. Сычев. Применение ВЭЖХ в анализе лекарственных препаратов на примере ряда диазепинов 10.5. С.Н Сычев. Определение фальсфикации вин 10.5.1. Экспресс-анализ вина 10.5.2. Выявление тонких фальсификаций вин 10.6. С.Н. Сычев. Выявление фальсификации растворимого кофе 10.7. С.Н. Сычев. Определение афлатоксина В1 в продуктах питания методом НФ ВЭЖХ 10.8. С.Н. Сычев. Определение дезоксиниваленола в зерне и зернопродуктах методом НФ ВЭЖХ 10.9. С.Н. Сычев. Определение зеараленона в зерне и зернопродуктах методом НФ ВЭЖХ 10.10. К.С. Сычев (в соавторстве с К.Э. Эллером и В.А. Даванковым). Определение микотоксина патулина во фруктах и соках методом НФ ВЭЖХ с применением твердофазной экстракции на сверхсшитом полистироле 10.11. С.Н. Сычев. Определение витаминов А, Е, и Д в кормах, премиксах и витаминных смесях методом НФ ВЭЖХ 10.12. С.Н. Сычев. Анализ подсластителей и консервантов в напитках 10.13. С.Н. Сычев. Исследование процесса разложения аскорбиновой кислоты 10.14. С.Н. Сычев. Анализ горьких кислот хмеля в его экстрактах 10.15. С.Н. Сычев. Применение метода нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (НФ ВЭЖХ) для сравнительного анализа базовых моторных масел 10.16.1. С.Н. Сычев. Определение содержания производных фурана в электроизоляционных маслах методом ОФ ВЭЖХ 10.16.2. К.С. Сычев, С.Ю. Костиков. Определение содержания производных фурана в электроизоляционных маслах методом ТФЭ-ОФВЭЖХ 10.17. С.Н. Сычев. Анализ присадок в моторных, турбинных и трансмиссионных маслах 10.18. К.С. Сычев. Анализ ароматических углеводородов в топливах 10.19. С.Н. Сычев. Анализ и подтверждение идентичности образцов опиума и героина 11. Список международных сокращений, принятых в хроматографии 1. Базовые определения жидкостной хроматографии Хроматографию можно определить как метод, предназначенный для разделения (а также область химической науки о разделении) смесей веществ на составляющие их компоненты, которое происходит за счет различной скорости продвижения хроматографических зон разделяемых веществ в двухфазной системе «подвижная фаза - неподвижная фаза». Хроматография является лучшим из существующих методов анализа многокомпонентных смесей веществ, позволяющим идентифицировать (распознавать) индивидуальные вещества смеси (качественный анализ) и определять их концентрацию (количественный анализ). Разделяемая смесь веществ называется пробой. Аналитами называются компоненты пробы, для качественного и количественного определения которых проводится хроматографическое разделение. При рассмотрении теоретических основ разделения разделяемые вещества принято называть сорбатами (адсорбатами). В жидкостной хроматографии (ЖХ) продвижение зон хроматографируемых веществ обеспечивается пропусканием через колонку жидкой подвижной фазы (элюента) с заданной скоростью. В газовой хроматографии (ГХ) роль подвижной фазы выполняет газ-носитель. В наиболее распостраненном методе колоночной ЖХ применяются твердые неподвижные фазы, сорбенты (адсорбенты), с размером частиц от 10-25 до 2-3 микрометров, которые упаковывают суспензионным способом в хроматографические колонки – стальные или полимерные трубки длиной от 2 до 30 сантиметров и внутренним диаметром от 1 до 10-20 миллиметров. Подвижной фазой (элюентом) называется смесь растворителей, которая пропускается через хроматографическую колонку, и таким образом элюирует (вымывает) из нее разделенные компоненты пробы. Раствор, выходящий из хроматографической колонки, называется элюатом. Способность подвижной фазы элюировать компоненты пробы называется элюирующей силой. Применяемые для разделения неподвижная и подвижная фазы называются хроматографической системой. Часто понятие «хроматографическая система» применяется для обозначения всех условий проведения разделения: типа неподвижной фазы, размеров хроматографической колонки, состава подвижной фазы и скорости ее подачи, а также температуры колонки. 1.1. Устройство жидкостного хроматографа Прибор, предназначенный для проведения разделений смесей веществ, а также их качественного и количественного анализа, называется хроматографом. Жидкостной хроматограф состоит из насосной системы, узла ввода пробы, хроматографической колонки, детектора и регистрирующего устройства. Насосная система предназначена для пропускания подвижной фазы через хроматографическую колонку; узел ввода пробы – для ввода в колонку раствора разделяемой смеси (пробы). Разделение смеси происходит в хроматографической колонке. Детектирование (регистрация) выходящих из колонки веществ осуществляется детектором, сигнал от детектора обрабатывается и выдается в удобном для оператора виде регистрирующим устройством. 1.2. Хроматограмма Графическим представлением результата разделения является хроматограмма – зависимость сигнала детектора от времени элюирования. Хроматограмма начинается в момент ввода пробы и заканчивается в момент, определяемый оператором. Каждое вещество, регистрируемое детектором, изображается на хроматограмме в виде пика – зависимости концентрации этого вещества в элюате от времени элюирования. Площадь пика в области невысоких, от микрограммов до граммов в литре, концентраций пропорциональна концентрации вещества в пробе; коэффициент пропорциональности зависит от самого вещества и от типа применяемого детектора. Существуют детекторы, нечувствительные к определенным веществам, и наоборот – чувствительные к их очень небольшим количествам. 1.3. Параметры удерживания Основной характеристикой вещества в данной хроматографической системе является его удерживание в хроматографической колонке, которое может быть выражено несколькими величинами. Непосредственно из хроматограммы, по положению максимума пика вещества, определяется его время удерживания tR. Объем удерживания VR равен произведению времени удерживания на объемную скорость подачи подвижной фазы VR = tRu. Нулевым временем t0 называется время, затрачиваемое полностью несорбируемым веществом на прохождение по хроматографической колонке от узла ввода пробы до кюветы детектора. Нулевой объем V0, соответствующий нулевому времени, при условии пренебрежимо малого объема подводящих капилляров равен объему подвижной фазы внутри хроматографической колонки; нулевой объем V0 составляет величину порядка 70% ее общего объема Vc, около 30% составляет объем неподвижной фазы. Приведенным временем t’R удерживания называется разница между временем удерживания вещества и нулевым временем. Приведенному времени удерживания соответствует приведенный объем удерживания V’R. Фактором емкости k’ называется отношение приведенного времени удерживания вещества к нулевому времени, или приведенного объема удерживания к нулевому объему k’ = t’R/t0 = V’R/V0. Фактор емкости является безразмерной величиной и, таким образом, наиболее универсальной характеристикой удерживания вещества в хроматографической системе; его значение не зависит от размеров применяемой хроматографической колонки и скорости подачи подвижной фазы. Фактор емкости пика с точностью до постоянного для каждой хроматографической колонки множителя 1/φ равен константе адсорбции вещества в хроматографической системе, при условии предельно низкой концентрации аналита в пробе, т.е. в области линейности изотермы адсорбции аналита (области Генри). K = nS/nM = 1/φ * k’ = (V0/(Vc – V0))k’, где К – константа адсорбции вещества в хроматографической системе; nS – количество сорбата в неподвижной фазе; nM – количество сорбата в подвижной фазе; k’ – фактор емкости пика; φ – фазовое отношение; Vc – общий объем колонки; V0 – нулевой объем. Рисунок 1.3. Основные параметры, непосредственно выделяемые из хроматограммы: t0 – нулевое время; tR1 – время удерживания для первого пика; t’R1 – исправленное время удерживания для первого пика; w1 – ширина первого пика у основания; w1/2 – ширина пика на половине его высоты. 1.4. Разрешение как характеристика степени разделения Задачей хроматографии является разделение веществ за счет разности в их удерживании. Степень разделения двух веществ называется разрешением. Непосредственно из хроматограммы разрешение двух пиков вычисляется как отношение разницы во временах удерживания к половине суммы их ширин на уровне базовой линии. R = 2(tR1 – tR2)/(w1 + w2) Если вещества не разделяются, то разрешение равно нулю. При разрешении, равном единице, перекрываются лишь порядка 2% площадей двух пиков. Ситуация, когда разрешение больше или равно единице, соответствует разделению пиков «до базовой линии». Все вышесказанное относится к случаям, когда хроматографические пики можно описать симметричными кривыми Гаусса. В общем же случае пики не являются симметричными. Коэффициент асимметрии вычисляется как отношение «правой» полуширины пика к «левой» на одной десятой его высоты. Для сильно асимметричных пиков может вычисляться и специальный коэффициент асимметрии на одной сотой высоты. При равном разрешении, площади более асимметричных пиков перекрываются в большей степени, что значительно ухудшает точность их интегрирования. Степень разделения веществ зависит от физико-химических свойств хроматографической системы и от качества применяемой хроматографической колонки. 1.5. Селективность как физико-химическая характеристика системы Величина, отражающая способность хроматографической системы к разделению веществ, называется селективностью системы по отношению к этим веществам. Термин «селективность» может применяться в звух значениях: как в более общем – как свойство хроматографической системы, так и в конкретном – как селективность разделения двух веществ. Для последнего случая селективность вычисляется непосредственно из хроматограммы как отношение фактора емкости более удерживаемого пика к фактору емкости менее удерживаемого α = k’2/k’1. При α = 1 разделения не происходит, и его невозможно добиться применением более качественной хроматографической колонки или любым другим способом, кроме как изменить хроматографическую систему. Разделение возможно, если α > 1; сложность разделения быстро уменьшается с ростом селективности. Хроматограмма из n пиков характеризуется ½n(n-1) частными значениями α; с другой стороны, понимая «селективность» как общее свойство хроматографической системы разделять n данных веществ, этим термином можно назвать всю совокупность значений α. В этом случае «селективность» подразумевает типичный для данных хроматографических систем порядок элюирования веществ; независимо от удерживания веществ, при фиксированной селективности пропорции между факторами емкости или приведенными объемами (временами) удерживания веществ сохраняются. Селективность данной хроматографической системы является суммарной характеристикой физико-химических процессов в хроматографической системе, и определяется как типом неподвижной фазы, так и составом подвижной фазы. Одним из преимуществ жидкостной хроматографии является возможность улучшения селективности без замены неподвижной фазы, путем грамотного изменения состава подвижной фазы и соотношения ее компонентов. 1.6. Эффективность и пиковая плотность Качество хроматографической колонки определяется величиной, называемой эффективностью. Эффективность является мерой дисперсии (размывания) хроматографической зоны вещества, и, соответственно, ширины его пика на хроматограмме. Более эффективные, качественные хроматографические колонки характеризуются более узкими пиками при фиксированном времени удерживания. Эффективность может быть вычислена из параметров любого пика на хроматограмме, исходя из предположения, что его форма описывается кривой Гаусса. Эффективность равна квадрату отношения времени удерживания к ширине пика, помноженному на коэффициент, зависящий от высоты, на которой определялась ширина. N = 5.545 * (tR/w½)2, где w½ - ширина пика на половине высоты. Величина эффективности измеряется в теоретических тарелках, по названию теории размывания хроматографической зоны Мартина и Синджа. Теоретически, эффективность должна являться лишь функцией скорости потока (зависимость Ван-Деемтера); ее значение не должно зависеть ни от хроматографической системы, ни от сорбата, по пику которого проводится расчет. На практике, помимо типа хроматографической системы и применяемого сорбата, на измеряемую величину эффективности могут также оказывать влияние такие факторы, как температура, состав пробы и ее объем. Негативное влияние на эффективность может оказать наличие относительно больших «пустых» объемов в жидкостной системе хроматографа, особенно на участке между узлом ввода пробы и колонкой. Как правило, задача состоит в определении максимально возможной эффективности, которую иногда называют «паспортной». Для этой цели проводят специальное хроматографическое разделение, которое называется тестированием хроматографической колонки. Тестирование проводят в оптимальных условиях хроматографирования, подобранных опытным путем, или в условиях, «традиционно» применяемых для тестирования определенных типов неподвижных фаз. Набор сорбатов для тестирования, тестовая смесь, также подбирается эмпирически. Одними из наиболее часто применяемых в жидкостной хроматографии тестовых сорбатов являются ароматические углеводороды, толуол и нафталин. Эффективность хроматографической колонки в первом приближении пропорциональна ее длине; таким образом, при оценке качества упаковки колонки сорбентом принято использовать значение удельной эффективности, то есть эффективности, отнесенной к единице длины. Для современных высокоэффективных колонок значения удельной эффективности лежат в интервале от 40-50 до 100-120 тысяч теоретических тарелок на метр. Величина, обратная эффективности, называется высотой теоретической тарелки. Для качественно упакованных хроматографических колонок высота теоретической тарелки приблизительно равна удвоенному среднему диаметру частиц сорбента. Другой величиной, характеризующей качество хроматографической колонки, яляется пиковая плотность, равная числу пиков, которые могут быть расположены на хроматограмме друг за другом до определенного времени, в предположении, что разрешение для всех пиков равно единице. 1.7. Связь разрешения, селективности, эффективности и фактора емкости (основная формула хроматографии) Оптимизируя условия разделения, необходимо знать, при каких соотношениях селективности, эффективности и удерживания пара пиков может быть удовлетворительно разрешена. Формулу, связывающую разрешение со значениями α, N и k’, иногда называют основной формулой хроматографии: R = ¼ * (α-1)/α * √N * k’2/(k’среднее + 1) Наибольшее влияние на разделение веществ оказывает селективность хроматографической системы. При увеличении селективности на сравнительно небольшую величину – тридцадь пять тысячных 0.035 (от 1 до 1.035) при эффективности колонки N = 20,000 и факторе емкости второго пика k’2 = 5 разрешение пиков возрастает практически линейно, изменяясь от нуля (отсутствие разделения) до единицы (разделение до базовой линии). Разделение быстро элюируемых (т.е. слабо удерживаемых) соединений можно улучшить, увеличив их удерживание (следовательно, и фактор емкости k’) путем плавного изменения состава подвижной фазы. Этот способ оптимизации разрешения дает хорошие результаты при факторах емкости второго пика менее k’2 = 4-6, а при больших значениях k’ быстро теряет свою действенность. Так, при селективности разделения α = 1.035 и эффективности колонки N = 20,000 разрешение двух пиков с средним k’ = 0.5 составляет R = 0.4 (разделение примерно до уровня 2/3 высоты), а с k’ = 5 разрешение доходит до R = 1.0 (разделение до базовой линии). Третьим способом улучшения разрешения является применение более эффективных хроматографических колонок. Более эффективная колонка характеризуется либо большей длиной, либо меньшим диаметром частиц адсорбента. К сожалению, изменение обоих параметров в сторону увеличения эффективности приводит к увеличению гидродинамического сопротивления колонки, то есть повышению давления в жидкостной системе. Здесь есть два предела: во-первых, каждая насосная система имеет ограничение по давлению, во-вторых, максимальное давление в системе диктуется пределом механической прочности частиц адсорбента. Стандартные насосные системы могут работать при давлении до 300-400 атмосфер, что вполне достаточно для работы с 5 и 3-х микронными адсорбентами. Для работы с более мелкозернистыми (с частицами диаметром до одного микрона) адсорбентами существуют более дорогие системы сверхвысокого давления (ultra-high pressure). Механическая прочность адсорбционного материала зависит от его типа и условий синтеза. В принципе, если говорить о верхнем пределе возможных давлений, частицы качественного силикагеля способны выдерживать давление до 1000 атмосфер. С другой стороны, есть адсорбционные материалы, к примеру, слабосшитые полистирольные иониты, иммобилизованные полисахариды, которые могут работать только при невысоких давлениях, не более 50 атмосфер. Таким образом, перед применением колонки лучше удостовериться, прочитав руководство, что она не имеет каких-либо особенных ограничений (это касается не только максимального давления). Увеличение длины колонки также приводит к увеличению времени анализа. Универсального «рецепта» здесь нет – для каждого случая оптимальное соотношение между разрешением и временем элюирования подбирается индивидуально. Таким образом, разрешение хроматографических пиков может быть улучшено тремя основными способами: подбором оптимальной селективности (путем изменения типа неподвижной фазы или состава подвижной фазы), регулированием удерживания (плавным изменением состава подвижной фазы), или применением более эффективной хроматографической колонки. 2. Межмолекулярные взаимодействия в жидкостной хроматографии «… Просто окружающий мир слишком часто подтверждает странное правило: чем давать вещам объективную оценку, лучше воспринимать их, как тебе удобно, – и приблизишься к истинному пониманию этих вещей». Харуки Мураками, «Конец Света» Жидкостная хроматография является физико-химическим методом, основанном на принципе различия во взаимодействиях хроматографируемых соединений как с неподвижной, так и с подвижной фазами. Оптимизация хроматографических условий разделения является, по сути, регулированием целого комплекса физико-химических процессов, определяющих удерживание веществ и селективность их разделения. При рассмотрении этих процессов отправной точкой следует считать факт, что природа всех химических и физико-химических взаимодействий является единой, электродинамической. В хроматографической системе реализуются лишь слабые (физико-химические, межмолекулярные) взаимодействия, энергия которых сопоставима по величине с энергией теплового движения. Вообще, низкая энергия взаимодействия является отличительной чертой, спецификой любого физико-химического метода. По этой причине основное внимание при изложении будет уделено тем типам взаимодействий, которым, к примеру, в органической химии уделяется минимальное внимание, или не уделяется внимания вовсе. Взаимодействие адсорбата с адсорбентом можно представить как образование лабильного комплекса, который через некоторое короткое время распадается на исходные составляющие компоненты; образование такого комплекса происходит с минимальной энергией активации или без энергии активации. Такой комплекс адсорбента и адсорбата называют адсорбционным комплексом. Межмолекулярные взаимодействия, являющиеся причиной образования адсорбционных комплексов, могут описываться моделями двух основных типов: электростатическими и неэлектростатическими. Неравномерное распределение заряда по молекулярным системам является причиной их электростатического взаимодействия. Модели различных типов электростатических взаимодействий имеют наиболее простой вид, так как основаны на законе Кулона. Далее будут рассмотрены такие типы электростатических взаимодействий, как ион-ионные, ион-дипольные и диполь-дипольные. Рисунок. 2.0.1. Схемы, иллюстрирующие ион-ионное (а), ион-дипольное (б) и диполь-дипольное (в) взаимодействия. Наиболее удобной моделью, позволяющей рассмотреть различные аспекты образования других типов связей, которые не могут быть описаны простыми электростатическими моделями, является метод молекулярных орбиталей (МО). Согласно этой модели, каждому электрону, движущемуся в поле ядер, можно приписать определенную математическую функцию, квадрат которой равен вероятности его нахождения в пространстве. Эта функция, выраженная «графически», называется орбиталью электрона; каждая орбиталь характеризуется определенным значением энергии, а также определенной формой. Строго говоря, орбиталь не соответствует какому-то определенному электрону, поскольку они неразличимы. Правильно было бы говорить, что системе из нескольких ядер и электронов соответствуют определенные орбитали. Орбитали электронов, движущихся в поле нескольких ядер, можно разделить на три типа: несвязывающие, связывающие и разрыхляющие. Несвязывающие орбитали (n-орбитали) не принимают участие в образовании химических связей внутри молекулярной системы. Как правило, они характеризуются низкой энергией; это выглядит так, как будто некоторые электроны находятся только у «своих» ядер. Связывающие орбитали охватывают несколько ядер, что эквивалентно образованию связи между этими ядрами. В основном состоянии молекулярной системы электроны преимущественно находятся на несвязывающих и связывающих орбиталях с низкими энергиями, что приводит к устойчивости этой системы. В возбужденных состояниях электроны могут переходить на разрыхляющие орбитали, характеризующиеся более высокими энергиями. Глубина потенциального минимума этих электронных состояний значительно меньше, чем для связывающих состояний; в результате, даже при сравнительно невысокой колебательной энергии ядер молекулярная система в «разрыхляющем» электронном состоянии может диссоциировать (разрушиться). Связывающие и разрыхляюшие орбитали, расположенные преимущественно вдоль линий, соединяющих ядра, называются σ-орбиталями; остальные орбитали называются π-орбиталями. Таким образом, π-орбитали являются наболее делокализованными, то есть «размазанными» в пространстве, хотя некоторые n-орбитали и σ-орбитали также характеризуются значительной степенью делокализованности. Наболее сильные химические связи образуются «внутри» молекулярной системы; на языке МО это означает, что наиболее низкой энергией обладают σ-орбитали, являющиеся преимущественно внутри-молекулярными. Рисунок 2.0.2. Схематичное изображение некоторых орбиталей этилена. (а) Наиболее низкая по энергии связывающая σ-орбиталь, (б) наиболее высокая по энергии разрыхляющая σ-орбиталь, (в) наиболее низкая по энергии связывающая π-орбиталь, (г) наиболее высокая по энергии разрыхляющая π-орбиталь. Меж-молекулярное взаимодействие возникает, когда электроны молекулярных систем, находящиеся на значительно делокализованных орбиталях, могут «дотянуться» до свободных делокализованных орбиталей других молекулярных систем через разделяющее их минимально возможное расстояние, обусловленное отталкиванием несвязывающих электронов молекул. Другими словами, электрон(ы) молекулы-донора могут двигаться в поле ядер обеих молекул: донора и акцептора, что эквивалентно образованию связи между ними. Нередко связь такого типа называется «связью по донорно-акцепторному механизму». Молекула-донор электронов называется основанием Льюиса, молекула-акцептор электронов – кислотой Льюиса. Основанием Льюиса может служить частица, обладающая лабильным электроном (или парой электронов) на π-орбитали (реже – σ-орбитали), n-орбитали, или dорбитали (для ионов и атомов металлов). Кислотой Льиса может служить частица, обладающая свободной π-орбиталью (реже – σ-орбиталью), n-орбиталью, или свободной d-орбиталью (для ионов и атомов металлов). Частичный, или полный, переход электрона с орбитали донора на орбиталь акцептора называется переходом с переносом заряда, а образующиеся комплексы – комплексами с переносом заряда. В зависимости от характера донора и акцептора, комплексы с переносом заряда могут быть различных типов: π-π, π-d, n-d и так далее; в жидкостной хроматографии чаще всего встречаются комплексы с переносом заряда трех перечисленных типов, плюс комплексы σ-типа. Согласно наиболее распостраненной гипотезе, энергия взаимодействия в комплексе с переносом заряда обратно пропорциональна разнице между энергиями высшей занятой молекулярной орбитали (ВЗМО) электрон-донора и низшей свободной молекулярной орбитали (НСМО) электронакцептора. Рисунок 2.0.3. Схематичное изображение переходного шестицентрового π-комплексе диена (к примеру, бутадиена, изображен вверху) и диенофила (к примеру, этилена, изображен внизу) в реакции Дильса-Альдера. На приведенной схеме диен выступает в роли электрон-донора (он предоставляет высшую занятую связывающую π-орбиталь, ВЗМО, и пару электронов), а диенофил – в качестве электрон-акцептора (он предоставляет низшую свободную разрыхляющую π-орбиталь, НСМО). Рисунок 2.0.4. Электронный спектр поглощения для π-комплекса пирена с 1,1’-дибензил-4,4’бипиридил-катионом (а) и диаграмма энергетических уровней комплекса (б). M.S. Matos et al. / Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 488 (1999) 233-239 Фактически, точные модели этих взаимодействий довольно сложны. К счастью, для большинства практических целей, какими в жидкостной хроматографии являются прогнозирование удерживания и селективности разделения, бывает достаточно лишь качественно оценить характер взаимодействий и их величину. Итак, в грубом приближении межмолекулярные взаимодействия можно представить как комбинацию электростатического взаимодействия и взаимодействия с переносом заряда. При «чистом» электростатическом взаимодействии не происходит поляризации взаимодействущих систем, то есть их электронная плотность не перераспределяется. Взаимодействия с переносом заряда подразумевают поляризацию по крайней мере одной из взаимодействующих систем; при этом происходит перераспределение электронной плотности. Вообще, в литературе можно встретить довольно большое количество терминов, обозначающих различные типы взаимодействий. Общепринятыми же являются несколько основных их типов, которые основаны либо на соответствующих моделях, либо на принципе удобства описания определенного круга явлений, либо сложились исторически. Выбор же какого-либо определенного набора терминов для описания межмолекулярных взаимодействий является в определенной степени свободным, но зависящим от специфики описываемых явлений. Исходя из специфики метода жидкостной хроматографии, а также следуя принципам удобства, простоты и наглядности моделей, постулируем следующие типы физикохимических взаимодействий: 1. диполь-дипольные взаимодействия (включая индукционные и «диполь-полевые»); 2. водородная связь; 3. «сольвофобные» (включая «гидрофобные») взаимодействия; 4. ионные взаимодействия (включая ион-дипольные взаимодействия); 5. дисперсионные взаимодействия (исключая индукционные взаимодействия и π-взаимодействия); 6. π-взаимодействия; 7. координационные взаимодействия. 2.1. Дипольные взаимодействия Диполь – это физическая модель, описывающая систему из двух разноименных, но равных по величине электрических зарядов на некотором расстоянии друг от друга. Векторная величина, равная произведению вектора, соединяющего заряды, на величину электрического заряда, называется дипольным моментом μ и измеряется в Дебаях, D; 1 D ≈ 3.34 * 10-30 Кл*м. Прямая, соединяющая заряды, называется осью диполя. Напряженность электрического поля в направлении оси диполя обратна пропорциональна кубу расстояния до диполя, при условии, что расстояние значительно превышает его размеры. Многие несимметричные молекулы обладают постоянным дипольным моментом. Постоянный дипольный момент обусловлен неравномерным распределением заряда на молекуле, и в основном присущ соединениям с электроотрицательными заместителями в их структуре: галогенами –F, -Cl, -Br, функциональными группами, содержащими кислород, азот -OR, -NR2, -NO2, CN, -COOR, =C(O), -NHC(O)- и т.д. Постоянный дипольный момент не изменяется во внешнем электрическом поле или электрическом поле соседних молекул, являясь постоянной характеристикой молекулы. Под влиянием внешнего электрического поля молекула может получить дополнительный, наведенный или индукционный дипольный момент, если ее структура включает легко поляризуемый фрагмент. Значительной поляризуемостью обладают системы с кратными, в том числе сопряженными, связями, ароматические системы -Ar, а также группы, содержащие атомы с большим ионным радиусом, к примеру -SR, -I. В результате поляризации молекулы в электрическом поле происходит смещение заряда в молекуле, что является причиной появления наведенного дипольного момента. Наведенным моментом могут обладать соединения, не имеющие постоянного дипольного момента, но содержащие в своей структуре поляризуемые фрагменты. Дополнительный дипольный момент может также индуцироваться и на молекулах соединений с постоянным дипольным моментом; в этом случае результирующий дипольный момент зависит от угла между двумя диполями, то есть наведенный дипольный момент может как увеличивать, так и уменьшать постоянный дипольный момент. В отсутствии внешнего электрического поля, на данную молекулу может действовать электрическое поле соседних молекул, обладающих постоянным дипольным моментом. Напряженность электрического поля, действующего на молекулу, отлична от нуля, если она обладает локально несимметричным полярным окружением. Коэффициент пропорциональности между величиной индуцированного дипольного момента и напряженностью внешнего электического поля называется поляризуемостью молекулы. μинд = α * Е ~ α * μпост, где μинд – индуцированный (наведенный) диполь; μпост – индуцирующий постоянный диполь; α – поляризуемость молекулы; Е – напряженность электрического поля. Диполь-дипольным взаимодействием называется взаимодействие диполей, приводящие к их взаимной ориентации и притяжению. Энергия взаимодействия двух диполей пропорциональна произведению их дипольных моментов. Рисунок 2.1. Диполь-дипольное взаимодействие двух частиц (а) и диполь-полевое взаимодействие полярного адсорбата с поверхностью динамически модифицированного полярного адсорбента (б). В жидкостной хроматографии, как правило, рассматривается взаимодействие дипольного момента адсорбата с дипольными моментами полярных групп адсорбента; таким образом, дипольдипольное взаимодействие является одной из причин удерживания молекул, обладающих дипольным моментом, на полярных неподвижных фазах в неполярных средах. Наиболее характерный случай диполь-дипольного взаимодействия в жидкостной хроматографии соответствует ситуации, когда поверхность полярной неподвижной фазы модифицирована адсорбционным слоем полярного компонента подвижной фазы. Для этого случая моделью однородно модифицированной поверхности неподвижной фазы является эквипотенциальная поверхность, характеризующаяся некоторым усредненным значением напряженности электричекого поля. Энергия взаимодействия диполя адсорбата с электрическим полем неподвижной фазы равна произведению дипольного момента на напряженность электрического поля: U=-μ*E Напряженность электрического поля полярной адсорбционно модифицированной неподвижной фазы составляет величину порядка 109 В/м, а энергия «диполь-полевого» взаимодействия – порядка кДж/моль. 2.2. Водородная связь Водородная связь возникает между двумя молекулами, одна из которых имеет лабильный, подвижный атом водорода в составе какой-либо ее функциональной группы: -SO3H, -COOH, -OH, – NHC(O), –NH2, а другая молекула содержит в своей структуре атом электроотрицательного элемента: кислорода –O-, =О , азота =N-, или галогена –F, -Cl. На схеме образования водородной связи -X-H¨A- молекула-донор протона (ядра атома водорода) обозначается как -X-H, а электроотрицательный атом молекулы-акцептора протона A-; водородная связь обозначается пунктирной линией. Комплекс с водородной связью можно рассматривать как комплекс с переносом заряда, в котором несвязывающая n-орбиталь с высокой энергией («электронная пара» по теории ВС), или связывающая π-орбиталь -А взаимодействует с вакантной σ-орбиталью -X-H, локализованной преимущественно у водорода. В типичных комплексах с переносом заряда изменение межатомных расстояний невелико, однако протон является очень подвижным ядром, и в комплексе с водородной связью его положение значительно (от процентов до десятков процентов по сравнению с длиной связи X-H) изменяется. В свою очередь, сдвиг протона приводит к увеличению дипольного момента -X-H, что обуславливает дополнительное электростатическое связывание в комплексе. Таким образом, водородную связь можно представить как комбинацию взаимодействия с переносом заряда и электростатического взаимодействия (рис. 2.2.1). Рисунок 2.2.1. Схемы образования водородных связей, (а) слабой и (б) сильной. Классификация водородных связей основана на различии в их энергии. Сравнительно слабые водородные связи: С-H¨O=, -NH2¨N, -OH¨Ar имеют энергию порядка кДж/моль, более сильные -OH¨O=, -C(O)NH¨O= около 10-25 кДж/моль. Энергия водородных связей -COOH¨N, COOH¨О= может превышать 20 кДж/моль. Структура молекулярного комплекса с водородной связью также определяется ее энергией. Увеличение взаимодействия сказывается на деформации ковалентной связи X-H, которая становится длиннее, в отличие от самой водородной связи H¨A, которая становится короче. В случае слабой водородной связи ковалентные связи молекулы-донора и молекулыакцептора протона практически не деформируются; молекулярный комплекс лабилен и обладает очень коротким временем жизни. Средняя энергия взаимодействия -X-H¨A- порядка 10-25 кДж/моль соответствует случаю образования «классической» водородной связи; при образовании молекулярного комплекса связь X-H может в различной степени деформироваться. Водородная связь с высокой, более 25-30 кДж/моль, энергией приводит к образованию достаточно стабильного молекулярного комплекса, строение которого отличается от строения исходных молекул донора и акцептора протона. В этом случае образование водородной связи можно считать кислотно-основной реакцией, которая происходит в согласии с теорией Бренстеда. Молекулярный комплекс молекулы-донора и молекулы-акцептора является комплексом с частичным переносом протона, и называется ионной парой. Строение ионной пары может выражаться схемой -X¨H¨A-, или –X-¨+Н-A-, отражающей преимущественную локализацию протона около молекулы-акцептора. Свидетельством образования ионной пары является высокое значение инкремента дипольного момента молекулярного комплекса, равное векторной разнице между дипольным моментом комплекса и суммой дипольных моментов его компонентов. Зависимость инкремента дипольного момента от энергии водородной связи выражается S-образной кривой с интенсивным подъемом в интервале 30-60 кДж/моль с соответствующим увеличением инкремента дипольного момента комплекса приблизительно от 1 до 6-7 D; последний случай, к примеру, соответствует образованию комплексов фенолов с сильными основаниями в неполярных растворителях. Комплексы более сильных кислот с сильными основаниями являются ионными парами; инкремент дипольного момента пары имеет значение более 5-7 D, а энергия водородной связи – более 50-60 кДж/моль. Ионные пары могут существовать лишь в среде с низкой диэлектрической проницаемостью. В средах с высоким показателем диэлектрической проницаемости, в полярных растворителях и водных системах, они частично или полностью диссоциируют на ионы, для описания взаимодействия которых применяется теория электростатических ион-ионных взаимодействий. Водородная связь может быть по праву названа самым распостраненным типом взаимодействий в жидкостных системах, включающих протонные растворители как компоненты; в частности, такие системы часто применяются как подвижные фазы в жидкостной хроматографии. В хроматографической системе водородная связь может образовываться «напрямую» между молекулой адсорбата и функциональными группами полярной подвижной фазы, и, таким образом, приводить к удерживанию. С другой стороны, случаи непосредственного взаимодействия адсорбата с неподвижной фазой посредством водородной связи встречаются в жидкостной хроматографии довольно редко. В основном это связано с тем, что в обычно применяемых условиях хроматографирования поверхность полярной неподвижной фазы уже покрыта адсорбционным слоем полярного компонента подвижной фазы, или, другими словами, адсорбционно модифицирована. Деактивированая адсорбционным слоем неподвижная фаза в гораздо меньшей степени склонна к взаимодействию с адсорбатами за счет сильных водородных связей; удерживание же в этом случае может осуществляться, к примеру, за счет диполь-полевых взаимодействий. Рисунок 2.2.2. Схемы взаимодействия полярных адсорбатов с полярными адсорбентами, (а) за счет дипольных взаимодействий и слабых водородных связей – пики симметричные, (б) за счет сильных водородных связей (с «активными силанолами») и координационных взаимодействий (с примесями металлов) – пики асимметричные. Нередко образование сильных водородных связей между адсорбатом и неподвижной фазой является причиной уширения пиков и увеличения их асимметричности. Такая ситуация реализуется, например, когда неподвижной фазой служит «некачественный» с хроматографической точки зрения силикагель с несколькими типами активными адсорбционными центрами, а адсорбционное модифицирование его поверхности отсутствует или недостаточно эффективно. В этом случае в системе могут быть реализованы сильные и достаточно «медленные» взаимодействия некоторых типов полярных адсорбатов с неподвижной фазой, главным образом за счет образования сильных водородных связей (с кислыми силанольными группами) и за счет координационных взаимодействий (с примесями ионов металлов). Результатом «медленных» взаимодействий в хроматографической системе является, соответственно, и медленный массобмен, который, в свою очередь, и является причиной уширения пиков и увеличения их асимметричности (рис. 2.2.2). Режимы элюирования, допускающие непосредственное взаимодействие адсорбатов с неподвижной фазой за счет водородных связей, встречаются в хиральной и аффинной хроматографии. В хиральной хроматографии применение таких режимов обусловлено тем, что дискриминация энантиомеров происходит только при близком контакте неподвижной фазы и адсорбата; в результате контакта должно обеспечиваться «трехточечное взаимодействие», часто именно путем образования сильных водородных связей, или за счет координационных взаимодействий (лигандообменная хроматография). В аффинной хроматографии биокомплементарность адсорбата (антигена) и лиганда (антитела) на поверхности неподвижной фазы также способна проявляться лишь при тесном контакте последних, а основным типом взаимодействия «антиген-антитело» является опять же водородная связь. Как следствие, в хиральной, и особенно аффинной хроматографии, адсорбаты нередко элюируются в виде уширенных асимметричных хроматографических пиков. Водородные связи играют значительную роль в сольватировании полярных адсорбатов в неполярных средах; в результате взаимодействия адсорбатов с полярными компонентами элюента образуются сольватные комплексы адсорбатов. Во многих случаях изменения в удерживании адсорбатов при варьировании доли протонного растворителя в подвижной фазе связаны с перестройкой их сольватных комплексов, и, таким образом, с изменением их адсорбционных свойств. Как правило, при сольватации происходит «гашение» дипольного момента адсорбата за счет антипараллельной ориентации диполей адсорбата и молекул полярного компонента подвижной фазы. Исключение составляют случаи образования ионных пар между адсорбатом и компонентом подвижной фазы, и случаи, когда адсорбат содержит внутримолекулярную водородную связь, при размыкании которой за счет водородных связей с растворителем происходит увеличение дипольного момента сольватного комплекса. Рисунок 2.2.3. Схема сольватного комплекса адсорбата. Наконец, водородные связи являются основной причиной высокой структурированности многих протонных растворителей. 2.3. Сольвофобные взаимодействия Термин «сольвофобные взаимодействия» относится к категории исторически сложившихся и прочно вошедших в обиход терминов, формулировка которых, однако, оставляла и оставляет желать лучшего. К сожалению, без этого термина обойтись нельзя, поскольку понятие о сольвофобных взаимодействиях является центральным при описании адсорбции из сред высокой полярности, особенно из протонных растворителей: воды, спиртов и их смесей. Протонные растворители и системы на их основе характеризуются высокой степенью структурированности, обусловленной наличием сильных водородных связей. Многие системы такого типа обладают характерным свойством – протонным обменом, который происходит «по сетке» водородных связей. Быстрый протонный обмен в воде и водно-органических системах приводит к образованию своего рода единого жидкого кристалла фазы, к которому не применимо понятие молекулы. Стуктурированность систем протонных растворителей, и особенно водных систем, приводит также к значительному дальнодействию взаимодействий в их среде. Помещение в такую среду частицы большого объема приводит к искажению или нарушению структуры среды. Этот процесс является энергетически невыгодным, особенно для неполярных, не взаимодействующих со средой частиц, не способных как-либо компенсировать рост энергии системы. Адсорбция же частицы приводит к уменьшению площади контакта со средой, то есть является процессом энергетически выгодным, уменьшающим энергию системы. Нарушение структуры растворителя принято выражать термином «сольвофобное взаимодействие», или, для воды и водно-органических систем – «гидрофобное взаимодействие». Уже путем сравнения слов «нарушение» и «взаимодействие» можно понять, насколько неудачны исторически сложившиеся термины. Слово «взаимодействие» в них относится к частицам, которые агрегируются по причине их вытеснения из полярной среды. Подобная терминология часто применяется в коллоидной химии и физхимии полимеров. Таким образом, энергетический эффект сольвофобного взаимодействия при адсорбции равен энергии связей в среде растворителя, которые «восстанавливаются» после адсорбции соединения. Грубую оценку «выталкивающей» способности среды можно провести по ее поверхностному натяжению, которая в энергетической интерпретации называется свободной поверхностной энергией. Соответственно, чем больше поверхностное натяжение среды, тем выше в ней величины сольвофобного взаимодействия для различных соединений. Достаточно интересной характеристикой также является межфазное поверхностное натяжение среды (растворителя) на границе раздела фаз «среда-растворяемое вещество», если растворяемое вещество является жидкостью, ограниченно смешивающейся с растворителем. В этом случае сольвофобное взаимодействие будет, вероятно, являться лишь одним из основных факторов, определяющих наблюдаемую величину. 2.4. Ионные взаимодействия Взаимодействие двух небольших разноименных ионов, как правило, описывается кулоновским притяжением двух сфер с некоторым пространственным распределением заряда внутри них. В первом приближении, способность иона к электростатическим взаимодействиям выражается через величину отношения заряда к квадрату его эффективного радиуса, которая пропорциональна поверхностной плотности заряда. Величина эффективного радиуса включает также сольватную оболочку иона, поэтому она, как правило, не совпадает с величиной истинного ионного радиуса и зависит от природы растворителя. Более того, ион-дипольное взаимодействие иона с молекулами растворителя приводит к интересному и парадоксальному на первый взгляд эффекту: ионы с меньшими истинными ионными радиусами характеризуются большими эффективными радиусами, причем в биполярных растворителях это справедливо и для катионов, и для анионов. Причина этого явления заключается в том, что ионы с небольшими истинными радиусами обладают большей поверхностной плотностью заряда, чем ионы с большими истинными радиусами; в результате, первые сольватируются гораздо сильнее, что в итоге приводит к обращению размеров ионов. Такие растворители, как вода, эффективно сольватируют и катионы, и анионы. Некоторые апротонные растворители, к примеру, диметилсульфоксид, эффективно сольватируют катионы, но плохо сольватируют анионы. В таких растворителях эффективный радиус анионов может приближаться к их истинному радиусу. Сходное являние можно наблюдать для смесей растворителей: эффект предпочтительной сольватации катиона одним растворителем, а аниона другим, называется гетероселективной сольватацией. Различным образом сольватированные ионы называются сольватомерами. Таким образом, путем регулирования состава среды можно регулировать размер сольватированных ионов и величину ионного взаимодействия. 2.5. Дисперсионные взаимодействия Если химика попросить привести пример проявления дисперсионных взаимодействий, что он вспомнит прежде всего? Что алифатические углеводороды способны взаимодействовать фактически только за счет дисперсионных взаимодействий. Что в основном дисперсионными взаимодействиями обусловлены такие явления, как конденсация и затвердевание углеводородов, понижение межфазного поверхностного натяжения жидкостей (в том числе воды) при контакте с углеводородной фазой, адсорбция паров углеводородов на неполярных фазах в газовой хроматографии. Вообще, термин «дисперсионные взаимодействия» также относится к категории исторически сложившихся терминов, смысл которого «эволюционировал» на протяжении целого века. Не вдаваясь в исторические подробности, поясним современную смысловую нагрузку термина при его применении в жидкостной хроматографии. Дисперсионными взаимодействиями в жидкостной хроматографии принято обозначать взаимодействия адсорбатов с неполярными, как правило, углеводородными, структурными фрагментами адсорбента. При этом предполагается, что взаимодействие осуществляется за счет мгновенных наведенных диполей. Затруднительно сказать что-либо более конкретное о значении термина, поскольку касательно деталей мнения исследователей начинают расходиться. Однако, существует одно свойство дисперсионных взаимодействий, которое признается всеми исследователями, и которым можно пользоваться как критерием. В сознании любого хроматографиста понятие о «дисперсионных взаимодействиях» прочно увязывается с понятием о «неспецифических взаимодействиях». Разделение взаимодействий на специфические и неспецифические было введено Киселевым. Так, электростатические взаимодействия, образование водородных связей – эти типы взаимодействий являются специфическими в том смысле, что каждый из них может быть характерен только для определенных соединений, тогда как для других соединений этот тип взаимодействий может полностью отсутствовать. К примеру, неорганический ион способен к ионионным и ион-дипольным взаимодействиям, не характерным для молекулы углевода (в нейтральной среде). В свою очередь, углевод может участвовать в диполь-дипольных взаимодействиях и образовывать водородные связи, что менее характерно для неорганического иона. Наконец, алифатический углеводород не способен ни к одному из указанных выше взаимодействий, за исключением, пожалуй, очень слабых индукционных диполь-дипольных. Наряду со специфическими физико-химическими взаимодействиями, существуют также и другие, характерные в той или иной мере для всех соединений. Эти более «универсальные» взаимодействия можно назвать неспецифическими. Именно такие взаимодействия в хроматографии принято называть дисперсионными. С позиции МО, «хроматографические» дисперсионные взаимодействия можно рассматривать как взаимодействия σ-доноров и σ-акцепторов электронов, которыми могут являться, по сути, любые молекулы. Как уже было упомянуто, практически любая молекула обладает достаточно делокализованными σ-орбиталями, как занятыми электронами, так и свободными. Частичное перекрывание занятых и свободных делокализованных σ-орбиталей взаимодействующих молекул, то есть взаимодействие с переносом заряда σ-σ типа, является причиной неспецифических, или дисперсионных взаимодействий. Так как σ-орбитали молекулы можно в какой-то мере сопоставить с определенными химическими σ-связями (то есть сопоставить метод молекулярных орбиталей с методом валентных схем), для некоторых простых молекул относительную величину дисперсионного взаимодействия можно оценить, суммируя инкременты химических связей в их структурных формулах. В жидкостной хроматографии дисперсионные взаимодействия играют значительную роль в адсорбции неполярных соединений из полярных подвижных фаз. 2.6. π-Взаимодействия Не все взаимодействия углеводородных фрагментов являются неспецифическими. Фрагменты, содержащие кратные, в особенности, сопряженные связи, ароматические системы, в том числе с донорными и акцепторными заместителями, способны проявлять специфические взаимодействия за счет пи-электронных систем. π-Взаимодействия можно определить как взаимодействия, приводящие к образованию комплексов с переносом заряда π-типа, в частности, π-π и π-d типов (данные об образовании комплексов π-n типа до сих пор достаточно противоречивы). π-Взаимодействия могут быть как сравнительно слабыми, так и очень сильными. Слабые межмолекулярные взаимодействия этого типа существуют в бензоле, сильные – в комплексах пикриновой кислоты с ароматическими соединениями, очень сильные, внутри-молекулярные – в молекуле ферроцена. В хроматографии взаимодействия π-π типа реализуются при удерживании ненасыщенных адсорбатов на адсорбентах, в структуру которых входят фрагменты с ненасыщенными электрондонорными/акцепторными системами. Взаимодействия π-π типа более сильно выражены для ароматических соединений. Большой склонностью к взаимодействиям π-π типа обладает также карбонильная группа альдегидов и кетонов, особенно ароматических. Рисунок 2.6.1. Структуры ароматических лигандов, прививаемых к силикагеляю. К.Kimata et al. / J.Chromat.A 786 (1997) 237-248 Взаимодействия π-d типа, как правило, реализуются при удерживании ненасыщенных адсорбатов на адсорбентах с иммобилизованными (закрепленными) ионами или комплексами переходных металлов. Бывают и обратные случаи, когда адсорбенты с ненасыщенными фрагментами применяются для разделения ионов и комплексов переходных металлов. Во всех этих случаях перенос заряда осуществляется между π-орбиталями ненасыщенной системы и dорбиталями переходного металла. Взаимодействия π-d типа наиболее сильно выражены для углеводородов с двойными и тройными связями. Рисунок 2.6.2. Схематичные изображения π-d (а) и π-π (б) взаимодействий. Первому примеру (а) соответствуют комплексы олефинов и ненасыщенных жирных кислот (триглицеридов) с ионами серебра, второму примеру (а) – комплексы серебра с полиароматическими углеводородами. Для ПАУ с гетероатомами (O, S, особенно N) более характерны комплексы с ионами серебра π-n типа. Примеру (б) соответствуют комплексы ПАУ с сильными ароматическими электрон-акцепторами (тринитротолуол, пикриновая кислота) и донорами (ароматические аминами, 1,1’-дибензил-4,4’бипиридил-катионом, рис. 2.0.4). Важно отметить то, что π-взаимодействия наиболее ярко проявляются в неполярных средах. Устойчивость лабильных π-комплексов быстро падает при увеличении полярности окружения. Наименее вероятно образование π-комплексов в водных средах, хотя образование комплексов между неполярными ароматическими структурами еще вполне возможно. Полярные же ненасыщенные соединения в этих условиях интенсивно сольватируются, в результате чего устойчивость π-комплексов, для которых необходима плотная «стыковка» (pi-stacking) π-систем, зачительно снижается. Наличие π-взаимодействий постулируется для большого числа неподвижных фаз для жидкостной хроматографии, однако значительно реже встречаются реальные доказательства их вклада в удерживание. Тем не менее, π-π взаимодействия очень ярко проявляются при хроматографировании ароматических соединений в малополярных средах на неподвижных фазах, содержащих ароматические фрагменты. Теория π-взаимодействий в хроматографии пока находится на начальном этапе. Для описания этого типа взаимодействий теория молекулярных орбиталей, как кажется, подходит наиболее удачно. Рассмотрение ситуации с позиции МО дает приблизительно следующую схему. В зависимости от расположения уровней энергии ВЗМО (высшей занятой МО) и НСМО (низшей свободной МО) адсорбата относительно ВЗМО и НСМО адсорбента, адсорбат может быть преимущественно либо донором, либо акцептором электронов. При меньшей разнице НСМО адсорбата и ВЗМО адсорбента адсорбат является в основном акцептором электронов, а при меньшей разнице ВЗМО адсорбата и НСМО адсорбента – донором электронов. В каждом из этих случаев результатом взаимодействия является образование лабильного адсорбционного комплекса с переносом заряда, имеющего дипольный момент. Если величины «перекрестных» разниц ВЗМО и НСМО адсорбента и адсорбата приблизительно равны, то перенос заряда от адсорбата к адсорбенту и от адсорбента к адсорбату приводит к образованию π-комплекса без значительного дипольного момента. По этой причине, π-комплексы неполярных ароматических углеводородов являются наиболее устойчивыми к разрушению в полярных средах. Рисунок 2.6.3. Схема образования лабильных адсорбционных комплексов за счет πвзаимодействий. (а) Адсорбат является преимущественно электрон-донором, (б) электронакцептором, (в) не является преимущественно ни донором, ни акцептором. 2.7. Координационные взаимодействия Термин «координационные взаимодействия» будет здесь применяться для описания процесса образования комплексов ионов металлов (как правило, переходных) с различными лигандами. Координационные взаимодействия являются по сути сложным сочетанием электростатических взаимодействий и взаимодействий с переносом заряда. Электростатические взимодействия (ионные и ион-дипольные) обусловлены наличием в структуре лигандов ионизированных функциональных групп и полярных фрагментов с неоднородным распределением заряда. Комплексы с переносом заряда образуются, как правило, за счет взаимодействия несвязывающих орбиталей лиганда с d-орбиталями металла, то есть лиганды чаще всего координируются путем образования комплексов с переносом заряда n-d типа. В жидкостной хроматографии также встречаются примеры образования координационных комплексов π-d типа; взаимодействия этого типа будут в дальнейшем рассматриваться как πвзаимодействия. Рисунок 2.7. Примеры координационных взаимодействий ионов металлов с органическими соединениями, (а) ЭДТА, (б) краун-эфирами. 3. Типы удерживания в жидкостной хроматографии «Тут в плане выяснения механизмов сорбции важно помнить, что обычно наука не делается ради науки. Знание механизма, хотя бы в первом приближении, ценно в плане практике тем, что позволяет целенаправленно делать какие-то телодвижения по улучшению разделения, формы и асимметричности пика, экспрессности анализа. А в некоторых случаях позволяет и предсказать (пусть даже не на 100%) результат эксперимента, а значит – экономить силы, время и средства за счет исключения необходимости проведения заведомо бесперспективных экспериментов, а также бессистемного варьирования состава элюента в надежде методом «научного тыка» найти оптимальный вариант разделения. Далее, важно видеть за всей цифровой эквилибристикой физический смысл получающихся зависимостей и границы применимости предлагаемых моделей». Леонид В. Сапрыкин, аналитический форум www.anchem.ru «Мы обнаружили, что всякое состояние в мире может быть представлено в виде суперпозиции (линейной комбинации с подходящими коэффициентами) базисных состояний. Вы вправе спросить, во-первых: каких именно базисных состояний? Что ж, возможностей тут немало… Имеется очень-очень много различных представлений – аналогов различных систем координат, которые можно применять для представления обычных векторов. Затем можно спросить: с какими коэффициентами их брать? А это уж зависит от физических обстоятельств. Различные совокупности коэффициентов отвечают различным физическим условиям. Здесь важно знать одну вещь – «пространство», в котором вы работаете, иными словами, знать, что эти базисные состояния означают физически. Так что первое, что вы, вообще говоря, должны знать, – это на что похожи базисные состояния. Тогда вам станет понятно, как описывать положение вещей на языке этих базисных состояний». Ричард Фейнман, «Фейнмановские Лекции по Физике» Приведенные типы межмолекулярных взаимодействий можно рассматривать как своего рода «базис», язык для описания свойств хроматографической системы. С этой точки зрения, любая хроматографическая система, теоретически, могла бы быть описана путем суперпозиции типов физико-химических взаимодействий с какими-либо коэффициентами. На поверку, однако, оказывается, что моделирование на этом уровне обречено на неудачу, если речь идет не об однойдвух наиболее «простых» хроматографических системах, а о десяти или ста системах, причем достаточно «сложных». Основная причина сложности моделирования на уровне типов взаимодействий (или, как их называют на «хроматографический» лад, механизмов удерживания) заключается в том, что, вопервых, физические модели этих взаимодействий являются слишком простыми фактически и слишком сложными рассчетно; во-вторых, проверка этих моделей, как правило, осуществляется на наиболее «простых» системах, специально подобранных для этих целей. На практике же «простые» системы встречаются редко; в большинстве хроматографических систем удерживание и селективность определяются целым комплексом межмолекулярных взаимодействий, которые нельзя разделить на составляющие их типы ни экспериментально, ни умозрительно, и тем более нельзя определить загадочные коэффициенты (см. эпиграф). Таким образом, описание свойств хроматографических систем на языке типов межмолекулярных взаимодействий (механизмов удерживания) являются недостаточно удобным и практичным (здесь эти прилагательные звучат как синонимы). Идея выхода из трудной ситуации следует из наблюдения, что различные типы межмолекулярных взаимодействий наиболее часто встречаются в хроматографических системах лишь в определенных сочетаниях, а в каких-то сочетаниях не встречаются совсем. Более того, приемлемых сочетаний такого рода существует на практике весьма ограниченное количество. Назовем модель некоторого «часто встречающегося» в хроматографических системах сочетания типов межмолекулярных взаимодействий термином «тип удерживания». Это будет являться не точным определением, а, для начала, первым, грубым приближением. Следующий важный вопрос, на который следует исчерпывающе ответить, звучит так: «Что же определенный таким образом тип удерживания будет означать на практике?» Допустим, проведено хроматографирование некоторого (довольно представительного) набора адсорбатов на одной неподвижной фазе, но при различных подвижных фазах. В результате, пусть наблюдается, что, несмотря на различную элюирующую силу (соответственно, различное удерживание), все примененные подвижные фазы обеспечивают неизменную селективность системы по отношению к выбранной группе адсорбатов. Этот факт прежде всего свидетельствует о том, что в разных хроматографических системах удерживание адсорбатов обусловлено теми же физико-химическими взаимодействиями, величина которых если и изменилась (точнее, действительно изменилась, так как изменилось удерживание), то для всех адсорбатов пропорционально, – ведь селективность осталась неизменной. Сделаем второе, и последнее, допущение: что коэффициенты емкости (или исправленные времена удерживания) адсорбатов изменяются в ряду, хорошо соответствующем какому-либо их физико-химическому свойству, независимо определенному, или рассчитанному не из хроматографических данных. Этот факт может свидетельствовать о том, что один из типов межмолекулярных взаимодействий является в этом случае доминирующим. В жидкостной хроматографии существуют всего несколько видов систем, отвечающих двум указанным выше условиям в достаточно широких рамках изменения химии неподвижной фазы и состава подвижной фазы. Назовем такие хроматографические системы «базовыми». Все дальнейшее изложение будет построено, исходя из такого утверждения: тип удерживания – это модель удерживания в базовой хроматографической системе. Это второе, более точное, определение типа удерживания, уже сочетающее в себе теорию жидкостной хроматографии с ее практикой. Согласно этому определению, понятие типа удерживания, с одной стороны, привязывается к характерному порядку элюирования, селективности, свойственным определенным типам хроматографических систем. С другой стороны, тип удерживания – это также определенное «сочетание» различных межмолекулярных взаимодействий. Разработанная модель удерживания предполагает обладание как можно большей информацией о хроматографической системе: о структуре поверхности неподвижной фазы, характере взаимодействий адсорбата с подвижной фазой, строении адсорбционного комплекса и т.д. Значительно удобнее говорить о жидкостной хроматографии на языке «типов удерживания», чем на языке «типов взаимодействий». Особо следует отметить, что, как будет показано далее, тип удерживания является четко определяемой экспериментально, количественной характеристикой хроматографической системы, в отличие от гипотетических качественных (большей частью) типов взаимодействий, или механизмов удерживания. Тип удерживания, выраженный количественно, далее будем называть дескриптором удерживания. Если попытаться определить «тип удерживания» коротко, то получится такое определение: «Тип удерживания – это модель системы, в которой реализуется определенный комплекс физикохимических взаимодействий, на практике проявляющийся как линейно независимая тенденция изменения селективности хроматографической системы». 3.1. Логическая связь между типом удерживания и видом хроматографии Для жидкостной хроматографии можно выделить следующие основные типы удерживания: нормально-фазовый, обращенно-фазовый, ионообменный, лигандообменный, квази-нормальнофазовый, эксклюзионный. В принципе, в отдельные типы можно выделить ион-парные (нормальнофазовый, квази-нормально-фазовый, обращенно-фазовый) и ион-эксклюзионный типы. Если попытаться кратко охарактеризовать каждый из типов удерживания, то получится следующая таблица. Таблица 3.1.1. Типы удерживания и их характеристики. Тип удерживания Нормально-фазовый Обращенно-фазовый Нормально-фазовый гидрофильной хроматографии Ионообменный Лигандо-обменный Типы физико-химических Соотносимые с Базовые хроматографические взаимодействий механизмом удерживания системы физико химические свойства адсорбатов Диполь-дипольные (диполь- Дипольные моменты НФ: силикагель, ПФ: гександиоксан-уксусная к-та, полевые), образование адсорбаты: бензойные кислоты водородных связей Дисперсионные «сольвофобные» («гидрофобные») и Коэффициенты НФ: С18 модифицированный распределения в системе силикагель, ПФ: ацетонитрилвода, адсорбаты: «октанол-вода», бензолы, растворимость в различных монозамещенные водно-органических системах ароматические углеводороды в Образование водородных НФ: NH2 модифицированный связей силикагель, ПФ: ацетонитрилвода, адсорбаты: полиспирты, сахара Ион-ионные и ион-дипольные «Эффективная» плотность НФ: ион-обменные фазы на заряда иона основе крупнопористого силикагеля, «слабого» и «сильного» типов, ПФ: водный буфер, адсорбаты: однозарядные неорганические ионы, или произвольные ионы (при фиксированном рН) Координационные Константы диссоциации взаимодействия комплексов Квази-нормальнофазовый π-взаимодействия Эксклюзионный - Энергия перехода с НФ: сверхсшитый полистирол, переносом заряда в π- ПФ: гексан-хлороформ; комплексе адсорбата с НФ НФ: фазы Пиркловского типа, бензоилированные (карбомоилированные) полисахариды, ПФ: гексанизопропанол; адсорбаты: монозамещенные бензолы, ароматические углеводороды Эффективный размер НФ: крупнопористый силикагель, молекулы аналита ПФ: хлороформ, аналиты: стандарты полистирола Из таблицы видно, что практически каждому механизму удерживания, определенному таким образом, можно поставить в соответствие базовую хроматографическую систему, в которой бы он встречался в наиболее чистом виде. В такой базовой системе селективность разделения сравнительно нечувствительна к изменениям условий хроматографирования, и может служить признаком доминирования соответствующего типа удерживания в произвольной системе. Термин «вид хроматогрфии» (или «режим хроматографии») обозначает все хроматографические системы, в которых доминирует определенный тип удерживания. В некоторых случаях, когда вклады двух (или более) типов становятся приблизительно равными, появляются трудности в названии режима хроматографирования. Иногда из этого затрудненительного положения выходят, называя такие режимы «смешанными» (mixed). Таблица 3.1.2. Виды жидкостной хроматографии. Вид хроматографии Типы удерживания, основной + Профиль градиента ПФ (возможные дополнительные) Нормально-фазовая Нормально-фазовый нормально-фазовый) Обращенно-фазовая Обращенно-фазовый + (нормально- Увеличение доли органического растворителя в фазовый, ионообменный) системе органический растворитель-водный буфер Гидрофильная Нормально-фазовый + (различные) Увеличение доли воды в системе органический растворитель-водный буфер Гидрофобная Обращенно-фазовый Уменьшение ионной силы в системе органический растворитель-водный буфер Эксклюзионная Эксклюзионный + (различные) - Ионная Ионообменный +(различные) Увеличение ионной силы водного буфера, изменение рН водного буфера Лигандообменная Лигандообменный + (различные) Увеличение концентрации добавки – лиганда, уменьшающего удерживание. Увеличение ионной силы водного буфера, изменение рН водного буфера Квази-нормально-фазовая Квази-нормально-фазовый + Увеличение доли органического растворителя, (обращенно-фазовый, нормально- способного к образованию π-комплексов фазовый) Аффинная хроматография, Различные «смешанные» режимы (полярный органический режим) + (квази- - - Достаточно часто в жидкостной хроматографии встречаются случаи, когда селективность произвольной системы не соответствует в точности селективности базовой системы, а в той или иной степени отклоняется от нее при изменении условий хроматографирования по определенному (возможно, априори неизвестному) правилу. Применение специального статистического метода (факторного анализа, о котором речь пойдет далее) в этих случаях дает следующий результат: в исследуемой хроматографической системе существует более одной линейно независимой тенденции изменения селективности. Основная, как правило, соответствует доминирующему типу удерживания, а дополнительная – некоторому минорному «сочетанию» типов взаимодействий (которое, возможно, еще следует интерпретировать и назвать). Достаточно опрометчиво было бы каждую такую тенденцию называть «типом удерживания»; в дальнейшем, будем называть ее фактором. Описать «сложную» хроматографическую систему можно будет, указав доминирующий тип удерживания, а также возможные дополнительные факторы, влияющие на селективность системы. Такое описание имеет важное следствие: нельзя формально утверждать, что какая-либо хроматографическая система является нормально-фазовой, обращенно-фазовой и т.д. лишь на основе марки адсорбента и состава подвижной фазы. Каждая система характеризуется определенным типом (типами) удерживания и, также возможно, некоторыми специфическими факторами, вклад которых в удерживание зависит не только от параметров системы, но также и от выборки адсорбатов. 3.2. Расчет количественных характеристик типов удерживания (дескрипторов удерживания) при помощи метода факторного анализа Факторный анализ является статистическим методом обработки экспериментальных данных. Этот метод позволяет обобщить результаты эксперимента, то есть уменьшить количество исходных экспериментальных данных без потери информативности описания изучаемой системы. Факторный анализ применяется в том случае, когда наблюдаемые параметры исследуемой системы коррелируют между собой, то есть описывают в какой-то мере сходные явления. Основное предположение, обосновывающее применение факторного анализа в хроматографии, состоит в том, что если наблюдаемые параметры (в данном случае – параметры удерживания в исследуемой хроматографической системе, log k’) коррелируют (то есть не являются линейно независимыми величинами), то они описывают некоторые тенденции изменения селективности хроматографической системы. Число таких тенденций по определению должно быть меньше, чем число наблюдаемых параметров (условие применимости факторного анализа). Эти тенденции и являются типами удерживания. Количественные характеристики типа удерживания (в дальнейшем будем называть их составляющими удерживания) не могут быть измерены напрямую, экспериментально, но могут быть математически выделены из наблюдаемых экспериментальных данных при помощи метода факторного анализа как факторы. С математической точки зрения задача нахождения факторов сводится к задаче нахождения собственных векторов матрицы корреляции исходной матрицы экспериментальных данных. Собственные векторы пропорциональны факторам, а собственные значения пропорциональны вкладам факторов в описание исходных данных. Теперь более подробное объяснение. Рассмотрим такую ситуацию: исходные экспериментальные данные представляют собой матрицу (таблицу) размерности mXn, где m – число строк (объектов), n – число столбцов (параметров). Параметры можно представить как n векторов в m-мерном пространстве объектов. Взаимозависимость двух параметров (их «похожесть») выражается коэффициентом корреляции, который геометрически можно представить как косинус угла между векторами-параметрами. Таким образом, несколько сильно коррелированных параметров выглядят в пространстве объектов как пучок векторов. Рисунок 3.2.1. Параметры (1,2,3,4) в пространстве объектов (A,B,C,D,E) Метод факторного анализа позволяет выделить наименьшее количество r некоторых новых линейно независимых параметров, которые могут описать систему практически так же хорошо, как и n экспериментальных параметров. Эти линейно независимые параметры, полученные из экспериментальных данных расчетным путем, называются факторами. Факторы можно представить как ортогональный базис (прямоугольную систему координат), по которому можно каждый экспериментальный параметр разложить на r составляющих. Геометрически коэффициенты такого разложения соответствуют проекциям параметров-векторов на оси-факторы, и называются факторными нагрузками (factor loadings). Матрица факторных нагрузок представляет собой таблицу размерности rXn. Рисунок 3.2.2. Параметры (1,2,3,4) в пространстве факторов (F1,F2) В пространстве объектов полученные факторы выглядят как m-мерные векторы. Матрица размерности mXr, состоящая из проекций факторов на оси объектов, и называется, собственно, матрицей факторов (factor scores). Рисунок 3.2.3. Факторы (F1,F2)в пространстве объектов (A,B,C,D,E). Таким образом, исходная матрица экспериментальных данных может быть представлена в виде произведения матрицы факторов на матрицу факторных нагрузок. Математическая процедура нахождения факторов состоит из нескольких этапов. На первом этапе исходная матрица Y = (yij) нормируется по правилу zij = (yij - yiav)/si , где yiav – среднее по столбцам, si – среднеквадратическое отклонение по столбцам; и, таким образом, преобразуется в стандартную матрицу Z = (zij). На втором этапе из матрицы Z = (zij) вычисляется матрица корреляции R размерности nХn, состоящая из коэффициентов корреляции экспериментальных параметров между собой. На третьем этапе находятся собственные векторы матрицы корреляции R, удовлетворяющие уравнению Rαl = λlαl, где λl – собственные значения матрицы корреляции, αl – искомые собственные векторы. Факторные нагрузки пропорциональны собственным векторам матрицы корреляции: ail = αil (λl/α21l + α22l + … + α2ml)1/2, а вклады факторов пропорциональны собственным значениям. Далее из матрицы факторных нагрузок может быть вычислена и матрица факторов P, поскольку, как уже было сказано, исходная матрица есть произведение матрицы факторов на матрицу факторных нагрузок zij = ai1p1j + ai2p2j + … + airprj, или Z = AP. Метод факторного анализа реализован во многих статистических программных пакетах, к примеру, STATISTICA 5.0 (StatSoft). Факторный анализ зарекомендовал себя как плодотворный метод исследования систем различных типов. Его применение позволяет получить ответы на несколько наиболее важных вопросов об изучаемой системе, среди которых можно выделить следующие. 1. Какое минимальное количество линейно независимых параметров необходимо для описания системы. 2. Как группируются наблюдаемые параметры (характеристики системы). 3. Как группируются объекты наблюдения. В некоторых исследованиях наличие подобной первоначальной информации о системе является достаточным условием выполнения поставленной задачи. В этих случаях цель, как правило, состоит в группировке параметров и объектов согласно их свойств (кластерный анализ), то есть просто в систематизации имеющихся данных. В более широком плане факторный анализ может применяться как метод формулирования и проверки новых гипотез. В этом случае факторы рассматриваются как дескрипторы, описывающие определенные тенденции к изменению наблюдаемых характеристик системы. Задача исследователя состоит прежде всего в планировании необходимого эксперимента и грамотной интерпретации получаемых дескрипторов-факторов. Интерпретацию факторов обычно проводят, рассматривая значения факторов и факторных нагрузок, а также проводя корреляции между факторами и какими-либо независимо определенными свойствами объектов или/и параметров. Следует отметить, что факторный анализ может применяться только в том случае, когда исследуемая система переопределена наблюдаемыми параметрами, то есть когда в исходной матрице заведомо содержится избыток информации о системе. При недостатке информации количество факторов всегда равно числу параметров, то есть применение факторного анализа не дает никакого результата. Понятие «системы» всегда определяется самим исследователем – так же, как и выбор наблюдаемых характеристик системы и объектов наблюдения. Факторный анализ не может дать информации о системе больше, чем изначально заложено в матрице экспериментальных данных. По этой причине, эксперимент необходимо проводить таким образом, чтобы при минимуме затрат он обеспечивал максимум информации об исследуемой системе. Итак, для определения составляющих удерживания для ряда схожих хроматографических систем необходимо: 1. Измерить ряд величин удерживания для выборки адсорбатов в исследуемых системах. Варьировать можно и состав подвижной фазы, и неподвижные фазы. Однако, чем больше разнородных систем входит в эксперимент, тем все большее число факторов выделяется в результате, и тем менее очевидны получаемые закономерности (и воспроизводимы составляющие удерживания). В качестве экспериментально определяемой величины удобно применять логарифм фактора емкости ln k’. Эта характеристика удерживания является безразмерной величиной, пропорциональной изменению энергии Гиббса при адсорбции (при определенной температуре и, строго говоря, давлении). 2. Расположить экспериментальные данные в таблицу (матрицу): параметры (столбцы) должны соответствовать различным хроматографическим системам, а объекты (строки) – различным адсорбатам. 3. Провести обработку данных методом факторного анализа; выделить основные факторы. 4. Основываясь на первоначальных предположениях, интерпретировать полученные факторы как определенные составляющие удерживания. Что может произойти не всегда – шансы успешно интерпретировать результаты повышаются, если в эксперимент включаются только схожие системы (к примеру, варьируется лишь состав подвижной фазы при неизменной неподвижной). С помощью этого метода можно отслеживать закономерности изменения селективностей хроматографических систем в рамках заданных условий эксперимента. На основании корреляции с селективностями базовых систем факторы можно приписывать к соответствующим типам удерживания и, таким образом, находить вклады (составляющие) различных типов удерживания в общее удерживание. Динамику изменения вкладов в зависимости от состава элюента можно проследить, к примеру, следующим образом: 1. получить ln k’ для десяти составов элюента (десять параметров) и расположить их в порядке изменения концентрации одного из компонентов; 2. составить из десяти параметров шесть матриц по пять параметров, на каждом шаге исключая по одному параметру «слева» и добавляя один параметр «справа»; 3. с помощью факторного анализа получить шесть значений вклада определенного типа в удерживание и отложить их по оси ординат; на оси абсцисс каждому значению вклада должна соответствовать концентрация выбранного компонента элюента, взятая «в середине» матрицы. 3. Типы удерживания в жидкостной хроматографии 3.3. Нормально-фазовый тип удерживания в нормально-фазовой хроматографии Нормально-фазовый тип удерживания является доминирующим как в нормально-фазовой, так и в гидрофильной хроматографии. Нормально-фазовая хроматография соответствует ситуации, когда разделение проводится на полярной неподвижной фазе при применении неполярного элюента. Основой нормальнофазовых подвижных фаз обычно является алифатический углеводород, к примеру, гексан, обладающий чрезвычайно слабой элюирующей силой. Полярный компонент подвижной фазы, обладающий элюирующей силой, называется полярной добавкой. Удерживание в нормальнофазовом режиме уменьшается при увеличении доли полярной добавки в подвижной фазе. Как правило, порядок элюирования для различных нормально-фазовых систем одинаков в случаях разделений даже достаточно больших выборок адсорбатов (рис. 3.3.1), однако селективноть разделения может быть существенно отличаться. Более того, для нормальнофазовых систем вообще свойственна гибкость (flexibility): способность изменять селективность в зависимости от условий хроматографирования. При должном подходе селективностью системы можно управлять, варьируя состав подвижной и (в крайнем случае) тип неподвижной фазы, тем самым добиваясь оптимального разделения. Резко изменить селективность нормально-фазовой системы можно двумя способами. Рисунок 3.3.1. Бензойная к-та, фенилпропионовая к-та, фенол. Колонки 150×3 5μm. Элюент: гексанизопропанол-уксусная к-та 95:2:3. Сверху вниз: (а) Separon SGX, (б) Separon NH2, (в) Separon CN. На всех трех фазах селективность разделения практически одинакова, хотя величина удерживания различна. Один из способов состоит в замене неподвижной фазы: к примеру, силикагеля нитрильную фазу или аминофазу, или наоборот (рис. 3.3.2). Рисунок 3.3.2. Хроматограммы образца продукта синтеза соединения бенздиазепина-S, нормальнофазовый вариант: вверху – на силикагеле, внизу – на цианопропилированном силикагеле (нитрильная фаза). Условия хроматографирования: колонки 80×2 Separon SGX и Separon CN, элюент гексан-хлороформ-изопропанол 76:20:4. При переходе на нитрильную фазу начальный участок хроматограммы «растягивается» (увеличивается удерживание и разрешение слабоудерживаемых компонентов) при неизменном времени выхода последнего пика и , соответственно, одинаковом времени анализа. Применение силикагеля и диольной фазы (особенно, обладающих высокой удельной поверхностью) оправдано тогда, когда в пробе необходимо определить лишь одно вещество, максимально эффективно разделив его от «примесей» (с технической стороны, в этих случаях желательно применять предколонку для защиты основной колонки). Другой способ состоит в применении в качестве одной из полярных добавок сильно (а главное – избирательно) сольватирующего растворителя, к примеру, алифатического спирта. С помощью такого приема можно значительно улучшить селективность разделения адсорбатов, не содержащих гидроксильных групп, от гидроксил-содержащих адсорбатов: удерживание первых изменяется плавно, а удерживание последних резко уменьшается при увеличении доли сольватирующего растворителя, «гасящего» их дипольные моменты (рис. 3.3.3). При этом следует помнить, что в этом случае, вообще говоря, селективность разделения соединений, содержащих гидроксильные, амидные и другие полярные группы, параллельно уменьшается (в хиральной хроматографии уменьшается также селективность разделения энантиомеров), поскольку адсорбционные свойства сольватных комплексов более схожи, чем адсорбционные свойства несольватированных соединений. По этой же причине не стоит применять алифатические спирты в качестве полярных добавок при хроматографировании структурно подобных среднеполярных соединений. Плавного изменения селективности нормально-фазовой системы можно добиться или путем замены полярной добавки (на растворитель, относящийся к другому классу соединений: спирт на эфир, простой эфир на сложный, эфир на хлорорганический растворитель и т.д.), или применяя смешанные полярные добавки. Применение хлорорганических растворителей (хлороформ, хлористый метилен), образующих с ароматикой слабые комлексы с переносом заряда, оправдано при разделении ароматических соединений. Для разделения полярных соединений желательно применять в качестве полярных добавок эфиры и кетоны (диоксан, ТГФ, этилацетат, ацетон – примерно в порядке уменьшения частоты применения), для разделения комплекса средне и сильнополярных соединений – спирты. Рисунок 3.3.3. Резкое уменьшение удерживание гидроксил-содержащих соединений (фенол и хинин) относительно других соединений (никотин, фенилпропионовая и бензойная к-ты) при уделичении доли спирта в неполярном элюенте. 150×3 Separon SGX, 5 μm. Элюенты гексанизопропанол-ТЭА-уксусная кислота, сверху вниз – 10, 20 и 30% изопропанола в элюенте. Третьим «стандартным компонентом» нормально-фазовой системы, помимо неполярной основы и полярной добавки, является модификатор. Сразу же следует подчеркнуть, что модификатором также называется любой органический растворитель в обращенно-фазовой хроматографии (так уж сложилось исторически), и эти два «модификатора» не следует путать. В нормально-фазовой хроматографии модификатором называется чрезвычайно полярное вещество, значительно изменяющее адсорбционные свойства полярной неподвижной фазы. В частности, наиболее часто используется свойство модификатора «дезактивировать» полярную фазу, то есть уменьшать ее способность к образованию сильных водородных связей. Если доля полярной добавки может быть сравнима и даже больше доли неполярной «основы», то доля модификатора в подвижной фазе обычно невелика: от сотых процента до нескольких процентов. Рисунок 3.3.4. Никотин, фенол, хинин. 150×3 Separon NH2 5 μm. Элюент гексан-изопропанол-ТЭАуксусная кислота 90:10:0.1:0.1. В качестве модификатора чаще всего применяется уксусная кислота (ее применение обязательно при разделении соединений кислого характера), реже – муравьиная кислота, вода. В случаях разделения сильнополярных веществ основного характера в качестве модификатора применяют алифатические амины (диэтиламин, триэтиламин) (рис. 3.3.4), комбинируют триэтиламин и уксусную кислоту; триэтиламин, уксусную кислоту и воду; применяют водные растворы ацетата аммония и т.д. При применении комплексных модификаторов следует помнить, что концентрация солей в неполярном элюенте должно быть минимальным. Даже если элюент выглядит гомогенным, соли могут выпасть в осадок на колонке. Так, при применении элюента гексан-изопропанол-водауксусная кислота-триэтиламин 60:40:2.5:0.75:0.2 для разделения азотистых оснований (рис. 3.3.5) на силикагеле было замечено, что давление в системе непрерывно растет, и становится недопустимым всего через две недели работы. При этом эффективность и симметрия пиков оставались отличными. По всей видимости, выход колонки из строя был обусловлен выпадением в осадок на колонке ацетата триэтиламмония. Таким образом, для нормальной работы концентрацию уксусной кислоты и триэтиламина следовало бы уменьшить как минимум в десять раз. Рисунок 3.3.5(а). 150×3 Separon SGX 5μm. Гексан-изопропанол-вода-ТЭА-уксусная кислота 60:40:2.5:0.75:0.2. 1 – никотиновая к-та, 2 – пиндолол, 3 – N-ацетилтриптофан, 4 – алпренолол, 5 – фенол, 6 – бензойная к-та, 7 – дитиазем, 8 – прометазин. Рисунок 3.3.5(б). Структурные формулы адсорбатов. При применении нормально-фазовых систем с добавкой модификатора удерживание среднеполярных соединений хорошо описывается моделью «диполь-полевого» взаимодействия (уже упоминавшейся в разделе по дипольным взаимодействиям). Основное предположение модели состоит в выполнении условия адсорбционной модификации неподвижной фазы по отношению к хроматографируемым адсорбатам; это условие означает, что адсорбаты не могут «пробить» адсорбционный слой модификатора, и, таким образом, не способны образовывать сильные водородные связи с силикагельной «матрицей». Согласно «диполь-полевой» модели, удерживание происходит за счет взаимодействия диполей сольватных комплексов адсорбатов с электрическим полем адсорбционно модифицированной неподвижной фазы. В этом случае логарифмы факторов емкости (или исправленных времен удерживания) адсорбатов напрямую зависят от дипольных моментов адсорбатов, измеренных в подходящем растворителе. Другими словами, при применении нормально-фазовых систем с добавкой модификатора удерживание среднеполярных адсорбатов обусловлено только их дипольными моментами (точнее, дипольными моментами их сольватных комплексов). Это свойство может быть использовано в качестве критерия доминирования нормально-фазового механизма удерживания на любой неподвижной фазе в любой (вообще говоря, достаточно неполярной) среде, – надо лишь договориться о «стандартной» выборке тестовых адсорбатов, и, желательно, о примерном составе подвижной фазы для базовой системы. Например, в качестве тестовых адсорбатов можно применять замещенные бензойные кислоты; хроматографирование можно проводить, применяя подвижную фазу «гексан-пропионовая кислота» в необходимом для полного элюирования соотношении. Корреляция логарифмов факторов емкости бензойных кислот, аппроксимированных к нулевой концентрации полярной добавки, с их дипольными моментами будет, таким образом, являться признаком доминирования нормально-фазового механизма удерживания в хроматографической системе. Список соединений, для которых измерен дипольный момент, ограничен; таким образом, только в редких случаях при прогнозировании удерживания можно надеяться на наличие литературных данных по дипольным моментам адсорбатов (правда, некоторые пакеты расчетных химических программ позволяют оценить дипольный момент практически любого соединения). Как правило, для приблизительной оценки удерживания в нормально-фазовых хроматографических системах адсорбатам приписывается некоторое свойство, характеризующее способность соединения вступать в дипольные взаимодействия и образовывать водородные связи; это свойство называется «полярностью». Полярность – это скорее качественная характеристика, в отличие от дипольного момента, являющего характеристикой количественной. Соединения с большей полярностью сильнее удерживаются на полярных неподвижных фазах. Полярность адсорбата можно связать с наличием в его структуре определенных функциональных групп. Учитывая специфику удерживания в нормально-фазововых условиях, функциональные группы можно расположить в следующий ряд в порядке увеличения их полярности: -Cl, -Br < -Ar < -OR < -NO2 < -COOR < =C(O) < -COOH* < -NH2*, -OH < -CN < -NHC(O)R* << -SO3H* Звездочкой отмечены те функциональные группы, которые способны образовывать сильные водородные связи; наличие таких групп в структурах адсорбатов приводит к необходимости применять для их хроматографирования нормально-фазовые системы с адсорбционным модифицированием неподвижной фазы. Кроме того, для этих групп не соблюдается аддивность их вкладов в «полярность»: наличие еще одной полярной функциональной группы в дополнение к уже имеющейся приводит к резкому увеличению удерживания в нормально-фазовых условиях. К примеру, бензойная кислота (с одной карбоксильной группой) легко элюируется с силикагеля 1% уксусной кислотой в гексане, а для элюирования фталевых кислот (с двумя карбоксильными группами), или миндальной кислоты (с карбоксильной и гидроксильной группами) требуются элюенты с предельно большой (для нормально-фазовой хроматографии) элюирующей силой: хлороформ-вода-уксусная кислота, или гексан-изопропанол-вода-уксусная кислота. Полярность растворителей, применяемых в нормально-фазовой хроматографии для составления подвижных фаз, также является важным параметром, поскольку позволяет прогнозировать их элюирующую силу. Существуют несколько критериев полярности растворителей, среди которых следует упомянуть следующие: диэлектрическую проницаемость, дипольный момент, произведение диэлектрической проницаемости на квадрат дипольного момента, общий параметр полярности Снайдера и три его составляющих (характеризующих способность соединения к диполь-дипольным взаимодействиям и образованию водородных связей как донора и акцептора протона), параметр растворимости Гильдебрандта, сольватохромный параметр, а также непосредственно параметр элюирующей силы, оцененный для многих растворителей. Ряд растворителей, расположенных в порядке увеличения элюирующей силы, называется элюотропным рядом. Усредненный параметр элюирующей силы больше всего подходит для оценки реальной способности растворителя элюировать полярные адсорбаты, хотя в ряде случаев такая оценка может быть весьма неточной. (Одним из таких примеров является «аномально» высокая элюирующая способность спиртов по отношению к гидроксилсодержащим соединениям. По всей видимости, «аномалии» встречаются в тех случаях, когда сольватный комплекс адсорбатов имеет достаточно сложное строение.) По некоторым мнениям, недостаточная предсказательная ценность параметра элюирующей силы объясняется в основном тем, что он был разработан, исходя из «вытеснительной модели» адсорбции; в результате, параметр элюирующей силы для силикагеля или окиси алюминия характеризует не реальную элюирующую силу как таковую, а способность полярного растворителя к адсорбционной модификации полярной неподвижной фазы. 3.4. Нормально-фазовый тип удерживания в гидрофильной хроматографии Нормально-фазовый тип удерживания может быть реализован на полярных фазах при применении не только неполярных, но также и полярных подвижных фаз, содержащих в своем составе воду. Основой подвижных фаз в этом случае является органический растворитель, смешивающийся с водой: ацетонитрил или, значительно реже, метанол. Полярной добавкой является вода. Такой вид хроматографии в зарубежной печати называется «гидрофильной хроматографией» (HILIC, HydrophILic Interaction Chromatography). Примечательно, что этот термин появился сравнительно недавно, хотя хроматография была открыта Цветом именно на системах такого типа (неподвижная фаза – известняк, подвижная фаза – этанол-вода). Гидрофильная хроматография применяется для разделения чрезвычайно полярных веществ: полиспиртов, сахаров, гликозидов, органических кислот, аминокислот, полипептидов, фармацевтических препаратов. Чем более полярно вещество, тем сильнее оно удерживается в этом режиме. Для сахаридов и гликозидов удерживание увеличивается при увеличении количества углеводных единиц в молекуле. Рисунок 3.4.1. Разделение УФ-поглощающих аминокислот и пептидов в экстракте рога сайгака. 150×3 Separon NH2 5 μm. Ацетонитрил-вода 80:20. УФ 254 нм. Рисунок 3.4.2. Анализ примеси 5-фторурацила в 5-фторцитозине. 250х4.6 Zorbax NH2. Ацетонитрил-(25мМ кислый фосфатный буфер рН 6.5) 80:20. B.A.Olsen/J.Chromat.A. 913 (2001) 113122. Удерживание адсорбатов в гидрофильной хроматографии происходит, если говорить в общих чертах, за счет образования сильных водородных связей. Механизм удерживания в гидрофильной хроматографии пока исследован недостаточно хорошо. Считается, что вода образует на поверхности полярной фазы тонкую пленку, и полярные молекулы распределяются между водной пленкой и относительно менее полярной подвижной фазой. Таким образом, в системе реализуются «сольвофобные взаимодействия наоборот»: полярные адсорбаты не только взаимодействуют с адсорбентом за счет водородных связей, но также вытесняются из обедненной водой подвижной фазы в обогащенную водой пленку на поверхности адсорбента. Для хроматографирования в большинстве случаев применяются силикагель и аминофаза, хотя существуют также и другие полярные фазы для гидрофильного режима (они будут рассмотрены в соответствующем разделе). В случае применения силикагеля для разделения нейтральных соединений нормальнофазовый тип удерживания является доминирующим. Если же адсорбатами являются частично ионизированные вещества, то наряду с нормально-фазовым типом удерживания может наблюдаться и ионообменный. На аминофазе оба типа удерживания имеют значительные вклады в удерживание при разделении соединений кислого характера. Режим хроматографии, который соответствует этой ситуации, иногда называют гидрофильно-ионообменным (HILIC-ion-exchange). Вклад нормально-фазового типа в этом режиме уменьшается при увеличении доли воды в элюенте и изменении его рН в сторону ионизации адсорбатов. Базовой хроматографической системой в гидрофильной хроматографии можно считать систему из силикагеля и водно-ацетонитрильного подкисленного элюента. В качестве адсорбатов удобнее всего применять гликозиды нейтральных соединений и углеводы. 3. Типы удерживания в жидкостной хроматографии 3.5. Обращенно-фазовый тип удерживания Обращенно-фазовый тип удерживания доминирует в системах, состоящих из неполярных неподвижных фаз и полярных подвижных фаз. Удерживание осуществляется за счет комплекса дисперсионных и сольвофобных взаимодействий. Подвижными фазами в обращенно-фазовой хроматографии являются системы, состоящие из водного буфера и полярных органических растворителей. Элюирующая сила подвижной фазы в обращенно-фазовом режиме возрастает с увеличением доли органического растворителя, который принято называть модификатором. В обращенно-фазовой хроматографии способность адсорбата к удерживанию характеризуется свойством гидрофобности. В первом приближении, чем лучше любое вещество растворяется в неполярных растворителях, или хуже растворяется в водных средах, тем выше его гидрофобность. Чем выше гидрофобность соединения, тем сильнее оно удерживается в обращенно-фазовых условиях. Рисунок 3.5.1. Разделение двух изомерных соединений в обращено-фазовых условиях. 250х4 LiChrospher100 RP18. Элюент ацетонитрил-буфер 60:40. Буфер – 0.5 мл триэтиламина на 100 мл воды, рН 2.8 фосфорной к-той. В соединении, которое элюируется вторым, неполярные группы расположены таким образом, занимают больше места. Соответственно, гидрофобность такого изомера выше, и его удерживание в обращено-фазовых условиях больше. Наиболее часто применяемой количественной характеристикой гидрофобности адсорбатов являются их коэффициенты распределения в двухфазной системе «октанол-вода». Коэффициент распределения равен отношению количества адсорбата в фазе октанола к количеству адсорбата в фазе воды. Если известна структурная формула соединения, то «гидрофобность» как некоторую количественную величину можно вычислить по одной из нескольких существующих аддитивных схем, суммируя известные инкременты (вклады) функциональных групп в удерживание. Термин «гидрофобность» употребляют также применительно к неподвижным обращенным фазам для сравнения их способности удерживать соединения в обращенно-фазовых системах. Количественно величину «гидрофобности неподвижной фазы» можно выразить как удерживание некоторого (желательно, не слишком полярного) соединения в произвольной обращенно-фазовой хроматографической системе. Обращенно-фазовые хроматографические системы применяются в современной аналитической практике наиболее часто. Одна из причин заключается в той относительной простоте, с которой можно предсказывать порядок элюирования адсорбатов, который в общем случае совпадает с рядом увеличения величины их «гидрофобности». Другая причина состоит в том, что обращенно-фазовые системы обеспечивают высокую воспроизводимость селективности разделений, которая, как правило, не изменяется значительно не только при варьировании состава подвижных фаз, но и при переходе на другие, но аналогичные, неподвижные фазы. Другими словами, обращенно-фазовые системы являются негибкими, и порядок элюирования в этих системах фактически фиксирован – даже для тех выборок адсорбатов, которые включают соединения совершенно различных классов. «Негибкость» обращенно-фазовых систем в определенных случаях является не меньшим преимуществом, чем «гибкость» для систем, к примеру, нормально-фазовых. Применение гибких систем целесообразно в случае проведения каких-то исследовательских работ, или для специальных приложений – то есть тогда, когда необходимо за короткое время подобрать требуемую селективность разделения одной или нескольких различных смесей соединений. Кроме того, для грамотной работы с гибкими системами требуется специалист достаточно высокой квалификации. Негибкие же обращенно-фазовые системы оптимальны для проведения рутинных определений и скрининговых анализов. Негибкость обращенно-фазовых систем можно объяснить тем, что при замене одной такой системы на другую (с иной неподвижной и подвижной фазами) величины дисперсионных и сольвофобных взаимодействий, обеспечивающих основной вклад в обращенно-фазовый механизм, изменяются практически пропорционально для адсорбатов различных типов, что приводит к изменению удерживания, но не селективности. Величина дисперсионных взаимодействий (здесь и далее под дисперсионными взаимодействиями подразумеваются «неспецифические» σ-взаимодействия) не зависит напрямую ни от состава подвижной фазы, ни от температуры. Для данной неполярной фазы и данного адсорбата величина дисперсионных взаимодействий является вообще постоянной, если только изменение условий хроматографирования не приводит к изменению физической структуры адсорбента (структуры привитого слоя или полимерной матрицы). При переходе на иные неподвижные обращенные фазы величина дисперсионных взаимодействий, естественно, изменяется, однако не произвольным образом, а приблизительно пропорционально для адсорбатов даже разных классов. Причина заключается в «неспецифичности», аддитивности дисперсионных взаимодействий, приводящих к тому, что селективность обращенно-фазовых систем становится сравнительно нечувствительной к «химии» неполярной фазы. Причина же «уникальной селективности» некоторых неподвижных фаз, формально рассматриваемых как обращенно-фазовые, состоит во вкладе в удерживание других механизмов, в дополнение к основному обращенно-фазовому (рис. 3.5.2). Рисунок 3.5.2. Вверху: 250x4.6 Inertsil ODS (С18 силикагель), элюент ацетонитрил-вода 60:40. Внизу: 250х4.6 Chromalite 5HGN (сверхсшитый полистирол), элюент ацетонитрил-вода 90:10. 1 – ацетон, 2 – пиридин, 3 – п-хлорфенол, 4 – бензальдегид, 5 – толуол, 6 – кумол. Отличающаяся от С18 фаз селективность полистирольной фазы, по-видимому, обусловлена дополнительными π-взаимодействиями в сочетании с меньшим инкрементом алкильных групп. Ситуация с сольвофобными взаимодействиями, на первый взгляд, видится более неоднозначной; вначале может показаться, что сама модель сольвофобных взаимодействий, то есть модель выталкивания адсорбата из полярной среды, является слишком простой для описания сложных взаимодействий произвольного адсорбата с полярной подвижной фазой. Здесь на помощь приходит практическое соображение, что в подвижных фазах с достаточно высокой долей воды все склонные к сольватации адсорбаты уже предельно сольватированы. При варьировании же состава подвижной фазы изменяется лишь величина «выталкивания» из нее предельно сольватированных адсорбатов, а их адсорбционные свойства при этом остаются неизменными. Увеличение или уменьшение «выталкивания» адсорбатов из подвижной фазы приводит, соответственно, к увеличению или уменьшению их удерживания – при неизменой селективности, которая, таким образом, оказывается также сравнительно нечувствительной и к «химии» подвижной фазы. Как уже было отмечено, макро-характеристикой подвижной фазы к «выталкиванию» адсорбатов может в первом приближении служить ее поверхностное натяжение. Уменьшение поверхностного натяжения подвижной фазы достигается увеличением доли модификатора (органического растворителя) или увеличением температуры (в высокотемпературной ВЭЖХ), а увеличение – добавкой неорганических солей. Уменьшение поверхностного натяжения элюента приводит в обращенно-фазовой хроматографии к уменьшению удерживания адсорбатов. Иногда селективность обращенно-фазовой системы с С18 неподвижной фазой можно изменить, заменив модификатор на другой. К примеру, ацетонитрил можно заменить на метанол, что, как правило, приводит к увеличению селективности разделения многих полифенольных соединений. В этом случае конечная селективность устанавливается не сразу, а только за несколько часов или даже дней. По всей видимости, этот эффект связан с достаточно медленным адсорбционным перемодифицированием силикагельной матрицы, которая «открыта» у неэндкеппированных или недостаточно плотно эндкеппированных адсорбентов. Фактически, такой эффект является признаком дополнительного вклада нормально-фазового механизма в удерживание в обращенно-фазовой системе. Элюирующая сила модификаторов для обращенно-фазовой хроматографии увеличивается в ряду: метанол < ацетонитрил < этанол < изопропанол, ТГФ < хлористый метилен, хлороформ; метанол и ацетонитрил применяются чаще всего, ТГФ и длинноцепочечные спирты – реже, а хлороорганические растворители – в исключительных случаях. Существуют и единичные, но весьма любопытные, примеры разделения по обращеннофазовому механизму с применением в качестве элюентов смесей на основе гексана. Адсорбентом является специальная пористая сажа, а адсорбатами – «тяжелые» компоненты вакс. Признаком обращенно-фазового типа является то, что алифатические углеводороды элюируются в порядке увеличения количества метиленовых групп. Таким образом, разницы в дисперсионных взаимодействиях «сажа-вакса» и «вакса-гексан» оказывается достаточной для эффективного разделения. Здесь можно вспомнить и эффект адсорбции некоторых углеводородов гаптеновой фракции асфальтенами, наблюдающийся в нефтях. Базовой обращенно-фазовой системой можно считать систему из С18 неподвижной обращенной фазы и водно-ацетонитрильной (водно-метанольной) подвижной фазы. Типичным набором тестовых адсорбатов являются бензол и его гомологи, как правило, с одним неразветвленным заместителем: толуол, этилбензол, пропилбензол и т.д. Селективность (или логарифм селективности) разделения двух соседних пиков гомологов является важной характеристикой любой обращенной фазы – «метиленовой селективностью». 3.6. Ионообменный тип удерживания Ионообменный тип удерживания реализуется для ионных адсорбатов на неподвижных фазах, содержащих ионные функциональные группы. Удерживание происходит за счет ионных и ион-дипольных взаимодействий. Подвижными фазами в ионообменных хроматографических системах являются, как правило, водные буферы (для разделения неорганических ионов) или их системы с полярными органическими растворителями (для разделения всех типов ионов, в том числе органических). В последнем случае, при разделении органических ионов на сравнительно неполярных ионообменных фазах, значительный вклад в удерживание в дополнение к основному ионообменному может вносить также обращенно-фазовый тип удерживания. В подобных случаях, но при применении полярных ионообменных фаз в сочетании с элюентами, богатыми органическим растворителем, может проявляться нормально-фазовый тип удерживания. Элюирующая сила подвижной фазы в ион-обменном режиме возрастает с увеличением концентрации вытесняющего иона (driving ion). Если хроматографируемые адсорбаты, или ионообменный адсорбент, содержат в своей структуре способные к ионизации функциональные группы, то удерживание также зависит и от рН подвижной фазы. Допустим, что заряд адсорбента не зависит от рН; это условие выполняется на «сильных» ионообменных адсорбентах, а также на «слабых» ионообменных адсорбентах в области рН, где все функциональные группы адсорбента полностью ионизированны. В этом случае зависимость удерживания от рН определяется степенью ионизации функциональных групп адсорбатов. В катионобменных системах элюирующая сила по отношению к способным к ионизации органическим основаниям возрастает с увеличением рН, так как ионное равновесие сдвигается в сторону образования неудерживаемой молекулярной формы адсорбата. По аналогии, в анионообменной системе элюирующая сила буфера возрастает по отношению к органическим кислотам при уменьшении рН. Основанный на этом принципе метод разделения пептидов и белков в ионной хроматографии называется «хроматофокусированием (chromatofocusing) белков». В условиях градиентного элюирования с изменением рН белки элюируются в порядке изменения их изоэлектрических точек. «Слабая» ионообменная фаза, применяемая в этом случае, должна быть полностью ионизирована во всем интервале рН подвижной фазы. Рассмотрим другой случай, когда заряд адсорбата не зависит от рН (во всей или некоторой области), а удерживание определяется степенью ионизации фунциональных групп «слабого» ионообменного адсорбента. Здесь наблюдается обратная зависимость: удерживание оснований уменьшается при уменьшении рН, так как уменьшается заряд «слабого» катионообменного адсорбента; удерживание кислот на слабом анионообменном адсорбенте, соответственно, уменьшается при увеличении рН подвижной фазы. Фактически, регулирование удерживания в этом случае достигается за счет изменения адсорбционной емкости неподвижной фазы (следовательно, и ее заряда). По этой причине, максимальная возможная нагрузка в этих условиях чрезвычайно чувствительна к рН пробы, который должен соответствовать начальному составу элюента (при градиентном элюировании). Влияние на зависимость удерживания от рН в ионной хроматографии может также оказывать ионные равновесия вытесняющего иона, если он является многоосновным и/или слабодиссоциирующим. Селективность разделения по ионообменному механизму зависит от природы ионных функциональных групп адсорбента. На «сильных» ионообменных адсорбентах ряд элюирования неорганических ионов одинакового заряда совпадает с рядом изменения их «эффективных» радиусов, то есть радиусов сольватированных ионов – удерживание адсорбата увеличивается при уменьшении его «эффективного» радиуса. В этом случае функциональные группы адсорбента и адсорбаты пространственно разделены слоем растворителя, и в системе реализуются ион-ионные взаимодействия гидратированных ионных адсорбатов и гидратированных ионных групп ионобменного адсорбента. При переходе к «слабым» ионообменным адсорбентам, ряд элюирования неорганических ионов одного знака, как правило, в той или иной степени отличается от ряда изменения их «эффективных» радиусов, становясь больше похожим на ряд изменения «истинных» радиусов ионов. Этот факт можно объяснить тем, что на «слабых» ионообменных материалах возможен более тесный контакт функциональных групп адсорбента и адсорбатов, что приводит к реализации в системе ион-дипольных взаимодействий, изменяющих селективность в сторону ряда изменения «истинных» радиусов ионов. Необъясненным пока остается свойство специальных анионообменных адсорбентов на основе полистирола с трет-бутильным заместителем при аминогруппе – проявлять повышенную селективность к нитрат-аниону. Базовой ионообменной системой можно считать хроматографическую систему, состоящую из «сильной» ионообменной неподвижной фазы на основе силикагеля и водного буфера в качестве подвижной фазы. Тестовыми адсорбатами могут являться однозарядные неорганические ионы. Рисунок 3.6. IonPac AS20. Градиент от 5мМ до 55мМ гидроксида калия. 1 – фторид, 2 – ацетат, 3 – бутират, 4 – формат, 5 – хлорит, 6 – бромат, 7 – хлорид, 8 – нитрит, 9 – хлорат, 10 – бромид, 11 – нитрат, 12 – карбонат, 13 – сульфат, 14 – селенат, 15 – оксалат, 16 – фталат, 17 – фосфат, 18 – хромат, 19 – иодид, 20 – арсенат, 21 – цитрат, 22 – тиоцианат, 23 – перхлорат. www.dionex.com 3.7. Лигандообменный тип удерживания Лигандообменный тип удерживания реализуется для адсорбатов, образующих в условиях хроматографирования лабильные комплексы с координационно ненасыщенными ионами (атомами) металлов, иммобилизованных на адсорбенте. Примечательно, что в твердом состоянии такие комплексы могут быть вполне устойчивыми соединениями. Удерживание осуществляется за счет координационных взаимодействий; соответственно, оно увеличивается в ряду увеличения констант устойчивости комплексов адсорбатов. Изменение элюирующей силы подвижных фаз достигается изменением концентрации в подвижной фазе добавки-лиганда, или коодинирующего иона металла, а также варьированием широкого спектра условий, влияющих на комплексообразование, в том числе ионной силы и рН элюента. Лигандообменный тип удерживания является доминирующим в системах, где лигандами являются адсорбаты, способные к образованию хелатных комплексов с координационно ненасыщенными ионами металлов, закрепленных на адсорбенте. Ярким примером разделения по лигандообменному типу является расщепление рацемических смесей α-аминокислот на адсорбенте с закрепленным L-гидроксипролином при применении медь-содержащих водных подвижных фаз. С другой стороны, среди типичных лигандообменных хроматографических систем немало таких, которые затруднительно подвести под какую-либо классификацию. Несмотря на наличие лигандного обмена, удерживание в них может происходить по иному механизму, или же смешанному механизму, который очень трудно разделить на «типы» даже умозрительно (насколько известно автору, таких экспериментальных попыток не производилось). Так, лигандный обмен может реализоваться в формально обращенно-фазовых системах, если адсорбаты способны к координационным взаимодействиям. Среди таких систем можно выделить три основных типа по характеру приложений. Системы первого типа в основном находят применение для разделения α-аминокислот. Обращенно-фазовый адсорбент не содержит каких-либо функциональных групп, но водноорганическая подвижная фаза содержит добавку медного комплекса какой-либо аминокислоты. Адсорбаты (α-аминокислоты) замещают лиганды в комплексе-добавке с образованием различных комплексов адсорбатов, которые непосредственно удерживаются и разделяются по обращенно-фазовому типу. Похожие системы применяются для более селективного обращенно-фазового разделения широкого круга органических соединений, способных к координационным и π-d взаимодействиям с ионом серебра, например, гетероциклических ароматических соединений. В этом случае система отличается от «обычной» обращенно-фазовой только добавкой соли серебра в подвижную фазу. Тем не менее, иногда в таких системах можно разделить структурные изомеры ароматических соединений, которые в «обычных» обращенно-фазовых условиях элюируются совместно. Наконец, ион-парный вариант обращенно-фазовых систем (хотя эти системы уже скорее следует называть ионообменными) применяется для разделения катионов редкоземельных металлов. В этом случае подвижная фаза, кроме ион-парного реагента (додецилсульфат), также содержит хелатирующую добавку, концентрация которой нарастает в течение анализа – то есть этот метод можно назвать методом градиентной лигандообменной хроматографии. Лиганднообменными, в принципе, можно также назвать и некоторые типичные ионообменные системы. В ионной хроматографии, где ионы металлов являются адсорбатами, нередко применяют подвижные фазы с комплексообразующими добавками, улучшающими селективность разделения. С большим, однако, правом лигандообменными могут быть названы разделения катионов на формально «ионообменных» неподвижных фазах, содержащих привитые хелатирующие лиганды. В последнем случае тип удерживания уже можно уверенно называть лигандообменным. Существуют примеры, когда некоторые системы, названные лигандообменными, фактически не являются таковыми. Так, «лигандообменными во внешней сфере комплекса» называются некоторые типичные нормально-фазовые системы с применением в качестве адсорбента полярных фаз, динамически модифицированных органическими комплексами переходных металлов (такие адсорбенты применяются в хиральной хроматографии). Лигандообменным по сути является принцип удерживания ненасыщенных соединений на импрегнированных солями серебра фазах в неполярных средах за счет π-d взаимодействий. Однако, во избежание путаницы, в дальнейшем будем считать, что в этих системах удерживание происходит по квази-нормально-фазовому типу (см. далее). 3.8. Квази-нормально-фазовый тип удерживания Термин «квази-нормально-фазовый» был введен для обозначения режима хроматографирования ароматических соединений на неполярном адсорбента, сверхсшитом полистироле, неполярными подвижными фазами на основе гексана. Причина необходимости нового термина заключалась в том, что хроматографическая система «неполярный адсорбентнеполярный элюент» не соответствовала канонам разделения адсорбционных систем на «нормально-фазовые» и «обращенно-фазовые». Здесь мы будем говорить о квази-нормально-фазовом типе удерживания, имея в виду тип удерживания ненасыщенных (в том числе ароматических) органических соединений на неподвижных фазах, содержащих в своей структуре π-донорные/акцепторные фрагменты и/или координационно ненасыщенные ионы (атомы) переходных металлов, за счет образования комплексов с переносом заряда π-π и π-d типа. Рисунок 3.8.1. 250x4.6 Chromalite 5-HGN (сверхсшитый полистирол). Хроматограмма модельной смеси в различный режимах элюирования. Сверху вниз: а) Обращенно-фазовый режим, ПФ: ацетонитрил-изопропанол-вода 80:15:5; б) «Смешанный» режим, ПФ: хлористый метилен-метанол 1:1; в) Квази-нормально-фазовый режим, ПФ: гексан-хлористый метилен 80:20. При переходе из ОФ режима в смешанный наиболее очевидно исчезновение вклада алкильных групп в удерживание: кумол перемещается с третьего места на первое. При переходе от смешанного к КНФ режиму происходит обращение порядка элюирования для пары антрацен/антрахинон и резкое увеличение удерживания бензальдегида (перемещается со второго на пятое место). В случае КНФ режима удерживание адсорбатов обусловлено π-π взаимодействиями с адсорбентом. Рисунок 3.8.2. Хроматограмма полихлорированных бифенилов на колонке с пиренилмодифицированным силикагелем (см. рис. 2.6.1 PYE). Элюент – гексан. К.Kimata et al. / J.Chromat.A 786 (1997) 237-248. Удерживание адсорбатов обусловлено π-π взаимодействиями с адсорбентом. Рисунок 3.8.3. Разделение триглицеридов пальмового масла на силикагеле, динамически модифицированном нитратом серебра. Градиент толуола в гексане. S, O, L – остатки жирных кислот с 0, 1 и 2 двойными связями соответственно. P.J.W. Schuyl et al. / J. Chromatogr. A 810 (1998) 53-61. Удерживание адсорбатов обусловлено π-d взаимодействиями с ионами серебра, присутствующими на поверхности адсорбента. Вид элюотропного ряда растворителей для квази-нормально-фазового механизма удерживания достаточно сильно зависит от типа адсорбата. В общем случае, элюирующая сила растворителя зависит от его способности вступать в дипольные взаимодействия и образовывать слабые комплексы с переносом заряда. Для электрон-донорных и электрон-акцепторных адсорбатов наибольшей элюирующей силой обладают именно те растворители, которые способны вступать в диполь-дипольные взаимодействия, поскольку адсорбционные комплексы электорон-доноров и электрон-акцепторов обладают дипольным моментом. Элюотропный ряд для этого случая выглядит следующим образом (растворители расположены с порядке увеличения элюирующей силы по отношению к нитробензолу на сверхсшитом полистироле): гексан < изопропанол << толуол < ТГФ < этилацетат < ацетон < хлористый метилен. Для адсорбатов, не являющихся преимущественно ни донорами, ни акцепторами электронов, наибольшей элюирующей силой обладают растворители, способные вступать во взаимодействия с переносом заряда: ароматические и галогенированные углеводороды. Элюотропный ряд для этого случая выглядит следующим образом (растворители расположены в порядке увеличения элюирующей силы по отношению к нафталину на сверхсшитом полистироле): гексан < изопропанол << ТГФ < этилацетат < толуол < хлористый метилен. Примечательно, что очень низкой элюирующей силой обладают спирты – даже если учитывать только возможность дипольных взаимодействий. Верояно, этот факт объясняется самоассоциированием молекул спирта в гексановых растворах, что приводит к «гашению» их дипольных моментов. дихлорметан ацетон этилацетат ТГФ толуол изопропанол гексан 0 50 100 Рисунок 3.8.4(а). Элюотропный ряд, составленный согласно экспериментальным значениям lg k’ (верхние столбцы) и k’ (нижние столбцы) нитробензола при элюировании на сверхсшитом полистироле. Для гексана принято значение 0, для дихлорметана – 100. дихлорметан толуол этилацетат ТГФ изопропанол гексан 0 50 100 Рисунок 3.8.4(б). Элюотропный ряд, составленный согласно экспериментальным значениям lg k’ (верхние столбцы) и k’ (нижние столбцы) нафталина при элюировании на сверхсшитом полистироле. Для гексана принято значение 0, для дихлорметана – 100. Наиболее ярко π-взаимодействия проявляются в неполярных средах, где адсорбционные ππ и π-d комплексы наиболее устойчивы. В чрезвычайно полярных средах π-взаимодействия проявляются, вероятно, в основном лишь для ароматических углеводородов – адсорбатов, не являющихся по отношению к большинству применяемых для квази-нормально-фазовой хроматографии неподвижных фаз преимущественно ни электрон-донорами, ни электронакцепторами – поскольку их адсорбционные комплексы устойчивы в достаточной мере. Справедливость таких представлений была показана на примере удерживания различных ароматических соединений на сверхсшитом полистироле в квази-нормально-фазовом и обращенно-фазовом режимах. В обращенно-фазовом режиме на сверхсшитом полистироле селективность разделения полярных ароматических углеводородов (которые в том числе являются сильными электрон-донорами и электрон-акцепторами) фактически соответствует селективности их разделения на С18 фазах. Для ароматических углеводородов селективность разделения на сверхсшитом полистироле значительно выше, чем на С18 силикагелях (значения α-1 больше от нескольких раз до нескольких десятков раз), что является признаком вклада пи-взаимодействий для этой группы соединений. 3.9. Эксклюзионный и ион-эксклюзионный типы Эксклюзионный механизм не является адсорбционным механизмом, в этом состоит его главная особенность. Соответственно, эксклюзионный тип не является типом удерживания, – он является типом эксклюзии (исключения, «выталкивания» из пор). Разделение по эксклюзионному типу осуществляется за счет разницы в размерах молекул соединений, что приводит к различию в их способности диффундировать в поры неподвижной фазы. Молекулы с меньшим размером значительное время находятся в порах неподвижной фазы, в тогда как крупные молекулы преимущественно движутся по каналам между частицами фазы, не диффундируя в поры; в результате, молекулы небольшого размера удерживаются неподвижной фазой сильнее. Объем подвижной фазы в хроматографической колонке, то есть нулевой объем, можно представить как сумму двух объемов: объема подвижной фазы между частицами неподвижной фазы («мертвый объем») и объема подвижной фазы в порах неподвижной фазы (объем эксклюзии). В адсорбционной хроматографии неудерживаемым считается несорбируемое соединение. Несорбируемое низкомолекулярное соединение элюируется в нулевом объеме подвижной фазы, который является мерой минимально возможного удерживания. «Максимальное» удерживание в адсорбционной хроматографии ничем не ограничено, и зависит только от способности соединения адсорбироваться неподвижной фазой. В эксклюзионной хроматографии минимальное удерживание соответствует мертвому объему; в мертвом объеме элюируются крупные соединения, не способные к диффузии в поры неподвижной фазы. Молекулярная масса наименьшего соединения, которое элюируется в мертвом объеме, называется пределом эксклюзии. Эксклюзионная колонка не способна разделять соединения с молекулярными массами, большими предела эксклюзии. Максимальным удерживанием в эксклюзионном режиме обладают небольшие молекулы, которые могут проникать со все доступные поры. Максимально возможное удерживание определяется общим объемом подвижной фазы в хроматографической колонке, то есть объемом эксклюзии. Низкомолекулярные соединения, способные к диффузии во все доступные поры неподвижной фазы, элюируются в нулевом объеме. Продолжительность эксклюзионного хроматографирования равна произведению скорости подачи на нулевой объем колонки. Элюирование соединений образца с достаточно широким молекулярно-массовым распределением начинается в момент достижения мертвого объема, и заканчивается в момент достижения нулевого объема. Если мысленно представить процесс разделения по эксклюзионному типу, то станет очевидным любопытный парадокс: крупные молекулы движутся вдоль колонки быстрее, чем растворитель. Дело в том, что молекулы растворителя, как правило, небольшие и проникают во все доступные поры. В порах они не перемещаются вдоль колонки, а ведь там они находятся в течении всего времени эксклюзии! И только в течение «мертвого» времени растворитель перемещается в пространстве между частицами. Таким образом, скорость крупных молекул, которые проводят в порах гораздо меньше времени, оказывается выше, чем скорость продвижения фронта растворителя. Параметром, отражающим «эффективный» размер молекулы соединения, является логарифм его молекулярной массы. Зависимость между объемами эксклюзии и логарифмом молекулярных масс соединений, выраженная графически, называется калибровочной кривой. Калибровочная кривая является индивидуальной характеристикой для каждой марки эксклюзионной неподвижной фазы и типа образца, по которому проводится калибровка. Линейный участок на калибровочной кривой соответствует диапазону молекулярных масс, в рамках которого данная эксклюзионная фаза может применяться для анализа молекулярномассового распределения образца, то есть диапазону линейности. Тангенс угла наклона линейного участка соответствует разделительной емкости эксклюзионной колонки. Разделительная емкость выражается в миллилитрах растворителя, приходящихся на один порядок изменения молекулярной массы. Диапазон линейности и разделительная емкость являются двумя наиболее важными характеристиками эксклюзионных фаз. Диапазон линейности характеризует универсальность эксклюзионной фазы, то есть возможность ее применения для анализа полимерных образцов как можно с более широкими молекулярно-массовыми распределениями. Условие линейности выполняется в том случае, когда размер пор неподвижной фазы сопоставим с размерами эксклюдируемых соединений. Соответственно, большой диапазон линейности характерен для фаз с широким распределением пор по размеру. Увеличения диапазона линейности можно добиться тремя путями: применяя бипористые фазы, применяя смеси фаз с различным средним размером пор, а также соединяя эксклюзионые колонки, заполненные фазами с различным средним размером пор. Разделительная емкость определяет селективность эксклюзионного разделения. Величина разделительной емкости возрастает при увеличении рабочего объема эксклюзионной колонки. По этой причине эксклюзионные колонки, как правило, выпускаются в больших форматах; по этой же причине желательной характеристикой эксклюзионной неподвижной фазы является ее высокая пористость. Эксклюзионное разделение может осуществляться и на непористых частицах; в этом случае «порами» являются каналы между частицами, предельно сужающиеся к участку «стыка» последних. Разделительная емкость таких фаз, конечно же, невелика. На микропористых частицах (под микропорами здесь понимаются «молекулярные» поры с диаметром 20-30 ангстрем) эксклюзия идет как в микропорах, так и в каналах между частицами. В результате, на калибровочной кривой наблюдается излом между двумя наклонными участками, приблизительно в области тысячи или нескольких тысяч дальтон, соответствующий первому пределу эксклюзии. Такой излом на калибровочной кривой можно наблюдать только на фазах, не имеющих «истинных» пор размера порядка 50 ангстрем и выше. Вообще говоря, увеличение диапазона линейности эксклюзионной фазы при прочих фиксированных условиях характеризуется уменьшением ее разделительной емкости; таким образом, при выборе экслюзионной фазы для конкретного разделения следует исходить из оптимального соотношения между этими важными параметрами. При анализе образца полимера с приблизительно известной молекулярной массой лучше применять фазу с небольшим диапазоном линейности, однако с большой разделительной емкостью в необходимой области. Для исследовательских целей удобно применять фазы с высоким диапазоном линейности. При дизайне современных эксклюзионных фаз, обладающих прежде всего значительным диапазоном линейности, их высокое разрешение при сравнительно низкой разделительной емкости поддерживается за счет высокой эффективности упаковки эксклюзионных колонок частицами неподвижной фазы с небольшим диаметром: 10, 5 и 3 мкм. По полярности применяемых подвижных фаз эксклюзионные методы можно разделить на «неводные» (non-aqueous method, gel-permeation) и «водные» (aqueous method, gel-filtration). В неводном методе в качестве подвижных фаз применяются органические растворители: ТГФ, хлороформ, толуол, ГФИП (гексафторизопропанол), ДМСО и другие. Такой режим эксклюзионной хроматографии применяется для анализа неполярных полимерных образцов. В качестве неподвижных фаз применяются как сшитые полимерные материалы – полностью полимерные, или на силикагельном носителе, как правило, сополимеры полистирола и дивинилбензола, – так и силикагели различной пористости. Водный метод, как правило, применяется для анализа водорастворимых белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов. Подвижной фазой в этом случае является водный буфер, иногда с небольшой добавкой органического растворителя. В качестве неподвижных фаз применяются пористые гидрофильные полимерные материалы, а также силикагели, химически модифицированные гидрофильными соединениями. В качестве базовой эксклюзионной системы можно рассматривать как типичную неводную систему (неподвижная фаза: пористый, совместимый с неполярными растворителями материал, подвижная фаза: хлороформ, тестовые соединения: стандарты полистирола), так и водную (неподвижная фаза: пористый, совместимый с водой материал, подвижная фаза: водный буфер, возможно с добавками органического растворителя, тестовые соединения: водорастворимые белки, к примеру, рибонуклеаза А, инсулин, цитохром С, трипсин, лизозим и т.д). Применение эксклюзионных методов для определения молекулярно-массового распределения полимеров (или определения молекулярной массы белковых соединений) подразумевает недопустимость вклада какого-либо адсорбционного механизма в удерживание в дополнение к эксклюзионному механизму. Существует два основных метода уменьшения влияния адсорбции на эксклюзионное разделение. Первый метод заключается в подборе для разделения оптимального растворителя с элюирующей силой, достаточной для полного подавления адсорбции. Другой метод состоит в проведении анализа при повышенной температуре (так, фазы на основе полистирола могут работать при температуре до 200 градусов). Напротив, в ряде остальных случаев, когда задача заключается не в определении молекулярной массы, а в разделении соединений, сочетание эксклюзии с различными адсорбционными механизмами не только допустимо, но и желательно, поскольку нередко приводит к значительному увеличению селективности разделения. При анализе ММР сополимеров, как правило, рекомендуется применять неводный метод, что особенно касается сополимеров полиэлектролитов. В водных средах различные структурные единицы могут в различной мере сольватироваться и вносить разный вклад в объем полимерной молекулы. Таким образом, точно измерить ММР будет невозможно, поскольку экспериментально получаемое значение всегда будет зависеть от состава сополимера. Применение неводного метода позволяет сгладить влияние этого эффекта. Для градуировки эксклюзионной системы, как правило, применяют стандарты полистиролов и полиэтиленгликолей. При этом, если проводится определение ММР каких-либо иных полимеров, в полученную калибровочную кривую необходимо ввести поправку, вычисляемую из значения характеристической вязкости изучаемого полимера. По этой причине эксклюзионные хроматографы, кроме специализированного рефрактометрического детектора, обычно комплектуются вискозиметром и специальным программным обеспечением. Есть и другой эффективный метод градуировки в эксклюзионной хроматографии – метод масс-спектрометрического определения ММР (для этого применяется техника MALDI-TOF). Массспектрометрический метод предоставляет наиболее надежные данные о ММР полимера, однако сам прибор очень дорог. Наиболее целесообразно применять его для точной калибровки эксклюзионной системы по исследуемым полимерам. Для ионов, точно также как и для нейтральных соединений, вклад в удерживание могут вносить эксклюзионные эффекты, которые, в отличие от ионного обмена и ионной эксклюзии, способны проявляться и на нейтральных микропористых фазах. Такие эффекты широко известны под термином «ion retardation», и не имеют ничего общего с электростатическими взаимодействиями, то есть являются эксклюзионными «в чистом виде». Так, фронтальным методом на нейтральных микропористых полимерах и углях можно разделять кислоты от солей, а также расщеплять соли на кислоты и основания. Особым случаем эксклюзионного типа является ион-эксклюзионный тип, который, как правило, реализуется на «сильных» ионообменных материалах, имеющих определенный заряд. В результате электростатического отталкивания из пор заряженной неподвижной фазы эсклюдируются одноименно заряженные ионы (в случае катионита – анионы), в то время как разноименные ионы (для катионита – катионы) удерживаются. Таким образом, механизм ионной эксклюзии является своего рода «антиподом» ионообменого механизма. Однако, порядок элюирования при ионной эксклюзии не обязательно в точности соответствует обратному порядку элюирования при ионном обмене, хотя в общем подобная тенденция существует. «Ион-эксклюзионным» часто называют разделение органических кислот на сульфокатионитах в кислых средах. Органические кислоты являются слабодиссоциирующими соединениями, а условия разделения не благоприятствуют их ионизации – поэтому ионная эксклюзия наверняка является не единственным механизмом эксклюзии в этом случае. 3.10. Ион-парные режимы хроматографии. Мицеллярная хроматография Ион-парные режимы хроматографии применяются для резкого увеличения удерживания и селективности разделения ионизированных и/или способных к ионизации адсорбатов путем добавления в подвижную фазу органического соединения-противоиона. По-видимому, можно выделить три основных вида ион-парных режимов: обращенно-фазовый, нормально-фазовый и квази-нормально-фазовый – каждый из которых имеет свои особенности. Наиболее часто применяется обращенно-фазовый ион-парный вариант, который выделяют в отдельный вид хроматографии: ион-парная обращенно-фазовая хроматография (в английском варианте IP HPLC, ion-pair HPLC – по умолчанию относится именно к обращенно-фазовому варианту). Примечательно, что этот исторически сложившийся термин не является достаточно корректным – в водноорганических подвижных фазах, характеризующихся высокой диэлектрической проницаемостью, образование ионных пар чрезвычайно маловероятно, поскольку химическое равновесие сильно сдвинуто в сторону их диссоциации. Таким «ион-парным» системам более соответствует модель динамически модифицированного органическим противоионом неполярного адсорбента. В результате адсорбции противоиона из подвижной фазы адсорбент приобретает ионообменные свойства. Таким образом, в первом приближении можно считать, что ион-парная обращенно-фазовая хроматография описывается суммой обращенно-фазового и ионообменного типов удерживания. Для разделения органических кислот и их солей в подвижную фазу добавляют, как правило, соли (чаще прозрачные в УФ области сульфаты) четвертичных катионов аммония, среди которых наибольшее распостранение получил тетрабутиламмоний (ТБА). Для разделения неорганических анионов также может применяться триметилцетиламмоний; правда, такие ионообменные системы на динамически модифицированных неполярных фазах уже фактически вышли из хроматографической практики. При разделении органических оснований и их солей в качестве противоионов в большинстве случаев применяют соли алифатических сульфоновых кислот: чаще додецилсульфонат, реже гептил и гексилсульфонаты. Для ион-парного обращенно-фазового разделения недериватизованных аминокислот существует специальный тип противоионов – соли перфторкарбоновых кислот. Концентрация ион-парного реагента в водном буфере для приготовления подвижной фазы обычно не превышает 5-10 ммоль/л во избежание мицеллообразования в растворе. Дальнейшее увеличение концентрации противоиона не будет способствовать улучшению селективности, а приведет лишь к ухудшению эффективности разделения. Ион-парные обращенно-фазовые хроматографические системы вполне стабильны лишь в тех случаях, когда разделяемые органические кислоты (основания) являются достаточно «сильными». В противном же случае селективность разделения может весьма сильно колебаться от раза к разу, что зависит как от погрешностей в приготовлении подвижных фаз (особенно в доводке рН буфера), так и от температуры, от рН образцов. Рисунок 3.10.1. Анализ карнитина (N,N,N-триметиламино)-2-гидроксибутановой кислоты) в водном экстракте шоколадных батончиков. 250x4.6 Inertsil ODS, элюент ацетонитрил-(5мМ додецилсульфоната в 0.1% фосфорной к-те) 30:70. УФ 210 нм. Рисунок 3.10.2. Модельная смесь водорастворимых витаминов. 150x4.6 Wakosil C18 RS. Элюент ацетонитрил-(5мМ гексилсульфоната в 0.1% фосфорной к-те) 10:90. Скорость подачи 1 мл/мин. УФ 210 нм. 1 – аскорбиновая к-та, 2 – никотиновая к-та, 3 – никотинамид, 4 – пиридоксин, 5 – кофеин, 6 – тиамин, 7 – биотин, 8 – рибофлавин. www.sge.com Наиболее яркие результаты при применении ион-парного режима достигаются в тех случаях, когда «обычная» обращенно-фазовая система не может справиться с разделением структурно подобных соединений, содержащих ионизированные функциональные группы. Применение ион-парной техники в большинстве случаев позволяет решить эту проблему (рис. 3.10.3). Рисунок 3.10.3. Анализ экстракта коры йохимбы. Основной пик – йохимбин, соседние с ним пики – аналоги, не разделяющиеся без ион-парной добавки в элюент. 250x4.6 Inertsil ODS. Элюент ацетонитрил-буфер 45:55. Буфер – 5мМ додецилсульфата, рН 2.5 фософорной к-той. УФ 270 нм. При переходе от «обычной» обращенно-фазовой системы к ион-парной удерживание целевых адсорбатов может сильно увеличиться, особенно при применении додецилсульфата и тетрабутиламмония. Для обеспечения приемлемого удерживания подвижная фаза должна содержать значительно большую объемную долю модификатора, нередко в два-три раза превышающую первоначальную. В настоящее время выпускается ряд неподвижных фаз, способных эффективно сочетать обращено-фазовый и ионный типы удерживания. Таким образом, на подобных фазах можно выполнять «ион-парные» разделения с применением обычных водноорганических элюентов без каких-либо добавок. «Смешанные» фазы такого типа на основе силикагеля выпускает SIELC Technologies, и на полимерной основе – Dionex. Примечательно, что соотношение обращенофазового и ионного типов удерживания можно регулировать, изменяя состав бинарного элюента. Увеличение доли воды приводит к преобладающему влиянию обращено-фазового типа, уменьшение доли воды – к преобладающему влиянию ионного типа (рис. 3.10.4). Рисунок 3.10.4. 150х4.6 Primesep 100. Элюенты, вверху – вода-ацетонитрил-ТФУ 70:30:0.2, внизу – вода-ацетонитрил-ТФУ 30:70:0.15. 1 – миндальная к-та, 2 – тирозин, 3 – бензойная к-та, 4 – пиридин, 5 – фенилаланин, 6 – бензиламин, 7 – бензонитрил, 8 – толуол. www.primesep.com Нормально-фазовый ион-парный режим хроматографии применяется на практике значительно реже обращенно-фазового. Как правило, область его применимости охватывает лишь разделения неполярных карбоновых кислот и фенольных соединений, хотя адсорбатами могут являться и основные органические соединения – к примеру, при нормально-фазовых разделениях фармацевтиков на хиральных фазах Пиркловского типа. В неполярной подвижной фазе ион-парный реагент образует с кислотными (основными) адсорбатами ионные пары, или же, по крайней мере, комплексы с мощной водородной связью. Дипольный момент ионных пар значительно превышает таковой для исходных соединений, поэтому добавление в подвижную фазу только ион-парного реагента приводит к практически необратимому удерживанию адсорбатов полярной фазой. Для получения приемлемых времен удерживания в подвижную фазу, помимо ион-парного реагента, следует также вводить добавку соединения, подобного адсорбатам – для снижения доли способного к связыванию с адсорбатами реагента. Так, для разделения бензойных кислот и фенолов в ион-парном нормально-фазовом режиме в качестве модификатора в неполярную подвижную фазу можно добавлять триэтиламин (который является ион-парным реагентом) и уксусную кислоту (которая является соединением, подобным адсорбатам), причем их объемное отношение должно быть по крайней мере равным, или уксусной кислоты должно быть больше. Суммарная доля такого смешанного модификатора должна быть по возможности ниже, не более десятых процента. В квази-нормально-фазовой хроматографии удерживание адсорбатов происходит за счет πвзаимодействий, поэтому применяемый ион-парный реагент должен содержать ненасыщенный (желательно ароматический) фрагмент, который обеспечивал бы его удерживание в квазинормально-фазовых системах. Таблица 3.10. Удерживание замещенных пропионовых кислот в режиме ион-парной квазинормально-фазовой ВЭЖХ на пористой графитированной саже «Hypercarb». ПФ: 0.35 мМ хинина в дихлорметане. A. Karlsson. Thesis for the degree of PhD. Uppsala University, Uppsala 1991 Адсорбат K’1 α Ибупрофен, 2-(4’-трет-бутил)-фенилпропионовая к-та 1.3 1.15 2-Феноксипропионовая кислота 2.6 1.37 Кетопрофен, 2-(3’-бензоил)-фенилпропионовая к-та 4.7 1.20 Напроксен, 2-(6’-метокси)-2-нафтилпропионовая к-та 11 1.25 Поскольку образование ионной пары вряд ли способно сильно изменить электронную плотность ненасыщенных систем адсорбата и ион-парного реагента (если только ненасыщенные системы не сопряжены с кислотными или основными функциональными группами, принимающими участие в образовании ионной пары), то, скорее всего, введением подходящего ион-парного реагента в этом случае можно добиться увеличения удерживания адсорбатов, но не значительного изменения селективности их разделения. Впрочем, метод ион-парной квази-нормально-фазовой хроматографии применялся на практике очень редко, и количества экспериметальных данных на данный момент явно не достаточно для того, чтобы делать однозначные выводы об определенных закономерностях удерживания. Наиболее разработанными применениями метода являются хиральные разделения фармацевтиков кислого характера (с применением хинина в качестве ион-парного реагента) и основного характера (ион-парными реагентами могут служить дериватизированные по азоту аминокислоты и дипептиды) на пористой графитированной саже при элюировании смесями гексанхлористый метилен. Примечательно, что в этих системах можно добиться хирального разделения и насыщенных органических кислот, видимо, по причине стерических различий в контакте диастереомерных ионных пар с адсорбентом. Мицеллярная хроматография, на первый взгляд, по типу применяемых систем похожа на ион-парную обращенно-фазовую хроматографию, однако между этими хроматографическими режимами существуют, по крайней мере, два важных различия. В большинстве случаев в качестве поверхностно-активного реагента в мицеллярной хроматографии применяют додецисульфонат, причем, в отличие от ион-парных систем, в концентрации, превышающей ККМ (критическую концентрацию мицеллообразования). Второе отличие касается типа и концентрации модификаторов: в мицеллярной хроматографии в качестве модификаторов применяются алифатические спирты со средней величиной радикала (изопропанол, бутанол, изоамиловый спирт), причем их концентрация в подвижной фазе редко превышает пяти-десяти объемных процентов. Специфика состава подвижных фаз для мицеллярной хроматографии объясняется прежде всего необходимостью стабилизировать мицеллярную фазу, в отличие от ион-парной обращенно-фазовой хроматографии, где мицеллообразования стараются по возможности избежать. Мицеллярную хроматографию применяют прежде всего для анализа биологических проб, не прошедших, кроме предварительного осаждения белков, никакой дополнительной очистки. Такие пробы содержат большие остаточные количества белковых компонентов, которые в случае применения для разделения обращенно-фазовых систем способны адсорбироваться неподвижной фазой, что приводит к ее быстрому загрязнению и выходу из строя. В мицеллярном режиме белковые соединения лиофилизируются поверхностно-активным реагентом, что приводит к значительному уменьшению их удерживания; более того, основная их часть элюируется в нулевом объеме, не загрязняя неподвижную фазу, и не мешая определению целевых аналитов. Рисунок 3.10.5. Хроматограмма водорастворимых витаминов в режиме мицеллярной хроматографии. 150x4 Hypersil ODS. Элюент: 4% 1-пентанола в 0.1М растворе додецилсульфатa натрия, рН 3. УФ 230 нм. 1 – рибофлавин; 2 – никотинамид; 3 – пиридоксин; 4 – пиридоксамин; 5 – тиамин. L. Monferrer-Pons et. al. / J.Chromat.A. 984 (2003) 223-231. В мицеллярной хроматографии достигаются в среднем меньшие значения эффективностей, чем в хроматографии обращенно-фазовой, или даже ион-парной. Прежде всего, это принято связывать с замедленной кинетикой массообмена в мицеллярных системах. 4. Неподвижные фазы для высокоэффективной жидкостной хроматографии Неподвижные фазы для ВЭЖХ продолжают совершенствоваться – наряду с аналогами уже известных типов неподвижных фаз, за последние несколько лет стали доступны и принципиально новые адсорбционные материалы, исследование хроматографических свойств которых только началось. Появление большого числа новых продуктов на рынке неподвижных фаз – это, безусловно, благо – как для метода, так и для пользователей. Однако, есть в этой ситуации и свои минусы. Прежде всего, выбор при растущем предложении становится делать все сложнее. И не всегда выбор делается в пользу нового продукта. Даже специалист в большинстве случаев предпочтет работать «по-старинке». И тем более именно так, скорее всего, поступит пользователь, далекий от хроматографии. Многие новые неподвижные фазы, появившиеся в продаже за последние несколько лет, еще не «обкатаны» в достаточной мере: на них проводилось мало анализов, или с их применением разработано мало методик. Зачастую сам производитель в полной мере не осознает всех достоинств и недостатков своей продукции. С другой стороны, новые адсорбционные материалы открывают и новые возможности. Несомненно, многие проблемные задачи в их свете обретают значительно более простые и красивые решения. Основной целью этой главы является обзор неподвижных ВЭЖХ фаз новых типов, появившихся на рынке за последние несколько лет. Меньшее внимание в обзоре уделено тем типам неподвижных фаз, которые достаточно давно вошли в практику рутинной ВЭЖХ. При анализе литературы предпочтение отдавалось информации, которая подтверждалась несколькими независимыми источниками, или личным опытом работы. В тексте достаточно часто встречаются узкопрофессиональные термины; их разъяснение приведено в словаре терминов. 4.1. Архитектура и химия неподвижных фаз для ВЭЖХ Рассматривая различные принципы строения неподвижных фаз для ВЭЖХ, можно выделить пять основных типов их архитектур: пористые частицы, непористые частицы, перфузионные частицы, макропористые (бипористые) монолиты и микропористые монолиты. Большинство современных неподвижных фаз построено на основе пористых частиц. Неподвижные фазы на основе непористых и перфузионных частиц применяются для разделения белковых соединений. Непористые частицы ограниченно применяются в ионной хроматографии. Конкуренцию пористым частицам пока могут составить только пористые монолиты – как неорганические (на основе силикагеля нового поколения – соль-геля), так и органические (как правило, на основе сополимера полистирола с дивинилбензолом). Предельная эффективность современных монолитов на основе соль-геля приблизительно соответствует эффективности 3-х микронных пористых частиц. Наиболее перспективно применение монолитов в капиллярных колонках, поскольку колонки такого формата сложно заполнять пористыми частицами. Природа пористого материала основы может быть как неорганической (силикагель, окись циркония, алюминия), так и органической (сюда можно причислить синтетические полимеры и природные полисахариды). Основы могут непосредственно применяться как неподвижные фазы. Однако, поскольку они не способны обеспечить всего спектра необходимых адсорбционных свойств, их подвергают химической модификации. Существует несколько технологий модификации основ. 1. Новая неподвижная фаза может быть получена прививкой соединений, изменяющих адсорбционные свойства материала, на «активные» функциональные группы исходной основы (этот метод называется химической дериватизацией, chemical derivatization). К примеру, таким методом получаются большинство неподвижных фаз на основе силикагеля. Прививка новой химической фазы осуществляется по реакции -Si-OH + Cl-Si(CH3)2-R = -Si-O-Si(CH3)2-R где R – заместитель. Для широко распостраненных обращенных фаз R = C18H37 (марка С18), или C8H17 (марка С8), для полярных фаз R = (CH2)3-NH2 (аминофаза), (CH2)3-CN (нитрильная фаза). Новую фазу можно создать, модифицируя уже привитую фазу; к примеру, целый спектр фаз с различными свойствами можно получить из аминофазы по реакции -Si-O-Si(CH3)2(CH2)3-NH2 + Cl-C(O)R = -Si-O-Si(CH3)2(CH2)3-NH-C(O)R Исходные синтетические полимерные основы, несущие «активные» функциональные группы, и полисахаридные основы также могут быть модифицированы подобных образом. Полимерные материалы на основе полистирола могут сульфироваться (при этом получается сульфокатионит) и хлорметилироваться (аминирование хлорметилированного полимера дает аминофазу на полимерной основе, из которой также можно получить большое число новых фаз). Существуют и другие методы введения функциональных групп в полимерные материалы на основе полистирола, большинство которых основаны на реакции Фриделя-Крафтса. 2. Исходная основа может быть покрыта полимерным слоем (polymer-grafted film) с принципиально новыми адсорбционными свойствами. Для этой цели применяют основы с функциональными группами, способными вступать в реакцию полимеризации. Такие группы могут быть введены и в неорганические основы, к примеру, по реакции Основа-OH + Cl-Si(CH3)2-CH=CH2 = Основа-О-Si(CH3)2-CH=CH2, однако чаще для этих целей применяют полимерные основы, приготовленные на базе дивинилбензола (они имеют достаточно много остаточных двойных связей). После получения материала с нанесенной полимерной пленкой в реакционную смесь добавляется соединение, сшивающее полимерные цепи. 3. Непористые и макропористые основы с заряженными группами на поверхности могут быть обработаны суспензией коллоидных частиц противоположно заряженного низкомолекулярного полимерного материала. В этом случае полимерная пленка (electrostaticagglomerated film) удерживается на поверхности основы за счет сильных электростатических взаимодействий. Заряд частиц совпадает с зарядом полимерной пленки. В результате этого процесса на основе непористых частиц можно получить ионобменные материалы небольшой емкости, которые обычно применяются в суппрессорных установках. При синтезе фаз для ионной хроматографии в качестве основ применяют иониты на базе макропористых (1000-3000 А) полистирол-дивинилбензольных материалов. Материалы, приготовленные по приведенной технологии, иногда называют пелликулярными (pellicular), дословно – «пленочными». Некоторые современные ионобменные фазы принадлежат к этому типу метериалов. 4. Так называемые энкапсулированные (polymer-encapsulated) материалы могут быть получены динамическим нанесением низкомолекулярной полимерной пленки на непористый носитель с последующей интенсивной сшивкой полимерного покрытия. В результате исходная основа оказывается в полимерной «капсуле». Неподвижные фазы такого типа, полученные с применением бутадиен-малеинового сополимера, применяются как слабые катионобменные фазы. 4.2. Неподвижные фазы для нормально-фазовой и гидрофильной ВЭЖХ Классическим адсорбционным материалом как для нормально-фазовой, так и для гидрофильной хроматографии является силикагель (в названиях силикагельных фаз присутствует метка Silica или Sil). По сей день силикагель является наиболее практичным адсорбентом для препаративной хроматографии. В области аналитической хроматографии силикагель по частоте применения сравним с аминофазами на силикагельной основе (Amino, NH2). Отстает от них по популярности нитрильная фаза (CN). Значительно реже применяются диольные (Diol) и карбокси (-COOH) фазы. Нитро-фаза (NO2) фактически вышла из практического применения. Прогнозировать ситуацию в области применения полярных фаз в настоящий момент достаточно сложно. Текущая тенденция – активное развитие гидрофильной хроматографии при продолжающейся стагнации нормально-фазовой хроматографии. Для нормально-фазовых разделений, как показывает практика, вполне достаточно силикагеля, нитрильной фазы и аминофазы. Но какой материал является оптимальным для гидрофильного метода? На этот вопрос еще нет ответа – по странной иронии, метод гидрофильной хроматографии, открытый Цветом в начале 20-ого века, начал свое развитие только в 21-ом. Не исключено, что более пристальное внимание будет уделено диольным и карбокси-фазам, а также амидным фазам, большое разнообразие которых можно получить на основе стандартных аминофаз. За последнее время появилось несколько полярных фаз, сконструированных специально для гидрофильной хроматографии. «Цвиттер-ионные» фазы получаются прививкой цвиттер-ионных (при нейтральном рН) лигандов на поверхность силикагеля (ZIC-HILIC, SeQuant AB). «Полиэтиленгликолевой» фазой на основе силикагеля является Discovery HS PEG (Supelco). Силикагельной фазой с привитым поли-(2-сульфоэтил)аспартамидом является PolySulfoethyl A, PolyLC. Эффективность применения этих фаз пока неочевидна (силикагель показывает результаты по крайней мере не хуже), однако возросший интерес к синтезу новых полярных фаз стоит отметить. К полярным фазам на полимерной основе относятся: TSK-GEL Amide-80 (Tosoh Bioscience), Asahipak NH2P (Showa Denko), PRP-X700 (Hamilton). PRP-X700 является аминофазой на полимерной основе, предназначенной для разделения сахаров. Для этой же цели разработана фаза Asahipak NH2P на основе из поливинилового спирта с привитыми полиаминными группами. TSK-GEL Amide-80 является макропористым полистиролом, модифицированным амидными функциональными группами. Поскольку увеличить эффективность фаз по сравнению с силикагелем фактически невозможно, производители делают упор прежде всего на необычную селективность разрабатываемых фаз. Необычная селективность разделений достигается путем комбинирования доминирующего нормально-фазового типа удерживания с ионообменным, квази-нормальнофазовым и обращенно-фазовым типами. К примеру, на поли-(2-сульфоэтил)аспартамид-привитом силикагеле удерживание определяется суммой нормально-фазового, обращенно-фазового и ионообменного типов. На пентафторфенильных фазах реализуется сумма нормально-фазового, обращенно-фазового и квази-нормально-фазового типов. Системы на основе таких фаз характеризуются большой гибкостью, однако целенаправленно управлять ей фактически не представляется возможным. В гидрофильной хроматографии на полимерных полярных фазах можно ожидать увеличения вклада обращенно-фазового типа удерживания при увеличении доли воды в элюенте. Особенно заметным он может стать для адсорбатов с гидрофобными фрагментами, например, гликозидов гидрофобных соединений. На практике это провляется в том, что при увеличении доли воды в подвижной фазе удерживание адсорбатов уменьшается лишь до определенного предела, когда вклад обращенно-фазового типа становится равным вкладу нормально-фазового типа. При дальнейшем уменьшении доли воды удерживание адсорбатов начинает возрастать, причем селективность разделения инвертируется, то есть изменяется с «нормально-фазовой» на «обращенно-фазовую». В гидрофильной хроматографии при элюировании ионизированных адсорбатов даже на сравнительно «слабых» ионообменных фазах («NH2», «COOH») определенный вклад в удерживание вносят ионообменный и ион-эксклюзионный типы. В этом случае удерживание адсорбатов и селективность разделения непосредственно зависят от рН и ионной силы водного буфера, входящего в состав подвижной фазы. К полярным фазам со смешанным механизмом удерживания относятся многие хиральные неподвижные фазы. Что неудивительно – для эффективного расщепления рацематов различной природы адсорбент должен быть способен, по идее, ко всем типам физико-химических взаимодействий. Нередко, одна и та же хиральная фаза способна разделять энантиомеры и в нормально-фазовом, и в обращенно-фазовом, и в «промежуточных» режимах. К таким фазам относятся наиболее распостраненные химически модифицированные полисахаридные фазы Chiralcel OD, AD, OJ (Diacel Chemical Industies), тейкопланиновая и ванкомициновая фазы Chirobiotic Т, Chirobiotic V (Astec). Гидрофильный режим для этих и подобных им хиральных фаз иногда называют «polar organic mode». 4.3. Неподвижные фазы для обращенно-фазовой ВЭЖХ Большая часть современных аналитических приложений выполнена на обращенных фазах различного типа. Разработка обращенных фаз идет по пути решения сразу нескольких задач, среди которых можно выделить следующие: 1. Повышение гидролитической стабильности обращенных фаз на основе силикагеля. Фазы с улучшенной гидролитической стабильностью имеют более долгий срок службы, они более терпимы к агрессивным условиям (высокие концентрации неорганических солей, высокие рН), чем «обычные». 2. Повышение эффективности разделения основных (азотсодержащих) адсорбатов, улучшение формы их пиков. На специальных фазах можно проводить разделения основных фармацевтиков и алкалоидов на простых водноорганических элюентах без динамического модификатора (например, триэтиламина). 3. Синтез обращенных фаз, проявляющих улучшенную селективность разделения соединений определенной группы (определенной природы). Удерживание на таких фазах обусловлено, как правило, несколькими типами, среди которых обращенно-фазовый тип является доминирующим. 4. Синтез фаз, совместимых с водой и водно-солевыми буферами. При работе на таких неподвижных фазах с применением элюентов без добавки органического модификатора не присходит фазового коллапса – резкого уменьшения удерживания адсорбатов и эффективности их разделения вследствие несмачиваемости адсорбционного материала. 5. Синтез фаз для разделения соединений высокой гидрофобности (С30 привитые силикагели). Для синтеза обращенных фаз на основе силикагеля с повышенной гидролитической стабильностью существует два основных подхода. Первый подход состоит в применении в качестве основы для синтеза гидролитически устойчивого силикагеля нового типа (соль-геля, sol-gel), на который прививаются неполярные лиганды. Прививка ведется таким способом, чтобы как можно в большей мере блокировать силикагельную матрицу. Среди таких способов можно отметить: 1. Организацию на поверхности силикагеля полимерного слоя, предотвращающего контакт подвижной фазы с адсорбентом. С18 фазами с полимерным силиконовым покрытием являются Wakosil II C18AR (SGE), Capcell Pak C18 (Phenomenex). 2. Прививку лигандов Cl-Si(R2)C18H37 с объемными «боковыми» заместителями R, бидентантных лигандов с общей формулой Cl-Si(CH3)2-R-(CH3)2Si-Cl. К последнему типу относится фаза Zorbax Extend C18 (Agilent Technologies). 3. Проведение интенсивного двойного эндкеппинга триметилхлорсиланом и/или диметилдихлорсиланом. К таким фазам относятся Wakosil II C18RS (SGE), Zorbax Eclipse XDB-C18 (Agilent Technologies), Hypersil BDS C18 (Thermo Hypersil - Keystone). Другой подход состоит в получении гидролитически стабильной обращенной фазы в один шаг, путем полимеризации триэтоксисиланов типа CH3Si(OR)3 и (RO)3SiCH2CH2Si(OR)3, где R – углеводородный радикал. Такой подход реализован фирмой Waters при синтезе адсорбентов серии XTerra. Иногда такие материалы называют «гибридными». Фазы приведенных типов могут эффективно применяться и для разделения основных соединений. Однако, для разделения основных соединений существуют также фазы, сконструированные по другому принципу. Он состоит в прививке к силикагелю в целом неполярных лигандов, однако содержащих в своей структуре полярную группу (polar-embedded group): карбаматную, простую эфирную или амидную – каторая находится рядом с реакционным центром. Прививка в этом случае осуществляется таким способом, что полярная группа оказывается рядом с поверхностью силикагельной матрицы. При этом «силанольная активность», которая считается основной причиной уширения пиков основных соединений, подавляется за счет взаимодействия остаточных силанольных групп с полярной группой привитого соединения. Примером карбаматной фазы является SymmetryShield RP C18 (Waters), эфирной фазы – Polaris C18 Ether (Varian), амидных фаз – Discovery RP-AmideC16 (Supelco), Polaris Amide C18 (Varian). Любопытно, что фазы подобного типа, изначально сконструированные для разделения основных соединений, впоследствии стали позиционироваться как фазы с необычной селективностью и совместимостью с 100% водными подвижными фазами. Для синтеза фаз с хорошей совместимостью с водой и водными буферами наиболее часто применяется подход, состоящий в эндкеппинге остаточных силанольных групп полярными реагентами – «полярный эндкеппинг». Среди фаз, сконструированных по такому принципу, можно отметить Synergi Hydro-RP и Synergi Polar-RP (Phenomenex) (химия полярного эндкеппинга производителем не раскрывается). Наряду с хорошей совместимостью со 100% водными подвижными фазами, адсорбенты этого типа обладают и недостатками, прежде всего, достаточно низкой гидрофобностью, что выражается в слабом удерживании гидрофильных адсорбатов, а также невысокой метиленовой селективностью. Для более эффективного разделения гидрофильных соединений в 100% водных средах были разработаны специальные неподвижные фазы, не имеющие приведенных недостатков. К таким фазам относятся Atlantis dC18 (Waters) и Develosil RP-Aqueous (Nomura Chemical). Такие фазы эффективно применяются для обращенно-фазового разделения многих гидрофильных соединений, прежде всего, органических кислот и нуклеотидов. Для разделения липидов методом обращенно-фазовой хроматографии часто применяют безводные подвижные фазы, нередко содержащие липофильные модификаторы: ТГФ, ацетон, хлороформ. С18 привитые силикагели в подобных средах достаточно резко теряют эффективность разделения, по-видимости, из-за «разжижения», нарушения привитого слоя. Для эффективной работы в неполярных подвижных фазах на основе силикагеля сконструированы адсорбенты с привитыми С30Н62 лигандами – С30 фазы. Так, ProntoSIL 200-5-C30 (Bischoff) и Develosil Combi-RP (Nomura Chemical), новые фазы такого типа, могут применяться для разделения триглицеридов, жирорастворимых витаминов, изомеров каротиноидов. Многие обращенные фазы характеризуются необычными селективностями, которые обусловлены вкладами одного или нескольких типов удерживания в дополнение к основному обращенно-фазовому. Вклад нормально-фазового типа наиболее ярко проявляется на карбаматных и амидных обращенных фазах, а также на фазах с полярным эндкеппингом. Так, карбаматные фазы проявляют отличную от обычных С18 фаз селективность по отношению к катехинам, флавонолам. На фазах с полярным эндкеппингом в «нестандартной» последовательности элюируются водорастворимые витамины, причем, как было замечено, этот порядок весьма сильно зависит и от типа применяемого буфера. Вклад квази-нормально-фазового механизма проявляется при хроматографировании ароматических соединений в обращенно-фазовых условиях на фазах, содержащих ароматические π-донорные/акцепторные фрагменты. Среди таких «обращенных» фаз на основе силикагеля можно выделить пентафторфенильные фазы: Discovery F5 HS (Supelco), FluoroSep-RP Phenyl HS (ES Industries). Полистирольные фазы PRP-1 (Hamilton), PLRP-S (Polymer Labs), PolymerX RP-1 (Phenomenex) также считаются обращенными, хотя проявляемая ими селективность указывает на значительный вклад квази-нормально-фазового типа удерживания. Наибольший вклад квазинормально-фазового типа наблюдается для пористой графитированной сажи Hypercarb (Thermo Hypersil - Keystone) и сверхсшитого полистирола Chromalite 5HGN (Purolite). 4.4. Неподвижные фазы для эксклюзионной ВЭЖХ Отличительной чертой современных неподвижных фаз для эксклюзионной ВЭЖХ является их высокая эффективность, которая достигается применением носителей небольших диаметров (от 10 до 3 мкм). Другой их важной характеристикой является широкий диапазон линейности, который даже для фаз с 5 мкм частицами может составлять величину порядка MW 100-1,000,000. Фазы для эксклюзионной хроматографии в неводных средах выпускаются фирмами Showa Denko, TosoHaas, Polymer Labs, Waters, Phenomenex. Showa Denko выпускает эксклюзионные фазы Shodex на основе полистирол-дивинилбензола в виде нескольких серий: GPC KF-400, KF-800, HFIP-400, HFIP-600, LF-804. Фазы отличаются форматом, характеристиками, диаметром частиц (от 8 до 3 мкм); доступны фазы, заполненные из ТГФ, хлороформа, толуола, ДМФА и ГФИП. TosoHaas выпускает новые полистирол-дивинилбензольные фазы TSKgel Super HZ c 3 мкм частицами и серию фаз TSK-gel HHR. Polymer Labs выпускает пять новых полистирол-дивинилбензольных колонок Plgel MIXED 3, 5, 10 и 20 мкм с широким диапазоном линейности; 20 мкм колонка разработана для разделения полимеров с большой молекулярной массой (предел эксклюзии MW 4x107). Серии 5 мкм полистирол-дивинилбензольных фаз выпускает Waters (Styragel HR) и Phenomenex (Phenogel). Среди новых материалов для эксклюзионной хроматографии в водных средах можно выделить несколько основных типов фаз, отличающихся по химии носителей. Фазы на основе полиметакрилата (TSKgel Super AW), а также сополимера метакрилата и этиленгликоля (TSKgel Super PW) выпускается TosoHaas; фаза на основе сополимера метакрилата и гидроксиэтилметакрилата PSS HEMA выпускается Polymer Standards Services. Фаза PL Aqua-OH Mixed 8 мкм на основе полиоксиэтилена выпускается Polymer Labs. Новыми эксклюзионными фазами на основе сульфированного полистирола являются PSS MCX (Polymer Standards Services), на основе полидивинилбензола с полиэтилениминной привитой фазой – Polar Pac WAX (Jordi Associates). Серия фаз на основе гидроксиметакрилата выпускаются Waters (Ultrahydrogel), Showa Denko (Shodex OHpak KB-800, 8 мкм). Среди фаз на основе силикагеля можно упомянуть полиол-модифицированный силикагель Nucleosil 125-5 GFC (Macherey-Nagel), глицерин-модифицированный силикагель MICRA Gold SEC (Eichrom Technologies), диол-модифицированный силикагель Cosmosil-5Diol-120(300)-II (Nacalai Tesque). Для эксклюзионного разделения олигосахаридов различными производителями выпускается ряд сульфированных макропористых полистиролов. Эти материалы могут выпускаться как в кислотной форме, так и в формах солей различных катионов, к примеру, калия, кальция, свинца, серебра. В случае применения фаз в форме кальция, свинца и серебра считается, что значительный вклад в удерживание начинает вносить лигандный обмен, а также ионный обмен в случае элюирования щелочными подвижными фазами. Среди подобных фаз можно упомянуть Supelcogel K, Pb, Ca, H и Supelcosil Ag1, Ag2 (Supelco) в различных формах, Rezex RSOOligosaccaride (Phenomenex) в серебряной форме, Shodex Sugar KS-801 (Showa Denko) в натриевой форме. Ряд подобных микропористых полимерных сульфированных фаз выпускается в различных формах для разделения моносахаридов, а также в кислотной форме – для «ион-эксклюзионного» разделения органических кислот. Среди фаз для ионной эксклюзии можно упомянуть Chromalite 6GSA (Purolite), Supelcogel C-610H, H (Supelco), Rezex ROA-Organic Acids (Phenomenex). 4.5. Неподвижные фазы для ионной ВЭЖХ В настоящее время для ионной ВЭЖХ применяются фазы как на полимерной основе, так и на основе силикагеля. Фазы на полимерной основе обладают большим временем жизни, однако при этом и большей стоимостью. Силикагельные ионообменные фазы незаменимы при анализе органических ионов, тогда как для разделения ионов неорганических все чаще применяются полимерные фазы. Большинство новых типов фаз для ионной хроматографии сконструированы на полимерной основе. Основным путем развития этого направления по-прежнему остается увеличение эффективности и стабильности полимерных ионобменных фаз при сохранении их достаточной емкости. Важными свойствами полимерных материалов, которые также необходимо увеличивать, являются совместимость с органическими растворителями и способность выдерживать высокое давление. Этими свойствами в достаточной мере обладают полимерные ионообменные материалы с высокой, порядка 50%, степенью сшивки основы. Фазы с низкой степенью сшивки вышли из практики ионообменной хроматографии, и применяются только для ион-эксклюзионных разделений. В области синтеза новых полимерных ионообменных материалов наблюдается тенденция постепенного перехода от «сильных» ионитов к «слабым». Основными преимуществами применения «слабых» ионитов являются более мягкие условия элюирования сильноудерживаемых ионов, лучший массообмен. Ионообменные фазы на основе силикагеля производятся SGE (Exsil SCX, SAX), Supelco (Supelco SCX, SAX1), Phenomenex (Luna SCX). Полимерные анионообменные фазы производятся Dionex, Phenomenex, Showa Denko и рядом других компаний. Фазы серии IonPac AS выпускает Dionex, новая колонка в серии – IonPac AS18. Аналогом является фаза Star-Ion A300 (Phenomenex). Обе фазы полистиролдивинилбензольные сильной сшивки с четвертичными аммонийными группами. Showa Denko выпускает анионобменные фазы серии Shodex IC SI на основе поливинилового спирта, новой колонкой серии является Shodex SI-52 4E. Hamilton выпускает фазы PRP-100 и PRP-110 на основе полиметакрилата. Анионообменным материалом нового типа заполнена колонка IonPac Cryptand A1 (Dionex). Эта фаза с привитым на полистирольную основу краун-эфиром содержит положительно заряженные «мобильные» комплексы краун-эфира с однозарядными катионами. Емкость фазы можно регулировать путем варьирования концентрации катиона в водном буфере и заменой катиона на другой. IonPac Cryptand A1 позволяет производить надежные измерения конценрации перхлората в образцах воды с высоким содержанием хлорида, кабоната и сульфата. Примером пелликулярного материала, разработанного для ионообменного разделения недериватизованных аминокислот и сахаров, является фаза AminoPac PA10 (Dionex). Фаза получена нанесением слоя латекса с четвертичными аммонийными группами на основу – сульфированный полистирол сильной сшивки. Новые катионобменные фазы IonPac CS17 (Dionex) и Shodex YL-421 (Showa Denko) являются карбоксильными энкапсулированными фазами, позволяющими проводить разделения как неорганических катионов, так и азотистых оснований в мягких условиях. Подвижными фазами являются водные растворы метансульфоновой кислоты, или другой кислоты средней силы. Shodex YL-421 обладает меньшей емкостью, и предназначена для применения в сочетании с кондуктометрическим детектированием без подавления. 4.6. Неподвижные фазы для квази-нормально-фазовой ВЭЖХ Термин «квази-нормально-фазовая жидкостная хроматография» (quasi normal phase liquid chromatography) был введен совсем недавно, и поэтому не успел достаточно прочно укрепиться в профессиональном хроматографическом лексиконе. Впервые этот термин был применен для описания удерживания ароматических соединений на неполярном адсорбенте, сверхсшитом полистироле, при применении неполярных подвижных фаз на основе алифатических углеводородов. Здесь этот термин будет применяться для обозначения отдельного вида хроматографии, где удерживание в основном обусловлено квази-нормально-фазовым типом. Чаще всего квази-нормально-фазовые хроматографические системы отвечают сочетанию неполярной неподвижной и неполярной подвижной фаз. Главной отличительной чертой неподвижных фаз для квази-нормально-фазовой хроматографии является наличие в их структуре ароматических фрагментов, способных взаимодействовать с разделяемыми ненасыщенными соединениями с образованием лабильных комплексов π-π и π-d типов. Фазы с ароматическими фрагментами в структуре хорошо удерживают и разделяют ароматические и карбонилсодержащие соединения, тогда как фазы с закрепленными ионами или комплексами переходных металлов, к примеру, серебра, чрезвычайно селективны по отношению к соединениям с кратными связями углерод-углерод. Одной из наиболее ранних хроматографических фаз для квази-нормально-фазовых разделений является пористая графитированная сажа Hypercarb (Thermo Hypersil - Keystone). Ее основное современное применение как фазы для квази-нормально-фазовых разделений состоит в фракционировании полихлорированных бифенилов и дибензофуранов при градиентном элюировании смесями толуола с гексаном. Многообещающей фазой для квази-нормально-фазовой хроматографии является Chromalite 5HGN (Purolite), представляющая собой сверхсшитого полистирола «гелевого» типа в виде 5 мкм сферических частиц. На этой фазе были проведены разделения ароматических соединений различных классов, в том числе и в градиентных режимах элюирования. Среди фаз для квази-нормально-фазовых разделений на основе силикагеля наибольшей известностью обладают фазы Cosmosil PYE и Cosmosil PBB (Nacalai Tesque). Cosmosil PYE является 2-(1-пиренил)-этилированным силикагелем. Химия Cosmosil PBB не приводится производителем, однако по примерам разделений можно заключить, что эта фаза также является силикагелем с привитым ароматическим лигандом. Cosmosil PBB, в частности, применяется для аналитических разделений фуллеренов при их элюировании толуолом. Квази-нормально-фазовый тип удерживания может быть доминирующим и для многих хиральных фаз. Более подробно этот вопрос будет освещен в главе по хиральной хроматографии. 4.7. Производители неподвижных фаз для ВЭЖХ Информация по производителям неподвижных фаз, а также по основным маркам выпускаемой ими продукции, суммирована в таблице. Производитель Координаты Марки неподвижных фаз Advaced Chromatography Technologies (ACT) Aberdeen, UK Ace C18, C8, C4, CN, Ph, C18-HL Agilent Inc. Wilmington, USA Technologies Delaware, Примечания Zorbax SB 80A C3, C8, C18, CN; Zorbax SB 300A C3, C8, C18; Zorbax SB Aq; Zorbax GF (BioSeries), Zorbax Extend-C18, Zorbax Bonus RP; Zorbax Eclipse XDB-C18, C8, Phenyl; MacMod ACE, Hydrobond, ACE-AQ, ACE-300A Alltech Associates Inc. Deerfield, Illinois, USA www.alltechWEB.com Alltima; Adsorbsphere; Alphabond; Ecosil; Prevail Carbohydrate, Organic Acid Amersham Biosciences Piscataway, Jersey, USA Source 5RPC ST 2.1/150 Analytical Sales Services Inc. and Pompton Plains, New Jersey, USA Sprite Sil, C18 Ansys Technologies Inc. Lake Forest, California, USA Abzelute ODS-DB, CN/E, C4/E; Carbosorb C8, ODS-2, ODS-3; MetaSil Si, C1, C6, C8, C18, CN, SCX, SAX, Phenyl; MetaSil AQ C18, 120A, 200A; Polaris C18-A, B; Pursuit C18, Phenyl Hexyl Astec www.astecusa.com Chirobiotic V,T, TАg Cyclobond I,II,III Хиральные фазы BIA Separations d.o.o. Ljubljana, Slovenia CIM QA-80 Mono HP, QAA; BIO BioChrom Labs Inc. Terre Haute, Indiana, USA Hydrocell RP 20F PS-DVB; BIO New Bio-Sil C18, CN, Phenyl, SEC, Chiral; Hi-Pore; Bio-Gel MA7C,Q,S, MP7 HIC Bio-Rad Bischoff Chromatography Leonberg, Germany ProntoSIL 120A, 300A, Aq 120A, SH 120A, ACEEPS, HTS; Hi-Pak PS-DVB; BIO Aquapore, Pecosil, Pecosphere Brownlee/Perkin Elmer Cluzeau-Info-Labo SainteFoyLaGrande, France Stability RP C18 Sil, C18 Diacel Chemical Industies Ltd Chiral Technologies Inc. Osaka, Japan Exton, Pensylvania, USA Chiralcel OD-H, OJ-H, AD-H, AS-H; Chiralpak; Chrownpak Хиральные фазы Diazem 1000, 2000, 3000, 4000, C18EC, C8EC, Chiral Diazem Dionex Corp. Sunnyvale, California, USA www.dionex.com www.lcpackings.com AminoPac PA10, CarboPac, DNAPac, IonPac Cryptand A1; IonPac CS3 - CS17, AS4 - AS18, ICE-AS1,5,6; Acclaim 120 C18 (C8) EKA Chemicals Bohus, Sweden www.kromasil.com Kromasil Sil, C4, C8, C18, Chiral DMB, TBB Eprogen Darien, Illinois, USA ProteoSep kit (2) ES Industries West Berlin, Jersey, USA Aquasep, Chromegabond, Chromegabond PFP, Amino/ Cyano, BD 60A, 100A, 300A, C4 500A, 1000 A, C6, C18, Chiral, Diol, MC-18, SCX/SAX, DNA Primer-Pure, WR-C18-EX; FluoroSep-PR Phenyl, Octyl, Propyl; Grammabond C1, C8, C18, PVP, SCX, WCX; Protec RP; Chromolith Flash RP-18e GL Scienses Tokyo, Japan W.R. Vydac Grace&Co. - Hesperia, USA New Inertsil ODS-Prep-100A; Inertsil 150A Silica, C4, C8, ODS-2, Phenyl; Inertsil 100A, ODS-3, C8-3, Ph-3, CN-3, ODS-P California, Vydac VHP SAX, SCX, WAX; Vydac 202TP (PAH), 228TP, 259VHP, 238TP C8, C18, 300 IC405, 301 TP Anion, 302 IC, 400 IC405, 401, 201, 208, 214, 218 TP Hamilton USA www.hamiltoncompany. com PRP-1, 3, Infinity, X-100, 110, 500 Фазы на полимерной основе Inerchim Montluçon, France Uptisphere HSC (NEC) Sil, C18 Jones Chromatography Hengoed, UK Apex Carbohydrate, Chiral, WP, PAH, Symmetry, Genesis, Genesis Aq Jordi Associates Inc. Bellingham, Massachusetts, USA Jordi AQ-G, AQ-G Sulf.-DVB, Gel C18 DVB, Glucose-DVB, GPC-DVB, OA, Pesticide Cleanup, RP-DVB, Sulf.-DVB Bakerbond Abx, RP300, Affinity, Chiral, Hi-propyl, WP CBX, DEAM, PEI, Quat. J. T. Baker Macherey-Nagel GmbH & Co. KG Düren, Germany www.mn-net.com Nucleodur C18 Gravity; Nucleodur 100 C18 EC Merck Science Darmstadt, Germany LiChrosper; LiChrosorb KgaA/EM SynChropak Anion, AX, Cation, CHO, CM300, GPC, HAP, PAH, Propyl, Q300, RPP-100, RP-P, RP-8, RP-4, RP-1000, 4000, S300, 1000, SCD100 Micra Scientific Mitsubishi America Inc. Chemical White Plains, New York, USA MCI Gel Anion SCA04, Cation SCK01, CK08e, ec, ep Nacalai Tesque Cosmosil Silica, C1, C8, C18, Phenyl, NH2, CN, C18-AR,MS, PYE, NPE, PBB, Buckyprep Nomura Chemical Co. (Phenomenex) Develosil Silica 60,100, C1, C8, ODS, Phenyl, NH2, RP-Aqueous, Combi-RP Sil, C18 Orachrom Woburn, Massachusetts, USA Styros MC-IDA (MC-TED); Styros SE (CM) Phenomenex 411 Madrid Ave., Torrance, CA, USA www.phenomenex.com BioSep-SEC; Curosil - PFP; EnviroSep PP, CM; Jupiter C4, C5, C18, Proteo, 300; Luna Silica, C5, C8, C18, Phenyl-Hexyl, CN, NH2; Phenogel; PolymerX RP-1; Prodigy Silica, C8, ODS, Phenyl, PH-3; Rezex RKP, RCM, RHM, RAM, RSO, RNO, RPM, RNM, ROA; StarIon A300; Synergy Hydro-RP, Polar-RP Polymer Laboratories Amherst, Massachusetts, USA www.polymerlabs.com PLRP-S, PLPR-S 300A, PL Gel, Hi-PLEX, Aquagel-OH Фазы на полимерной основе Purolite Cowbridge Road, Pontyclun, Wales CF7 8YL, UK www.purolite.com Chomalite 5HGN, 5HMN Сверхсшитые полистиролы Chromalite 5MN1, 6GSA Dynamax 60, 100, 300A; Dynamax CN, NH2; Hydropore EP, Protein A, HIC, SCX, SEX, WCX; PureGel SAX, SCX Rainin Regis Technologies Inc. Morton Grove, Illinois, USA Rexchrom 100A, 300A; Hi-Chrom, Hi-Chrom CN, NH2 Pinnacle; PinnacleUltra C18 Restek SeQuant AB Umeå, Sweden ZIC-HILIC SGE (Scientific Glass Engineering) www.sge.com Wakosil C18RS, AR, HG; Wakosil C8RS; Nucleosil 300 ODS; Exsil ODS, C8, Phenyl, Amino, Cyano Propyl, Silica, SCX, SAX Shiseido Co, Ltd (Phenomenex) Japan Capcell Pak C18 MG, UG120, ACR, AQ; Ceramospher RU-1, 2; Chirex Showa Denko KK Kanagawa, Japan Asahipak ODP, NH2P; Shodex GPC KF, K, KD; RSpak DE, DM, KC, SugarSH; OHpak SB, SugarKS, Protein KW; AXpak; AFpak; Shodex IC SI, I, Y, YK, T, R; Shodex ORpak CDBS, CDA, CDB, CDC HQ Supelco Bellefont, Pennsylvania, USA sigma-aldrich.com Supelco Discovery C5, C8, C18, Cyano, RPAmide16; Supelco Discovery HS F5, C18, PEG; Supelcosil ABZ plus, LC Si, 1, 8, 18, DABS, PAH, F, CN, NH2, NH2-NP, Diol, 3Diol, SAX1, SCX; Supelcogel TPR-100, ODP-50 Bellefont, Pennsylvania, USA Hypersil Silica, C1, C8, C18, Phenyl, CN, NH2, SAX, Green PAH; Hypersil BDS C8, C18, Phenyl, CN; Hypercarb; Aquasil; BETASIL C8, C18, Phenyl, Phenyl-Hexyl; BetaBasic C8, C18, Phenyl, CN; BioBasic C4, C8, C18, SCX Tosoh Biosep Montgomeryville, Pennsylvania, USA TSK SP5PW, ODS80-TM, ODS 120-T, PW, SW, H, Affinity; Super ODS, Octyl; TSKgel; TSKgel Amide-80 Varian www.varianinc.com Polaris C18A, C18 Ether, Amide C18 Waters Corp. Milford, Massachusetts, USA www.waters.com Symmetry C8, C18; SymmetryShield C8, C18; XTerra MS, RP; Ultrahydrogel; Atlantis dC18 Thermo Keystone Для металлохелатной хроматографии Hypersil- Силикагели с силиконовым покрытием Хиральные фазы Фазы на полимерной основе Фазы на полимерной основе Partisil; Partisphere Whatman YMC Milford, Massachusetts, USA YMC-Pack 120A, 300A, CN, DiolS, NH2, Phenyl, PRO-C18, Protein-RP, C18 RS, SEC-DVB; YMC Basic, Carbamate, Carotenoid, Fuel Analysis, Chiral, Explosives; PRO C4, C8, C18; Hydrosphere ZirChrom Separations Anoka, Minnesota, USA ZirChrom RP, SAX, SCX 5. Хиральная высокоэффективная жидкостная хроматография Хиральная жидкостная хроматография (chiral LC) применяется для разделения и количественного анализа зеркальных изомеров (энантиомеров) оптически активных органических соединений. Поскольку разные энантиомеры биологически активных веществ обладают разным действием на организм, хиральная хроматография наиболее часто применяется для анализа фармацевтических препаратов и полупродуктов их синтеза. Другой областью ее применения является органическая химия хиральных соединений. Таким образом, пробы могут представлять собой не только растворы чистых веществ, но и реакционные смеси. По этой причине неподвижные фазы для хиральной ВЭЖХ, наряду с высокой селективностью разделения энантиомеров и универсальностью, должны обладать также как можно большей эффективностью. Современные хиральные неподвижные фазы (chiral stationary phases, CSPs) на основе силикагеля обладают эффективностью порядка 30-80 тыс.т.т./м по оптически неактивным тестовым соединениям. По энантиомерам достигаемая эффективность всегда меньше предельной, поскольку многоточечное взаимодействие адсорбента с хиральными адсорбатами, необходимое для их дискриминации, всегда приводит к ухудшению кинетики массообмена, и, следовательно, эффективности. Хиральное разделение в большинстве случаев проводится в режиме нормально-фазовой хроматографии, однако в последнее время также довольно часто – в режимах обращенно-фазовой и гидрофильной хроматографии. В нормально-фазовом режиме удерживание определяется суммой нормально-фазового и квази-нормально-фазового типов, в обращенно-фазовом и гидрофильном режимах – суммой обращенно-фазового, нормально-фазового и ионообменного типов. К сожалению, в хиральной ВЭЖХ пока еще нет ни одной достаточно удовлетворительной теории, при помощи которой можно было бы заранее оценивать величину расщепления произвольной пары энантиомеров на какой-либо хиральной фазе. При необходимости разделить на энантиомеры новую рацемическую смесь обычно вначале испытывают наиболее универсальные фазы из имеющихся. Затем, в случае неуспеха, переходят к менее универсальным, или же пытаются достичь разделения за счет варьирования условий хроматографирования: состава элюента и температуры. При этом многое зависит от интуиции и практического опыта хроматографиста. Особым видом хиральной хроматографии является метод динамической хиральной ВЭЖХ. Его отличительной особенностью является то, что время превращения одного элюируюмого энантиомера в другой сравнимо со временем их элюирования. Динамический вариант хиральной хромтаографии применяется, к примеру, для разделения атропоизомеров – соединений, хиральность которых обусловлена заторможенным вращением вокруг одинарной связи. Полное разделение энантиомеров таких соединений осуществляется при пониженных температурах, необходимых для «замораживания» вращения. При высокой температуре на хроматограмме атропоизомера наблюдается лишь один пик. При понижении температуры пик расщепляется на два пика с характерной «перемычкой» между ними. Два полностью разрешенных пика наблюдаются при низкой температуре. Подобные эсперименты применяются для определения энергии активации взаимопревращения атропоизомеров. 5.1. Основные типы хиральных неподвижных фаз Неподвижные фазы для хиральной ВЭЖХ можно классифицировать по типу хирального селектора (табл. 5.1.1). Таблица 5.1.1. Классификация хиральных селекторов для неподвижных фаз. Источник Тип селектора Хиральный селектор Натуральные Протеины Альбумины Гликопротеины Энзимы α-Циклодекстрин β-Циклодекстрин γ-Циклодекстрин Ванкомицин Тейкопланин Ристоцетин Хинин Хинидин Дериватизированные циклодекстрины Карбаматы полисахаридов Сложные эфиры полисахаридов Ионообменные селекторы Производные пролина и других аминокислот (лигандообменные селекторы) Пиркловские фазы (фазы браш-типа) Олигосахариды Антибиотики Алкалоиды Полусинтетические Синтетические Модифицированные олигосахариды Модифицированные полисахариды Модифицированные низкомолекуярные природные соединения Низкомолекуярные синтетические соединения Синтетические полимеры Сшитые тартрамиды Полиакрилаты и полиакриламиды Импринтные материалы С практической же точки зрения наиболее удобно рассмативать их с позиции частоты применения. Безусловно, наиболее универсальными и широко применяющимися являются фазы с хиральными селекторами на основе модифицированных полисахаридов (карбаматов и эфиров). Считается, что, имея линейку трех или четырех фаз этого типа (Chiralcel OD, AD, OJ, AS), можно разделить до восьмидесяти процентов всех хиральных соединений (рис. 5.1.1). Рисунок 5.1.1. Разделение рацемата (структурная формула приведена на рисунке) на четырех различных фазах Chiralcel. Элюент гексан-изопропанол 100:10. Хроматограмма получена Ильиным М.М. (лаборатория ССП ИНЭОС РАН). Эти неподвижные фазы получают прививкой модифицированных полисахаридов на силикагельную основу. Производство налажено фирмой Diacel Chemical Industies, которая выпускает их под общим названием Chiralcel. Основными фазами серии являются Chiralcel OD (ODH, OD-R, OD-RH), Chiralcel AD (AD-H, AD-RH), Chiralcel OJ (OJ-H) и Chiralcel AS-H (AS-RH) (рис.). Большинство разделений проводятся в нормально-фазовом режиме, однако в последнее время широко начал применяться и обращенно-фазовый вариант, для которого были разработаны специальные модификации фаз (их названия включают аббревиатуру R, reversed, например, Chiralcel OD-RH). Рисунок. 5.1.2. Модификации фаз Chiralcel. Префикс «O» - производное целлюлозы, префикс «А» производное амилозы. Для разделения энантиомеров водорастворимых соединений широко применяются фазы с привитыми антибиотиками. Производство налажено фирмой Astec, которая выпускает их под общим названием Chirobiotic: Chirobiotic V с привитым антибиотиком ванкомицином, Chirobiotic R с ристоцетином, Chirobiotic T с привитым тейкопланином и Chirobiotic TAg – его производным. Эти фазы, первоначально разработанные для разделения аминокислот, прекрасно справляются с разделением многих гидрофильных хиральных соединений (рис. 5.1.3). Рисунок 5.1.3. Разделение гидрофильного рацемата на фазе Chirobiotic TAg. Элюент метанол-вода 1:1. Хроматограмма получена Ильиным М.М. (лаборатория ССП ИНЭОС РАН). Гораздо реже для разделения водорастворимых соединений применяются фазы с привитыми протеинами (табл. 5.1.2). Недостатками таких фаз является невысокая универсальность, эффективность и стабильность. В то же время, для некоторых соединений, структура которых сходна со структурой антигенов, фазы с привитыми протеинами способны проявлять непревзойденную селективость вплоть до α = 10-30 и выше. Таблица 5.1.2. Неподвижные хиральные фазы с привитыми протеинами. Протеин Коммерческое название Производитель BSA (бычий альбумин) Resolvosil BSA-7, BSA-7PX Ultron ES-BSA Chiral BSA Chiral HAS Chiral-HSA Chiral-AGP Ultron ES-OVM Biotic AV-1 Chiral-CBH Ultron ES-PEPSIN Nagel Shinwa Chemical Industries Shandon Shandon ChromTech AB ChromTech AB Shinwa Chemical Industries GL Sciences ChromTech AB Shinwa Chemical Industries HAS (человеческий альбумин) AGP (α1-гликопротеин) OMCHI (овомукоид яичного белка) AVI (авидин) CBH I (целлобиогидролаза I) Пепсин Значительная часть хиральных разделений проводится на фазах браш-типа (Пиркловского типа). Хиральными селекторами служат низкомолекулярные энантиомеры, привитые на силикагельную основу. Фазы браш-типа, как правило, применяются для нормально-фазовых разделений. Исключение составляют фазы с привитыми алкалоидами, которые применяются для ионообменных хиральных разделений. Одной из достаточно популярных фаз Пиркловского типа для нормально-фазовых определений является Whelk-O,1 фирмы Regis; структурная формула хирального селектора приведена на рисунке 5.1.4. Рисунок 5.1.4. Хиральные селекторы наиболее широко применяемых фаз Пиркловского типа. (а) Pirkle ULMO, (б) Whelk-O,1, (в) фаз с привитым хинином. Рисунок 5.1.5. Разделение пары энантиомеров и мезо-формы соединения (структура приведена на рисунке) на фазе 250х4.6 Whelk-O,1. Элюент гексан-изопропанол 100:4. Хроматограмма получена Ильиным М.М. (лаборатория ССП ИНЭОС РАН). К хиральным фазам на основе синтетических полимеров можно причислить Kromasil Chiral DMB и Kromasil Chiral TBB производства EKA Chemicals, полученные закреплением диметилбензоил- и третбутилбензоил- модифицированных тартрамидных полимеров на силикагельную основу. Эти фазы применяются для нормально-фазовых разделений (рис. 5.1.6). Рисунок 5.1.6. Разделение N,N’-ди(2,4-динитробензил)-транс-1,2-диаминоциклогексана на фазе Kromasil Chiral DMB. Элюент гексан-этилацетат 85:15. Для разделения широкого спектра хиральных веществ до недавнего времени широко применялись фазы на основе циклодекстринов, привитых на силикагельную основу. В настоящее время применение этих фаз в значительной мере сократилось. Циклодекстриновые фазы выпускаются фирмой Astec и носят общее название Cyclobond. Применяемые для прививки циклодекстрины отличаются прежде всего размером олигосахаридного цикла: наименьшим является α- и наибольшим – γ-циклодекстрин; наиболее универсальными являются фазы на основе среднего по размеру β-циклодекстрина. Фазы на основе α-, β- и γциклодекстринов обозначаются как Cyclobond I, Cyclobond II и Cyclobond III соответственно. Применяются также модификации этих фаз с дериватизированными циклодекстринами. Примечательно, что в оригинальных источниках циклодекстриновые фазы предлагалось назвать, по аналогии с Пиркловскими фазами, Армстронговскими по фамилии их изобретателя. Динамическим модифицированием обращенных фаз N-гексадецил-L-гидроксипролином с последующей пропиткой солью меди (II) получают фазы для лигандообменной хиральной хроматографии. Именного названия этот метод не имеет, однако сам модификатор, N-гексадецилL-гидроксипролин, называется модификатором Даванкова. Лигандный обмен применяется для хирального разделения α-аминокислот, α-гидроксикислот и их производных. Первое полное разделение энантиомеров методом жидкостной хроматографии (адсорбатом был пролин) было осуществлено именно методом лигандообменной хроматографии на полистирольной смоле со включенным L-пролином (В.А. Даванков в соавторстве с С.В. Рогожиным, патент 1968 г.). 5.2. Закономерности хиральной ВЭЖХ Одна из особенностей хиральной хроматографии состоит в том, что для успешного разделения адсорбат должен взаимодействовать с адсорбентом по крайней мере в трех точках. Иначе говоря, в оптимальном варианте должно достигаться множественное взаимодействие наиболее удерживаемого энантиомера с хиральной полостью. Только в этом случае разница в энергии адсорбции энантиомеров будет значительной, достаточной для их хроматографического разделения (разница в энергии адсорбции пропорциональна логарифму селективности). Таким образом, для повышения универсальности хиральных фаз разработчиками проводится поиск таких селекторов, которые обеспечивали бы по возможности максимально возможное количество взаимодействий с адсорбатами различных классов. Для тестирования селективности хиральных фаз существуют даже специальные наборы модельных веществ. Селекторы современных хиральных фаз способны к различным типам взаимодействий. В результате, удерживание на хиральных фазах, как правило, определяется суммой различных типов. Вклады различных типов могут быть сопоставимы по величине, при этом их величина может существенно различаться для адсорбатов даже сходной структуры. Так, в нормально-фазовых условиях большинство типов хиральных фаз могут удерживать соединения по нормально-фазовому и квази-нормально-фазовому типам одновременно. В этом случае для полярных адсорбатов без мощных ароматических систем в большей мере применимы закономерности нормально-фазовой хроматографии, а для неполярных ароматических адсорбатов – закономерности квази-нормально-фазовой хроматографии. Наиболее ярко эти закономерности отслеживаются на полисахаридных фазах типа Chiracel OD и Пиркловских фазах типа Whelk-O,1, поскольку такие фазы содержат в своей структуре как полярные функциональные группы, так и мощные ароматические системы. Тейкоплаиновые и ванкомициновые фазы в гидрофильном режиме способны удерживать адсорбаты по нормально-фазовому, обращенно-фазовому и ионообменному типам. Выявить закономерности изменения удерживания и селективности разделения в зависимости от состава элюента на этих фазах чрезвычайно сложно. Успешность разделения пары энантиомеров на определенной хиральной фазе зависит от нескольких факторов. Прежде чем начать их рассматривать, обратимся к понятию хиральной полости, которым оперируют при построении моделей хирального распознавания. Дискриминация (распознавание) энантиомеров на хиральных неподвижных фазах становится возможной по причине хиральности центров адсорбции энантиомеров. Величины энергий взаимодействия адсорбционного центра с каждым из энантиомеров различаются – соответственно, различаются и времена удерживания энантиомеров. Адсорбционный центр хирального селектора, включая его микроокружение (которое также участвует в связывании молекулы энантиомера), называется хиральной полостью. Согласно теории, для распознования энантиомера адсорбционным материалом необходимо его по крайней мере трехточечное взаимодействие с хиральной полостью. Каждый тип хиральных фаз характеризуется индивидуальной структурой хиральной полости. Как было установлено в специальных исследованиях, для полисахаридных фаз хиральной полостью может являться каждая структурная единица спирали, то есть каждый модифицированный остаток глюкозы. Для фаз браш-типа хиральной полостью является молекула селектора и ее окружение (включая спейсер). Для циклодекстриновых фаз хиральной полостью является молекула циклодекстрина, образующая с адсорбатами комплексы включения. Достаточно крупная молекула селектора может иметь несколько хиральных полостей, даже для одного энантиомера. Так, молекула альбумина HAS содержит один сайт связывания с Rибупрофеном, и по крайней мере два – с S-ибупрофеном. Отсутствие разделения энантиомеров при любой эффективности, то есть α = 1, может объясняться несколькими причинами. Очевидно, что разделения энантиомеров не происходит, если адсорбаты не проникают в хиральную полость. В свою очередь, это может быть вызвано тем, что: 1. размер молекулы адсорбата, или размер хиральной части его структуры, больше размера хиральной полости (рис. 5.2.1); 2. адсорбат не может проникнуть сквозь адсорбционный слой полярного модификатора, блокирующий хиральную полость (в нормально-фазовом режиме). Даже если адсорбат проникает в хиральное окружение, дискриминация энантиомеров может не происходить, так как: 3. при связывании не достигается «трехточечная» фиксация адсорбата; 4. адсорбат связывается с хиральной полостью преимущественно нехиральным участком. В случаях 1 и 3 разделение принципиально невозможно осуществить на выбранной неподвижной фазе. В случае 4 разделение можно провести, если значительно изменить хроматографическую систему. К примеру, можно перейти от нормально-фазовой системы к обращенно-фазовой или наоборот, если выбранный тип фазы это позволяет. Добиться разделения путем коррекции состава подвижной фазы и/или температуры можно только во втором случае. Рисунок 5.2.1. Разделение ряда производных ферроцена на фазе 250x4.6 Chiralcel OD-H. Элюент гексан-изопропанол 100:4. Хроматограмма получена Ильиным М.М. (лаборатория ССП ИНЭОС РАН). Разделение уменьшается справа налево, при замене достаточно компактного и способствующего удерживанию ароматического кольца на две метильные группы, а затем исчезает при замене одной метильной группы на более объемную трифторметильную, а другой – на более объемную тиофенильную. Некоторые структуры могут быть достаточно «трудными» для хирального разделения методом жидкостной хроматографии (рис. 5.2.2). Можно выделить несколько признаков, по которым «трудные» рацематы быстро распознаются: 1. Заместители при хиральном центре – небольшие и неполярные, примерно одинакового объема. Пример: хлор и метил. 2. Заместители при хиральном центре очень похожи, особенно вблизи хирального центра. 3. Молекула адсорбата достаточно крупная, с разветвленными алифатическими заместителями. В случае неудачного разделения в нормально-фазовом режиме можно попробовать разделить такую структуру на обращенно-фазовой системе. 4. Хиральный центр в составе крупной молекулы удален от ее наиболее полярного фрагмента или фрагмента с наиболее мощной ароматической системой. Рисунок 5.2.2. Пример разделения «трудного» рацемата на фазе 250x4.6 Chiralcel AS-H. Элюент гексан-этанол-триэтиламин 50:50:0.1. Хроматограмма получена Ильиным М.М. (лаборатория ССП ИНЭОС РАН). Хиральный центр одинаково удален от наиболее полярной части молекулы (вблизи сульфамидной группы) и от ароматических фрагментов (одно и другое ароматические кольца с заместителями). Только один заместитель при хиральном центре способен взаимодействовать с адсорбентом (аминогруппа). Разделение было достигнуто только на одной фазе, Chiralcel AS-H, причем оно не было стабильным – селективность зависела от трудно контролируемых параметров. В том случае, когда недостаточная селективность разделения энантиомеров обусловлена образованием адсорбционного слоя полярного модификатора, блокирующего хиральную полость, разделение может быть, в принципе, улучшено путем изменения состава подвижной фазы и/или температуры. Такие случаи характерны, в большей или меньшей степени, для всех хиральных фаз в нормально-фазовом режиме хроматографирования. Общий принцип улучшения разделения здесь можно сформулировать следующим образом: следует создать такие условия, в которых адсорбционный слой не образуется, или происходит его замена на адсорбционный слой другого модификатора, не препятствующего разделению. Примером хиральной фазы, к которой этот принцип применим в полной мере, является Kromasil Chiral DMB. Фаза, как было упомянуто, получена закреплением диметилбензоилмодифицированного тартрамидного полимера на силикагельную основу. Для этой фазы вклад квази-нормально-фазового типа удерживания невелик, значительно меньше, чем для типичных Пиркловских фаз. В результате, хиральное распознавание происходит по большей части за счет водородных связей амидных групп и влияния стерического фактора. Стоит также отметить, что и полярность этой фазы невысока – меньше, чем у нитрильной фазы, и значительно меньше, чем у силикагеля. Применение спиртов (особенно с разветвленными заместителями) как полярных добавок приводит в этом случае к резкому уменьшению селективности разделения. По этой причине, в качестве полярных добавок при применении Kromasil Chiral DMB применяют эфиры. Спирты, повидимому, блокируют амидные функциональные группы – при этом блокируются и хиральные полости. Этот эффект большей частью связан именно с поверхностью, поскольку для его проявления достаточно совсем небольшой концентрации спиртов в элюенте. Оптимальной полярной добавкой для Kromasil Chiral DMB является метил-третбутиловый эфир, который, из-за трет-бутильного заместителя, обладает наименьшей модифицирующей способностью даже среди эфиров. Подобные закономерности характерны также и для Пиркловских, и для полисахаридных фаз (рис. 5.2.3). Многие исследователи отмечали, что селективность разделения на них увеличивается при переходе от протонных полярных добавок к апротонными. Рисунок 5.2.3. Разделение рацемата аллилметилфенилкарбинола (2,3) на фазе 250x4.6 Chiralcel OD-H. Элюент гексан-хлороформ-уксусная к-та 95:3:2. При применении в качестве элюента системы гексан-изопропанол разделения не наблюдалось. Разделение было достигнуто при замене изопропанола на уксусную кислоту. Добавление в элюент хлороформа было вызвано необходимостью разделения рацемата (2, 3) от пика ацетофенона (1). Большое число случев влияния адсорбционного модифицирования и перемодифицирования на селективность разделения энантиомеров выявлено для полисахаридных фаз серии Chiralcel. Эти фазы характеризуются как наиболее высоким среди хиральных фаз вкладом квази-нормально-фазового типа удерживания (поскольку содержат замещенные ароматические фрагменты), так и чрезвычайно высокой полярностью, сравнимой или даже большей, чем у силикагеля. Еще одна их особенность связана с тем, что производителем не рекомендуется применять элюенты на основе иных растворителей кроме гексана, спиртов и воды (возможны небольшие добавки кислот и аминов). Соответственно, при разделении полярных соединений без спиртов не обойтись. Селективность разделения можно увеличить, применяя спирты с меньшим заместителем, или добавляя в элюент гексан-спирт небольшие количества воды. В последнем случае происходит перемодификация поверхности адсорбента, то есть молекулы спирта, блокирующие хиральные полости, заменяются на молекулы воды. Следует также заметить, что подобный процесс происходит и при замене одного спирта на другой, поскольку при этом нередко наблюдается значительное изменение селективности вплоть до инверсии порядка элюирования энантиомеров. Один из наиболее ярких примеров увеличения разделения энантиомеров вследствие перемодификации поверхности наблюдался при анализе бензимидазола тимопразола, проведенного на фазе Chiralpak AD при варьировании доли метанола в подвижной фазе гексанизопропанол 80:20. При составах элюента гексан-изопропанол-метанол от 80:20:0 до 80:15:5 разделение едва намечается. При достижении концентрации метанола в элюенте 5% наблюдается резкий скачок времени удерживания второго энантиомера (более удерживаемого) при неизменном времени удерживания первого энантиомера. В результате, происходит резкое увеличение селективности разделения, которое не изменяется при дальнейшем увеличении концентрации метанола в элюенте. Такие же случаи наблюдались и с применением воды в качестве перемодификатора. Иногда эти случаи бывали курьезными, как, к примеру, при разработке методики разделения полярных амидов 2-оксо-3-пиперидин-ацетамидов на фазе Chiralcel OD. Разделение, полученное в одной лаборатории на элюенте гексан-этанол 90:10 с 0.1% ТФУ не воспроизвелось в другой лаборатории – разделения не наблюдалось. Оказалось, что во второй лаборатории этанол был абсолютированный, тогда как в первой – обычный азеотроп с водой. Таким образом, в первом элюенте содержалось еще порядка 0.38% воды, за счет которой и достигалось полное разделение. Добавление воды не всегда приводит к увеличению селективности. Отмечены случаи, когда удерживание и селективность очень слабо зависят от концентрации воды в диапазоне 1-2 г/л; такая зависимость наблюдалась для α-гидроксиметопролола на фазе Chiralcel OD. По всей видимости, такой полярный адсорбат способен «пробить» любой адсорбционный слой. При увеличении концентрации воды удерживание второго энантиомера может уменьшаться при неизменном времени удерживания первого, что приводит к уменьшению селективности. Такая ситуация наблюдалась при хроматографировании метопролола на фазе Chiralcel OD. Метопролол менее полярен, чем α-гидроксиметопролол, и именно этим можно объяснить то, что вода в данном случае уже выступает как модификатор, блокирующий хиральные полости. Важным параметром, который необходимо по возможности контролировать при проведении разделений на полисахаридных фазах, является температура. Нередки случаи, когда при изменении температуры происходило изменение селективности вплоть до инверсии порядка элюирования энантиомеров. В целом же, несмотря на такие «тонкости», полисахаридные фазы остаются на сегодняшний день наиболее универсальными и эффективными хиральными неподвижными фазами. 6. Общие подходы к хроматографическому анализу различных объектов За время существования хроматографического метода, наверное, не осталось таких объектов, которые бы не подвергались хроматографическому анализу. Тем не менее, сами методы непрерывно изменяются и совершенствуются. По этой причине, для анализа одного и того же объекта может существовать целый ряд методов – от старых и привычных до самых новых. В этой главе будут перечислены основные подходы, которые могут применяться для анализа типовых объектов. 6.1. Фармацевтические препараты и природные алкалоиды Особое место среди объектов ВЭЖХ анализа занимают сильнодействующие синтетические фармацевтики и природные алкалоиды. С химической точки зрения алкалоиды являются органическими соединениями с азотсодержащими функциональными группами, проявляющими основные свойства: аминами и/или азотсодержащими гетероциклическими соединениями. С момента возникновения жидкостной хроматографии подобные соединения считались «трудными» для хроматографирования, поскольку на «обычных» обращенных и нормальных фазах они зачастую элюируются в виде уширенных асимметричных пиков. Исследования этой проблемы привели к появлению специальных неподвижных фаз для анализа азотистых оснований, а также к разработке определенных хроматографических приемов для увеличения эффективности их разделения. Для анализа фармацевтиков и алкалоидов, как правило, применяется обращенно-фазовая хроматография, хотя в последнее время все чаще начинает применяться гидрофильная хроматография. Приложения же нормально-фазовой хроматографии сравнительно редки, и, за некоторыми исключениями, ограничены хиральными разделениями. По типу применяемых неподвижных фаз хроматографические методы анализа азотсодержащих веществ можно классифицировать следующим образом: 1. Анализ на обращенных фазах старого типа (Silasorb C18, Separon C18, LiChrosorb RP-18) с применением аминов в качестве динамических модификаторов. 2. Анализ на обращенных фазах нового типа, полученных на основе соль-геля (sol-gel): с последующим интенсивным эндкеппингом (Wakosil II C18RS, Zorbax Eclipse XDB C18, Hypersil BDS C18), модифицированого лигандами с полярной группой (Discovery Amide C16, SymmetryShield C18) – а также на основе силикагеля «гибридного» типа, получаемого полимеризацией алкилсилоксанов (XTerra). 3. Анализ методом гидрофильной нормально-фазовой хроматографии на аминофазах и силикагелях. 4. Анализ методом нормально-фазовой хроматографии с применением различных модификаторов (как правило, этот метод применяется только для хиральных разделений). При хроматографировании на обращенных фазых старого типа азотсодержащие соединеня элюируются в виде уширенных асимметричных пиков. По общепринятому мнению, этот эффект большей частью обусловлен взаимодействием основных адсорбатов с силикагельной матрицей, содержащей «активные силанолы» и примеси металлов. Для блокирования поверхности силикагеля необходимо динамически модифицировать адсорбент, что достигается добавлением в водноорганическую подвижную фазу 0.1-1% алифатического амина, к примеру, триэтиламина (рис. 6.1.1, 6.1.2). Для регулирования рН, который в большинстве методик устанавливается в диапазоне от 2 до 7, применяются фосфорная, трифторуксусная, уксусная кислоты. Рисунок 6.1.1. Разделение реакционной смеси, содержащий основный карборан. 250х4 LiChrospher100 RP18, элюент ацетонитрил-буфер 60:40. Буфер – 0.5 мл триэтиламина на 100 мл воды, рН 2.8 фосфорной к-той. Рисунок 6.1.2(а). Хроматограмма модельной смеси фармацевтических препаратов. 150×3 Separon SGX С18, элюент ацетонитрил-водный буфер (1 об.% триэтиламина, рН 3.0 фосфорной кислотой) 30:70. Рисунок 6.1.2(б). Компоненты модельной смеси. Значительно уменьшить асимметрию пиков при разделении основных адсорбатов также можно, перейдя в режим ион-парной хроматографии (рис. 6.1.3). В качестве ион-парного реагента в этом случае следует применять гексил, гептил или додецилсульфонат в концентрации ниже ККМ (порядка 1-10 мМ, в зависимости от реагента и состава водноогранической системы). Рисунок 6.1.3. Стандарт алкалоида йохимбина. 250x4.6 Inertsil ODS. Элюент ацетонитрил-буфер 45:55. Буфер – 5мМ додецилсульфата, рН 2.5 фософорной к-той. УФ 270 нм. Хорошие результаты, в том числе, дают системы с одновременной добавкой ион-парного реагента с небольшим алифатическим заместителем (гексил или гептилсульфоната) и алифатического амина (триэтиламина). Регулирование удерживания осуществляется изменением рН фосфорной или трифторуксусной кислотой, а также варьированием состава водноорганической основы элюента. Значительного изменения удерживания можно добиться изменением концентрации ион-парного реагента. Применение динамического модифицирования позволят в большинстве случаев увеличить эффективность разделения азотсодержащих соединений до приемлемого уровня. Тем не менее, такие системы обладают рядом недостатков. Применение алифатических аминов и ион-парных реагентов, особенно в случае их недостаточной чистоты, может привести к появлению на хроматограмме ряда системных пиков (рис. 6.1.4). Особенно сильно этот негативный эффект проявляется при детектировании в коротковолновой УФ области. При изократическом элюировании системные пики, в принципе, могут и не причинять больших неудобств, если только не накладываются на пики адсорбатов. Для правильной интерпретации хроматограммы достаточно провести перед анализом холостое элюирование и идентифицировать все системные пики – как положительные, так и отрицательные. При градиентном элюировании адсорбционное равновесие в системе динамическими модификаторами непрерывно изменяется в течение хроматографического анализа. Последствия могут быть самыми неприятными: от значительного дрейфа базовой линии до появления большого числа системных пиков большой интенсивности (особенно в коротковолновой УФ области). Ухудшаться может и воспроизводимость времен удерживания адсорбатов. При использовании систем с ион-парыми реагентами и другими модификаторами вместо градиентного элюирования лучше применять несколько изократических систем с различной элюирующей силой. В крайнем случае, допустим градиент органического растворителя не более 5-10%. Более терпимы к градиенту системы, содержащие значительную долю органического растворителя. В то же время, неудачей могут закончиться попытки градиентного элюирования на системах с динамическим модифицированием, если стартовый состав элюента содержит значительную долю водного буфера. Так, доказано, что несколько системных пиков, проявляющихся на хроматограммах при применении систем с триэтиламином в качестве модификатора, обусловлены адсорбцией-десорбцией триэтиламина. При старте с элюента, содержащего значительную долю буфера, эти системные пики выходят в начале хроматограммы, полностью закрывая (при детектировании на коротких длинах волн) значительную ее часть. CH3 O N C 3.15 AU CH2 Cl C N 210 nm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Рисунок 6.1.4. 75х2.0 Silasorb SPH 5 C18. Градиентное элюирование, элюент А: Диэтиламин (0,5/150 мл воды) + ТФУ до рН3, Б: Ацетонитрил. Градиент: 0-500 мкл 5% Б, 500-2500 мкл 5-70% Б. Скорость подачи: 200 мкл/мин. УФ 210 нм. Хроматограмма предоставлена Удаловым А.В. Помимо динамического модифицирования адсорбента, увеличить эффективность разделения азотсодержащих соединений можно, применяя элюенты с высокой концентрацией 0.10.2 М неорганических солей, к примеру, перхлората лития. С практической точки зрения такой метод значительно уступает методу с применением динамического модифицирования органическими добавками: концентрированные растворы неорганических солей являются агрессивными средами, разрушающими силикагель, что особенно справедливо для недостаточно гидролитически стабильных силикагелей старого типа. Проводить разделения основных азотсодержащих соединений без применения систем с динамическим модифицированием стало возможным благодаря появлению ряда неподвижных фаз, специально созданных для этой задачи. В результате, проводить анализ такого рода адсорбатов в настоящее время можно и в режиме градиентного элюирования. Наличие такой возможности дает неоценимые преимущества при скрининговых анализах фармацевтических препаратов и алкалоидов в различных биологических объектах (рис. 6.1.5). Рисунок 6.1.5. Хроматограмма модельной смеси высокоосновных фармацевтических препаратов. 150x4.6 Wakosil C8 RS, элюент метанол-(20мМ фосфатный буфер) 62:38. Скорость подачи 1 мл/мин. УФ 254 нм. 1 – протриптилин, 2 – нортриптилин, 3 – доксепин, 4 – имипрамин, 5 – амитриптилин, 6 – тримипрамин. www.sge.com Применение подобных неподвижных фаз в сочетании с системами с динамическим модифицированием позволяет добиться для основных соединений идеальной формы хроматографических пиков и максимальной, «паспортной» эффективности разделения (рис. 6.1.6). Рисунок 6.1.6. 150x4.6 Wakosil C18 AR. Ацетонитрил-(50мМ фосфатный буфер, 1% диэтиламина, рН 3.5 фосфорной к-той) 10:90. Скорость подачи 1 мл/мин. УФ 210 нм. 1 – скополамин, 2 – атропин, 3 – бруцин. www.sge.com Силикагель и полярные фазы на его основе применяются для разделения фармацевтических препаратов и алкалоидов в режиме гидрофильной хроматографии. Популярность метода гидрофильной хроматографии быстро растет в связи с совместимостью хроматографических систем с ВЭЖХ-МС аппаратурным оформлением. Градиентные гидрофильные системы с масс-спектрометрическим детектированием часто применяются для поиска и идентификации метаболитов в биологических жидкостях. Сам метод, соответственно, становится одним из основных инструментов комплексного исследования новых фармацевтических препаратов. Гидрофильные системы характеризуются порядком элюирования, противоположным обращенно-фазовому: гликозиды удерживаются сильнее агликонов. По этой причине, преимуществом гидрофильной хроматографии является возможность надежного удерживания и селективного разделения гликозидов алкалоидов и гидрофильных метаболитов синтетических фармацевтиков. Нормально-фазовая хроматография применяется для разделения основных азотсодержащих соединений очень редко. Как правило, этот метод применяется только для хиральных разделений фармацевтических препаратов и полупродуктов их синтеза. В рамках классических нормально-фазовых систем могут быть проанализированы только соединения умеренной полярности. Другим фактором, ограничивающим применимость таких систем, является плохая растворимость полярных соединений в неполярных элюентах. К счастью, для определения энантиомерного состава определенной пары оптических изомеров полное растворение образца не является необходимым – концентрация соединения в пробе должна лишь быть достаточной для хорошего детектирования. Для анализа основных соединений в нормально-фазовых условиях применяются подвижные фазы с добавками комплексных динамических модификаторов, неотъемлемым компонентом которых является алифатический амин (например, триэтиламин). При подборе оптимального динамического модификатора можно комбинировать алифатический амин с алифатической кислотой (триэтиламин-уксусная кислота), и с водой (триэтиламин-уксусная кислота-вода, водный раствор ацетата аммония). При применении комплексных модификаторов следует помнить, что концентрация солей в неполярном элюенте должно быть минимальным, ориентировочно – не более 0.1%. Даже если элюент выглядит гомогенным, соли могут выпасть в осадок на колонке. 6. Общие подходы к хроматографическому анализу различных объектов 6.2. Природные фенольные соединения Различные фенольные соединения широко распостранены в природных объектах растительного происхождения. Они могут встречаться как в виде различных гликозидов, так и в форме свободных агликонов. Природные фенольные соединения можно подразделить на простые: фенолы, оксибензойные и оксикоричные кислоты, кумарины, – и полифенольные. К полифенольным соединениям относятся флавоноиды, а также полимерные фенольные соединения (например, лигнины). Методом ВЭЖХ могут определяться все виды фенольных соединений. Флавоноиды (фенольные соединения, в основе имеющие структуру, подобную флавану) являются наиболее широким классом природных фенольных соединений, и представлены флавонолами, дигидрофлавонолами, флавонами, флавононами, изофлавонами, антоцианами, проантоцианами, катехинами, халконами, флаванами, пренилированными производными флавоноидов и другими типами соединений. При анализе фенольных соединений, которые содержатся в образце в виде гликозидов, существуют два варианта анализа: без гидролиза образца и с его предварительным гидролизом. Анализ с гидролизом образца применяется для количественной оценки содержания гликозидов фенольных соединений путем количественного анализа соответствующих им агликонов, выделяющихся при гидролизе. Удобство метода состоит в том, что количество агликонов значительно меньше числа соответствующих им гликозидов; в результате, количественный анализ растительного препарата может быть проведен при наличии лишь нескольких стандартных образцов агликонов. По этому методу проводится определение флавонолов и изофлавонов. Рисунок 6.2.1. Хроматограмма гидролизата травяного бальзама. 250х4.6 Inertsil ODS. Элюент метанол-0.1% фосфорная к-та в воде 80:20. Флавонолы: 1 – кверцетин, 2 – кемпферол, 3 – изорамнетин. УФ 370 нм. Рисунок 6.2.2. Хроматограмма гидролизата соевой муки. 250х4.6 Inertsil ODS. Элюент метанол-0.1% фосфорная к-та в воде 30:70. Изофлавоны: 1 – дайдзеин, 2 – глицетеин, 3 – генистеин. УФ 270 нм. В анализе без гидролиза определяется весь спектр гликозидов. Этот анализ применяется в в тех случаях, когда требуется получить не только некоторую суммарную количественную характеристику образца, но также просмотреть гликозидный профиль анализируемого растительного препарата. По этому методу в основном определяются оксикоричные кислоты и их гликозиды, профиль антоцианов. Сравнение полученного гликозидного профиля с эталоном применяют для проверки подлинности объекта исследования. Рисунок 6.2.3. Хроматограмма оксикоричных кислот в биологически активной добавке на основе хвои. 250х4.6 Wakosil C18 AR. Элюент ацетонитрил-0.1% фосфорная к-та в воде 15:85. УФ 330 нм. Рисунок 6.2.4. Хроматограмма антоцианов черники. 250х4.6 Wakosil C18 AR. Элюент ацетонитрил2% фосфорная к-та в воде 12.5:87.5. Вид. 520 нм. Анализ без гидролиза применяется для анализа свободных агликонов: катехинов, дигидрофлавонолов, пренилированных халконов и флавононов. Для ВЭЖХ анализа фенольных соединений традиционно применяется обращенно-фазовая хроматография, однако в последнее время для этих целей все чаще применяется гидрофильная хроматография. В гидрофильных системах порядок элюирования противоположен обращеннофазовому: сначала элюируются агликоны, затем моногликозиды и дигликозиды. 6. Общие подходы к хроматографическому анализу различных объектов 6.3. Ароматические углеводороды Ароматические соединения могут быть разделены в обращенно-фазовом, нормальнофазовом и квази-нормально-фазовом режимах. Ароматические углеводороды разделяется на силикагеле или аминофазе при элюировании чистым гексаном или гексаном с небольшими добавками полярных растворителей. Удерживание происходит за счет сравнительно слабых индукционных взаимодействий, и возрастает при увеличении сопряженной ароматической системы адсорбатов. Сходным с ароматическими углеводородами хроматографическим поведением обладают слабоосновные гетероциклические соединения типа индола и карбазола. Этот способ анализа имеет большой недостаток: удерживание чрезвычайно чувствительно к ряду параметров, влияющих на состояние адсорбционного слоя полярной фазы. Для достижения приемлемых результатов должны применяться только тщательно осушенные реактивы; вся система должна термостатироваться. Даже в этом случае разрешение и воспроизводимость времен удерживания быстро ухудшаются, если образцы содержат значительные количества влаги. В настоящее время этот метод применяется только в пробоподготовке для выделения фракций ароматических углеводородов. Общепринятым методом для разделения широкого круга ароматических соединений является обращенно-фазовая хроматография. В этом режиме отлично разделяются метиленовые гомологи ароматических соединений. На С18 фазах области элюирования моно-, би- и трициклических углеводородов перекрываются. С другой стороны, обращенные С18 фазы с высокой массовой долей углерода характеризуются максимальной метиленовой селективностью, то есть способностью разделять гомологичные соединения. На фазах с нейтральным сверхсшитым полистиролом типа Chromalite 5HGN (Purolite) в обращенно-фазовых условиях области элюирования моно-, би- и трициклических углеводородов практически не перекрываются: вначале элюируются гомологи моноароматики, затем гомологи биароматики и так далее. Вместе с тем, Chromalite 5HGN характеризуется меньшей метиленовой селективностью, чем С18 фазы. Обращенно-фазовая хроматография является стандартным методом анализа полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). В достаточно редких случаях для улучшения разделения полиароматических, в том числе гетероциклических, соединений в водноорганический элюент добавляют растворимую соль серебра. При этом удерживание соединений, образующих с серебром комплексы в подвижной фазе, уменьшается. Этот метод исключает возможность детектирования в ближней УФ области. Нейтральные и замещенные ароматические соединения можно разделить в квазинормально-фазовом режиме. В первом приближении, порядок элюирования похож на таковой для нормально-фазового режима, поскольку удерживание также возрастает при увеличении сопряженной ароматической системы адсорбатов. Однако, как удерживание, так и селективность разделения ароматических углеводородов для квази-нормальной хроматографии значительно выше, чем для нормально-фазовой хроматографии. Подобные разделения можно проводить на пиренил-модифицированных силикагелях, графитированной пористой саже типа Hypercarb, сверхсшитых полистирольных фазах типа Chromalite 5HGN. Квази-нормально-фазовые системы с применением сверхсшитого полистирола обладают большой гибкостью, поскольку в неполярных элюентах в дополнение к основному квази-нормальнофазовому типу удерживания определенные вклады могут вносить также эксклюзионный и обращенно-фазовый типы. Эксклюзионный тип проявляется даже для мономолекулярных соединений, поскольку неподвижная фаза обладает молекулярными микропорами размера 20-30 ангстрем. Обращенно-фазовый тип проявляется даже в сравнительно неполярных средах по причине значительной гидрофобности сверхсшитого полистирольного материала. При элюировании гексаном с добавкой хлористого метилена группы ароматических углеводородов разделяются по квази-нормально-фазовому типу, а гомологи внутри групп – по эксклюзионному типу. Метиленовая группа имеет отрицательный вклад в удерживание; таким образом, удерживание уменьшается при увеличении объема алкильного заместителя. В системе с элюентом хлористый метилен-метанол отрицательный эксклюзионный вклад алкильных групп приблизительно нейтрализуется положительным вкладом обращенно-фазового типа. В результате, разделение гомологов подавляется; моно-, би- и триароматические углеводороды элюируются в виде трех достаточно узких пиков. Алифатические углеводороды и олефины элюируются в нулевом объеме. Эта система может применяться для группового анализа ароматических углеводородов в нефтях и различных топливах. 6.4. Сахариды и полиспирты Основной характеристикой углеводов, определяющей выбор хроматографического метода определения, является количество входящих в их структуру мономерных единиц. По этому признаку углеводы можно подразделить на три группы: моносахариды и полиспирты, олигосахариды и полисахариды. Для разделения углеводородов могут применяться различные виды хроматографии: гидрофильная, ионобменная, эксклюзионная (в сочетании с лигандным обменом или без), обращенно-фазовая. Гидрофильная хроматография применяется для разделения моносахаридов и некоторых олигосахаридов. Как правило, для этого вида анализа применяют аминофазы на силикагельной основе. В последнее время начали применяться также аминофазы на полимерной основе. Изократические условия пригодны для определения профиля моно- и дисахаридов. Для определения олигосахаридов необходимо градиентное элюирование. В изократичесских условиях для детектирования достаточно рефрактометрического детектора, в градиентных условиях необходим испарительный детектор светорассеяния. Для гидрофильной хроматографии характерен следующий порядок элюирования: фруктоза, глюкоза, мальтоза, мальтотриоза. Ионобменная хроматография применяется для разделения моносахаридов и олигосахаридов в виде анионов. Для этого вида анализа применяют анионобменные фазы на полимерной основе, к примеру, AminoPac PA10 (Dionex), RCX-30 (Hamilton). Изократическое элюирование щелочным буфером применяют для разделения моносахаров; для определения олигосахаридов необходимо градиентное элюирование. Для детектирования применяют кондуктометрический или электрохимический детектор. Для анионобменной хроматографии характерен следующий порядок элюирования: глюкоза, фруктоза, мальтоза, мальтотриоза. Олигосахариды и полисахариды анализируются методом эксклюзионной хроматографии. Для анализа олигосахаридов в основном применяются фазы на основе сульфированных макропористых сшитых полистиролов в различных ионных формах. Разделение на подобных фазах в кальциевой, серебряной, а также свинцовой форме происходит не только по эксклюзионному механизму. Заметный вклад вносит также лигандный обмен. В конечном итоге, выбор ионной формы фазы определяется оптимальной для определенного объекта селективностью. В эксклюзионной хроматографии углеводы элюируются в следующем порядке: мальтотриоза, мальтоза, глюкоза, фруктоза (этот порядок элюирования одинаков для всех фаз, однако селективность может изменяется достаточно сильно). Для анализа полисахаридов с большой молекулярной массой применяются как гидрофильные, так и гидрофобные широкопористые эксклюзионные фазы. К примеру, анализ пектинов может быть проведен на гидроксиметакрилатных фазах в водном элюенте. Анализ целлюлозы проводят на полистирол-дивинилбензольных фазах с применением диметиламидного раствора хлорида лития в качестве элюента. В некоторых случаях олигосахариды могут быть разделены на гидрофобных обращенных фазах, совместимых с 100% водными подвижными фазами. Так, для подобного анализа применялась C30 фаза Develosil 5 RP-Aqueous (Nomura Chemical). Также, в режиме обращенно-фазовой хроматографии моносахариды могут быть разделены в виде их производных, к примеру, гидразонов. 6.5. Аминокислоты, пептиды и белки Для разделения аминокислот, пепетидов и белков разработано множество хроматографических систем, которые удобнее рассматривать по виду применяемого метода. Обращенно-фазовая хроматография в основном применяется для разделения пепетидов и дериватизированных аминокислот. Для разделения белков в обращенно-фазовых системах применяются специальные типы широкопористых и перфузионных неподвижных фаз. В некоторых случаях для разделения недериватизированных аминокислот применяется ион-парная обращенно-фазовая хроматография. В качестве ион-парного реагента можно применять либо додецилсульфат, либо специально разработанный реагент – пентафторпропионовую кислоту. Гидрофильная хроматография применяется для анализа недериватизированных аминокислот и пепетидов. Разделение можно проводить в градиентных условиях. Ионная хроматография применяется для разделения аминокислот. Так, в модификации метода, разработанной Dionex, разделение проводится на полимерной пелликулярной аминофазе при применении градиентного элюирования достаточно сложного профиля. Ионная хроматография белков в градиенте рН элюента называется хроматофокусированием. В качестве неподвижной фазы применяют, как правило, аминофазу. Порядок элюирования белков совпадает с порядком изменения их изоэлектрических точек. Для выделения и разделения специфических антигенов применяют метод высокоэффективной аффинной хроматографии. Единственным методом, позволяющим разделить белковые соединения без потери их биологической активности, является метод эксклюзионной хроматографии на полярных фазах. В качестве элюента необходимо применять водный буфер, в котором разделяемые белки сохраняют биологическую активность. 6.6. Липиды В большинстве случаев для разделения липидов применяется обращенно-фазовая хроматография. В качестве неподвижных фаз целесообразно применять специально разработанные для этого вида анализа С30 обращенные фазы. Привитый слой этих фаз не нарушается в элюентах с такими сравнительно неполярными растворителями, как ацетон, ТГФ, изопропанол. Таким образом, применение подобных растворителей не приводит к потере эффективности разделения. Примечательно, что С30 фазы проявляют селективность, несколько отличную от С18 фаз. Так, бета- и гамма- токоферолы не могут быть разделены на С18 фазах. На С30 фазе Develosil 5 RPAqueous все четыре изомера токоферолов разделяются до базовой линии. Раньше считалось, что такое разделение можно осуществить только методом нормально-фазовой хроматографии. Как уже было отмечено, в обращенной-фазовом анализе липидов подвижные фазы часто содержат достаточно неполярные растворители. Основной целью их применения является повышение растворимости липидов в подвижной фазе. Другим приемом, позволяющим увеличить растворимость неполярных адсорбатов, является термостатирование хроматографической системы при повышенной температуре. Для разделения полярных липидов может применяться и нормально-фазовая хроматография. Так, жирорастворимые витамины достаточно хорошо разделяются на силикагеле. Нормально-фазовые и гидрофильные системы также применяются для разделения полярных фосфолипидов. 7. Технические приемы в жидкостной хроматографии Правильность, надежность, легкость проведения хроматографических определений во многом зависят от уровня владения оператором рядом технических приемов, которые при отсутствии специализированных курсов по практике метода нередко постигаются путем многих проб и ошибок. В этой главе перечислены некоторые технические приемы и тонкости работы на хроматографических приборах. Их знание может помочь в решении проблем, с которыми сталкиваются все начинающие специалисты хроматографического метода. 7.1. Общие требования к проведению хроматографического анализа К технике выполнения любых хроматографических определений предъявляются некоторые общие требования. Прежде всего, необходимо отметить те из них, которые вызывают у начинающих специалистов больше всего вопросов. 1. Кондиционирование помещения. В помещении, где устанавливается жидкостной хроматограф, не должно быть резких колебаний температуры. Изменение температуры может привести к изменению удерживания, эффективности, и даже селективности разделения. В летнюю жару в некондиционированных помещениях сильно затрудняется работа с нормально-фазовыми легкокипящими подвижными фазами. В течение дня происходит их постепенное испарение, которое приводит к изменению состава элюента. При пониженных температурах появляются проблемы в работе с элюентами, обогащенными водой и/или содержащими спирты. Вязкость таких элюентов резко возрастает при понижении температуры, что приводит к повышению давления в системе. Влияние небольших колебаний температуры на разделение можно устранить, термостатируя хроматографическую колонку, или всю жидкостную систему (что возможно не для всех хроматографов). 2. Качество электропитания. Большинство современных хроматографов оснащено системами стабилизации питания, однако, качество электропитания на месте также должно быть высоким. При недостаточно хорошем электропитании любой запуск серии определений в автоматическом режиме может окончиться неудачей из-за сбоя. 3. Чистота растворителей. Для приготовления подвижных фаз следует применять особо чистые растворители. В общем случае, требования, предъявляемые к чистоте подвижной фазы, зависят от способа детектирования, метода элюирования (изкратического или градиентного), чувствительности детектора к целевому аналиту и его концентрации. При применении УФ детектирования требования к чистоте растворителей повышаются при переходе к коротковолновому диапазону, менее 230-240 нм. Для изократического элюирования при УФ детектировании на длинах волн, больших 220-240 нм, можно применять растворители марки «ос.ч.» и воду-дистиллят. Все реагенты, добавляемые в подвижную фазу, также должны быть достаточно чистыми; кристаллические реагенты перед применением бывает полезно перекристаллизовать. Для градиентного элюирования необходимо применять растворители марки «для жидкостной хроматографии» («for liquid chromatography») и воду-бидистиллят. Особые требования в методе градиентного элюирования (в обращенно-фазовой хроматографии) предъявляются к чистоте водного буфера и воды в частности. Прежде всего это связано с тем, что на начальной стадии элюирования адсорбент поглощает из обогащенной водным буфером подвижной фазы загрязняющие компоненты, которые в дальнейшем элюируются и проявляются на хроматограмме в виде «горбов», «порогов» и отдельных пиков, сильно затрудняющих выделение полезных сигналов аналитов. Наиболее чистые растворители требуются для проведения групповых определений следовых количеств веществ в режиме градиентного элюирования. Для выполнения определений в градиентном режиме элюирования, а также прецизионных определений в изократическом режиме, подвижная фаза должна применяться однократно, то есть элюат должен сбрасываться или утилизироваться. При изократическом элюировании, если нет особенных проблем с чувствительностью, отработанный элюент можно применять повторно. Система, в которой элюат после прохождения через детектор поступает обратно в емкость с подвижной фазой, называется «системой с рециклом». Особенно полезной такая система оказывается в случае проведения большого числа рутинных изократических определений на стандартных колонках (250х4.6, 150х4.6) при объемной скорости порядка 1 мл/мин. В этих случаях система с рециклом обеспечивает экономию до 200-300 мл органического растворителя в день. Такая экономная система позволяет применять для анализа очень чистые, дорогие растворители. Вопрос экономии дорогих растворителей стоит менее остро в случае применения микроколонок (80х2, 100х2), поскольку для проведения разделения требуется на порядок меньший объем подвижной фазы. 4. Дегазация растворителей. Растворители, применяющиеся в хроматографии для приготовления подвижных фаз, обычно содержат растворенный воздух. Особенно много воздуха содержит вода. При работе на недегазированных элюентах пузырьки воздуха попадают в различные узлы жидкостной системы: насос, колонку, капилляры, детектор. При попадании воздуха в жидкостную систему на хроматограмме появляются высокие периодические шумы, вызванные колебанием давления в жидкостной системе. Это приводит к резкому уменьшению чувствительности анализа. Для удаления воздуха их элюента проводят его дегазацию. Как правило, дегазируют только элюенты для обращенно-фазовых разделений – поскольку водноорганические смеси содержат значительные количества растворенного воздуха. Особенно тщательно дегазация должна осуществляться в случае градиентного элюирования, а также при применении флуориметрического детектирования. В ходе градиентного элюирования в обращенно-фазовом режиме происходит смешивание двух элюентов – водноорганических смесей различного состава. Смешивание недегазированных элюентов приводит к интенсивному выделению растворенного воздуха, что критично для проведения определения в целом (на хроматограмме пузырьки воздуха регистрируются в виде резких «выбросов» на нулевой линии). Чувствительность флуориметрического детектирования уменьшается при высоком содержании растворенного воздуха в подвижной фазе (происходит тушение флуоресценции). Такиим образом, при применении флуориметрического детектирования дегазации элюента должно уделяться особое внимание. Существует три основных способа дегазации подвижных фаз для жидкостной хроматографии. а. Дегазация вакуумом – элюент выдерживают в колбе Кляйзена под вакуумом водоструйного насоса в течение нескольких минут. При проведении дегазации следует избегать кипения элюента. б. Термическая дегазация применяется для дегазации водноорганических элюентов с высокой долей воды. Подвижную фазу помещают в колбу, которую не герметично закрывают пробкой, и оставляют в водной бане при температуре около 50ºС. Через 10-15 минут колбу закрывают пробкой герметично и охлаждают ее под струей воды до комнатной температуры. в. Дегазация ультразвуком. Подвижную фазу несколько минут обрабатывают ультразвуком, а затем дают ей остояться в течение 10-15 минут. Этот способ часто бывает недостаточно эффективен для дегазации водноорганических элюентов. Современные насосные системы для жидкостной хроматографии комплектуются системами автоматической дегазации. Тем не менее, при проведении градиентных анализов обе подвижные фазы лучше дегазировать предварительно и «вручную», по одному из приведенных методов. 5. Фильтрация подвижной фазы. Для обеспечения бесперебойной работы насоса подвижную фазу желательно фильтровать под вакуумом с применением мембранного фильтра. 6. Промывка колонки и узлов жидкостной системы. После работы с водноорганическими подвижными фазами, содержащими соли и кислоты, всю жидкостную систему (включая колонку) следует промыть дистиллированной водой с добавлением 5-10% органического растворителя. Такая промывка делается для того, чтобы в нерабочее время дополнительно не изнашивались узлы жидкостной системы хроматографа и сама неподвижная фаза. Не проведение такой промывки грозит прежде всего тем, что после остановки насоса на его деталях и стенках кюветы детектора из элюента осаждаются соли, что приводит к неустойчивой работе прибора в целом, а также преждевременному износу движущихся частей насоса. Регулярное отсутствие промывки системы от содержащих соли и кислоты элюентов может привести к сокращению времени жизни неподвижной фазы. Добавка к промывочной воде некоторого количества органического растворителя необходима для предотвращения биологического загрязнения жидкостной системы. 7. Переход на новую подвижную фазу, которая не смешивается с предыдущей. Такой переход осуществляется через промежуточный растворитель, неограниченно смешивающийся с обеими подвижными фазами – обычно, через изопропанол или ацетон. Для перехода с водного элюента на неполярный элюент жидкостную систему следует промыть водой с добавкой органического расворителя, затем снять хроматографическую колонку, промыть систему изопропанолом (ацетоном), промыть систему неполярным элюентом, установить новую колонку. Для обратного перехода снимают хроматографическую колонку, промывают жидкостную систему изопропанолом (ацетоном), затем водным элюентом, затем ставят новую колонку. При переходе от водного элюента к неполярному следует заранее убедиться, что материал уплотнений насоса расчитан на работу с неполярными растворителями. 8. Фильтрация пробы. Если анализируемая проба содержит нерастворенную взвесь, то ее желательно отфильтровывать, пропуская пробу через мембранный фильтр, соединенный со шприцем. К сожалению, если пробы мало, менее миллилитра, то профильтровать ее таким способом становится практически невозможно. При регулярном анализе проб, содержащих взвеси, входной фильтр на колонке (фрит) может засориться, что приведет прежде всего к увеличению давления в системе. В этом случае входной фильтр лучше заменить, а при отсутствии замены – промыть его в органическом растворителе с обработкой ультразвуком в течение 10-15 минут. Наиболее оптимальным решением проблемы является применение ин-лайн фильтра перед колонкой. Ин-лайн фильтр содержит сменный фрит – такой же, как и на колонке. Замена фрита на ин-лайн фильтре является рутинной операцией, которая может проводиться достаточно часто. 9. Применение предколонок. При регулярном анализе «грязных» проб хроматографическая колонка достаточно быстро загрязняется и теряет свою разделительную способность. Известной альтернативой тщательной пробоподготовки в этом случае является применение предколонки, защищающей основную колонку от загрязненя. Иногда пробоподготовку целесообразно вообще не проводить, а поставить в линию перед основной колонкой ин-лайн фильтр и предколонку. Преимуществами этой схемы являются простота и экспрессность анализов при меньшей затрате труда и реагентов. 10. Консервация хроматографических колонок. Перед достаточно длительным хранением хроматографические колонки промываются и заполняются растворителем, вполне определенным для каждого типа неподвижной фазы. Так, хроматографические колонки для работы в нормально-фазовых системах обычно заполняются высококипящим углеводородом, например, изооктаном. Обращенные фазы промывают водой и заполняют ацетонитрилом, или на небольшой скорости подачи – изопропанолом. Фазы, предназначенные для работы с водными буферами, заполняются водой с небольшой добвкой азида натрия (бактериостатика). Инструкции по хранению колонки могут указываться в ее паспорте. 11. Хранение водных буферов. В случае проведения рутинных определений бывает достаточно удобно готовить сразу большой объем водного буфера для приготовления подвижной фазы. К сожалению, водный буфер не может храниться больше нескольких дней, если не добавить в него азид натрия, бактериостатик. Очень плохо хранятся подвижные фазы на основе фосфатного буфера. Иногда большой объем водного буфера готовят для того, чтобы «повысить воспроизводимость анализа». Вообще говоря, при таком подходе вопроизводимость анализа не повышается, а вот проблемы с хранением буфера появляются неизбежные. Вообще же говоря, ответ на вопрос – готовить ли водный буфер на неделю или на один день? – определяется исключительно принципом удобства. 12. Регулярность проведения калибровки. Как правило, калибровку по стандарту проводят каждый день, или же каждый раз при приготовлении нового элюента. Калибровка проводится при достижении стационарного состояния хроматографической системы; считываемыми параметрами являются время удерживания пика стандарта, его площадь (при спектрофотометрическом детектировании – на опорной длине волны), спектральные отношения (при применении сканирующего или диодно-матричного спектрофотометрического детектора). В начале работы стандарт может быть проанализирован дважды – для подтверждения воспроизводимости времени удерживания. 7.2. Выбор оптимального растворителя для приготовления пробы Для приготовления пробы стараются по возможности применять растворители, обладающие в используемой хроматографической системе наименьшей элюирующей силой. В этом случае размывание хроматографической зоны на входе в колонку также оказывается наименьшим, а эффективность – максимально достижимой в рамках данной системы. С этой точки зрения, «идеальным» растворителем для приготовления пробы является гексан для нормальнофазового режима, и вода для обращенно-фазового режима (по крайней мере, для разделения нейтральных веществ). На практике же такое простое решение встречается довольно редко, поскольку к растворителю для приготовления пробы предъявляется и ряд других требований. Прежде всего, растворитель должен обеспечивать достаточную растворимость компонентов пробы. Лучшим является вариант, когда проба (при комнатной температуре) представляет собой прозрачный раствор без взвеси и опалесценции. Вода пригодна для приготовления проб (имеются в виду пробы для обращенно-фазовых определений) лишь наиболее полярных, водорастворимых соединений. В целом, лучшей растворимостью, чем вода, обладают ее смеси с органическими растворителями – водноорганические смеси пригодны для растворения даже достаточно неполярных соединений. С другой стороны, чем больше в смеси органического растворителя, тем выше ее элюирующая сила, и тем больше размывание хроматографической зоны при инжекции. Та же ситуация характерна и для нормально-фазовой хроматографии: многие полярные вещества могут недостаточно хорошо растворяться в чистом гексане. В результате, необходимо применять его смеси с каким-либо более полярным растворителем. С другой стороны, опять же, – чем больше доля полярного компонента, тем большей элюирующей силой обладает такой составной растворитель, и тем больше размывание хроматографической зоны просходит при инжекции. Удачным компромиссом между двумя противоположными требованиями: большей растворяющей способности и меньшей элюирующей силы – является применение самой подвижной фазы для приготовления пробы. Этот метод также хорош тем, что проба при инжекции вызывает минимальное возмущение в хроматографической системе. Если же состав растворителя пробы сильно отличается от состава подвижной фазы, то стационарное состояние хроматографической системы в момент ввода пробы частично нарушается, что может привести к появлению на хроматограмме нежелательных системных пиков. Обычно, если состав растворителя для приготовления пробы не известен заранее (определение ведется не по методике), то прежде всего пробуют растворить образец именно в подвижной фазе. Если образец не полностью растворяется в подвижной фазе, то в качестве растворителя стоит попробовать «сильный» компонент подвижной фазы (модификатор или полярную добавку, соответственно). Далее, есть два варианта: вводить пробу непосредственно в «сильном» компоненте элюента, или сначала разбавить пробу его «слабым» компонентом. Без преувеличения можно сказать, что этот выбор во многом является определяющим для методики определения в целом. Ввод пробы непосредственно в «сильном» компоненте всегда является мерой вынужденной – когда нет ни времени для экспериментов, ни достаточного количества образца – то есть в случае потоковых рутинных определений. Этот способ всегда связан с опасностью выпадения компонентов пробы в осадок непосредственно в хроматографической колонке. Нередко при применении такого способа введения пробы можно наблюдать эффект резкого падения эффективности разделения – хроматографические пики «расплываются», принимают трапецевидную форму, иногда расщепляются – в этом случае надо либо разбавлять пробу «слабым» компонентом (иногда достаточно совсем небольшой добавки), либо уменьшать объем вводимой пробы. Перечисленные проблемы наиболее характерны для потоковых определений чистоты синтетических продуктов комбинаторной химии: как правило, образцы отдаются для хроматографического анализа в виде их раствора в дейтеро-ДМСО (диметилсульфоксиде) – растворителе, обладающего очень высокой элюирующей силой. Существуют хроматографические работы, в которых утверждается, что в этом случае для проведения определений хорошо подходит градиентная обращенно-фазовая хроматография. При этом изначально предполагается, что в начале градиента компоненты пробы выпадают в осадок, но затем постепенно растворяются обогащенной модификатором подвижной фазой и элюируются в виде достаточно узких пиков. Такая техника элюирования достаточно необычна, но вполне возможна. В большинстве же случаев пробу, растворенную в «сильном» компоненте подвижной фазы, перед вводом разбавляют «слабой» основой. Здесь важно знать, при каком составе растворителя проба представляет собой насыщенный раствор (наименее растворимого компонента). При последовательном разбавлении пробы (прозрачного раствора) в определенный момент должна появиться слабая опалесценция; достигнутый к этому моменту состав пробы как раз соответствует насыщенному раствору. Вводимую пробу нельзя разбавлять «слабым» компонентом подвижной фазы до состояния насыщенного раствора – необходимо оставлять некоторый запас растворяющей способности. Для проведения правильного определения образец должен быть растворен количественно; из этого правила существует всего два исключения. Неполное растворение сухого остатка допускается, если точно известно, что целевые аналиты при этом растворяются количественно. Во-вторых, количество растворенного вещества не играет большой роли в случае определения оптической чистоты одного из энантиомеров пары. Отсутствие необходимости полностью растворять образец открывает много новых возможностей приготовления пробы; сохраняется лишь единственное условие: количества вещества в пробе должно быть достаточно для его детектирования. Так, образец можно растворить в «сильном» компоненте подвижной фазы, а затем неограниченно разбавлять «слабым» компонентом (при этом образец будет выпадать в осадок); таким способом можно уменьшить элюирующую силу растворителя пробы и увеличить эффективность разделения. Если кристаллический образец медленно растворяется в подвижной фазе, то подвижную фазу с образцом можно нагреть до кипения, затем охладить до комнатной температуры и немного разбавить чистым элюентом: количества вещества в пробе вполне может хватить для его детектирования. Вообще, в водных элюентах можно растворить небольшие количества даже чрезвычайно неполярных веществ; верно и обратное – в элюентах на основе гексана можно растворить небольшие количества водорастворимых соединений. В первом случае неполярное вещество растворяется в гексане (хлороформе), небольшая часть полученного раствора переносится в изопропанол; часть раствора в изопропаноле, в свою очередь, переносится в водный элюент. Во втором случае гидрофильное вещество растворяется в воде, часть раствора переносится в изопропанол, часть раствора в изопропаноле – в элюент на основе гексана. 7.3. Техника проведения градиентного элюирования в обращенно-фазовой хроматографии В жидкостной хроматографии существуют два способа элюирования: изократический и градиентный. В изократическом методе применяется одна подвижная фаза постоянного состава. При градиентном элюировании состав подвижной фазы изменяется в течение анализа. Непрерывное изменение состава подвижной фазы осуществляется программируемым смешиванием двух или нескольких подвижных фаз (непрерывный градиент), либо последовательным элюированием несколькими подвижными фазами (ступенчатый градиент). Программа изменения состава подвижной фазы называется профилем градиента. При градиентном элюировании каждая последующая подвижная фаза должна обладать большей элюирующей силой, чем предыдущая. Хотя на стыке эксклюзионной и адсорбционной хроматографии возможно также применение градиентов уменьшающейся элюирующей силы, такая техника является редким исключением, и здесь рассматриваться не будет. В дальнейшем, первая подвижная фаза с наименьшей элюирующей силой будет называться начальной, а последняя подвижная фаза с наибольшей элюирующей силой – конечной. Смысл применения градиентного элюирования заключается в возможности разделения в рамках одной системы (и за приемлемое время) соединений, сильно различающихся по своим адсорбционным свойствам. Допустим, при изократическом элюировании подвижной фазой А слабо удерживаемые компоненты пробы хорошо удерживаются и разделяются, но сильно удерживаемые компоненты не элюируются вообще. Если же взять подвижную фазу Б с высокой элюирующей силой, то, напротив, сильно удерживаемые соединения элюируются в приемлемое время и хорошо разделяются, а слабо удерживаемые компоненты не удерживаются вообще (и, естественно, не разделяются). Для определения в этом случае надо применять либо две эти изократические системы совместно, либо одну, но градиентную: взяв подвижную фазу А как начальную ступень и подвижную фазу Б как конечную ступень градиента. Важным параметром градиентного элюирования, во многом определяющим разделение, является форма профиля градиента (то есть программа изменения элюирующей силы подвижной фазы). Профиль градиента определяется прежде всего селективностью разделения соединений – соответственно, его оптимальную форму нетрудно подобрать, если предварительно провести пробное изократическое элюирование некоторой средней по элюирующей силе подвижной фазой, и создав из этого разделения наглядное представление о селективности выбранной системы. «Вогнутый» градиент (с пологим участком в начале) применяется в случае критического разделения слабо удерживаемых соединений; «выпуклый» градиент (с пологим участком в конце) – в случае критического разделения сильно удерживаемых соединений. Если селективность разделения хорошая, то для разделения достаточно наиболее простого, линейного градиента, который и применяется в большинстве случаев. Наконец, если разделение и слабо удерживаемых, и сильно удерживаемых соединений критично, то вместо градиентного элюирования лучше применять два или более изократических элюирования различными по силе подвижными фазами (иногда употребляется термин «разбить градиент на изократические системы»). Аппаратура не всегда позволяет запрограммировать плавную форму градиента, однако всегда можно составить градиент из линейных участков различного наклона. Некоторые насосы шприцевого типа позволяют работать со ступенчатыми градиентами; в этом случае профиль градиента формируется из ступеней разной высоты и продолжительности. Важной особенностью градиентного элюирования является сужение хроматографических зон разделяемых компонентов в течение анализа – пики на хроматограмме в некоторый момент достигают максимальной ширины, и далее начинают сужаться. Этот эффект наиболее ярко проявляется в области быстрого изменения элюирующей силы, то есть на крутом участке профиля градиента. Как следствие, эффективность хроматографической колонки нельзя измерить в условиях градиентного элюирования. Сказанное выше в равной степени относится к любому виду градиентного элюирования. В обращенно-фазовой хроматографии этот способ элюирования применяется наиболее часто, особенно в сочетании с распостраненным и достаточно универсальным методом УФ детектирования. При применении обращенно-фазового градиентного элюирования в сочетании с УФ детектированием (далее в этой главе речь будет вестись только о таких системах) особые требования предъявляются к чистоте растворителей и реагентов для приготовления подвижных фаз. Если подвижная фаза содержит адсорбирующиеся примеси, поглощающие УФ излучение, то в ходе определения они будут вначале поглощаться адсорбентом, а затем элюироваться; на хроматограмме это будет соответствовать дрейфу нулевой линии (в виде «порогов», «горбов», «подъемов») и (или) появлению системных пиков, затрудняющих обработку хроматограммы, или вообще делающих ее невозможной. Трудности, связанные с применением недостаточно чистых подвижных фаз, тем существеннее, чем больше разница в элюирующей силе между начальной и конечной ступенями. Чрезвычайно нежелательным при проведении градиентного элюирования является применение элюентов с добавкой различных реагентов. Концентрация реагента в подвижной фазе достаточно велика, следовательно, значительны и ее колебания в элюате в ходе градиентного элюирования, что регистрируется УФ детектором (особенно в коротковолновой области) как резкий дрейф нулевой линии. По этой причине чрезвычайно редки примеры применения градиентного элюирования в ионпарной обращенно-фазовой хроматографии. В крайнем случае, провести градиентное элюирование в этом случае можно, если начальная и конечная ступени не слишком сильно различаются по элюирующей силе, и каждая ступень содержит равное (или конечная ступень немного большее) количество ион-парного реагента. Нежелательно также применять градиентное элюирование в тех случаях, когда подвижная фаза содержит добавки алифатических аминов (такой тип элюентов применяется для повышения эффективности разделения основных азот-содержащих соединений). Градиентное элюирование лучше заменить двумя или несколькми изократическими – как и в случае ион-парной хроматографии. При крайней необходимости применения градиента для проведения определения следует применять неподвижные фазы специального типа, разработанные для разделения азотсодержащих соединений, и подвижные фазы без добавок аминов. Повышенные требования при градиентном элюировании предъявляются и к дегазации элюентов. При недостаточно тщательной дегазации процесс смешивания двух водноорганических элюентов разного состава сопровождается интенсивным выделением растворенного воздуха, что сильно затрудняет проведение определения. Особенно характерна эта проблема для случая, когда начальной ступенью градиента является водный буфер без добавки модификатора (поэтому желательно в качестве первой ступени применять буфер с содержанием хотя бы трех-пяти процентов модификатора). Одна из технических ошибок при проведении градиентного элюирования связана с тем, что две емкости для элюента заполняются непосредственно исходным водным буфером и модификатором; формирование же начальной и конечной ступеней как таковых происходит автоматически в смесителе – в результате, незначительная экономия времени на приготовлении элюентов может обернуться сбоем работы жидкостной системы хроматографа из-за выделения пузырьков воздуха. Проблема с выделением воздуха в жидкостной системе при градиентном элюировании уменьшается до приемлемого уровня в современных приборах, оснащенных системами автоматической дегазации. При работе на простых или устаревших системах элюенты необходимо тщательно дегазировать. Определенными преимуществами в этом случае обладают приборы с возможностью создания ступенчатого градиента, поскольку элюент каждой ступени можно дегазировать по отдельности. Как уже было отмечено, при градиентном элюировании происходит сужение хроматографических зон элюируемых соединений, в результате чего достигается их концентрирование перед регистрацией детектором. Таким образом, при градиентном элюировании чувствительность определения можно значительно повысить, что на практике осуществляется двумя способами. Во-первых, объем пробы при градиентном элюировании, в отличие от изократического, может быть значительно увеличен без сильной потери эффективности. Так, в стандартную колонку 250х4.6 можно вводить до 100 мкл пробы и более. В этом случае, как правило, применяют «вогнутые» градиенты. Далее, профиль градиента можно подобрать таким образом, чтобы целевой аналит элюировался на его плато после резкого подъма. Резкий подъем градиента необходим для концентрирования аналита, а задержка при выходе градиента на плато – для стабилизации нулевой линии и, соответственно, уверенного детектирования. В заключение можно отметить, что метод обращенно-фазового градиентного элюирования особенно хорошо подходит для групповых определений и скрининговых исследований, а также количественного анализа веществ низкой концентрации. По сравнению с изократическим элюированием, метод обладает рядом повышенных требований к технике исполнения, аппаратуре и применяемым реагентам. 7.4. Ручная разметка хроматограммы Разметка хроматограмы осуществляется для выделения на ней ряда полезных сигналов – пиков целевых аналитов – и получения их характеристик: времен удерживания, площадей, спектральных отношений (при многоволновом спектрофотометрическом детектировании). Алгоритм разметки хроматограммы включает несколько этапов: 1. выделение нулевой линии (вычитание фона); 2. нахождение максимумов пиков; 3. определение начала и конца каждого пика; 4. возможная дополнительная коррекция сигнала; 5. получение численных параметров пиков. Выделение нулевой линии. В идеальном случае нулевая линия должна оставаться на одном уровне в течение всего анализа, но на практике это выполняется далеко не всегда. Даже при изократическом элюировании нулевая линия может дрейфовать, изменять свое положение. Еще более эта ситуация характерна для градиентного элюирования, где дрейф нулевой линии может стать серьезой проблемой. Верное выделение нулевой линии чрезвычайно важно при интегрировании пиков (определении их площадей), покольку именно ей пик ограничивается «снизу». Неопределенность хода нулевой линии автоматически приводит к неточности интегрирования пиков и ошибке количественного анализа. Если нулевая линия «прописана» на одном уровне до начала и после конца пика (группы пиков), то ее поведение очевидно – она остается на том же уровне и во время выхода пика (или их группы). Если же эти уровни не совпадают, ситуация усложняется, и многое начинает зависеть от практического опыта оператора. Ход нулевой линии должен быть восстановлен, основываясь на ее участках, «прописанных» на хроматограмме. Нулевая линия выделяется оператором путем отметки на хроматограмме реперных точек, которые затем соединяются прямолинейными участками. Реперными точками, как правило, являются точки начала и конца отдельных пиков или групп неразделившихся пиков. Нахождение максимумов пиков. Если времена выхода пиков целевых аналитов известны заранее, то на хроматограмме обычно отмечаются все пики с временами удерживания, близкими к искомым. Определение начала и конца каждого пика. Эта операция может стать серьезной проблемой, если пики не разделены до базовой (нулевой) линии. Наиболее распостраненным методом разделения группы пиков является метод перпендикуляра: из точек перегиба между пиками на нулевую линию опускаются перпендикуляры, каждый из которых является концом одного из пиков и началом другого. Значительно реже применяется метод аппроксимации: неразделившиеся пики аппроксимируются гауссовыми кривыми; исходными данными являются максимумы пиков, которые отмечаются вручную. Возможная дополнительная коррекция сигнала. При небольном отношении сигнал/шум пика его форму можно сгладить перед интегрированием. Если во время выхода пика произошел короткий «выброс», отразившийся на хроматограмме, то форму пика можно скорректировать, убрав сигнал «выброса». Получение численных параметров пиков на современном оборудовании осуществляется автоматически. 7.5. Количественный анализ Задача количественного анализа состоит в определении концентрации целевых аналитов в образце. Непосредственно измеряемой величиной является площадь пика аналита. В дальнейшем, площадь пика, в зависимости от метода, пересчитывается либо в количество аналита, содержащееся в части пробы, введенной в хроматограф (количество аналита «в пике»), либо сразу в количество аналита во всей пробе. Путем дальнейшего пересчета найденное количество аналита можно перевести в его концентрацию в образце, или какой-либо иной показатель (вопрос пересчета концентрации будет рассмотрен в этой главе далее). Количественный анализ может осуществляться двумя способами, один из которых называется методом внутреннего стандарта, а другой – методом внешнего стандарта. В жидкостной хроматографии, в отличие от хроматографии газовой, наиболее часто применяют метод внешнего стандарта. В методе внешнего стандарта площадь пика аналита на хроматограмме сравнивается с площадью пика внешнего стандарта, получаемого при отдельном анализе пробы с известным количеством аналита; при этом хроматографические условия анализа проб образца и стандарта должны быть одинаковы. По методу внешнего стандарта вначале рассчитывают количество аналита «в пике»; искомая величина находится по формуле n = (S/Sст)nст, где S – площадь пика аналита в пробе образца, Sст – площадь пика стандарта, nст – известное количество аналита в пике стандарта. Для калибровки хроматографа можно получить одно значение Sст для одного значения nст, то есть одну точку; такой способ калибровки называется одноточечной. Его применение допустимо, если: 1. зависимость Sст от nст практически не отличается от линейной в рабочем диапазоне концентраций; 2. для выполнения цели анализа достаточно установить, является ли концентрация аналита в образце больше или меньше некоторого порогового значения; 3. не требуется высокая точность определения. Если необходимо достичь высокой точности определения при зависимости Sст от nст, значительно отличающейся от линейной в рабочем диапазоне концентраций, тогда по нескольким экспериментальным точкам (nст,Sст) строят калибровочную кривую, охватывающую необходимый диапазон. Для каждой точки на калибровочной кривой производится оценка ошибки определения. Анализ стандартного раствора аналита проводится также для уточнения времени удерживания его пика. По этой причине одноточечную калибровку желательно проводить каждый рабочий день, а также каждый раз при переходе на свежий элюент. Метод внутреннего стандарта является стандартным методом количественного анализа в газовой хроматографии, однако в ряде случаев он применяется и в хроматографии жидкостной. Сущность метода заключается в сравнении площадей двух пиков на хроматограмме: пика аналита и пика определенного вещества (внутреннего стандарта), введенного до анализа в пробу в известном количестве. В этом случае непосредственно рассчитываемой величиной является количество аналита во всей пробе, которая находится по формуле n = k(S/Sст)nст, где S – площадь пика аналита, Sст – площадь пика внутреннего стандарта, nст – известное количество внутреннего стандарта, добавленное во всю пробу, k – коэффициент, обусловленный разностью в чуствительности детектора между аналитом и внутренним стандартом (определяется для каждого аналита). Сравнивая ее с формулой для метода внешнего стандарта, можно заметить два отличия. Так, в случае внутреннего стандарта в формуле появляется коэффициент k, обусловленный тем, что внутренним стандартом является не аналит, а другое вещество. Второе отличие заключается в том, что расчет ведется не на количество аналита «в пике», а на его количество во всей пробе. По этой причине точность расчета не зависит от погрешности введения пробы, что и обуславливает широкое применение метода в газовой хроматографии (в системах с делением потока, где точно отмерить объем пробы просто невозможно). Если площади пиков аналита и внутреннего стандарта линейно зависят от их концентраций, то точность количественного анализа по методу внутреннего стандарта не зависит ни от объема вводимой пробы, ни от объема всей пробы. Из-за последнего обстоятельства метод внутреннего стандарта применяется и в жидкостной хроматографии, когда измерение объема всей пробы является задачей проблематичной, или увеличивающей трудоемкость методики определения. В качестве примера можно привести прямые определения веществ в гетерогенных реакционных смесях, гидролизатах не до конца растворяемых матриц, или в пробах, получаемых перерастворением сухого остатка в чрезвычайно малом объеме летучего растворителя. Внутренний стандарт также может найти применение в случае групповых определений структурно подобных соединений, если зависимость площадей пиков аналитов от их концентраций значительно отклоняется от линейной в измеряемом диапазоне. Строго говоря, значения поправочных коэффициентов k справедливы лишь при применении детекторов одного типа с одинаковыми настройками оптической системы. По этой причине, значения k надо не просто брать из литературных источников, а по возможности определять экпериментально, хотя бы частично. Однако, во многих случаях этими «тонкостями» пренебрегают. Пересчет концентрации вещества «в пике» или в пробе на его концентрацию в образце осуществляется по пропорции: Собр = (Vаликв / nобр) * Саликв , где Собр – объемная (массовая) концентрация аналита в образце; Саликв – объемная концентрация аналита в аликвоте (объеме вводимой пробы или всей пробы); nобр – объем (масса) образца; Vаликв – объем аликвоты. Также можно вначале определить массу или количество аналита во всей пробе, а затем просто разделить это значение на массу или объем образца, из которого эта проба была приготовлена. При пересчете концентрации аналита на какое-либо другое «стандартное» соединение необходимо умножить концентрацию аналита на молекулярную массу «стандартного» соединения и разделить на молекулярную массу аналита. Особого внимания заслуживают случаи, когда концентрацию аналита определяют, не имея его стандартов (в методе внешнего стандарта) или точных значениний поправочных коэффициентов (в методе внутреннего стандарта). Есть два типа таких случаев. Концентрацию аналита можно оценить, если есть стандарт другого, но структурно подобного соединения, экстинкция которого сильно не отличается от экстинкции аналита. Концентрацию «по структурно подобному соединению» необходимо умножить на молекулярную массу аналита и разделить на молекулярную массу подобного соединения. В серьезных методиках такого рода концентрацию аналита, определенную приведенным выше способом, умножают также на поправочный коэффициент, характеризующий отличие в чувствительности детектора между данным веществом и структурно подобным веществом, на которого идет пересчет концентрации (все эти коэффициенты должны быть приведены в методике). К примеру, таким образом производится определение суммы оксикоричных кислот. Для проведения анализа небходим стандарт феруловой кислоты, который применяется для расчета концентраций индивидуальных кислот. На заключительном этапе концентрации индивидуальных кислот складываются. Если же проводить поправки только на молекулярную массу, без учета разницы в коэффициентах экстинкции, то конечное значение будет называться «суммарной концентрацией оксикоричных кислот в пересчете на феруловую кислоту». В принципе, для самых поверхностных оценок суммарной концентрации подобных аналитов поправки на разницу в молекулярных массах можно также не вносить. Так, в приведенном выше примере можно сложить площади всех пиков оксикоричных кислот и получить некоторое значение «концентрации» в предположении, что экстинкция и молекулярная масса всех кислот соответствует таковым для феруловой кислоты. При этом следует помнить, что определенная таким образом величина не может даже называться «суммарной концентрацией оксикоричных кислот в пересчете на феруловую кислоту». Подобные методы оценки концентрации всегда полны двусмысленностей: конечное значение зависит от кого, как считать – учитывая разницу в молекулярных массах (коэффициентах экстинкции), или нет. Поэтому к ним следует относиться с известной осторожностью. Второй случай связан с количественным анализом соединений путем их перевода какимлибо химическим методом в одно или несколько других соединений, для которых имеются стандарты. Рассмотрим эту ситуацию на наглядном примере: допустим, необходимо определить суммарную концентрацию различных гликозидов какого-либо одного агликона, для которого имеется стандарт. Образец подвергается гидролизу, методом внешнего стандарта определяется концентрация в образце агликона. На этой стадии можно и остановиться, применяя для полученного значения формулировку «в пересчете на агликон», но можно пойти и далее. В этом случае возникнет вопрос: как от концентрации агликона перейти к суммарной концентрации его гликозидов? Для этого концентрацию агликона нужно умножить на некоторый коэффициент, определенный в результате широкого исследования гликозидного состава данного типа растительного сырья; такие коэффициенты должны быть приведены в методиках, или могут быть найдены в оригинальных литературных источниках. Подобный коэффициент в идеале должен учитывать и распределение гликозидов по массе, и среднее различие в чуствительности дететора между агликоном и его гликозидами. Если растительное сырье фальсифицированно, то применять такой метод пересчета нельзя. С большой осторожностью его следует применять и при анализе различных видов сырья из различных регионов. 8. Исследование в жидкостной хроматографии Жидкостная хроматография является не только замечательным аналитическим методом и достаточно обширным разделом знаний, но также широким полем исследовательской деятельности. Исследования в жидкостной хроматографии могут вестись по нескольким направлениям: 1. исследование химического состава образца с применением комплекса хроматографических методов; 2. разработка аналитических методик; 3. синтез новых неподвижных фаз и исследование их свойств; 4. исследование межмолекулярных взаимодействий. 8.1. Применение комплекса хроматографических методов для исследования химического состава образца. Объектом хроматографического исследования может быть некоторый образец или ряд подобных образцов неизвестного (возможно, предполагаемого) химического состава. Нередко предметом интереса является не сам образец, а вещество или группа веществ, которые в нем могут содержаться. В целом, для решения задачи можно применить, к примеру, следующий алгоритм. 1. Экстракция, растворение образца в различных растворителях. 2. Разделение веществ, содержащихся в экстрактах (растворах) на группы по различным свойствам при помощи «классических» и адсорбционных методов. 3. Скрининговый анализ проб и идентификация интересующих соединений. 4. Разработка метода выделения целевых соединений из матрицы (включая препаративное выделение и очистку). Разработка аналитического метода контроля чистоты выделяемых соединений. 5. Препаративное выделение целевых соединений и их характеризация спектральными методами. Рассмотрим каждую из этих стадий подробнее. 8.1.1. Методы и условия извлечения соединений из матрицы. Прежде всего, исследуемый образец должен быть проэкстрагирован или растворен в подходящих растворителях. Если природа целевых соединений априори неизвестна, то можно рекомендовать четыре вида растворителей для получения начальных экстрактов (растворов). 1а. Полярный органический растворитель: метанол, ацетонитрил – возможно, для большей растворимости образца – в смеси с ТГФ, изопропанолом или ацетоном. Такой экстракт (раствор) будет содержать достаточно полярные вещества. 1б. Неполярный растворитель: гексан, толуол; для большей растворимости образца можно добавлять хлороформ или хлористый метилен, диэтиловый эфир, этилацетат. Такой экстракт (раствор) будет содержать неполярные вещества. 1в. Растворитель на основе кислого водного буфера. Для большей растворимости образца водный буфер можно смешивать с полярными органическими растворителями: метанолом, ацетонитрилом. Такой экстракт (раствор) будет содержать основные вещества. 1г. Растворитель на основе щелочного водного буфера. Для большей растворимости образца водный буфер также можно смешивать с полярными органическими растворителями. Такой экстракт (раствор) будет содержать кислотные вещества. 8.1.2. Адсорбционные методы разделения соединений на группы согласно их физикохимическим свойствам. Существуют две техники адсорбционного разделения веществ на группы. Условно их можно обозначить как твердофазную экстракцию (ТФЭ) и адсорбционную очистку. В методе адсорбционной очистки на адсорбенте удерживаются сопутствующие компоненты, а целевые соединения остаются в элюате. В методе ТФЭ на первой стадии целевые соединения поглощаются адсорбентом. Такая ситуация обеспечивает значительную гибкость адсорбционного метода подготовки пробы. Так, адсорбент с целевыми соединениями может быть промыт подходящими растворителями для удаления ряда сопуствующих компонентов. При этом должно соблюдаться единственное условие: целевые соединения не должны «теряться», то есть элюироваться, или разрушаться в применяемых средах. Более того, методом градиентного элюирования (при пробоподготовке, как правило, низкого давления) целевые соединения можно дополнительно дифференцировать по величине определенного физико-химического свойства. Целевые органические соединения могут быть разделены на группы в соответстствии со следующими свойствами: величина молекул, полярность-неполярность, гидрофильностьгидрофобность, кислотность-основность (величина заряда: отрицательного, положительного), а также по количеству и степени сопряжения ненасыщенных, в том числе ароматических, систем в молекуле (назовем это свойство «ненасыщенностью»). 2а. Величина молекул. По свойству величины молекул соединения разделяются в эксклюзионном режиме. Выбор типа неподвижной фазы обусловлен прежде всего растворителем для элюирования, который в идеале должен совпадать с растворителем, в котором приготовлена проба, и обеспечивать отсутствие вклада адсорбционного механизма в удерживание. Эксклюзионное разделение, даже предварительное, проводится методом колоночной хроматографии низкого (высокого) давления в стеклянных (стальных) колонках достаточно большого объема. Этим предварительное разделение эксклюзионным методом отличается от подобных разделених адсорбционными методами, для которых более практично применять небольшие картриджи. Несмотря на трудоемкость и длительность предварительных эксклюзионных разделений, при проведении серьезных исследований они применяются весьма часто. Причина состоит в том, что эксклюзия является оптимальным методом разделения мономеров, олигомеров и полимеров химически сходных соединений. 2б. Полярность-неполярность. По свойству полярности соединения разделяются в нормальнофазовом режиме на полярных адсорбентах. В большинстве случаев адсорбентом является силикагель или полярные материалы на его основе (амино-, циано-, диол- и цвиттер-ионные фазы), а образец – экстрактом (раствором) матрицы в неполярном растворителе. В этом случае полярные соединения поглощаются адсорбентом, а неполярные остаются в элюате. Полярные вещества затем элюируются с адсорбента полярным органическим растворителем или водноорганической смесью. 2в. Гидрофильность-гидрофобность. По свойству гидрофобности соединения разделяются в обращенно-фазовом режиме на неполярных адсорбентах. Для этой цели применяются различные типы материалов: С8 и С18 модифицированные силикагели, полимерные и углеродные адсорбенты. Образец, как правило, представляет раствор в воде или в водноорганической смеси, однако при применении ряда полимерных и углеродных адсорбентов можно концентрировать вещества из их растворов в полярных органических растворителях. В этом методе гидрофобные соединения поглощаются адсорбентом, а гидрофильные остаются в элюате. Гидрофобные вещества затем элюируются с адсорбента полярными органическими растворителями, а со сверхшитых полистирольных и углеродных материалов также неполярными растворителями. 2г. Кислотность-основность. По свойству кислотности соединения разделяются на «сильных» анионообменных материалах, а по свойству основности – на «сильных» катионообменных. В целом, образец может наноситься в любом растворителе, однако наибольшее удерживание будет достигаться, если образец наносить в водном буфере или в водноорганическом растворителе с рН, способствующим ионизации целевых соединений. Слабокислые органические соединения затем элюируются с анионообменных материалов органическими растворителями или водноорганическими смесями с добавкой кислот (добавка кислоты способствует переводу целевых соединений в молекулярную, менее удерживаемую форму). Слабоосновные органические соединения элюируются с катионообменных материалов органическими растворителями или водноорганическими смесями с добавкой аммиака или других оснований. 2д. Насыщенность-ненасыщенность. По свойству ненасыщенности достаточно неполярные органические соединения можно разделить в квази-нормально-фазовом режиме на адсорбентах, содержащих электрон-донорные/акцепторные фрагменты. Одним из лучших материалов, применяемых в данном случае, является сверхсшитый полистирол; также можно применять силикагели, модифицированные полиароматическими углеводородами, и углеродные материалы. Образец может наносится в любом растворителе; единственное требование состоит в том, чтобы целевые соединения поглотились адсорбентом. Целеые соединения дифференцируются по свойству ненасыщенности путем градиентного элюирования смесями гексана с хлороформом, хлористым метиленом, ацетоном, толуолом, этилацетатом, ТГФ – при увеличении концентрации добавки. При нанесении образца, растворенного в алифатическом углеводороде, к примеру, гексане, ненасыщенные соединения остаются на адсорбенте, а насыщенные – в элюате. Ненасыщенные соединения затем элюируются хлороформом, хлористым метиленом, ацетоном, толуолом. 8.1.3. Скрининговый анализ проб и идентификация интересующих соединений. Каждая из групп выделенных соединений может быть исследована с помощью различных физико-химических методов. В этой главе будут перечислены возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии для такого рода исследований. Поиск целевых соединений в исследуемой группе связан с необходимостью как можно более полного разделения всех соединений, входящих в группу, в рамках одного анализа. Такие анализы часто называют скрининговыми. Так как соединения могут значительно различаться по своим адсорбционным свойствам, для решения этой задачи целесообразно применять градиентную технику элюирования, если это возможно. Для проведения скринингового анализа необходимо вначале определиться с выбором физико-химического свойства, согласно которому будет проводиться разделение. 3а. Величина молекул. Если целевые соединения отличаются от сопутствующих соединений группы прежде всего величиной молекул, то для скринингового анализа можно применять высокоэффективную эксклюзионную хроматографию. При не известных априори молекулярных массах целевых соединений лучшим выбором являются фазы с высоким диапазоном линейности; в противном случае для анализа следует применять фазы с максимальной разделительной емкостью с области молекулярных масс целевых соединений. 3б. Полярность-неполярность. Нормально-фазовая хроматография редко применяется для скрининговых анализов, поскольку этот вид хроматографии ограниченно совместим с градиентной техникой элюирования. Тем не менее, если полярность целевых соединений априори известна, становится возможно разработать изократическую систему, в которой целевые соединеия с высокой вероятностью будут элюироваться и разделяться. Значительно чаще для скининга применяются гидрофильные хроматографические системы. В этом случае можно разделить лишь достаточно полярные вещества. 3в. Гидрофильность-гидрофобность. Градиентная обращенно-фазовая хроматография является оптимальным, и поэтому наиболее распостраненным методом скринингового анализа. Возможность разделения широкого спектра соединений, предсказуемость относительных времен удерживания, совместимость метода с большинством видов детектирования делают обращеннофазовую хроматографию незаменимым методом для «просмотра» состава предварительно выделенных групп соединений. 3г. Кислотность, основность (величина отрицательного или положительного заряда). Если целевые соединения отличаются от сопутствующих соединений группы кислотностью (основностью) или величиной отрицательного (положительного) заряда, для скрининга можно применять градиентную анионообменную (катионообменную) хроматографию. В зависимости от ситуации можно применять различную технику градиентного элюирования, повышая элюирующую силу увеличением ионной силы буфера, изменением рН буфера, или увеличением доли органического модификатора в водном буфере. Наиболее универсальной является техника элюирования восходящим градиентом ионной силы водного буфера. Элюирование градиентом рН (хроматофокусирование) дает хорошие результаты в случае скринингового анализа полипептидов и белков, особенно если для целевых соединений такого рода априори известны приблизительные значения их изоэлектрических точек. 3д Насыщенность-ненасыщенность. Градиентная высокоэффективная квази-нормально-фазовая хроматография в настоящее время не является распостраненным методом анализа; тем не менее, на примере применения сверхсшитого полистирола была показана перспективность такой техники элюирования для проведения скрининговых анализов ароматических соединений. Важную роль при разработке метода скринингового анализа играет выбор метода (методов) детектирования. В целом, можно выделить шесть основных групп методов детектирования для жидкостной хроматографии, классифицируя их по свойствам соединений, подлежащих детекции. 4а. Спектрофотометрическое детектирование в ультрафиолетовом (УФ, UV) и видимом (Вид., Vis.) диапазонах. Этот вид детектирования предназначен для идентификации соединений, поглощающих излучение в УФ или видимом диапазоне; метод совместим с градиентным элюированием. 4б. Флуоресцентное детектирование (FLD) предназначено для определения флуоресцирующих соединений. Метод совместим с градиентным элюированием. 4в. Кондуктометрическое детектирование (Conductivity detection) применяется для определения заряженных (диссоциированных) соединений. Кондуктометрическое детектирование с подавлением совместимо с градиентным элюированием. 4г. Рефрактометрическое детектирование, детектирование по светорассеянию после испарения (RI и ELSD). Предназначены для определения любых соединений, присутствующих в достаточно высоких концентрациях. ELSD детектирование совместимо с градиентным элюированием, RI детектирование – не совместимо. 4д. Амперометрическое, кулонометрическое детектирование (ECD) применяется для определения соединений, способных к окислению. Ограничено совместимо с градиентным элюированием. 4е. Масс-спектрометрическое детектирование (МС, MS). Предназначено для определения любых соединений, способных в выбранных условиях к ионизации и фрагментации с образованием характерных молекулярных ионов. Безусловно, наиболее универсальным и информативным методом скрининга является градиентная обращенно-фазовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием. 8.2. Разработка аналитических методик При разработке аналитической методики прежде всего следует определиться с кругом образцов, на анализ которых будет ориентирована создаваемая методика. Образцы могут различаться по агрегатному состоянию и химическому составу, то есть, другими словами, по типу матрицы. Как правило, определенная аналитическая методика предназначается для проведения определения аналитов в образцах с подобными матрицами. В этом случае для всех образцов разрабатывается единый алгоритм подготовки пробы и ее анализа. Другим важным моментом является выбор подходящего метода анализа пробы, который должен обеспечивать возможность четкой идентификации и количественного анализа целевых аналитов. Метод анализа пробы (после его должной оптимизации) предъявляет конкретные требования к необходимой концентрации целевых аналитов в пробе и к чистоте пробы (либо к их отношению, если критичным параметром является не концентрация аналитов, а чистота пробы). Выборка целевых аналитов, тип матрицы образца и метод анализа пробы являются своего рода постоянными, изначально задаваемыми разработчиком. Все остальные параметры методики: условия анализа и подготовки пробы – являются переменными, значения которых следует оптимизировать. Работу по созданию методики следует начинать с поиска литературы по данной теме. Накопленный предшественниками опыт способен сэкономить массу времени, которое при применении метода проб и ошибок может быть потрачено на исследование заведомо бесперспективных подходов. Если стандартный метод анализа пробы целевых аналитов неизвестен, то его требуется подобрать и оптимизировать. В случае анализа методом жидкостной хроматографии разработку методики можно начать с выбора одного или нескольких типов хроматографических систем, в которых целевые аналиты, предположительно, смогут быть эффективно разделены друг от друга и от сопутствующих примесей. Условия должны быть оптимизированы таким образом, чтобы разделение обеспечивало наилучшее сочетание селективности и чувствительности. Исходя из разработанного метода анализа, проводится оценка требуемой концентрации аналитов в пробе, а также оценка требуемой чистоты пробы. В частности, на данном этапе небходимо установить, какие именно сопутствующие компоненты матрицы образца будут больше всего мешать проведению определения. Соответственно, при разработке метода подготовки пробы акцент должен быть сделан на очистку пробы именно от соединений подобного рода. Безусловно, наиболее сложным этапом создания аналитической методики является разработка метода подготовки пробы. Такой метод должен обеспечивать перевод целевых аналитов из матрицы образца в содержащую их в достаточной концентрации пробу, которая также дожна содержать минимальное количество мешающих определению компонентов матрицы. Рисунок 8.2. Схема разработки аналитической методики. Исследование различных вариантов подготовки пробы начинается с их проработки «на бумаге», то есть с разработки их схем, от наиболее простых до более сложных. Как правило, работа начинается с исследования наиболее простой схемы. В случае неудовлетворительных результатов, схема надлежащим образом корректируется и испытывается вновь, либо же для испытания берется принципиально другая схема. 8.3. Исследование неподвижных фаз Эта глава появилась как результат попытки сформулировать в общих чертах алгоритм исследования новых неподвижных фаз, синтез и внедрение которых сегодня зачастую опережают процесс изучения их адсорбционных свойств и возможностей практического применения. Неподвижная фаза обладает двумя основными характеристиками: физической структурой (архитектурой неподвижной фазы) и химическим составом той части адсорбента, которая доступна для взаимодействия с адсорбатами (другими словами, химией неподвижной фазы). Архитектура фазы определяет ее гидродинамические свойства, кинетику массообмена. Пористость является причиной разделения веществ различной молекулярной массы по эксклюзионному механизму. Химия фазы определяет ее адсорбционные свойства, а также влияет на кинетику массообмена. Исследование свойств фазы следует начинать прежде всего с получения достоверной информации об ее архитектуре и химии. При наличии исчерпывающей информации о фазе программа исследований может быть полностью проработана заранее; в противном случае исследование неизбежно пойдет по пути проб и ошибок. Кроме того, при отсутствии сведений об исследуемой фазе нельзя установить соответствие между структурой фазы и ее свойствами, то есть такое исследование не будет иметь никакой предсказательной, научной ценности. Акцент в исследовании может быть сделан на изучении влияния как химической, так и физической структуры на хроматографические свойства фазы. 8.3.1. Выявление роли физической структуры фазы Архитектура неподвижной фазы оказывает решающее влияние на ее гидродинамические характеристики. Соответственно, именно архитектура фазы определяет ограничения по максимальному давлению в жидкостной системе, а также максимальной скорости потока подвижной фазы. Высокие давления недопустимы при работе на сравнительно «мягких», легко «сминаемых» фазах, к примеру, полимерных материалах низкой степени сшивки. Применение высоких скоростей потока может стать проблемой в случае длинных колонок, заполненых мелкими частицами, по причине значительного давления в жидкостной системе. Тем не менее, хроматографы ультравысокого давления дают возможность работать на фазах, упакованных чрезвычайно мелкими, порядка одного микрона, частицами. Архитектура фазы оказывает непосредственное влияние на кинетику массообмена в хроматографической системе, которая отражается величиной тангенса угла наклона зависимости обратной удельной эффективности от скорости потока (зависимости Ван-Деемтера) в кинетической области. При налаженной и воспроизводимой технологии упаковки колонок каждая фаза характеризуется средней удельной эффективностью, а также оптимальной скоростью потока подвижной фазы, при которой достигается максимальная эффективность. Чем хуже кинетика массообмена, тем круче наклон кривой Ван-Деемтера в кинетической области, ниже максимальная удельная эффективность и ниже оптимальная скорость подвижной фазы. Косвенно архитектура фазы влияет и на формат хроматографической колонки. Наиболее эффективные фазы, как правило, оказывается целесообразно упаковывать в колонки меньшей длины, а эффективные и хорошо упаковываемые – в колонки меньшей длины и меньшего внутреннего диаметра (микроколонки). Преимущество микроколонок перед колонками «стандартного» формата заключается в том, что при фиксированной эффективности микроколонки обеспечивают достижение требуемой пиковой плотности за гораздо меньшее время, то есть время анализа при применении микроколонок можно существенно сократить, одновременно подняв соотношение сигнал/шум. Характеристиками, непосредственно связанными с архитектурой фазы, являются пористость, распределение пор по размеру (объему), а также структура и геометрия пор. Помимо решающего влияния на кинетику массообмена (и, нередко, влияния на гидродинамические свойства), структура пор определяет эксклюзионные свойства фаз. Фазы с широким распределением пор по размеру имеют высокую линейность, с узким распределением пор и высокой пористотью – высокую разделительную емкость. Программа изучения влияния архитектуры фазы на ее хроматографические свойства зависит прежде всего от специфики задачи. В наиболее общем случае исследование включает: изучение структуры с помощью электронного микроскопа, нахождение распределения пор по размеру; при наличии упакованной хроматографической колонки: изучение гидродинамических свойств, эксклюзионных свойств, получение зависимостей Ван-Деемтера в различных средах для различных адсорбатов и их анализ. 8.3.2. Выявление роли химии фазы Химия фазы определяет ее адсорбционные свойства, а также косвенно влияет на кинетику массобмена. Надежная информация о химии фазы дает первое представление о возможных механизмах удерживания и, в приципе, уже позволяет прогнозировать адсорбционные свойства материала. К примеру, при наличии полярных функциональных групп возможно разделение по нормальнофазовому типу; если материал достаточно гидрофобен – по обращенно-фазовому; ионообменный тип удерживания возможен при наличии ионизированных функциональных групп; квази-нормально тип удерживания – при наличии ненысыщенных/ароматических фрагментов, и так далее. Выбор состава подвижных фаз диктуется прежде всего совместимостью различных растворителей с исследуемой неподвижной фазой, а также спецификой аналитических задач. Для увеличения вклада нормально-фазового и квази-нормально-фазового механизмов следует применять менее полярные подвижные фазы, для увеличения вклада обращенного-фазового – более полярные, на водной основе. Для первоначального тестирования можно применять базовые системы (если они совместимы с адсорбционным материалом) и типичные для этих систем выборки адсорбатов, хроматографическое поведение которых хорошо изучено на ряде неподвижных фаз. Первоначальный тест покажет основные различия в селективности исследуемой фазы по сравнению со «стандартными» фазами, широко и повсеместно применяющимися на практике. Более того, на основании подобных тестовых разделений можно судить о приблизительном вкладе тех или иных механизмов удерживания в данных условиях, и планировать дальнейшие, более детальные хроматографические эксперименты. Для доказательства вклада определенного типа удерживания в разделение, а также нахождения его численной характеристики (для определенного диапазона изменяемых условий), можно применять метод, основанный на факторном анализе хроматографических данных. 9. Твердофазное концентрирование и адсорбционная очистка Конечной целью прикладных исследований в области аналитической химии является разработка методов анализа определенных веществ или групп веществ (аналитов) в различных образцах. Комплексный аналитический метод как правило состоит из целого ряда стадий: отбора пробы, хранения образца, выделения аналитов из матрицы, очистки пробы от нежелательных примесей, идентификации аналитов в пробе и измерения их количеств. Стадии выделения аналитов из матрицы образца, очистки пробы и ее концентрирования могут быть объединены общим названием: подготовка пробы, или пробоподготовка. В большинстве случаев наибольшие затраты труда, времени и химических реактивов связаны именно с проведением стадии подготовки пробы. Среди классических и вместе с тем наиболее трудоемких процедур приготовления пробы следует отметить прежде всего жидкостную экстракцию и отгонку растворителя на роторном испарителе. Жидкостная экстракция неизбежна, если матрица образца твердая; в этом случае объектом дальнейших манипуляций становится первоначальный жидкий экстракт, или раствор [1]; альтернативой для жидкостной экстракции аналитов из твердых образцов может служить сверхкритическая флюидная экстракция [2]. При работе с жидкими образцами и первоначальными экстрактами классические методы пробоподготовки можно заменить значительно более удобным методом твердофазной экстракции (ТФЭ). Сущность метода ТФЭ состоит в извлечении аналитов из жидкого образца или экстракта путем их концентрирования на малом количестве (от десятков до сотен миллиграмм) адсорбционного материала. Смыв аналитов с адсорбента осуществляется сравнительно небольшим объемом растворителя (в пределах десяти миллилитров), что дает возможность либо сразу применить полученный концентрат для анализа, либо дополнительно сконцентрировать пробу через стадию получения сухого остатока, испарив растворитель в токе инертного газа (то есть не прибегая к использованию роторного испарителя). Таким образом, твердофазную экстракцию можно определить как сорбционный метод подготовки пробы, в котором аналиты переводятся из жидкого образца в твердую фазу концентрирующего сорбента. Благодаря неоспоримым преимуществам перед жидкость-жидкостной экстракцией (liquidliquid extraction, LLE), метод твердофазной экстракции уже более двух десятков лет является объектом интенсивных исследований в области адсорбционных технологий [3]. Последние успехи в применении ТФЭ, повлекшие за собой модернизацию метода в целом, можно связать прежде всего с появлением коммерчески доступных полимерных адсорбционных материалов нового типа, сочетающих высокую емкость, механическую прочность и химическую стабильность. В иностранной печати последние достижения в области твердофазной экстракции отражены в ряде обзоров [3-11]. 9.1. Методы ТФЭ В целом, все методы твердофазной экстракции (Solid-Phase Extraction, SPE) можно разделить на две группы: он-лайн и офф-лайн ТФЭ (on-line SPE, off-line SPE). В офф-лайн методах стадии пробоподготовки и идентификации аналитов аппаратурно разделены; поэтому подготовленная проба может быть сохранена и позже проанализирована несколькими различными аналитическими методами. В он-лайн методах концентрирующий картридж с сорбентом напрямую соединен с аналитической колонкой жидкостного хроматографа; в этом случае проба не выделяется, а сразу анализируется методом ВЭЖХ. Соответствующий он-лайн метод существует и для газовой хроматографии – это метод твердофазной микроэкстракции ТФМЭ (Solid-Phase Microextraction, SPME). Он значительно отличается от метода ТФЭ и поэтому не может рассматриваться как одна из его модификаций [3]; метод ТФМЭ не будет рассмотрен в данном обзоре. 9.1.1. Офф-лайн твердофазная экстракция В большинстве случаев метод ТФЭ реализуется в офф-лайн исполнении. Основная причина успеха офф-лайн метода состоит в возможности комбинирования процедуры экстракции и концентрирования аналитов с последующими процедурами адсорбционной очистки и замены растворителя. В офф-лайн режиме концентрирование может проводиться в статических и динамических условиях. В статическом методе адсорбционный материал (зачастую не в виде гранульного сорбента, а в виде спрессованной таблетки или полимерной пленки) выдерживается в жидком образце до наступления адсорбционного равновесия, а затем переносится в емкость с элюирующим растворителем, где происходит смыв аналитов с адсорбента. Этот метод ТФЭ применяется довольно редко, т.к. требует значительных затрат времени для достижения адсорбционного равновесия в системе. В последнее время наибольшее распространение получила модификация этого метода, в которой адсорбционный материал, полисилоксановая пленка, нанесена на магнит мешалки (метод Stir Bar Solid Extraction, SBSE [12]). Метод особенно удобен для экстракции из загрязненных механическими примесями образцов, из коллоидных растворов и гомогенизатов. Однако в нем не устраняется основной недостаток всех методов статической сорбции: невозможность полной экстракции целевых компонентов пробы. Степень экстракции в этих случаях всегда ограничена коэффициентами фазового распределения извлекаемых соединений и соотношениями объемов фаз раствора и сорбента в равновесной системе. Наиболее распространенным методом ТФЭ является метод динамического офф-лайн концентрирования. В этом методе анализируемый раствор пропускается через картридж, заполненный адсорбентом. В динамическом процессе при правильном подборе условий сорбции целевые компоненты пробы могут быть извлечены из раствора полностью. Жидкий образец может нагнетаться в картридж с помощью воздушного компрессора, вакуума, центробежной силой в центрифуге, насосом (к примеру, перистальтическим) и вручную. Как правило, в случае средних объемов жидкость перемещается вакуумом; при этом картриджи закрепляются в специальном держателе – манифолде. Небольшие количества жидкого образца обычно пропускаются через картридж вручную с помощью шприца; аналиты смываются с картриджа также вручную. Современные картриджи для ТФЭ представлены большим числом модификаций двух основных типов: патрона и диска, отличающихся диаметром и толщиной слоя адсорбента. Для диска высота слоя не превышает нескольких миллиметров, а для патрона она может достигать нескольких сантиметров. Мелкие частицы адсорбента (до 60 мкм) закреплены в диске волокнообразующим наполнителем и предназначены для скоростной экстракции. Размер частиц в патроне (обычно 60 мкм и более) ограничивается гидродинамическим сопротивлением слоя, которое возрастает обратно пропорционально квадрату диаметра частиц адсорбента. По сравнению с дисками патроны обладают большей сорбционной емкостью, что играет решающую роль в случае концентрирования следовых количеств аналитов, сильно различающихся по своему сродству к адсорбенту, из больших объемов сложных многокомпонентных образцов. Концентрирующие диски удобны в работе с небольшими объемами вязких растворов, например, при концентрировании аналитов из плазмы крови, которую из шприца пропускают через картридж вручную с невысокой скоростью. С другой стороны, диски применяются также для быстрого концентрирования из больших, до литра, объемов водных растворов в тех случаях, когда образец не содержит значительных количеств адсорбирующихся примесей, а целевые аналиты характеризуются значительным удерживанием на адсорбенте. Десорбция сконцентрированных в офф-лайн методе аналитов осуществляется обработкой сорбента подходящим растворителем. Метод позволяет производить предварительную промывку картриджа, реэкстракцию аналитов из концентрата, упаривание, перерастворение, однако каждая новая стадия может приводить к дополнительным потерям определяемых компонентов. 9.1.2. Он-лайн твердофазная экстракция В он-лайн методе ТФЭ концентрирующий патрон присоединяется к инжекционному крану вместо дозирующей петли и, таким образом, оказывается напрямую связан с аналитической ВЭЖХ колонкой. Небольшие объемы образца, до десяти миллилитров, можно пропускать через патрон вручную с помощью шприца, однако это может привести к преждевременному износу инжекционной системы. Концентрирование из больших объемов требует применения отдельного насоса и специального крана-дозатора. Смыв аналитов с картриджа осуществляется потоком подвижной фазы в момент начала анализа непосредственно в аналитическую колонку. Поэтому он-лайн метод позволяет без потерь переносить в колонку все количество сконцентрированных путем адсорбции аналитов, сводя таким образом причины снижения степени их извлечения только к неполноте экстракции и неполноте десорбции. В этом и состоит основное достоинство он-лайн концентрирования, которое позволяет получать более воспроизводимые и нередко более высокие значения степеней извлечения, чем в методе офф-лайн концентрирования. Для увеличения хроматографической эффективности он-лайн системы в картриджах необходимо применять узкие фракции адсорбционных материалов с небольшим, порядка 10-30 мкм, средним диаметром частиц. Он-лайн твердофазная экстракция все же обладает двумя серьезными принципиальными недостатками. Суть первого состоит в том, что для получения качественной хроматограммы картридж и колонка должны быть совместимы по своим адсорбционным свойствам. Он-лайн экстракция с последующим хроматографическим анализом пока реализованы только в обращеннофазовом варианте, и здесь условие совместимости можно сформулировать таким образом: гидрофобность адсорбционного материала аналитической колонки должна не уступать, а лучше превосходить гидрофобность материала концентрирующего картриджа. В противном случае подвижная фаза либо медленно и неполно десорбирует аналиты из концентрирующего патрона, либо не обеспечивает их достаточного удерживания в аналитической колонке. Это приводит к уширению хроматографических зон и падению эффективности разделения. Во многих случаях условие совместимости сорбентов не выполняется, т. к. наиболее распространенные С18 хроматографические колонки уступают в гидрофобности новым полимерным материалам для ТФЭ. «Экстенсивный» метод решения проблемы уширения пиков состоит в применении градиентного элюирования на длинных, 250 мм, хроматографических колонках (см. рис. 1). Этот метод позволяет увеличить эффективность системы по сильно удерживаемым аналитам до приемлемого уровня, однако по слабо удерживаемым аналитам эффективность разделения обычно недостаточна для их надежного определения в реальных пробах [13-15]. «Интенсивный» метод состоит в разработке новых полимерных [16] и углеродных [17] высокоэффективных сорбентов большой гидрофобности для ВЭЖХ аналитических колонок. До последнего времени коммерчески доступными фазами этого типа являлись две фазы на основе полистирола (PLPR-S, PRP-1) и одна углеродная фаза (Hypercarb). Вторым серьезным недостатком он-лайн ТФЭ является отсутствие в этом методе стадий комплексной очистки пробы, что особенно затрудняет анализ сложных образцов, в которых присутствуют значительные количества мешающих детектированию соединений. Одним из решений данной проблемы может служить применение селективного детектирования. К сожалению, этот подход не является универсальным, т. к. круг задач, решаемых ВЭЖХ с флуориметрическим и электрохимическим детектированием, сравнительно невелик, а жидкостные хроматографы с масс-спектрометрическим детектором пока слишком дороги. Альтернативный подход может заключаться в применении высокоселективных аффинных или импринтных адсорбционных материалов для он-лайн ТФЭ, которые однако еще не появились на рынке сорбентов. Рисунок 1. Хроматограмма замещенных анилинов и фенолов, полученная градиентным элюированием на обращенной С18 фазе с применением он-лайн концентрирования на полистироле высокой степени сшивки PLPR-S. Несоответствие гидрофобности материалов для ТФЭ и ВЭЖХ приводит к уширению пиков слобоудерживаемых аналитов. 1 – анилин, 2 – кофеин, 3 – фенол, 4 – 4-нитроанилин, 5 – 4-нитрофенол [14]. 9.1.3. Адсорбционная очистка Анализируемая проба по возможности должна содержать как можно меньше компонентов матрицы образца, могущих помешать определению целевых аналитов или загрязнить узлы применяемой для анализа аппаратуры. Адсорбционная очистка пробы имеет целью быстрое и эффективное удаление мешающих веществ матрицы при помощи различных адсорбционных материалов. Адсорбционная очистка может происходить без перевода аналитов в фазу сорбента; в этом случае процедура очистки не приводит к концентрированию целевых аналитов, которые остаются в жидкой фазе, тогда как примеси сорбируются и удаляются. В другом методе адсорбционной очистки на первом этапе проводят концентрирование аналитов на твердой фазе с последующим смывом примесей на второй стадии, и по возможности более селективным смывом аналитов на третьей. Фактически, этот способ адсорбционной очистки активно использует твердофазную экстракцию; в зарубежной печати этот подход называется SPE cleanup, что можно перевести как «очистка с применением ТФЭ». В сущности, любая процедура ТФЭ сопровождается некоторой очисткой пробы, т. к. из образца удаляются соединения, не удерживаемые адсорбционным материалом, к примеру, неорганические соли [18]. Очистку можно продолжить, если удается подобрать элюент, вымывающий из сорбента примеси без заметной десорбции аналитов. Такая возможность очевидна в случае применения для ТФЭ наиболее селективных адсорбционных материалов, таких как ионообменные и комплексообразующие смолы, аффинные и импринтные материалы. Селективные картриджи для твердофазной экстракции как правило не дешевы; их регенерируют и применяют многократно. Адсорбционная очистка без ТФЭ аналитов в основном осуществляется на однократно используемых дешевых марках адсорбентов, таких как силикагель, амино-, циано-, диол-, С8- и С18-силикагели, флоризил, сульфат магния, окись алюминия. Адсорбционная очистка может проводиться как динамическим методом на картридже, так и статическим (путем перемешивания пробы с адсорбентом и ее фильтрацией). Резюмируя, можно сказать, что многие адсорбционные материалы могут применяться в зависимости от ситуации как для концентрирования, так и для адсорбционной очистки, либо для обеих целей одновременно. 9.2. Методы оценки эффективности процедуры ТФЭ Рассмотрим стандартную твердофазную экстракцию офф-лайн методом как процедуру, состоящую из трех стадий: адсорбции аналитов, их десорбции подходящим растворителем и замены последнего на растворитель, наиболее удобный для анализа. (Стадии подготовки картриджа, активации сорбента и кондиционирования картриджа будут рассмотрены ниже). Ключевыми понятиями, применяемыми для оценки эффективности стадии адсорбции на концентрирующих картриджах, являются понятия «проскока» и сорбционной емкости каририджа. График зависимости концентрации аналита в фильтрате от объема пропускаемого через картридж жидкого образца называется кривой выхода сорбции или «кривой проскока» (breakthrough curve). Эта кривая имеет характерную S-образную форму с более или менее резким подъемом концентрации аналита в области насыщения им сорбирующего картриджа. Объемом проскока принято считать тот объем пропускаемого образца, при котором концентрация аналита в фильтрате достигает 10% от его концентрации в исходном растворе. Термин «объем проскока» для метода ТФЭ по своей сути является аналогом хроматографического термина «объем удерживания». Строго же говоря, «объемом удерживания» для твердофазной экстракции, являющейся по сути реализацией фронтального хроматографирования, является объем V’, соответствующий точке перегиба на кривой выхода сорбции при предельно низких концентрациях аналита. Нередко объем проскока не измеряют напрямую, а оценивают по значению V’, которое получают из хроматографических данных, либо рассчитывают из результатов эксперимента по статической сорбции аналита [19]. Измерение объемов проскока обычно начинают в «идеальных» условиях – жидким образцом является раствор аналита в чистом растворителе, например, в воде, водном буфере или водно-органической смеси. На практике, когда через картридж пропускается реальный жидкий образец или первоначальный экстракт со сложной матрицей, наблюдаемые значения объемов пробоя могут оказаться значительно ниже «идеальных», что обусловлено конкуренцией доминирующих компонентов матрицы с адсорбцией аналитов. Другими словами, при повышенных концентрациях сорбируемых соединений насыщение сорбента в картридже наступает раньше, и объем проскока соответственно уменьшается. После надежного установления эффективности стадий адсорбции и смыва аналитов (в офф-лайн ТФЭ) измерение степени извлечения может использоваться для контроля эффективности процедур дополнительной очистки экстракта и замены растворителя. Нередкими являются случаи, когда основные потери аналитов происходят именно на этих последних стадиях пробоподготовки. При оптимизации всей процедуры удовлетворительными можно считать такие условия, в которых достигается максимальная чистота пробы при приемлемом уменьшении степеней извлечения. В случае концентрирования следовых количеств соединений из водных образцов существует еще один источник потерь аналитов: их адсорбция на стенках посуды и подводящих капиллярах. Уменьшения вклада стеночной адсорбции можно добиться экстенсивным методом, сократив длину подводящих капилляров и увеличив соотношение объема пропускаемого образца к общему объему используемых сосудов. Лучшего решения проблемы можно достичь, добавив в водный образец некоторое количество органического растворителя, что снижает адсорбцию неполярных аналитов на поверхности подводящих капилляров и стекла. 9.2.1. Методы оценки сорбционной емкости в случае ТФЭ Понятие сорбционной емкости, наряду с понятием объема «проскока», также является важным понятием в практическом приложении метода твердофазной экстракции. Важно отметить, что в методе ТФЭ в понятие «сорбционной емкости» вкладывается несколько иной смысл, чем в классической теории адсорбции. В методе твердофазной экстракции «сорбционная емкость» тесно связана с объемом «проскока» аналита и степенью «загрязненности» концентрируемого образца компонентами матрицы. Фактически, сорбционной емкостью картриджа следовало бы назвать суммарное количество компонентов матрицы образца, поглощенного им к моменту проскока исследуемого аналита. С другой стороны, количественно выразить емкость в соответствии с этим определением нельзя, так как образец содержит множество различных «загрязняющих» компонентов в различных концентрациях. Такая ситуация привела к тому, что понятие сорбционной емкости применяется для метода ТФЭ крайне редко, и в основном оценки емкости носят качественный характер; основным же понятием является объем «проскока», измеренный в определенных условиях, «идеальных» или для конкретного образца. Затруднение в количественной оценке емкости можно избежать, измеряя ее значение лишь для одного из основных компонентов матрицы, наиболее типичного в изучаемом случае, и присутствующем в образце в наибольшей концентрации. Располагая сведениями о концентрации в образце «загрязняющих» его компонентов матрицы, и зная значение емкости применяемого сорбента для ТФЭ по основному компоненту матрицы или по структурно подобному соединению, можно оценить максимальный объем образца, который удается сконцентрировать на картридже с известным количеством этого сорбента без значительных потерь аналита. Заранее следует отметить, что определение емкостей картриджей для различных нагружающих компонентов матрицы и различных аналитов целесообразно лишь при разработке аналитических методик или при исследовании адсорбционных свойств материалов для твердофазной экстракции. Для экспериментального определения сорбционной емкости необходимо получить ряд кривых выхода сорбции аналита для модельных образцов, содержащих нагружающий компонент матрицы в различных концентрациях и исследуемый аналит с постоянной концентрацией, соответствующей реальным образцам. Далее строится зависимость объемов «проскока» аналита от концентрации нагружающего компонента матрицы. Исходя из чувствительности применяемого аппаратурного метода, оценивается объем образца, который необходимо сконцентрировать. Этому объему на построенной зависимости соответствует определнная максимально допустимая концентрация компонента матрицы, выше которой количественное концентрирование аналита становится невозможным. Сорбционная емкость для данного случая вычисляется как произведение этой предельно допустимой концентрации нагружающего компонента матрицы на объем «проскока» аналита, приведенное к единице массы сорбента. Так как изотерма адсорбции обычно описывается выпуклой кривой с насыщением, из изотермы адсорбции нагружающего компонента матрицы можно определить предельную емкость сорбента, соответствующую его полному насыщению этим веществом. «Частные» значения сорбционной емкости по этому компоненту матрицы, измеренные по приведенной выше схеме для любого конкретного аналита, всегда будет меньше значения предельной емкости. Значения предельной емкости являются удобными критериями для сравнения эффективности различных марок сорбентов для ТФЭ. Сорбенты с большей предельной емкостью насыщаются медленнее, что положительно сказывается на объеме «проскока» любого аналита: он уменьшается медленнее при росте концентрации компонентов матрицы в концентрируемом образце. В заключение следует еще раз отметить, что значения объемов «проскока» и емкостей справедливы лишь для тех условий, в которых они определены. Эти условия: тип матрицы образца, его объем и скорость пропускания, марка адсорбента, его масса и размер частиц, исследуемый аналит и его приблизительная концентрация – должны указываться рядом с экспериментально определенными значениями объемов пробоя и емкостей. 9.3. Адсорбенты для твердофазной экстракции и адсорбционной очистки До сравнительно недавнего времени алкилированные С8 и С18 силикагели являлись фактически единственными адсорбционными материалами для твердофазной экстракции. В очень редких случаях в этих целях применялись пористые полистирол-дивинилбензольные (ПС-ДВБ, PSDVB) смолы типа Amberlite XAD-1-4 [3]. В настоящее время на лидирующее место выходят полимерные адсорбционные материалы, за ними по частоте применения следуют активированные угли и лишь затем – С8, С18 и другие привитые силикагели [7]. Полимерные сорбенты и угли, особенно с большой удельной поверхностью, обладают на один-два порядка большими, чем С18, объемами пробоя при ТФЭ из водных и водно-органических систем и позволяют добиваться значительно более высоких эффектов концентрирования. Твердофазные адсорбционные материалы по отношению к концентрируемым аналитам можно условно разделить на селективные, универсальные и групповые (см. рис. 2). Последние должны сочетать по возможности количественную адсорбцию определенной группы аналитов (внутри-групповую универсальность) с отсутствием адсорбции нежелательных классов соединений (меж-групповой селективностью). К примеру, для скрининга низкомолекулярных веществ из биологических жидкостей или растительных образцов наиболее эффективная подготовка пробы включает твердофазную экстракцию на адсорбенте, обладающем максимальным сродством к любым низкомолекулярным аналитам (внутри-групповая универсальность) и минимальным сродством ко всем высокомолекулярным соединениям (меж-групповая селективность). 9.3.1. Универсальные адсорбенты для ТФЭ Универсальные адсорбенты («generic» sorbents [20]) как правило применяются для извлечения из образца возможно более широкого спектра соединений различных классов и многократного их концентрирования. 9.3.1.1. Нейтральные полимерные адсорбционные материалы Адсорбционные свойства полимерных материалов зависят от совокупности их структурных и химических характеристик; к первым относятся величина удельной площади поверхности, размер пор, распределение пор по размеру, суммарный объем пор, ко вторым - гидрофобность или гидрофильность поверхности, наличие функциональных групп. Априорный выбор оптимального сорбента часто оказывается затруднительным, так как фирмы-производители редко сообщают все эти характеристики сорбентов. Структурные параметры сорбента определяются степенью сшивки его полимерного каркаса и использованием определенных порогенов в процессе синтеза. Материалы низкой степени сшивки не обладают пористостью в сухом состоянии, но способны набухать в ограниченном наборе жидких сред и, как правило, используются для получения ионообменных смол. Последние набухают в водных средах и извлекают из воды катионы или анионы как минеральной природы, так и органические кислоты или основания. Слабо сшитые гидрофильные материалы на основе декстранов также набухают в воде и могут использоваться для получения ионообменных или специфических сорбентов. Однако эти сорбенты в набухшем состоянии довольно эластичны и сминаются в колонке при повышении перепада давления. Сорбенты со средней степенью сшивки обычно синтезируют в присутствии осаждающего полимер порогена, что приводит к фазовому распаду системы и образованию макропористой структуры конечного материала. Удельная поверхность такого материала редко превышает несколько десятков м2/г, но поры имеют от сотен до тысяч ангстрем в диаметре. Такие поры, с одной стороны, позволяют сорбировать крупные молекулы, с другой - закреплять на поверхности пор крупные лиганды, например сложные молекулы красителей, комплексы металлов и даже белковые антитела. Макропористые полимеры используют для синтеза специфических сорбентов для селективной аффинной (биоспецифической) или металло-хелат-аффинной (лигандообменной) сорбции белков, или наоборот, для закрепления крупных антител и селективной сорбции низкомолекулярных антигенов (см. ниже). Примером сорбентов со средней степенью сшивки являются PLRP-S (PolymerLabs, Великобритания) и PRP-1 (Hamilton, США). Эти материалы способны работать в определенном наборе растворителей, что ограничивает возможности выбора среды для проведения процессов сорбции и десорбции. Еще в 1970-х годах В.А. Даванков и М.П. Цюрупа интенсивной сшивкой полистирола в присутствии термодинамически хорошего растворителя (предотвращающего фазовый распад системы) впервые получили жесткие микропористые полимерные материалы, практически одинаково набухающие и способные работать в любых жидких средах. Этому типу полимерных сеток и адсорбционных материалов было предложено название «сверхсшитые» (hypercrosslinked) [21]. Отличительным признаком сверхсшитых сорбентов является их исключительно высокая удельная поверхность – порядка 1000 м2/г и выше и, соответственно, высокая сорбционная активность. Характерный размер пор этих материалов 20-40 ангстрем. В настоящее время для ТФЭ применяются несколько марок коммерчески доступных сверхсшитых полистирольных материалов: Purosep MN-200 (Purolite, Великобритания) и Isolute ENV (IST, Великобритания) – эти сорбенты, кроме сорбционных микро и мезо-пор, содержат еще и транспортные макропоры. Сверхсшитую полистирольную природу имеет и сорбент LiChrolut EN (фирма Merck, Германия). По величине удельной поверхности и сорбционной емкости указанным сверхсшитым полистиролам существенно уступают пористые стирол-дивинилбензольные материалы типа Amberlite XAD-4 (Rohm&Haas, США). Все эти ПС-ДВБ сорбенты имеют гидрофобную поверхность. К сорбентам XAD по своей пористой структуре близок материал Oasis HLB (Waters, США), однако у него в ПС-ДВБ-матрицу включено до 30% звеньев поливинилпирролидона и потому он более гидрофилен, в частности, напрямую смачивается водой, тогда как гидрофобные сорбенты требуют предварительного смачивания («активации») метанолом или ацетонитрилом. Сверхсшитые полимерные материалы совместимы с любыми растворителями: водой, спиртами, эфирами, хлорорганикой и углеводородами. Термин «совместимость» в данном случае означает, что, с одной стороны, сверхсшитый адсорбционный материал остается проницаемым для средних молекул («набухает») в любом растворителе; с другой стороны, жесткость полимерной сетки не позволяет сорбенту менять свой объем при пропускании через картридж растворителей различной природы, так что каждый последующий растворитель быстро и количественно вытесняет предыдущий, не разрушая упаковку полимера в картридже. Особенным свойством сверхсшитых полистиролов является их способность концентрировать аналиты не только из водных сред, но и из органических растворителей. Из метанола и ацетонитрила активно сорбируются неполярные аналиты. Из углеводородов сорбируются органические соединения, структура которых включает ненасыщенные системы: кратные связи углерод-углерод, углерод-кислород, ароматические (в том числе гетероциклические ароматические) молекулярные фрагменты. В последнем случае адсорбция происходит за счет пивзаимодействий ненасыщенных систем аналитов и адсорбента [22, 23]. Режим сорбции в этих условиях был назван «квази-нормально-фазовым» для сверхсшитых полистирольных адсорбентов, не содержащих полярных групп [24]. Метод квази-нормально-фазного концентрирования применим для извлечения ароматических веществ из растительных и машинных масел, масляных экстрактов, нефтей и топлив. Рисунок 2. Классификация адсорбентов для ТФЭ по свойству селективности. 9.3.1.2. Углеродные адсорбционные материалы Достаточно перспективными материалами для ТФЭ являются активированные угли и сажи. Удельная поверхность этих материалов может варьироваться в широких пределах в зависимости от технологии их изготовления: от 10 м2/г для непористых саж (ENVI-Carb, Supelco, США) до 1000 м2/г (различные активированные угли). Сажи, выпускаемые для твердофазной экстракции, графитизуются при высокой температуре для гомогенизации их поверхности, удаления с нее остаточных полярных групп. Угли содержат на своей поверхности значительное количество полярных групп. Углеродные адсорбенты демонстрируют лучшие результаты по адсорбции из водных и водно-органических сред по сравнению со всеми остальными типами адсорбционных материалов. Гидрофобность углей такова, что позволяет адсорбировать липофильные аналиты даже из некоторых органических полярных растворителей, к примеру, метанола и в некоторых случаях – ацетона [2]. Основным и очень существенным недостатком углеродных адсорбентов является затрудненная десорбция аналитов, что ограничивает интенсивное применение углей. Для смыва аналитов с такого рода материалов обычно применяют термодесорбцию горячими растворителями с относительно высокими температурами кипения: толуолом, ксилолом, хлороформом и их смесями. В случае применения термодесорбции картриджи для углеродных материалов изготавливаются из стекла. 9.3.1.3. Смешанные адсорбенты Смешанные сорбенты могут представлять собой смеси различных типов адсорбентов в определенных пропорциях. Как правило, один из адсорбентов является обращенно-фазовым, а другой – ионообменным [25]; к примеру, для концентрирования основных соединений может применяться смесь нейтрального и сульфированного ПС-ДВБ. 9.3.1.4. Способы применения универсальных адсорбентов для твердофазной экстракции и твердофазной очистки Наиболее универсальными адсорбентами являются угли с высокой удельной поверхностью пор; такие углеродные адсорбенты фактически не проявляют селективности при концентрировании из воды и водных буферов, адсорбируя аналиты в широких интервалах их размеров и полярностей. Подобным свойством обладают и сверхсшитые нейтральные полистиролы. Нередкими оказываются ситуации, когда наряду с количественной адсорбцией аналитов такие адсорбенты также поглощают множество компонентов матрицы образца. Для уменьшения их негативного влияния концентрирование аналитов полезно проводить в условиях, ограничивающих сорбцию нецелевых компонентов. Такие условия зачастую могут быть созданы регулированием рН раствора или добавлением в водные образцы органических растворителей, к примеру, метанола или ацетонитрила. Регулирование рН образца применяется в том случае, когда основные мешающие компоненты матрицы являются ионизирующимися соединениями. Так, нейтральные (и даже слабощелочные – до рН 8.0) водные среды предпочтительнее кислых при концентрировании некоторых фенолов из грунтовых вод на сверхсшитых полистиролах [26], так как гуминовые кислоты и фульвокислоты, являющиеся в этом случае основными мешающими компонентами матрицы, адсорбируются при нейтральном рН в значительно меньших количествах, чем при рН 2-3, обычно рекомендуемом для экстракции фенолов. Конечно, изменение рН с кислого на нейтральный приводит к уменьшению объемов пробоя по фенолам, однако для таких активных и гидрофобных сорбентов как сверхсшитые полистиролы этот недостаток незначителен, и большинство фенольных соединений все равно извлекаются количественно. Добавление в водные образцы органических растворителей дает хорошие результаты, когда в процессе твердофазной экстракции необходимо избавиться от большинства более гидрофильных нейтральных и ионных компонентов матрицы при концентрировании более гидрофобных аналитов. Вместе с тем, концентрирование из водно-органических смесей позволяет уменьшить адсорбцию целевых гидрофобных аналитов на стенках сосудов, подводящих капиллярах, а также на нередко содержащихся в образцах коллоидных частицах. Так, при экстракции ПАУ из грунтовых вод добавление в образец органического растворителя приводит к очистке адсорбируемой пробы от гуминовых кислот и одновременно способствует повышению степеней извлечения ПАУ за счет уменьшения их связывания с полимерными молекулами гуминовых веществ [27]. Реализация эффективного концентрирования из водно-органических систем возможна только в случае применения полимерных и углеродных адсорбционных материалов; С8, С18 силикагели не могут применяться для этой цели по причине их низкой гидрофобности (см. рис. 3). Рисунок 3. Кривые «проскока» для пентахлорфенола из его раствора в системе ацетонитрил-вода (рН 2) 30:70 на различных адсорбционных материалах. 1 – С18 силикагель HySphere-C18-EC, 2 – полистирол (степень сшивки порядка 50%) PLRP-S, 3 – Oasis HLB, 4 и 5 – сверхсшитые полистиролы HySphere-resin-GP и HySphere-resin-SH [20]. 9.3.2. Селективные адсорбенты для ТФЭ 9.3.2.1. Бифункциональные адсорбционные материалы Бифункциональными называются материалы, на которых осуществляется селективная сорбция аналитов комбинацией нескольких механизмов взаимодействия с сорбентом. Такие адсорбенты могут содержать в своей структуре наряду с неполярными фрагментами различные полярные функциональные группы, в том числе ионные и хелатирующие группировки, а также ненасыщенные системы. Примером бифункционального материала может являться силикагель с различными одновременно привитыми фазами, обращенно-фазовой (октадецильной) и ионообменной (триметиламинопропильной или сульфопропильной). Широким классом бифункциональных адсорбентов являются химически модифицированные ПС-ДВБ смолы [4]. Кроме частичного сульфирования, модификация полистирольных материалов легко осуществляется ацилированием по Фриделю-Крафтцу, либо хлорметилированием с последующим аминированием. Улучшение адсорбционных свойств при концентрировании полярных и ионных аналитов принято связывать прежде всего с ускорением массопереноса вследствие увеличения смачиваемости изначально неполярных исходных материалов, а также с появлением дополнительных полярных взаимодействий адсорбент-аналит. Зависимость эффективности адсорбции на модифицированных смолах от плотности прививки полярных фрагментов проходит через максимум, так как чрезмерное количество полярных групп приводит к уменьшению гидрофобности материала и снижению адсорбции [5, 9, 28]. Степень сульфирования 0.6 мэкв/г была признана по результатам работы [28] оптимальной, повышающей факторы емкости по различным полярным аналитам в десятки раз по сравнению с несульфированными смолами (см. табл. 1). Активация картриджей метанолом перед экстракцией приводит к дополнительному увеличению удерживания полярных соединений. Таблица 9.3.2.1. Зависимости адсорбционных свойств ПС-ДВБ с высокой степенью сшивки от степени их сульфирования [28]. Жирным шрифтом выделены значения k’, полученные после активации адсорбента метанолом; обычным шрифтом – без активации метанолом. Фактор емкости k’ Степень сульфирования, Фенол Катехол Этилпируват 2,3-Бутандион мэкв/г 0.0 21 1 0 0 49 10 0 1 0.1 40 1 0 1 124 32 4 2 0.4 272 34 40 3 350 45 49 4 0.6 436 74 60 12 457 90 79 14 1.0 315 59 54 8 381 70 55 8 1.5 183 38 26 6 209 45 34 6 2.7 47 10 5 2 55 12 6 2 Наиболее широко применяемыми на данный момент бифункциональными адсорбентами для твердофазной экстракции являются Oasis HLB, Oasis MCX и Oasis MAX (Waters) [29], являющиеся сополимерами неполярных стирола и дивинилбензола и полярного винилпирролидона с высокой степенью сшивки: нейтральный (Oasis HLB), с привитыми сульфогруппами (Oasis MCX) и с триметиламино-группами (Oasis MAX). Фирма Purolite также предлагает бифункциональные сверхсшитые полистирольные материалы для ТФЭ серии Purosep-2хх с небольшим содержанием аминных, карбоксильных или сульфогрупп. Бифункциональный адсорбент может быть получен также динамической модификацией базового нейтрального продукта. В этом случае в водный образец добавляется ион-парный реагент, динамически модифицирующий нейтральный адсорбент и повышающий его сродство к ионным аналитам. Этот подход может быть реализован и в он-лайн исполнении, если концентрирующий картридж и хроматографическая колонка заполнены полимерными адсорбентами со сравнимой гидрофобностью [30]. 9.3.2.2. Адсорбенты с ограниченно доступной поверхностью Меж-групповой селективности по молекулярной массе аналитов можно добиться, применяя адсорбенты с ограниченно доступной поверхностью (restricted-access SPE materials). Адсорбенты этого типа сочетают универсальность в отношении адсорбции низкомолекулярных веществ с селективностью, основанной на гель-фильтрационном механизме исключения высокомолекулярных соединений. Одним из таких материалов является С18-модифицированный силикагель с привитой «сетью» из цепей полиэтиленгликоля, непроницаемой для высокомолекулярных соединений. Другая модификация С18 силикагелей с ограниченно доступной поверхностью имеет на поверхности частиц привитые нейтральные поверхностно-активные вещества («бислойные» адсорбенты). Высокомолекулярные белковые соединения в своем большинстве не удерживаются на таких фазах, а способные к диффузии низкомолекулярные вещества сорбируются по обращенно-фазовому механизму [31] в гидрофобных порах. Сорбенты этого типа позволяют концентрировать лекарственные препараты и их метаболиты непосредственно из плазмы крови без предварительного осаждения белков. Иным типом адсорбентов с ограниченно доступной поверхностью являются микропористые сверхсшитые полистиролы, например Purosep 270. Средний размер микропор в таком материале составляет величину порядка 20-30 ангстрем, то есть сопоставим с размером молекулы. В результате, сорбент концентрирует лишь те аналиты, эффективный размер молекул которых (учитывая сольватную оболочку) не превышает некоторого предела. Недостатком микропористых материалов может оказаться замедленный массоперенос, обусловленный отсутствием крупных транспортных пор. 9.3.2.3. Аффинные и импринтные адсорбционные материалы К наиболее селективным материалам для ТФЭ можно отнести аффинные (Аffinity SPE) и импринтные (Molecular Imprinted Solid-Phase Extraction, MISPE) адсорбенты. Принцип действия аффинных адсорбционных материалов основан на селективности биокомплементарных взаимодействий пары лиганд-аналит [32], например, пары антитело-антиген. Антитела являются белками, которые вырабатываются иммунной системой млекопитающих для связывания чужеродных соединений, называемых антигенами. В случае аффинного концентрирования аналитом является антиген, а прививаемым на стационарную фазу лигандом является соответствующее аналиту антитело. В одном из наиболее распространенных методов для получения аффинных лигандов используются иммуноглобулины G (IgG), антитела белковой природы с молекулярной массой порядка 150 кДа. Иммуноглобулины вырабатываются организмами лабораторных животных в результате иммунного ответа на вводимый антиген (аналит) или комплексный антиген, представляющий собой аналит, ковалентно связанный с белковым соединением для усиления иммунной реакции. Выделяемая из сыворотки крови фракция IgG содержит различные виды иммуноглобулинов (поликлональные антитела), среди которых лишь в среднем 15% проявляют активность по отношению к определяемому аналиту. Для получения лигандов приемлемого качества поликлональный пул антител может быть подвергнут фракционированию и обогащению [33]. Таким методом ранее были получены антитела для селективного концентрирования высокомолекулярных соединений, а за последние несколько лет - и целого ряда низкомолекулярных аналитов: антибиотиков, гормонов, пестицидов и ароматических углеводородов [10]. Для прививки (иммобилизации) антител применяются три типа стационарных фаз: полисахаридные носители (агароза, целлюлоза), макропористые полимерные носители на основе полиметакрилата или ПС-ДВБ, а также силикагель и макропористые стекла [11]. Метод офф-лайн ТФЭ совместим с аффинными адсорбционными материалами на любой основе, в то время как онлайн анализ возможен лишь с применением аффинных адсорбентов на основе силикагеля и ПСДВБ, способных выдерживать значительный перепад давления в экстракционном картридже. Одним из недостатков аффинных адсорбентов для ТФЭ является потеря их адсорбционной активности в водно-органических смесях с большой концентрацией органических растворителей, то есть в оптимальных условиях смыва аналитов. Для продления срока службы аффинных он-лайн картриджей применяется следующий технический прием: подвижная фаза пропускается через картридж только первые несколько минут градиентного элюирования до достижения определенного содержания органического растворителя в водном буфере, затем инжектор переключается в положение прерывания потока; подвижная фаза идет через хроматографическую колонку минуя картридж, который во время анализа регенерируется водным буфером [34]. В среднем, на одном аффинном картридже можно провести до десятка анализов. Высокая селективность импринтных адсорбентов обусловлена наличием полостей, комплементарных структуре концентрируемых аналитов [8, 35]. Импринтные адсорбенты получают сополимеризацией полярных мономеров типа акриламида, метилакрилата, винилпиридина со значительным количеством сшивающего агента (чаще всего этиленгликольдиметакрилата) в присутствии либо самого целевого аналита (формообразователя), либо аналогичного по структуре соединения. Затем это соединение тщательно отмывается, оставляя в сильно сшитой матрице полимера полости соответствующего размера и конфигурации. Одним из интересных с аналитической точки зрения свойств импринтных (а также аффинных) адсорбционных материалов является повышенная селективность удерживания структурно близких соединений (для аффинных адсорбентов – аналогов антигена); это свойство соответствует зарубежному термину «crossreactivity». Так [36], в ряду замещенных феноксиуксусных кислот наиболее селективное удерживание наблюдается для гербицидов, структура которых близка к структуре молекулыформообразователя, в данном случае 2,4,5-Т (см. табл. 2). Таблица 9.3.2.3. Зависимость удерживания на импринтном адсорбенте от структуры сорбируемых аналитов – производных феноксиуксусных кислот [36]. Гербицид k’ (импринт.) k’ (бланк) R1 R2 R3 α 2,4,5-T 4.39 0.44 1 Cl Cl H 2,4-D 3.00 0.27 0.68 Cl H H Fenoprop 2.72 0.39 0.62 Cl Cl CH3 Dichlorprop 2.22 0.23 0.51 Cl H CH3 MCPA 1.38 0.55 0.31 CH3 H H Mecoprop 1.22 0.27 0.28 CH3 H CH3 4-CPA 0.72 0.17 0.16 H H H Полярные, содержащие ионные группы импринтные адсорбенты на основе полиметакриловой кислоты или винилпиридина во многих случаях не обладают необходимой гидрофобностью для проведения эффективного концентрирования из водных образцов большого объема. В этих случаях импринтные адсорбенты применяются для твердофазной экстракции аналитов из пробы, уже сконцентрированной с помощью универсальных адсорбционных материалов [37]. 9.3.2.4. Неорганические полярные адсорбенты: окись алюминия, флоризил, силикагель; полярные адсорбенты на основе силикагеля Дешевизна неорганических полярных адсорбентов делает привлекательным их применение для адсорбционной очистки проб, особенно в случаях проведения рутинных анализов. В методах пробоподготовки с применением ТФЭ адсорбционной очистке неорганическими материалами подвергается как правило элеат с концентрирующего картриджа, то есть концентрированная проба в неполярном растворителе. Сорбция на минеральном сорбенте эффективно удаляет из пробы полярные компоненты матрицы, что наиболее важно в случае последующего анализа пробы методом ГХ, где присутствие гидрофильных слабо летучих соединений является крайне нежелательным. Твердофазная экстракция на полярных неорганических адсорбентах применяется для концентрирования полярных компонентов из растворов липофильные образцов в гексане; в этих случаях как правило используется силикагель [38] или его аминопропилированный аналог [39]. 9.4. Комплексные процедуры подготовки пробы с применением твердофазной экстракции и адсорбционной очистки Выбор аппаратурного аналитического метода для идентификации и количественного определения аналитов накладывает на качество пробы определенные требования, которые можно сформулировать следующим образом: 1. растворитель для растворения (или перерастворения) пробы должен обеспечивать максимальную эффективность ее последующего анализа выбранным аппаратурным методом; 2. концентрация аналитов в пробе должна быть достаточной для их надежной идентификации и количественного определения; 3. концентрации в пробе веществ, мешающих определению аналитов и приводящих к загрязнению узлов оборудования, должны быть снижены до приемлемого уровня. Задача пробоподготовки состоит в приготовлении пробы, удовлетворяющей этим требованиям, с наименьшими затратами труда персонала, времени и химических реактивов. Составление схемы подготовки пробы сводится к поиску компромисса между предъявляемыми требованиями к качеству пробы и требованиями по сокращению затрачиваемых на анализ ресурсов, и подразумевает выбор оптимального варианта из нескольких возможных. По своей малой ресурсоемкости и высокой эффективности метод ТФЭ выигрывает у классических методов пробоподготовки, что и делает его привлекательным для применения в комплексных аналитических методах. 9.4.1. Подготовка пробы с помощью офф-лайн методов 9.4.1.1. Концентрирование на универсальном адсорбенте, адсорбционная очистка на полярном неорганическом адсорбенте Одна из наиболее простых схем подготовки пробы с помощью офф-лайн ТФЭ включает два основных шага: концентрирование образца на универсальном адсорбенте и адсорбционную очистку пробы полярным неорганическим адсорбентом. Одним из примеров реализации этой схемы может служить определение микотоксина патулина в соках [40]. 20 мл сока пропускается через картридж с 1 мл сверхсшитого полистирола Purosep 200; далее картридж промывается 5 мл воды и сушится в токе азота. Аналит вымывается 5 мл этилацетата; полученная проба в этилацетате пропускается через тонкий слой силикагеля. Растворитель отгоняется в токе азота, сухой остаток перерастворяется в 100 мкл этилацетата и анализируется методом НФ ВЭЖХ-ДМД (с диодно-матричной детекцией). Концентрирующий картридж регенерируется 10 мл 4% фосфорной кислоты в смеси вода-ацетонитрил 1:1 (очистка от пигментов), 5 мл ацетонитрила и кондиционируется 10 мл воды. Кратность концентрирования по данной методике составляет величину 200-500 (объем образца при необходимости можно увеличить до 50 мл). Очистка пробы на силикагеле уменьшает содержание в пробе полярных веществ, загрязняющих хроматографическую колонку в режиме НФ ВЭЖХ. Эффективная регенерация концентрирующего картриджа позволяет применять его многократно. Во многих случаях целью первой стадии - твердофазной экстракции может оказаться не достижение высоких значений кратности концентрирования, а замена растворителя с целью более эффективной адсорбционной очистки пробы. Одним из примеров реализации такого подхода является метод определения остаточных количеств пестицидов в растительных образцах, разработанный автором (неопубликованные данные). 5 мл ацетонитрильного экстракта растительного гомогената разбавляется 20 мл 50мМ водного раствора хлорида натрия; 25 мл полученного образца пропускаются через картридж со сверхсшитым полистиролом. Картридж промывается 5 мл воды, затем вода вытесняется из картриджа воздухом, и пестициды смываются 10 мл этилацетата. Этилацетатный смыв сушится над сульфатом магния и пропускается через картридж со слабым анионообменным адсорбентом, диэтиламинопропилсиликагелем (DEAEсиликагель), на котором происходит основная очистка пробы. Этилацетат отгоняется в токе азота до объема 100-200 мкл, остаток перерастворяется в 1-10 мл (в зависимости от требуемой чувствительности анализа) гексана со введенным внутренним стандартом. Проба может быть проанализирована как методом ГХ-МС, так и методом ГХ-ДЭЗ. Этилацетат может быть отогнан досуха (при этом теряются некоторые высоколетучие пестициды); перерастворив сухой остаток в 100 мкл ацетонитрила, полученную пробу можно проанализировать и методом градиентной ВЭЖХМС. Основная идея применения ТФЭ в данном случае состоит в замене первоначального экстракта в ацетонитриле на пробу в этилацетате. Этилацетат является менее полярным растворителем, чем ацетонитрил, соответственно, эффективность очистки пробы от гидрофильных соединений на полярном DEAE-силикагеле возрастает многократно. Кроме того, уже в процессе ТФЭ на сверхсшитом полистироле образец очищается от большинства сахаридов, органических кислот и части гликозидов. Более того, методика имеет запас по чувствительности; пробу всегда можно дополнительно сконцентрировать, отогнав этилацетат досуха и перерастворив пробу в меньшем количестве гексана; также следует учесть, что проба может быть проанализирована более чувствительным методом - ГХ-ДЭЗ для подтверждения полученных результатов в спорных ситуациях. В некоторых случаях адсорбционная очистка образца может осуществляться до стадии концентрирования. Подобная схема подготовки пробы была реализована в разработанном автором методе определения ПАУ в порошкообразных коптильных препаратах (неопубликованные данные). 5 г коптильного препарата экстрагируется 50 мл гексана, к экстракту добавляется 1 мл изопропанола. Экстракт пропускается через слой DEAE-силикагеля, а затем через картридж со сверхсшитым полистиролом (квази-нормально-фазовая ТФЭ). Концентрирующий картридж промывается 1 мл метанола и сушится в токе азота; аналиты смываются 10 мл хлористого метилена. Растворитель отгоняется в токе азота, сухой остаток перерастворяется в 100 мкл хлористого метилена; проба анализируется методом ГХ-МС. Целью адсорбционной очистки гексанового экстракта на DEAE-силикагеле в данном случае является удаление из образца фенольных соединений, содержание которых в коптильных препаратах очень велико. Проведение стадии очистки образца до твердофазной экстракции предотвращает перегрузку концентрирующего картриджа веществами матрицы образца, и таким образом увеличивает практические значения объемов проскока аналитов. Добавка 2% изопропанола в гексановый экстракт предотвращает адсорбцию ПАУ на DEAE-силикагеле; промывка картриджа 1 мл метанола дополнительно очищает пробу от фенолов. 9.4.1.2. Концентрирование на универсальном адсорбенте, адсорбционная ионообменных и бифункциональных адсорбентах очистка на Одним из примеров реализации такого подхода является метод определения фенольных соединений в грунтовых водах, описанный в работе [6]. Образец грунтовой воды пропускается через картридж с непористой графитизированной сажей; при этом наряду с адсорбцией фенолов происходит извлечение больших количеств компонентов матрицы, в основном нейтральных и анионных сурфактантов. Концентрирующий картридж сушится в токе азота, аналиты смываются смесью хлористый метилен-метанол 6:4. Полученная проба пропускается через картридж с сильным анионообменным адсорбентом, который извлекает из пробы соединения кислого характера, то есть определяемые фенолы и анионные сурфактанты; нейтральные сурфактанты не задерживаются анионообменным адсорбционным материалом и вымываются с элюатом. Фенольные соединения смываются затем с анионообменного адсорбента 100% муравьиной кислотой; анионные же сурфактанты остаются на картридже. В случаях ионных аналитов концентрирование может быть проведено непосредственно на ионообменном адсорбенте. Примером такого подхода может служить метод определения ароматических аминов в табачном дыме [41], в котором реализована двухстадийная твердофазная экстракция: вначале на ионообменном, а затем на нейтральном полимерном материале. 2 мл экстракта фильтров сигарет в 5% водной HCl пропускается через картридж с катионообменной смолой Oasis MCX; картридж промывается 2 мл 1% водной HCl и 2 мл метанола; аналиты смываются 2 мл 5% NH4OH в метаноле. Полученная проба разбавляется 10 мл воды (рН 11), образец пропускается через картридж с нейтральным полимерным материалом Oasis HLB. Картридж промывается 2 мл воды (рН 11), 2 мл смеси метанол-вода 30:70 и затем сушится в токе азота; ароматические амины смываются с полимера 1.5 мл толуола. Высокая степень очистки пробы достигается с помощью комбинирования ионообменного и обращенно-фазового ТФЭматериалов. 9.4.1.3. Концентрирование и адсорбционная очистка на селективных импринтных и аффинных адсорбентах Успешное применение импринтных адсорбционных материалов иллюстрирует метод определения пестицидов триазинового ряда в грунтовых водах [37]. 500 мл грунтовой воды пропускается через диск с С18 силикагелем, затем картридж сушится; аналиты смываются 30 мл дихлорметана. Проба в дихлорметане пропускается через картридж с пестицид-импринтным адсорбентом на основе полиметакриловой кислоты. Полиметакриловая кислота, адсорбент с высокой полярностью, количественно концентрирует полярные слобоосновные аналиты из дихлорэтана. Картридж промывается 2 мл ацетонитрила для очистки пробы от компонентов матрицы образца; потери же аналитов при этой процедуре остаются незначительными. Затем аналиты количественно смываются с картриджа 3 мл метанола. Применение высокоселективных и достаточно емких импринтных адсорбционных материалов позволяет провести селективное концентрирование аналитов. Примером такой эффективной процедуры может служить метод определения гербицидов на основе феноксиуксусных кислот из водных образцов [36]. 1000 мл образца грунтовой воды пропускается через картридж с импринтным адсорбентом на основе винилпиридина, который эффектно сочетает принцип комплементарности с ионообменным взаимодействием с кислотными гербицидами. Картридж промывается 3 мл метанола; аналиты смываются 2 мл смеси метанол-уксусная кислота 4:1. Проба анализируется методом капиллярного электрофореза. На рисунке 4 показаны результаты анализа проб, полученных с помощью жидкость-жидкостной экстракции, ТФЭ на неселективной С18 фазе и ТФЭ на импринтном материале; удовлетворительное определение возможно лишь при пробоподготовке последним методом. Примером очистки пробы методом твердофазной экстракции на аффинном адсорбенте (без концентрирования аналитов) может служить метод определения метаболитов героина в образцах крови [42]. 1 мл плазмы крови пропускается через картридж с соответствующим иммуносорбентом, который затем промывается 5 мл воды; аналиты смываются 20 мл элюента, 8% ацетонитрила в кислом фосфатном буфере. Рисунок 4. Результаты анализа гербицидов методом капиллярного электрофореза в пробах грунтовой воды, полученных различными методами [36]. а – с помощью жидкость-жидкостной экстракции, b – ТФЭ на неселективном С18 силикагеле; с – ТФЭ на импринтном адсорбенте; d – ТФЭ на полимерном адсорбенте, полученном без формообразователя (бланк). 9.4.2. Подготовка пробы с помощью он-лайн методов Применение он-лайн концентрирования на универсальных адсорбционных материалах целесообразно лишь в тех случаях, когда исследуемые образцы не содержат извлекаемых сорбентом компонентов, способных помешать дальнейшему хроматографическому определению аналитов. В большинстве же практических приложений образцы являются комплексными, многокомпонентными. По этой причине наиболее перспективными материалами для он-лайн концентрирования являются высокоселективные импринтные и аффинные адсорбционные материалы. С другой стороны, успешным может оказаться и он-лайн концентрирование на менее селективном сорбенте, если аналитическая колонка позволяет надежно отделить аналиты от сопутствующих компонентов. Примером применения аффинных адсорбентов для он-лайн твердофазной экстракции может служить метод определения гербицидов группы линурона в образцах грунтовых вод [10]. На рисунке 5 для сравнения приведены хроматограммы, полученные при анализе проб, приготовленных с помощью ТФЭ на аффинном и неселективном С18 материалах; преимущество селективного он-лайн концентрирования на аффинном сорбенте очевидно. Рисунок 5. Сравнение хроматограмм, полученных с применением он-лайн концентрирования образца речной воды на картридже с неселективным С18 адсорбентом (вверху) и аффинным адсорбентом (внизу) [10]. 3 – хлортолурон, 5 – изопротурон, 6 – линурон, 9 – диурон. 9.5. Литературные источники [1] S.A. Barker. Matrix solid-phase dispersion. J. Chromat. A, 885 (2000) 115-127 [2] K.N.T. Norman , S.H.W. Panton. Supercritical fluid extraction and quantitative determination of organophosphorus pesticide residues in wheat and maize using gas chromatography with flame photometric and mass spectrometric detection. J. Chromat. A, 907 (2001) 247255 [3] I. Liska. Fifty years of solid-phase extraction in water analysis – historical development and overview. J. Chromat. A, 885 (2000) 3-16 [4] M.E. Leon-Gonzalez, L.V. Perez-Arribas. Chemically modified polymeric sorbents for sample preconcentration. J. Chromat. A, 902 (2000) 3-16 [5] C.W. Huck, G.K. Bonn. Recent developments in polymer-based sorbents for solid-phase extraction. J. Chromat. A, 885 (2000) 51-72 [6] I. Rodrigues, M.P. Llompart, R. Cela. Solid-phase extraction of phenols. J. Chromat. A, 885 (2000) 291304 [7] M.-C. Hennion. Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography. J. Chromat. A, 856 (1999) 3-54 [8] L.I. Andersson. Molecular imprinting for drug bioanalysis. A review on the application of imprinted polymers to solid-phase extraction and binding assay. J. Chromat. A, 739 (2000) 163-173 [9] J.S. Fritz, P.J. Dumont, L.W. Schmidt. Methods and materials for solid-phase extraction. J. Chromat. A, 691 (1995) 133-140 [10] N. Delaunay, V. Pichon, M.-C. Hennion. Immunoaffinity solid-phase extraction for the trace-analysis of low-molecular-mass analytes in complex sample matrices. J. Chromat. B, 745 (2000) 15-37 [11] D. Stevenson. Immuno-affinity solid-phase extraction. J. Chromat. B, 745 (2000) 39-48 [12] P. Sandra, B. Tienpont, F. David. M ulti-residue screening of pesticides in vegetables, fruits and baby food by stir bar sorptive extraction–thermal desorption–capillary gas chromatography–mass spectrometry. J. Chromat. A, 1000 (2003) 299-309 [13] S. Guenu, M.-C. Hennion. Evaluation of new polymeric sorbents with high specific surface areas using an on-line solid-phase extraction-liquid chromatographic system for the trace-level determination of polar pesticides. J. Chromat. A, 737 (1996) 15-24 [14] J. Patsias, E. Papadopoulou-Mourkidou. Development of an automated on-line solid-phase extractionhigh-performance liquid chromatographic method for the analysis of aniline, phenol, caffeine and various selected substituted aniline and phenol compounds in aqueous matrices. J. Chromat. A, 904 (2000) 171188 [15] R. Wissiack, E. Rosenberg, M. Grasserbauer. Comparison of different sorbent materials for on-line solid-phase extraction with liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry of phenols. J. Chromat. A, 896 (2000) 159-170 [16] V. Davankov, M. Tsyurupa, M. Ilyin, L. Pavlova, J. Chromatogr. A, 965 (2002) 65 [17] T. Hanai. Separation of polar compounds using carbon columns. J. Chromat. A, 989 (2003) 183-196 [18] M. Gilar, A. Belenky, B.H. Wang. High-throughput biopolymer desalting by solid-phase extraction prior to mass spectrometric analysis. J. Chromat. A, 921 (2001) 3-13 [19] A. Gelencser et al. A simple method for the determination of capacity factor on solid-phase extraction cartridges. J. Chromat. A, 693 (1995) 217-225 [20] A. Schellen et al. Generic solid phase extraction–liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for fast determination of drugs in biological fluids. J. Chromat. B, 788 (2003) 251-259 [21] V.A. Davankov and M.P. Tsyurupa. Structure and properties of hypercrosslinked polystyrene – the first representative of a new class of polymer networks. Reactive Polymers, 13 (1990) 27-42 [22] В.А. Даванков, К.С. Сычев, М.М. Ильин. Применение сверхсшитых полистирольных сорбентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Заводская лаборатория. Номер 4. 2003. Том 69 с. 3-7 [23] M.-C. Hennion et al. J. Chromat. A, 712 (1995) 287 [24] V.A. Davankov, C.S. Sychov, M.M. Ilyin, K.O. Sochilina. Hypercrosslinked polystyrene as a novel type of high-performance liquid chromatography column packing material. Mechanisms of retention. J. Chromatogr. A, 987 (2003) 67-75 [25] Z. Huang, S. Zhang. Confirmation of amphetamine, methamphetamine, MDA and MDMA in urine samples using disk solid-phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry after immunoassay screening. J. Chromat. B, 792 (2003) 241-247 [26] V. Pichon et al. Simple removal of humic and fulvic acid interferences using polymeric sorbents for the simultaneous solid-phase extraction of polar acidic, neutral and basic pesticides. J. Chromat. A, 737 (1996) 25-33 [27] N. Li, H.K. Lee. Solid-phase extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in surface water. Negative effect of humic acid. J. Chromat. A, 921 (2001) 255-263 [28] P.J. Dumont, J.S. Fritz. Effect of resin sulfonation on the retention of polar organic compounds in solid-phase extraction. J. Chromat. A, 691 (1995) 123-131 [29] www.waters.com [30] E. Pocurull et al. On-line solid-phase extraction-ion-pair liquid chromatography-electrospray mass spectrometry for the trace determination of naphthalene monosulfonates in water. J. Chromat. A, 854 (1999) 187-195 [31] R.A.M. van der Hoeven et al. Liquid chromatography-mass spectrometry with on-line solid-phase extraction by a restricted-access C18 precolumn for direct plasma and urine injection. J. Chromat. A, 762 (1997) 193-200 [32] N. Labrou, Y. D. Clonis, The affinity technology in downstream processing. J. Biothech., 36 (1994) 95119 [33] N. Ostryanina, G. Vlasov, T. Tennikova. Multifunctional fractionation of polyclonal antibodies by immunoaffinity high-performance monolithic disk chromatography. J. Chromat. A, 949 (2002) 163-71 [34] V. Pichon et al. Selective trace enrichment on immunosorbents for the multiresidue analysis of phenylurea and triazine pesticides. J. Chromat. A, 725 (1996) 107-119 [35] E. Caro et al. On-line solid-phase extraction with molecularly imprinted polymers to selectively extract substituted 4-chlorophenols and 4-nitrophenol from water. J. Chromat. A, 995 (2003) 233-238 [36] C. Baggiani et al. Molecularly imprinted solid-phase extraction sorbent for the clean-up of chlorinated phenoxyacids from aqueous samples. J. Chromat. A, 938 (2001) 35-44 [37] T. Pap et al. Effect of solvents on the selectivity of terbutylazine imprinted polymer sorbents used in solid-phase extraction. J. Chromat. A, 973 (2002) 1-12 [38] G. Marquez-Ruiz et al. Rapid, quantitative determination of polar compounds in fats and oils by solidphase extraction and size-exclusion chromatography using monostearin as internal standard. J. Chromat. A, 749 (1996) 55-60 [39] C.B. Johnson. Isolation of cholesterol oxidation products from animal fat using aminopropyl solidphase extraction. J. Chromat. A, 736 (1996) 205-210 [40] К.С. Сычев, К.И. Эллер, В.А. Даванков. Определение микотоксина патулина во фруктах и соках методом НФ ВЭЖХ с применением твердофазной экстракции на сверхсшитом полистироле. Заводская лаборатория, в печати (2004) [41] C.J. Smith, G.L. Dooly, S.C. Moldoveanu. N ew technique using solid-phase extraction for the analysis of aromatic amines in mainstream cigarette smoke. J. Chromat. A, 991 (2003) 99-107 [42] J. Beike et al. Immunoaffinity extraction of morphine, morphine-3-glucuronide and morphine-6glucuronide from blood of heroin victims for simultaneous high-performance liquid chromatographic determination. J. Chromat. B, 726 (1999) 111-119 10. Сборник методик анализа 10.1. С.Н. Сычев. Анализ ПАУ бенз(а)пирена Бенз(α)пирен является полициклическим ароматическим углеводородом, одним из самых сильных канцерогенов. Обнаружение бенз(α)пирена в воде, воздухе или пище является признаком присутствия в тех же объектах целого ряда полиядерных соединений, обладающих не менее сильным канцерогенным действием. В связи с этим, анализ бенз(α)пирена в следовых концентрациях является важной аналитической задачей. В этом разделе рассмотрены две задачи – определение бенз(α)пирена в воздухе [1] и копченостях. Методика количественного анализа атмосферного воздуха и воздуха рабочей зоны на содержание бенз(α)пирена методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием Характеристика метода Метод основан на использовании жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием. Отбор проб производится с концентрированием на фильтр. Определению не мешают другие ПАУ (полиароматические углеводороды). Время выполнения измерения, включая отбор и подготовку проб, – от 1 до 4 часов. Физико-химические свойства бенз(α)пирена Бенз(α)пирен, молекулярная масса 252, твердый мелкокристаллический порошок белого или серовато-желтого цвета; Тпл. = 179оС, Ткип. = 310 – 312оС при 10 мм рт.ст. Хорошо растворим в органических растворителях (бензол, бензин, гексан и т.п.), в воде не растворим. В воздухе находится в виде аэрозоля. Обладает канцерогенным действием (класс опасности – 1). ПДК в рабочей зоне – 0.00015 мг/м3 и 0.000001 мг/м3 в атмосфере. Средства измерений, аппаратура, посуда, реактивы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Хроматограф жидкостной «Милихром 5-7» с флуориметрическим детектором; ГСО состава раствора бенз(α)пирена; Фильтры АФА ВП-20 или АФА-ХА-20; Ультразвуковая баня; Ротационный испаритель; Аспиратор для отбора проб воздуха, модель 822; Ацетонитрил «осч» для ВЭЖХ, сорт 1, «Криохром» (Санкт-Петербург»; Спирт этиловый ректифицированный, высший сорт, ГОСТ 18300-87; Активированный уголь марок БАУ или КАД иодный, АГ-3, АП-3 или др. Очистка ректифицированного спирта Необходимо использовать следущую процедуру очистки: 1. Перегонка спирта на водяной бане, причем первые и последние порции в количестве 20% от исходного объема отбрасывают. 2. Для глубокой очистки применяют активированные угли марок БАУ, КАД иодный, АГ-3 и др. После однократной дистилляции в растворитель добавляют активированный уголь из расчета 10–20г на 1 л растворителя, смесь встряхивают в течение трех минут и выдерживают один час. 3. Растворитель отфильтровывают от угля и вновь перегоняют на водяной бане. Отбор проб воздуха Анализируемый воздух со скоростью 20 л/мин аспирируют через фильтры АФА-ВП-20 или АФА-ХА-20. Продолжительность отбора варьируют в зависимости от степени загрязнения воздуха на соответствующем рабочем месте или в атмосфере от десятков минут до 4-х часов. Скорость фильтрации воздуха по мере загрязнения фильтра снижается, поэтому следует не реже 1 раза в час снимать показания ротаметра и, в соответствии с показаниями, рассчитывать количество воздуха, прошедшее через фильтр. После отбора проб фильтры упаковывают в конверты из крафтбумаги и полиэтиленовые пакеты. Срок хранения фильтров с пробами – до 2 месяцев при комнатной температуре и до 4-х – в холодильнике. Условия хроматографирования и детектирования 1. 2. 3. 4. 5. Колонка 80х2, заполненная С18 обращенно-фазовым адсорбентом, или аналогичная. Элюент ацетонитрил – вода в объемном соотношении 75:25; Объемная скорость элюента 100 – 150 мкл/мин; Объем пробы – 9 мкл; Длина волны возбуждения флуориметрического детектора – 254 нм или 282 нм в зависимости от типа флуориметрического детектора; 6. Выходной эмиссионный фильтр – 380 нм; 7. Удерживаемый объем бенз(α)пирена – 1500-1550 мкл. Выполнение измерений содержания бенз(α)пирена Подготовка проб Фильтр АФА-ХА-20 с анализируемой пробой помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 мл. Пипеткой наливают 10 мл спирта этилового. Колбу помещают в ультразвуковую баню и в течение 10 мин. подвергают обработке ультразвуком. После обработки ультразвуком содержимое колбы (фильтр не трогать!) переливают в заранее подготовленную круглодонную колбу вместимостью 100 мл из комплекта ротационного испарителя. В ту же плоскодонную колбу с фильтром наливают еще 10 мл спирта этилового, колбу помещают в ультразвуковую баню и подвергают обработке ультразвуком в течение 10 мин. После обработки ультразвуком содержимое плоскодонной колбы переливают в ту же круглодонную колбу, в которую был слит раствор бенз(α)пирена в спирте после первой обработки ультразвуком. Круглодонную колбу устанавливают в ротационный испарититель и содержимое колбы выпаривают досуха. Для ускорения выпаривания можно установить температуру бани 95-100оС и на выход испарителя для создания разрежения подсоединить водоструйный насос или аспиратор. После выпаривания в ту же круглодонную колбу пипеткой на 1 мл наливают 1 мл ацетонитрила, колбу вновь устанавливают на ротор испарителя (баню и водоструйный насос убирают!) и в течение 5 мин. пробу перемешивают за счет вращения ротора. Полученный раствор фильтруют (в случае надобности) и отбирают аликвоту для анализа. Процедура подготовки пробы аналогична для градуировочных растворов. Выполнение измерений Подготовленную пробу объемом 9 мкл вводят в хроматограф и определяют площадь пика бенз(α)пирена в исследуемой пробе. Используя значение градуировочного коэффициента, рассчитывают ориентировочное значение концентрации бенз(α)пирена в исследуемой пробе. Затем приготавливают градуировочный раствор бенз(α)пирена, отличающийся от исследуемого не более, чем на 30%. С градуировочным раствором проводят те же самые операции, что и с реальным раствором. После этого градуировочный раствор трижды вводят в хроматограф и определяют площади пика бенз(α)пирена. На анализ необходимо затратить не менее 1900 мкл элюента для того, чтобы из колонки вышли более тяжелые углеводороды типа коронена. На регенерацию колонки необходимо затратить 250 мкл элюента. Рисунок 10.1. Хроматограмма воздуха в одном из промышленных районов г.Челябинска. Колонка 80х2 заполнена Диасорбом С16, элюент ацетонитрил - вода в соотношении 75:25, расход элюента 100 мкл/мин. Хроматограф "Милихром-5-7" с флуориметрическим детектором, длина волны возбуждения 282 нм, эмиссионный фильтр 380 - 600 нм. 1 - бенз(е)пирен, 2 - бенз(а)пирен (в пике 0.02 нг бенз(а)пирена). Определение бенз(а)пирена в копченостях методом ВЭЖХ с флуориметрической и УФдетекцией Подготовка пробы Навеску массой 5 г измельчают, перетирают с 0.2 г безводного сульфата натрия и помещают в коническую колбу. Туда же добавляют 50 мл изопропанола и проводят экстракцию в течение 15 минут. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу, добавляют 6 мл воды и 0.2 г гидроксида калия. Проводят гидролиз экстракта в течение 30 минут в колбе с обратным холодильником. Гидролизат фильтруют в стакан, добавляют 60 мл воды и экстрагируют 3х10 хлороформа (нижний слой). Органические вытяжки объединяют, осушают над хлоридом кальция и упаривают на роторном испарителе до объема 3-5 мл. Упаренную вытяжку переносят на стеклянную колоку диаметром 1-2 см, заполненную на 5 см силикагелем с зернением порядка 100 мкм (25 меш), и элюируют полиароматические углеводороды 30 мл смеси гексан:хлороформ 80:20. Элюат упаривают на роторном испарителе до объема 3-5 мл, переносят в микропробирку на 5 мл и отгоняют растворитель током воздуха. Сухой остаток перерастворяют в 500 мкл ацетонитрила или смеси ацетонитрил-вода 95:5. Объем вводимой пробы 5 мкл. Для экстракции ПАУ из разбавленного гидролизата можно также применять твердофазную экстракцию (ТФЭ) на сверхсшитом полистирольном адсорбенте. Для проведения анализа используются хроматографические колонки 80×2, заполненные С18 адсорбентом, или аналогичные по свойствам микроколонки. Анализ можно проводить как в изократическом, так и градиентном режимах. Условия градиентного элюирования. Ступени элюента − смеси ацетонитрил-вода состава 60:40 (ступень А), 70:30 (ступень Б), 80:20 (ступень В), 90:10 (ступень Г). Программа ступенчатого градиента А:Б:В:Г 1200(400):700:300. Для регенерации колонки используются 400 мкл ступени А. Длина волны возбуждения 282 нм, эмиссионный фильтр от 360 нм. Концентрация бенз[α]пирена рассчитывается по формуле: С = ( S * CCT * VCT * VПР. ОБЩ )/( SCT * VПР * m) , где S – площадь пика бенз[α]пирена в исследуемой пробе; SCT – площадь пика стандарта бенз[α]пирена в градуировочном растворе; CCT – концентрация градуировочного раствора, мкг/мл; VCT – объём вводимой пробы градуировочного раствора, мкл; VПР – объём вводимой исследуемой пробы, мкл; VПР. ОБЩ – общий объём приготовленной пробы, мкл; m – масса навески, г; С – концентрация бенз[α]пирена в объекте исследования, мкг/кг. Приготовление градуировочного раствора 1 мл ГСО бенз[α]пирена в ацетонитриле концентрации 100 мкг/мл переносят в мерную колбу объёмом 200 мл, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают. Концентрация градуировочного раствора бенз[α]пирена равна 0.5 мкг/мл. Литература Сычев С.Н. Методика количественного химического анализа воздуха рабочей зоны на содержание 3,4-бензпирена. – М.: ВНИИМС, 1994. – свидетельство № 109-94. – 15 с. 10.2. С.Н. Сычев. Определение альдегидов и кетонов в плазме крови методом ОФ ВЭЖХ в виде производных 2,4-динитрофенилгидразона (ДНФГ) Cкрининг альдегидов и кетонов в биообъектах осуществляется с целью определения карбонилсодержащих соединений, отходов производства промышленных предприятий, в организме человека. Подготовка пробы К 2 мл плазмы крови прибавляют 2 мл 0.2% спиртового раствора ДНФГ и 0.2 мл концентрированной соляной кислоты; реакционную смесь оставляют на 30 минут, затем разбавляют 20 мл воды и экстрагируют трижды 5 мл гексана. Объединённый гексановый экстракт упаривают на роторном испарителе, остаток растворяют в 0.5 мл ацетонитрила. Хроматографический анализ Для хроматографического анализа применяются колонка 80×2, заполненная С18 адсорбентом. Реактивы: вода дистиллированная, ацетонитрил для хроматографии «Криохром» 0го, 1-го или 2-го сорта. Режим работы хроматографа: длина волны 358 нм, скорость подачи 150 мкл/мин, объем вводимой в колонку пробы 3-5 мкл; элюент ацетонитрил-вода-диэтиламин-уксусная кислота в соотношении 50:50:1:1.5 по объему. Рисунок 10.2. Хроматограмма ДНФГ производных карбонилсодержащих соединений. 1 – ДНФГ, 2 – формальдегид, 3 – ацетальдегид, 4 – ацетон, 5 – пропаналь, 6 – изомасляный альдегид. Колонка 80х2 заполнена Диасорбом С16 (12% углерода) 10.3. С.Н. Сычев. Определение кортикостероидных гормонов: альдостерона, кортизона, кортизола и тестостерона Известен как обращенно-фазовый, так и нормально-фазовый варианты определения кортикостероидных гормонов в плазме крови. Нами опробован обращенно-фазовый вариант определения альдостерона, кортизона, кортизола и тестостерона на хроматографах серии «Милихром». Подготовка пробы В стекляные пробирки объемом 15 мл помещают 0.5 мл плазмы, 0.5 мл бидистиллированной воды и 4 мл гексана, встряхивают в течение 3 мин. и органический слой отсасывают на водоструйном насосе. После этого проводят экстракцию гормонов, добавляя 9 мл хлороформа к оставшейся в пробирке водной фазе и встряхивают смесь в течение 5 мин. Водный слой отсасывают, а органический – последовательно переносят в пробирку объемом 1 мл и упаривают в токе азота при температуре 400С. Остаток растворяют в 24 мкл элюента. 10 мкл экстракта вносят в хроматограф. Предел обнаружения 4 нг/мл. Рисунок 10.3. Хроматограмма кортикостероидных гормонов в плазме крови. Колонка 80х2 заполнена Сепароном С18. Элюент ацетонитрил - вода. Ступенчатый градиент: содержание ацетонитрила в воде изменяется от 30 до 65% за 23 мин. Расход 100 мкл, длина волны 242 нм. 1 - альдостерон, 2 - кортизол, 3 - кортизон, 4- кортикостерон, 5 - тестостерон. Литература 1. 2. 3. Еремин С.К., Изотов Б.Н. Анализ наркотических средств.- М.:Мысль, 1993, 281 с. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Под ред. Хеншена А. – М.: Мир, 1988. 687 с. Федоров В.И., Черкасова О.П. Применение отечественного микроколоночного хроматографа серии «Милихром» с ультрафиолетовым детектором для раздельного определения кортизола, кортизона и кортикостерона в одной пробе крови. Методические рекомендации № 10-10/37 от 1.04.91. Минздрав СССР, 1991. 10.4. К.С. Сычев, С.Н. Сычев. Применение ВЭЖХ в анализе лекарственных препаратов на примере ряда диазепинов Одной из наиболее быстро развивающихся современных отраслей химии является фармацевтическая химия. Хроматографические задачи, решаемые в области фармхимии, включают как задачи по анализу реакционных смесей при разработке методов синтеза новых биологически активных соединений, так и задачи контроля промышленного синтеза лекарственных препаратов. Метод ОФ ВЭЖХ в сочетании с элюентами на основе буфера «дигидрофосфат – диэтиламмоний» позволяет осуществлять скрининговые анализы реакционных смесей и определять в них соединения различных функциональных классов. НФ ВЭЖХ применяется в тех случаях, когда аналиты гидролизуются в условиях обращенно-фазового анализа. В качестве примера можно привести анализ образца неочищенного продукта синтеза алпразолама (рис.10.4.1). Условия хроматографирования: колонка 80×2, заполненная Диасорбом С16Т (12% С) или аналогичным по свойствам адсорбентом, элюент ацетонитрил-буфер (смесь «вода-диэтиламин» в соотношении 100:1, доведенная до рН=3 фосфорной кислотой) в объёмном отношении 30:70. Детектирование: 210, 220, 254, 270 нм. Рисунок 10.4.1. Хроматограмма неочищенного продукта синтеза алпразолама. 5 – Алпразолам. Нормально-фазовый вариант ВЭЖХ применяется в том случае, когда исследуемые соединения подвержены гидролизу в кислых водных средах. Примером может служить анализ образца неочищенного продукта синтеза серосодержащего диазепина-S. В обращенно-фазовых условиях диазепин-S гидролизуется с образованием гидрофильных соединений (рис.10.4.2). Условия хроматографирования: колонка 80×2, заполненная Диасорбом С16Т (12% С) или аналогичным по свойствам адсорбентом, элюент ацетонитрил-универсальный буфер в объёмном отношении 30:70. Детекция: 210, 220, 254 и 278 нм. Рисунок 10.4.2. Хроматограмма образца неочищенного продукта синтеза соединения диазепин-S, обращённо-фазовый вариант. В этом случае анализ должен проводиться в нормально-фазовых условиях. На рисунке 10.4.3 приведены хроматограммы образца продукта синтеза бенздиазепина-S на силикагеле и нитрильной (СN) фазе. Условия хроматографирования: колонки 80×2, элюент гексан-хлороформизопропанол 76:20:4, детектирование на длинах волн 232, 254, 270 нм. Из приведённых хроматограмм видно, что в этом случае нитрильная фаза проявляет лучшую селективность по отношению к анализируемым соединениям, чем силикагель. Рисунок 10.4.3. Хроматограммы образца продукта синтеза соединения бенздиазепина-S, нормально-фазовый вариант: вверху – на силикагеле, внизу – на цианопропилированном силикагеле. 10. Сборник методик анализа 10.5. С.Н Сычев. Определение фальсфикации вин 10.5.1. Экспресс-анализ Одной из наиболее актуальных проблем современной торговли является фальсификация продуктов питания, реализуемых через розничную сеть. Особое внимание привлекает фальсификация вина, размах которой иногда поражает воображение. ГОСТовстовские приемы и методы определения качества вин на сегодняшний день безнадежно устарели, а новые методы, несмотря на их бесспорную эффективность, упрямо не внедряются ни государственными организациями, обязанными следить за качеством пищевой продукции, ни коммерческими организациями, изготавливающими или торгующими соответствующей продукцией. Первой ступенью проверки большого массива образцов должен стать скрининговый анализ, который должен обладать определенным набором свойств: максимально возможной универсальностью по отношению к анализу различных классов соединений, быстрой и недорогой подготовкой пробы, недорогими реактивами, оптимальным сочетанием универсальности и селективности детектирования. В определенной степени такими свойствами обладает хроматографическая система в режиме обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ): сорбент С18, элюент «0.02 М раствор однозомещенного фосфата калия-ацетонитрил-диэтиламин-фосфорная кислота, рН 2.6-3.0», многоволновое детектирование в диапазоне 190 – 360 нм. Ниже приведены примеры использования такой системы для анализа различных вин, представляющих сложные смеси природных и синтетических соединений. Экспериментальная часть Хроматографический эксперимент проводился на хроматографах «Милихром-2», «Милихром-4-УФЭ» и «Милихром-5-3» с многоволновым сканирующим УФ-детектором (190 – 360 нм). Использовались колонки 80х2, заполненные сорбентами: Силасорб С18 (5 мкм), Диасорб С16 (6 мкм) и Сепарон С18 (5 мкм). Для приготовления элюентов использовалась дистиллированная вода, однозамещенный фосфат калия квалификации «хч», орто-фосфорная кислота «хч», ацетонитрил для ВЭЖХ сорт1 и 2 (фирма «Криохром», Санкт-Петербург), диэтиламин фирмы «Мерк». Буфер «А» готовился следующим образом: к 100см3 0.02 М КН2РО4 приливается 0.5 см3 диэтиламина, раствор доводится до рН = 3 орто-фосфорной кислотой. Условия хроматографического анализа вин на хроматографах серии «Милихром»: длины волн 230, 270 и 290 нм, расход элюента 80 мкл/мин. Объем пробы 10 мкл. Перед анализом вино фильтровалось через фильтр с голубой лентой. Элюент – ступенчатый градиент ацетонитрила в буфере «А»: 1 – я ступень: буфер – 700 мкл; 2 – я ступень: ацетонитрил – буфер (5: 95 по объему) – 500 мкл, из них 400 мкл регенерация; 3 – я ступень: ацетонитрил – буфер (10: 90 по объему) – 400 мкл; 4 – я ступень: ацетонитрил – буфер (20: 80 по объему) – 400 мкл; 5 – я ступень: ацетонитрил – буфер (40: 60 по объему) – 500 мкл; Результаты исследования Хроматограммы стандартных молодых купажированных красных полусладких и полусухих вин имеют вид, показанный на рис. 10.5.1., 10.5.2 и 10.5.3. Рисунок 10.5.1. Хроматограмма вина «Домашнее вино» (красное, полусладкое, Молдавия). Рисунок 10.5.2. Хроматограмма вина «Мерло» (красное, полусухое, Молдавия, розлив - Россия). В данных хроматографических условиях волна с длиной 330 нм позволяет селективно детектировать оксикоричные кислоты. «Горб» в конце хроматограммы, детектируемый на длинах волн 254-330 нм, предположительно относится к продуктам полимеризации природных антоциановых красителей. На длинах волн 270 нм и 290 нм в начале хроматограммы регистрируются в основном дубильные вещества, обладающие вяжущим вкусом. Рисунок 10.5.3. Хроматограмма вина «Алазанская долина» (красное, полусладкое, Грузия). Хроматограммы белых сухих, полусухих и игристых вин имеют вид, показанный на рис. 10.5.4. Белые вина характеризуются более низким уровнем содержания оксикоричных кислот и отсутствием полимерных антоцианов. Рисунок 10.5.4. Хроматограмма вина «Донецкое игристое» (белое полусухое, Украина). Фальсифицируют полусладкие красные вина несколькими способами. Способ, наиболее опасный для здоровья человека, заключается в подкрашивании некачественного белого вина синтетическими красителями, являющимися сильными аллергенами (рис. 10.5.5). Таким образом фальсифицируются большинство красных полусладких вин стоимостью от 70 до 150 руб. Сравнительно безобидный способ фальсификации характерен для красных полусладких вин стоимостью от 80 до 200 руб. Оставшаяся после одной-двух экстракций мезга красных сортов винограда заливается слабым подслащенным водно-спиртовым раствором, проводится ультразвуковая экстракция, полученный виноматериал купажируется, отстаивается и разливается в бутылки. Такой способ фальсификации характерен для предприятий, закупающий низкосортный виноматериал, например, во Франции и Италии. Хроматограмма такого фальсифицированного вина показана на рис. 10.5.6. Если фальсификация первого типа легко определяется экспертом, то фальсификация второго типа уверенно определяется только с помощью ВЭЖХ. Рисунок 10.5.5. Хроматограмма фальсифицированного вина «Кадарка» (красное, полусладкое, Болгария, розлив – Россия). Последний пик принадлежит синтетическому красителю. Рисунок 10.5.6. Хроматограмма фальсифицированного вина «Хванчкара» (красное полусладкое, Грузия, розлив - Россия). Отсутствуют оксикоричные кислоты. Трудно назвать фальсификацией портвейны стоимостью от 25 до 40 руб. Действительно, все и так знают, что кроме спирта, воды, посластителя, колера и лимонной кислоты в этих водноспиртовых смесях ничего не бывает (рис. 10.5.7). Вызывает удивление лишь одно – этикетка. При чем тут благородный напиток под названием «портвейн»? Рисунок 10.5.7. Хроматограмма фальсифицированного портвейна «72». Виноматериал отсутствует. При проверке красных полусладких вин стоимостью от 70 до 150 руб. за 0.7 л из 20 испытанных образцов 18 оказалось фальсифицированы, т.е. 90%. При проверке красных полусладких вин стоимостью от 150 до 220 руб. из 4 испытанных образцов оказался фальсифицированным 1, т.е. 25%. При проверке красных сухих вин стоимостью от 70 до 120 руб. из 6 образцов оказался фальсифицированным 1, т.е. 17%. При проверке портвейнов стоимостью от 25 до 70 руб. из 6 образцов все оказались фальсифицированы, т.е.100%. Таким образом, из 36 испытанных образцов 26 оказались фальсифицированными, т.е. 72%. 10.5.2. Выявление тонких фальсификаций На практике наиболее часто встречаются следующие способы фальсификации виноградных вин: 1.Разбавление виноградного вина малоценными продуктами (водой, сахарным сиропом, дешевым плодово-ягодным вином и др.) для увеличения его объема. Этот способ фальсификации наиболее распространенный и в то же время самый грубый, предпринимаемый как на стадии приготовления виноматериалов, так и в торговле. В результате изменяется интенсивность цвета, насыщенность букета, уменьшается крепость вина. Такие вина «исправляют» введением различных химических компонентов (спирта, чаще неочищенного, содержащего сивушные масла; сахарина; искусственных красителей и т.д.). 2. Гаализация вина. Этот способ является разновидностью первого, так как заключается в том, что плохие крепкие вина «улучшаются» прибавлением воды до известного объема и последующим доведением крепости и кислотности до определенных пределов. 3. Шаптализация вина. Заключается в обработке кислого сусла щелочными агентами, а также добавлении сахара до или во время брожения. 4.Петиотизация вина. Вина получаются путем настаивания и брожения сахарного сиропа на выжимках (мезге), оставшихся после отделения виноградного сока. Это весьма тонкий способ фальсификации, так как букет и цвет натурального виноградного вина сохраняются, а в некоторых случаях даже улучшаются. В вине снижается лишь содержание винной кислоты и тартратов. Известно, что вкус старых, выдержанных вин становится более «тонким» за счет осаждения винного камня, и в этом отношении петиотизированное вино по крепости, мягкости и букету похоже на вино старое. 5.Шеелизация вина (добавление глицерина). Применяется для уменьшения кислоты, горечи, увеличения сладости, а также прекращения процесса брожения. 6.Применение консервантов (салициловой кислоты, других антисептических средств) с целью ускорения технологического процесса. Так, салициловая кислота используется для консервирования дешевых, легко закисающих вин, а также вин, не прошедших стадии выдержки и хранения. 7.Окрашивание вина. Как правило, применяется для сокрытия других подделок, например, разбавления. Однако, известны случаи перекрашивания отдельных сортов малоценных белых вин в красные. Для окрашивания вин используются природные (ягоды бузины, черники, водный свекловичный настой и др.) и синтетические (анилиновая, нафталиновая, антраценовая краски, индигокармин, фуксин) красители, многие из которых являются не только вредными, но подчас даже ядовитыми соединениями. 8. Подделка букета вина. Так же, как и окрашивание, подделка букета используется в комплексе с другими видами фальсификаций. С этой целью применяют смеси различных сложных эфиров (энантового, валерианового, валериано-амилового, масляного и др.), а также засушенные цветы винограда. 9. Фальсификация способа производства. За высококачественные выдаются вина, изготовленные с нарушением технологии, разработанной и утвержденной для данного наименования вина. Например: за сортовые вина выдаются купажные; допускается смешивание различных фракций сусла (сусло-самотек, самая высококачественная фракция, смешивается с низкосортными прессовыми фракциями); фальсифицируется срок выдержки вина (за марочные выдаются ординарные) и т.д. 10. Приготовление «искусственных» вин. Для производства таких вин вместо виноградного сока подбирают смесь компонентов, органолептически воспринимаемую, как виноградное вино. В состав ее могут входить вода, дрожжи, сахар, винно-кислый калий, кристаллическая винная и лимонная кислоты, танин, глицерин, спирт, карамель и другие соединения в зависимости от «рецептуры». Приведенные данные свидетельствуют: все виды фальсификации связаны с обманом покупателя, так как под названием натурального вина производятся и продаются продукты, не отвечающие его качеству. Фальсифицированные вина наносят не только моральный и материальный ущерб, но могут быть опасны для здоровья потребителя, особенно при добавлении в крепленые вина технического спирта или анилиновых красителей. Лучшим методом определения фальсификации конкретного вина является метод «отпечатков пальцев», заключающийся в сравнении многоволновых хроматограмм исследуемого и эталонного вин в диапазоне длин волн 190 – 360 нм, а для красных вин в диапазоне 190 – 720 нм. Совпадение хроматограмм по временам выхода и спектральным отношениям хроматографических пиков анализируемого и эталонного образцов практически на 100% гарантирует идентичность образцов. Условия хроматографического анализа вин в диапазоне длин волн 190 –360 нм: 1. 2. 3. 4. 5. Хроматограф жидкостной микроколоночный «Милихром-5-3» или аналогичный с многоволновым сканирующим УФ-детектором (190 – 360 нм), термостатом колонок на 350С, с объемом шприцев насоса не менее 5000 мм3, программным обеспечением MultiChrom, UniChrom или аналогичным, поддерживающим многоволновой режим детекции. Хроматографические колонки 80х2, заполненные сорбентами Сепарон С18 (5 мкм), Диасорб С16 или аналогичными. Элюент. Для приготовления элюентов использовалась дистиллированная вода, однозамещенный фосфат калия квалификации «хч», орто-фосфорная кислота «хч», ацетонитрил для ВЭЖХ сорт 1 и 2 (фирма «Криохром», Санкт-Петербург), диэтиламин фирмы «Мерк». Буфер «А» готовился следующим образом: к 100см3 0.02 М КН2РО4 приливается 0.5 см3 диэтиламина и 1.5 см3 орто-фосфорной кислоты. Расход элюента 150 мкл/мин. Температура колонок 350С. Длины волн: 270, 290, 320, 330, 354 и 208 230, 254, 270 и 320 нм. Элюент – ступенчатый градиент ацетонитрила в буфере «А»: 1 – я ступень: буфер – 700 мкл, из них на регенерацию – 400 мкл; 2 – я ступень: ацетонитрил – буфер (5: 95 по объему) – 500 мкл; 3 – я ступень: ацетонитрил – буфер (10: 90 по объему) – 500 мкл; 4 – я ступень: ацетонитрил – буфер (15: 85 по объему) – 800 мкл; 5 – я ступень: ацетонитрил – буфер (20: 80 по объему) – 750 мкл; 6 – я ступень: ацетонитрил – буфер (30: 70 по объему) – 650 мкл; 7 – я ступень: ацетонитрил – буфер (40: 60 по объему) – 550 мкл; 8 – я ступень: ацетонитрил – буфер (50: 50 по объему) – 550 мкл. 6. Объем пробы 10 мкл. Перед анализом вино фильтровалось через фильтр с голубой лентой. Условия хроматографического анализа вин в диапазоне длин волн 380 – 720 нм: 1. Хроматограф «Милихром-5-4» или аналогичный с многоволновым сканирующим ВИДдетектором (380 – 720 нм), термостатом колонок на 350С и программным обеспечением ECHROM 9.23 или аналогичным. 2. Хроматографические колонки 80х2, заполненные сорбентом Сепарон С18 (5 мкм) или аналогичным сорбентом. 3. Элюент. Для приготовления элюентов использовалась дистиллированная вода, однозамещенный фосфат калия квалификации «хч», орто-фосфорная кислота «хч», ацетонитрил для ВЭЖХ сорт 1 и 2 (фирма «Криохром», Санкт-Петербург), диэтиламин фирмы «Мерк». При детектировании использовался многоволновой (пятиволновой) режим детектирования в следующих комбинациях: 520, 580, 640, 680, 716 нм; 440, 480, 520, 540, 580 нм; и наиболее часто используемый – 480, 520, 580, 640, 680 нм. 4. Хроматографические условия. Элюент – ступенчатый градиент ацетонитрила в буфере «А»: 1 – я ступень: ацетонитрил – буфер (15: 85 по объему) – 700 мкл, из них 400 мкл на регенерацию; 2 – я ступень: ацетонитрил – буфер (20: 80 по объему) – 500 мкл; 3 – я ступень: ацетонитрил – буфер (30: 70 по объему) – 400 мкл; 4 – я ступень: ацетонитрил – буфер (40: 60 по объему) – 400 мкл; 5 – я ступень: ацетонитрил – буфер (50: 50 по объему) – 500 мкл; Расход элюента 80 мкл/мин. Объем пробы 10 мкл. Перед анализом вино фильтровалось через фильтр с голубой лентой. Перед анализом вино подкислялось из расчета 3 мл орто-фосфорной кислоты на 25 мл вина. Температура колонок 350С. Проведение анализа Особенностью проведения анализа является практическое отсутствие пробоподготовки, т.е. практически вино вводилось в колонку в нативной форме. С одной стороны, такой подход связан с определенным риском: коллоидные частицы, содержащиеся в вине могли отравить сорбент, находящийся в колонке. С другой стороны, только введение вина в нативной форме гарантировует содержание полной информации о вине как в явной, так и в неявной форме. Обезопасить колонку можно с помощью установки ин-лайн фильтра. Как показал практический эксперимент, даже без использования ин-лайн фильтров засорялись только сменные входные фильтры, которые заменялись после каждых 10-ти экспериментов. Использование термостата колонок на 350С позволило не только снизить рабочее давление на колонках при использовании вязких элюентов, но и получить стабильные во времени времена удерживания (среднее квадратическое отклонение времен выхода в градиентном режиме не превышало 1.5% при норме 6.5% в градиентном режиме без термостата). Длины волн были выбраны таким образом, чтобы могли детектироваться практически все классы соединений, находящихся в вине – от сахаров и органических кислот до фенолкарбоновых кислот и антоцианов (мономерных форм, олигомеров и полимеров). Наиболее простой, но и самой важной задачей является инструментальное подтверждение фальсификации вина при выемке из продажи подкрашенных и подслащенных дешевых водноспиртовых смесей. Такие смеси обычно имеют наклейки с названиями популярных дешевых крепленых вин типа «портвейн» или «мадера». Как правило, такие смеси вообще не содержат виноматериалов и их фальсифицированный характер легко доказать по отсутствию в составе фенолкарбоновых (оксикоричных) кислот ( галловая кислота, сиреневая, кофейная, п-кумаровая, феруловая и другие). Фенолкарбоновые кислоты является обязательным компонентом любого натурального вина, их отсутствие в составе вина является доказательством фальсификации. Определение замены виноградными красных виноградных вин плодово-ягодными или белыми В режиме обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) замена красного виноградного вина на плодово-ягодное можно определить по наличию или отсутствию в вине галловой кислоты – плодово-ягодные вина и белые виноградные вина, как правило, не содержат галловую кислоту (первый интенсивный пик на хроматограмме 10.5.8). Плодово-ягодные и виноградные вина имеют также совершенно различный состав по оксикоричным кислотам (центральные участки на хроматограммых 10.5.8. и 10.5.9). Наконец, плодово-ягодные вина содержал мономерные антоцианы, которые практически отсутствуют в виноградном вине (см. далее). Рисунок 10.5.8. Хроматограмма красное сухого вина «Мерло», Молдавия (Алианта). Рисунок 10.5.9. Хроматограмма домашнего красное полусухое вишневого вина. Хроматограммы столовых и выдержанных красных виноградных вин в видимом диапазоне Хроматограммы природных красителей коллекционных и выдержанных вин резко отличаются от хроматограмм столовых вин: в хроматограммах коллекционных и выдержанных вин почти нет мономерных и олигомерных красителей. На обычных сорбентах типа Separon SGX C18 полимерные антоцианы выходят в виде широких размытых пиков со спектальными отношениями, близкими к спектральным отношениям мономерных и олигомерных красителей. Наоборот, столовые вина содержат большое количество мономерных и олигомерных красителей, имеющих острые и симметричные формы хроматографических пиков (рис. 10.5.10 а,б,в). Из рисунков 10.5.10 а,б,в хорошо видно, что за три года практически все мономерные и олигомерные антоцианы переходят в полимерные, имеющие плохую растворимость в вине. а б в 480 520 580 640 680 Рисунок 10.5.10. Хроматограммы антоцианов красных сухих столовых вин: а) – «Мерло» (Массандра), б) – «Фигаро» (Франция), в) «Кастилло» (Аргентина) (все – 2004 г. производства) а б в 480 520 580 640 680 Рисунок 10.5.10. Хроматограммы антоцианов красных сухих выдержанных вин: а) Милешти, 2001г., б) «Каберне» Мигдал, 1999 г., в) «Пино Нуар», 1999 г. «Каберне» 10.6. С.Н. Сычев. Выявление фальсификации растворимого кофе По заказу Управления госторгинспекции по Ивановской области было проанализировано состояние рынка растворимого кофе в г.Иваново. Для анализа были одновременно отобраны 15 образцов растворимого кофе различных изготовителей. Фальсификация растворимого кофе определялась методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) по количеству кофеина в кофе и наличию хлорогеновой кислоты. Существующая методика предназначена для определения кофеина и совершенно непригодна для определения кофейных кислот. Однако, в настоящее время широко распространена практика добавления в кофе или кофейный суррогат синтетического кофеина, поэтому определение подлинности кофе только по содержанию кофеина некорректно. Синтетический кофеин добавляют в кофе или кофейный суррогат по двум причинам: для фальсификации кофе или для формирования у населения устойчивого спроса (кофеиновая зависимость) на кофе определенной фирмы. В связи с этим нами предложена усовершенствованная хроматографическая система, позволяющая резко улучшить разрешение хроматографических пиков и обеспечить надежную идентификацию хлорогеновой кислоты. Экспериментальная часть Хроматографический эксперимент проводился на хроматографе «Милихром-5-3» со сканирующим УФ-детектором. Хроматографические условия: 1) хроматографическая колонка КАХ-6-80-5, заполненная Сепароном С18; 2) элюент : «буфер – ацетонитрил» в соотношении 90:10 по объему; Буфер: к 100 мл 0.02 М КН2РО4 прибавляют 0.5 мл диэтиламина и доводят раствор до рН= 2.6 орто-фосфорной кислотой. 3) расход элюента 100 мкл/мин.; 4) объем пробы 4 мкл; 5) длины волн 210, 230 и 254 нм ; Подготовка пробы производилась следующим образом: 1 г растворимого кофе растворялся в 30 мл горячей дистиллированной воды, раствор остывал до 20±20С и фильтровался через складчатый бумажный фильтр (синяя лента). Обсуждение результатов Типовая хроматограмма образца качественного растворимого кофе («Chibo exclusive») приведена на рисунке 10.6. Для этого и других образцов кофе были получены времена удерживания, площади пиков, спектральные отношения для кофеина и хлорогеновой кислоты, а также соотношение площадей пиков кофеина и хлорогеновой кислоты (см.таб. 10.6.1). 2 1 Рисунок 10.6.1. Хроматограмма образца кофе «Chibо exclusive». 1 – хлорогеновая кислота, 2 – кофеин. Таблица 10.6. Хроматографические и спектральные характеристики пиков кофеина и хлорогеновой кислоты для разных образцах растворимого кофе Название кофе Время удерживания кофеина, мин. Время удерживания хлорогеновой кислоты, мин. Площадь пика кофеина, Sк Площадь пика хлорогеновой кислоты, Sкт Спектральное отношение кофеина 230/210 нм Спектральное отношение хлорогеновой кислоты 230/210 нм Отношение Sк/ Sкт «Сhibo exclusive» «Mysoregold» «Grand» «Вдохновение» «Select» «Nescafe Matinal» «Casique» «Nescafe Сlassic» без кофеина «Amazon» «Nostradamus» «Acteca» «Alecsado» «Mocate» «Negro» «Java» 15.36 12.31 62.2 6.64 0.248 0.815 9.37 15.34 12.21 149 13.9 0.251 0.817 10.7 15.02 14.91 10.95 10.94 126 136 8.33 15.8 0.250 0.251 0.810 0.808 15.1 8.61 14.79 14.74 10.77 10.75 145 187 18.3 9.86 0.250 0.251 0.814 0.808 7.92 18.9 14.90 14.82* 10.98 10.46 56.6 17.6* 8.87 10.7* 0.246 0.218* 0.826 0.806 6.38 - 15.38* 15.79* - 0.55* 0.29* - 0.271* 0.294* - - 15.34 15.31 15.33 15.32 12.01 12.02 12.02 2.70 16.9 7.72 10.4 1.51 0.67 1.62 0.248 0.248 0.252 0.248 0.800 0.801 0.800 10.2 10.5 6.42 * Хроматографические и спектральные характеристики пиков, близких по времени удерживания к кофеину и хлорогеновой кислоте, но ими не являющиеся. Среднее квадратическое отклонение (СКО) по временам удерживания для кофеина составляет 1,69%, для хлорогеновой кислоты 1,92%. СКО спектральных отношений для кофеина составляет 0,80%, для хлорогеновой кислоты 1,69%. Совместное рассмотрение времен удерживания и спектральных отношений дает удовлетворительную идентификацию кофеина и хлорогеновой кислоты. На банках, содержащих образцы: «Amazon», «Nostradamus», «Acteca», «Alecsado», «Mocate», «Negro» и «Java» было написано «CAFFE INSTANT». Как видно из таблицы, образцы: «Amazon», «Nostradamus» и «Acteca» не содержат кофе вообще. При более внимательном изучении надписей при помощи лупы на обратной стороне банок были обнаружены надписи на английском языке с размером букв около 1.5 мм, сообщающие, что в этих образцах содержатся только злаковые и цикорий (т.е. кофе там и не должно быть). Расположение и размеры букв позволяют сделать вывод о сознательном вводе в заблуждении потребителя. Таким же образом расположены надписи о составе продукта в образцах «Mocate», «Negro» и «Java», содержащих в своем составе не более 10% кофе. Образец «Alecsado» является полной фальсификацией кофе, так как кофеина в образце содержится не более 5% от минимально допустимого, а кофейной кислоты нет вообще. Отсутствие кофейной кислоты позволяет сделать предположение о внесении кофеина в напиток, состоящий из продуктов переработки злаковых. Образцы «Сhibo exclusive», «Mysoregold», «Grand», «Вдохновение», «Select», «Nescafe Matinal» и «Casique» являются кофе, однако кофе «Casique» изготовлен с грубыми нарушениями технологии. В результате кофе имеет неприятный запах и металлический привкус. Для таких образцов характерно появление пиков, выходящих после кофеина (см. рисунок 10.6.2). 1 1 2 Рисунок 10.6.2. Хроматограммы образцов кофе: вверху - «Chibо exclusive», внизу – «Casique». 1 – кофеин, 2 – примесь, коррелирующая с металлическим привкусом кофе. Также обращает на себя внимание очень большое содержание кофеина в кофе «Nescafe Matinal». В этом образце кофеина в три (!) раза больше, чем в кофе «Сhibo exclusive». Сам по себе этот факт ни о чем не говорит, однако соотношение площадей пиков «кофеин/хлорогеновая кислота» достигает для этого кофе значения 18.9 при среднем значении этого параметра для остальных образцов около 10. Вопрос: может ли быть такое соотношение естественным? – остается открытым. Банка с кофе «Nescafe Сlassic» без кофеина заклеена русским переводом, в котором не содержится сведений о том, что этот кофе не содержит кофеина. После удаления наклеек с русским переводом выяснилось, что вся информация на английском языке отпечатана четко и ясно, и что претензии необходимо предъявить не к производителям, а к продавцам. Необходимо отметить, что фальсифицированный кофе и кофейные напитки под общим термином «CAFFE INSTANT», согласно этикеткам, произведены в Польше. 10. Сборник методик анализа 10.7. С.Н. Сычев. Определение афлатоксина В1 в продуктах питания методом НФ ВЭЖХ Афлатоксины являются продуцентами микроскопических грибов Asper-gilfus flavus и A.parasiticus. В естественных условиях встречаются 4 афлатоксина: B1, B2, G1 и G2. Среди них высокими токсическими свойствами и широкой распространенностью выделяется афлатоксин B1. Анализ обобщенных результатов исследования содержания микотоксинов в пищевых продуктах, проведенных в нашей стране и за рубежом, позволил определить виды продовольственного сырья и продуктов питания наиболее часто загрязненных афлатоксинами: арахис, кукуруза, продукты переработки хлопка, кокосового ореха, бобы, какао, некоторые зерновые, в частности, рис. Содержание афлатоксинов в пищевых продуктах регламентируется медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов на уровне 5 мкг/кг или 0.5 мкг/кг для продуктов детского питания. Методики определения афлатоксина В1 относятся к контролю безопасности пищевой продукции. Минздравом РФ утверждена методика определения афлатоксина В1 методом нормальнофазовой хроматографии [1]. Её основным недостатком при использовании хроматографов серии «Милихром» является использование элюента, содержащего 95% диэтилового эфира. Учитывая, что температура кипения эфира 34 °С, а температура кюветного отделения микроколоночного хроматографа серии «Милихром» 33 − 36 °С, становится очевидно, что стандартные детекторы этих приборов полностью неработоспособны при использовании указанного элюента. Таким образом, для использования нормально-фазового варианта методики определения афлатоксина В1 было необходимо разработать элюент, пригодный для применения на хроматографах серии «Милихром». Для хроматографического анализа применяются колонки 80×2, заполненные адсорбентом Силасорб 600 (5 мкм), реактивы: гексан, метанол, уксусная кислота марки «Extra Pure», бензол «осч», хлороформ марки «фарм», стабилизированный этанолом ( «Химед», г. Москва), ацетонитрил, сорт 1 ( «Криохром», г. Санкт-Петербург). В качестве градуировочного раствора применяется ГСО (Государственные стандартные образцы) афлатоксина В1 в смеси бензол-ацетонитрил 98:2 с концентрацией афлатоксина В1 5 мкг/мл, разбавленный в двадцать раз до концентрации 0.25 мкг/мл. Условия хроматографического анализа: подвижная фаза «хлороформ-гексан-метанолуксусная кислота» в объёмном соотношении 70:30:1:1, детектирование на длине волны 358 нм, скорость подачи подвижной фазы − 150 мкл/мин, объём вводимой пробы − 20 мкл (в смеси бензол – ацетонитрил 98:2). Требования к проведению хроматографического анализа 1. Обязательным условием воспроизводимости анализа является использование одинаковых объёмов проб анализируемой смеси и градуировочного раствора как при проведении анализа, так и при кондиционировании хроматографической колонки. 2. Кондиционирование колонки достигается многократным (5-10 раз) элюированием градуировочного раствора В1. Критерием завершения кондиционирования является воспроизводимость времён удерживания исследуемого вещества. Оптимальный удерживаемый объём составляет порядка 800 мкл (5-6 минут при скорости подачи 150 мкл/мин). 3. Удерживаемый объем афлатоксина В1 можно легко оптимизировать, изменяя объёмное содержание хлороформа в элюенте. Подготовка пробы 1. Подготовка пробы проводится по методике [1]. 2. Сухой остаток перерастворяется в смеси «бензол-ацетонитрил» в соотношении 98:2. 3. При анализе зерна и зернопродуктов, а иногда и других продуктов растительного происхождения очистку экстракта колоночной хроматографией на силикагеле можно не проводить. К примеру, на рис. 8.1 приведена хроматограмма экстракта арахиса, не очищенного на силикагеле. 4. При потоковом анализе однотипных образцов желательно предварительно определить степень извлечения афлатоксина, которая может отличаться от 100%. Рисунок 10.7. Хроматограмма экстракта арахиса. 1 – афлатоксин В1, в пике 5 нг. При использовании для приготовления элюента хророформа с содержанием этанола менее двух объёмных процентов (допустим, технического хлороформа) могут наблюдаться случаи, когда исследуемое соединение удерживается слишком сильно или не элюируется вообще, «мягкое» усиление элюента путём увеличения объёмного содержания хлороформа (требование 3) не приводит к заметному результату. В таких случаях рекомендуется увеличить объёмное содержание метанола в элюенте. К примеру, в случае использования нестабилизированнного этанолом хлороформа, хроматографическая система может быть такой: «хлороформ-гексан-метанолуксусная кислота» в объёмном соотношении 70:30:2.5:1. При тщательном выполнении пробоподготовки [1] и своевременной замене входного фильтра хроматографической колонки, ресурс используемой колонки достигает 400 – 450 анализов афлатоксина В1. В указанных условиях достигается оптимальный результат, сочетающий максимальную высоту пика афлатоксина В1 с его хорошим разделением от пиков примесей, присутствующих в пробе. Предел определения на длине волны 358 нм составляет 2.5 нг вещества в пике, что соответствует (при массе навески 25 г и объему вводимой пробы 20 мкл) содержанию афлатоксина В1 2.5 мкг/кг, или 0.5 ПДК. Известна надежная методика определения афлатоксинов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ [2]. Однако, более доступной является методика [1] с вышеуказанными поправками. Результатом наших исследований явилось твердое убеждение, что не бывает арахиса, свободного от афлатоксина В1. На рис. 10.7. представлена хроматограмма «экологически чистого» арахиса. Тем не менее содержание афлфтоксина В1 не позволяет использовать этот арахис в питании для детей – а ведь это действительно самый чистый арахис, который был проанализирован. Литература 1. «Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии» МУ № 4082. М.: Минздрав СССР, 1986. – 15 с. 2. Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции. МУК 4.1.787-99. М.: Минздрав РФ, 1999. – 30 с. 10.8. С.Н. Сычев. Определение дезоксиниваленола в зерне и зернопродуктах методом НФ ВЭЖХ Дезоксиниваленол (ДОН) является микотоксином, наиболее часто продуцируемым широко распространенными микроскопическими грибами рода Fusarium, поражающими зерновые культуры. ДОН вызывает тяжелые микотоксикозы у животных и приматов. В РФ установлена предельнодопустимая концентрация (ПДК) на содержание ДОН в продовольственном сырье на уровне 0.1 мг/кг – в сильных и твердых сортах пшеницы и на уровне 0.5 мг/кг – в остальной пшенице. Методики определения дезоксиниваленола относятся к контролю безопасности пищевой продукции. Минздравом РФ утверждена методика определения дезоксиниваленола (ДОН) методом нормально-фазовой жидкостной хроматографии [1]. Основным недостатком утвержденной методики является слишком высокое содержание изопропилового спирта и воды в элюенте состава «гексан-изопропанол-вода» в соотношении 85:25:1.5 по объему [1]. Такое содержание изопропанола связано с использованием аналитических колонок 250×4. В результате хроматографический пик дезоксиниваленола при использовании колонок 100×2 оказывается на «хвосте» выходящих в начале хроматограммы компонентов, мешающих определению. В результате адаптации методики для колонок 100×2 предложен для применения элюент «гексанизопропанол-вода» в соотношении 85:22:1 (по объему). Такое, казалось бы, незначительное изменение состава элюента приводит к резкому улучшению разрешения. Для хроматографического анализа применяются колонки 100×2 или 120х2, заполненные адсорбентом Силасорб-600 (5 мкм), реактивы: гексан «Extra Pure», бензол и изопропанол «осч», ацетонитрил, сорт 1 ( «Криохром», г. Санкт-Петербург). В качестве градуировочного раствора применяются ГСО ДОН в смеси бензолацетонитрил 98:2 с концентрацией 10-20 мкг/мл или ГСО с концентрацией 100 мкг/мл, разбавленный в пять раз. Условия хроматографического анализа: подвижная фаза гексан-изопропанол-вода в соотношении 85:22:1, детектирование на длине волны 224 нм, скорость подачи подвижной фазы − 150 мкл/мин, объём вводимой пробы − 5 мкл. Требования к проведению хроматографического анализа 1. Обязательным условием воспроизводимости анализа является использование одинаковых объёмов проб анализируемой смеси и градуировочного раствора как при проведении анализа, так и при проведении кондиционирования хроматографической колонки. 2. Кондиционирование колонки достигается многократным (5-10 раз) элюированием градуировочного раствора ДОН. Критерием завершения кондиционирования является воспроизводимость времён удерживания исследуемого вещества. Оптимальный удерживаемый объём составляет порядка 1500 мкл (9-10 минут при скорости подачи 150 мкл/мин). Подготовка пробы 1. Подготовка пробы проводится по методике [3]. 2. Сухой остаток перерастворяется в смеси бензол-ацетонитрил 98:2. 3. Очистку экстракта на активированном угле и окиси алюминия можно не проводить. В этом случае от общего экстракта для анализа на ДОН берётся аликвота не 25 мл, а 50 мл. Примечания к методике 1. Как правило, пик дезоксиниваленола выходит в окружении двух пиков близких по строению производных; спектральные отношения у этих трёх пиков также близки. Для уверенной идентификации ДОН следует хотя бы один раз проанализировать смесь пробы с градуировочным раствором; в этом случае пик ДОН станет выше относительно других пиков по сравнению с хроматограммой чистой пробы. 2. Для улучшения разделения ДОН и двух производных целесообразно использовать колонки, имеющие эффективность не менее 8000 тт. 3. При использовании кондиционированной колонки, время выхода хроматографа на рабочий режим не превышает 30 мин. Предел детектирования при использовании УФ-детектора на длине волны 224 нм составляет 0.1 мг/кг (рис. 10.8). Рисунок 10.8. Хроматограмма экстракта пшеницы. 1 – дезоксиниваленол. Известна надежная методика определения дезоксиниваленола методом обращеннофазовой ВЭЖХ [2]. Однако, более доступной является методика [1] с вышеуказанными поправками. Результаты определения ДОН влияют на сортность зерна, сдаваемого на элеваторы. Любая пшеница с концентрацией ДОН, большей 0.1 мг/кг, может быть только кормовой. Наиболее часто зараженной ДОН бывает пшеница из юго-западных регионов России. Литература 1. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах. М.: Минздрав СССР, 1990. – 13 с. 2. Определение массовой концентрации микотоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания. Подготовка проб методом твердофазной экстракции. МУК 4.1.787-99. М.: Минздрав РФ, 1999. – 30 с. 10.9. С.Н. Сычев. Определение зеараленона в зерне и зернопродуктах методом НФ ВЭЖХ Зеараленон, так же, как и ДОН, является микотоксином, наиболее часто продуцируемым широко распространенными микроскопическими грибами рода Fusarium, поражающими зерновые культуры. Зеараленон обладает выраженным эстрогенным действием на большинство сельскохозяйственных животных и приматов, вызывая нарушение функций воспроизводства. В РФ установлена ПДК на содержание зеараленона в зерновых 1 мг/кг. Методики определения зеараленона относятся к контролю безопасности пищевой продукции. Минздравом РФ утверждена методика определения зеараленона методом нормальнофазовой жидкостной хроматографии [1]. Основным недостатком утвержденной методики [1] определения зеараленона методом ВЭЖХ является использование элюента, содержащего 50% диэтилового эфира. Учитывая, что температура кипения эфира 34°С, а температура кюветного отделения микроколоночного хроматографа серии «Милихром» 33-36 °С, становится очевидно, что стандартные детекторы этих приборов неработоспособны при использовании указанного элюента. В результате адаптации был предложен следующий состав элюента: гексан-хлороформизопропиловый спирт-уксусная кислота в соотношении 65:25:1.5:1 по объему (рис.8.3). Для хроматографического анализа применяются колонки 80×2 или 100х2, заполненные адсорбентом Силасорб 600 (6 мкм), реактивы: гексан, уксусная кислота марки «Extra Pure», бензол и изопропанол «осч», хлороформ марки «фарм», стабилизированный этанолом («Химед», г. Москва), ацетонитрил, сорт 1 ( «Криохром», г. Санкт-Петербург). В качестве градуировочного раствора применяются ГСО зеараленона в смеси бензолацетонитрил 98:2 или в чистом бензоле с концентрацией 10 – 20 мкг/мл или ГСО с концентрацией 100 мкг/мл, разбавленный в пять раз. Условия хроматографического анализа: подвижная фаза «гексан – хлороформ – изопропиловый спирт – уксусная кислота» 65:25:1.5:1, детектирование на длине волны 282 нм, скорость подачи подвижной фазы − 150 мкл/мин, объём вводимой пробы − 5 мкл. Требования к проведению хроматографического анализа 1. Обязательным условием воспроизводимости анализа является использование одинаковых объёмов проб анализируемой смеси и градуировочного раствора как при проведении анализа, так и при проведении кондиционирования хроматографической колонки. 2. Кондиционирование колонки достигается многократным (5-10 раз) элюированием градуировочного раствора зеараленона. Критерием завершения кондиционирования является воспроизводимость времен удерживания исследуемого вещества. Оптимальный удерживаемый объём составляет порядка 1500 мкл (9-10 минут при скорости подачи 150 мкл/мин). Подготовка пробы 1. Подготовка пробы проводится по методике [1]. 2. Сухой остаток перерастворяется в смеси «бензол-ацетонитрил 98:2». Примечания к методике 1. При использовании для приготовления элюента хлороформа с содержанием этанола менее двух объёмных процентов (допустим, технического хлороформа) могут наблюдаться случаи, когда исследуемое соединение удерживается слишком сильно или не элюируется вообще, «мягкое» усиление элюента путём увеличения объёмного содержания хлороформа не приводит к заметному результату. В таких случаях рекомендуется увеличить объёмное содержание метанола в элюенте. 2. При тщательном выполнении пробоподготовки [1] и своевременной замене входного фильтра хроматографической колонки ресурс используемой колонки достигает 400 – 450 анализов. 3. При использовании кондиционированной колонки, время выхода хроматографа на рабочий режим не превышает 30 мин. Предел детектирования при использовании УФ-детектора на длине волны 282 нм составляет 0.1 мг/кг. Рисунок 10.10. Хроматограмма экстракта пшеницы: 1 – зеараленон. Литература 1. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах. М.: Минздрав СССР, 1990. – 13 с. 10.10. К.С. Сычев (в соавторстве с К.Э. Эллером и В.А. Даванковым). Определение микотоксина патулина во фруктах и соках методом НФ ВЭЖХ с применением твердофазной экстракции на сверхсшитом полистироле. Разработан простой, быстрый и чувствительный метод определения микотоксина патулина во фруктах, фруктовых соках и концентратах, включающий твердофазную экстракцию образца на картридже с коммерчески доступным сверхсшитым полистиролом c последующим анализом элюата методом нормально-фазной жидкостной хроматографии. Метод не содержит жидкостной экстракции и процедур очистки образца, что ведет к уменьшению времени и трудоемкости анализа, а также повышению степени извлечения в среднем на 10%. Полученные степени извлечения патулина из фруктовых соков варьировались от 82% до 93%, среднее значение составило 86% (СКО 3%, n = 6). Предел обнаружения патулина данным методом составляет величину порядка 10 мкг/кг. Патулин (см. рис. 10.10.1) является токсичным метаболитом – продуктом жизнедеятельности многих видов плесеней Penicillum и Aspergillus [1,2]. Установлено, что патулин является естественным контаминантом различной фруктовой продукции; его присутствие может служить признаком некачественного фруктового сырья. Во многих странах странах, в том числе в России, максимальным допустимым уровнем патулина в продуктах питания является концентрация 50 мкг/кг [3]. Рисунок 10.10.1. Структурные формулы патулина и ОМФ. Для решения задачи по определению патулина было предложено большое число аналитических методов [4-6]; наиболее широко распостраненным вариантом анализа является метод, включающий жидкостную экстракцию образца этилацетатом с последующими возможными процедурами очистки экстракта, и дальнейшим анализом образца методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Несмотря на повсеместное распостранение, этот метод не лишен серьезных недостатков. Жидкостная экстракция этилацетатом сопряжена с неизбежными потерями вещества из-за его неколичественного перехода в органическую фазу и частичной адсорбции сульфатом натрия в процессе осушения экстракта. Кроме того, жидкостная экстракция сама по себе – трудоемкий, длительный и неэкономичный процесс, требующий большого объема органического расворителя. В последнее время жидкостная экстракция стала эффективно заменяться твердофазной (ТФЭ). В твердофазной экстракции жидкий образец пропускается через патрон (картридж), заполненный сорбентом, извлекающим интересующее вещество из матрицы; затем оно вымывается из патрона небольшим количеством элюента. Таким образом, ТФЭ является одновременно и методом экстракции, и концентрирования, и очистки. Несколько методов с применением ТФЭ были опробированы для извлечения патулина [7,8]; однако, ни в одном из этих методов [9] для твердофазной экстракции и очистки не применялся свверхсшитый полистирол (ССПС), известный своими отличными адсорбционными свойствами по отношению к низкомолекулярным веществам [10, 11]. Именно по этой причине в данной работе сверхсшитый полистирол был выбран для твердофазной экстракции патулина. При анализе патулина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ многие лаборатории сталкиваются и с трудностями хроматографического характера: пик патулина перекрывается с пиками веществ матрицы; эта проблема как правило встает при анализе любых образцов, кроме яблочного сока. Учитывая то, что селективность разделения в режиме ОФ ВЭЖХ изменить путем варьирования состава элюента практически невозможно, метод обращенно-фазовой хроматографии едва ли подходит для анализа патулина. Для проведения подобного анализа может применяться и метод нормально-фазовой хроматографии, который является более гибким методом; в этом случае селективность разделения может быть отрегулирована путем изменения состава подвижной фазы. Примером анализа патулина методом НФ ВЭЖХ может служить методика фирмы «Hewlett Pakkard» c применением диол-модифицированного силикагеля в качестве неподвижной фазы [12]. Метод ТСХ является одним из наиболее селективных методов определения патулина [13], однако он не подходит для проведения рутинных анализов – метод требует значительных затрат времени и повышенных мер предосторожности из-за применения опасных химикатов. С другой стороны, ТСХ может применяться для подтверждения содержания патулина в подозрительных по результатам ВЭЖХ образцах. Для определения патулина в соках нами применялся метод твердофазной экстракции (ТФЭ) на коммерчески доступом сверхсшитом полистироле с последующим анализом элюата методом нормально-фазной хроматографии на силикагеле в качестве рутинного метода, и методом ТСХ в качестве арбитражного. Для твердофазной экстракции применялись 20×5 мм картриджи со сверхсшитым полистиролом «Purosep» (Purolite, Великобритания) зернения 70-160 мкм. Хроматографическая система состояла из насоса Jasko 880-PU, спектрофотометрического детектора Kratos Spectroflow 757 и инжектора Rheodyne с петлей на 20 мкл Анализ проводился на аналитической колонке 250×4.6 мм с силикагелем Силасорб 600. Для проведения анализа рекомендуется применять хроматографическую предколонку. Для элюирования применялись подвижные фазы гексан-этилацетат-уксусная кислота 70:45:1.5 об.% (элюент 1) и гексан-этилацетат-уксусная кислота 70:35:1.5 об.% (элюент 2) при скорости подачи 1 мл/мин. Детекция осуществлялась по УФ поглощению длине волны 273 нм. Применение многоволновой детекции способно значительно увеличить надежность проведения анализа. Анализ методом ТСХ проводился согласно МУ [13] с применением пластинок «Силуфол». Пробоподготовка 20 г гомогенизированных фруктов (пюре, сока с мякотью) помещаются в плоскодонную колбу 200 мл, добавляется 50 мл воды, 15 мл раствора Карреза 1 и 15 мл раствора Карреза 2. Осадок отделяется центрифугированием (3000 об/мин за 10 мин.), аликвота 50 мл отбирается для твердофазной экстракции. 20 г сока без мякоти, или 50 мл аликвоты, пропускаются через патрон с полистиролом на вакуумном манифолде при объемной скорости не выше 5 мл/мин, затем с той же скоростью патрон промывается 10 мл воды. Основная часть воды из патрона удаляется под вакуумом, затем патрон сушится током азота в течение 5-10 минут. Патулин вымывается из картриджа последовательно 2.5 см3, 0.3 см3 и 0.3 см3 этилацетата в виал объемом 5 мл, каждый раз верхний (этилацетатный) слой декантируется с остаточной воды (капля на дне виала). Этилацетатные слои объединяются, растворитель отгоняется током азота при комнатной температуре или при слабом нагревании досуха. Сухой остаток перерастворяется в 200 мкл этилацетата, 20 мкл пробы вводится в хроматографическую колоку, или наносится на хроматографическую пластину. С случае применения ТСХ сухой остаток допускается перерастворять в 100 мкл этилацетата для увеличения чувствительности метода. Образцы проб хранятся при –18 оС. Для регенерации картридж промывается последовательно 5 мл этилаетата, 3 мл ацетонитрила, 10 мл смеси ацетонитрил-5% водная фосфорная кислота 1:1 и 10 мл воды, после чего может применяться для новой твердофазной экстракции. Обсуждение результатов На рис. 10.10.2 показаны хроматограммы образца апельсинового сока с мякотью, с добавкой и без добавки патулина на уровне 100 мкг/кг (2 ПДК). Из приведенных хроматограмм (рис. 10.10.2) видно, что пик патулина хорошо разделяется от пиков веществ матрицы; том числе отличное разделение наблюдается и для пары патулин/ОМФ (рис. 10.10.1), часто являющейся критической в обращенно фазной хроматографии [14]. Рисунок 10.10.2. Хроматограммы a) образца апельсинового сока с добавкой патулина на уровне 100 мкг/кг (2 ПДК); б) образца апельсинового сока без добавки патулина. Элюент 1. 1 – патулин, 2 – ОМФ. Степени извлечения патулина из яблочных, виноградных и апельсиновых соков в экспериментах изменялись от 82% до 93%. Нетщательное просушивание патрона с полистиролом после экстракции (до элюирования патулина) может стать причиной повышенного количества в нем остаточной воды, что в целом приводит к понижению степени излечения на 10% (наблюдались степени извлечения 75%-85%). В случае же очень тщательной сушки картриджа азотом степень извлечения довольно стабильна и, как правило, выше 90%, однако время анализа при этом неоправданно увеличивается. На рисунке 10.10.3 показана хроматограмма концентрата яблочного сока с натуральным загрязнением патулином на уровне 11.6 мкг/кг. Концентраты соков являются наиболее трудными объектами анализа на содержание патулина, так как концентрация веществ матрицы в них гораздо выше, чем в соках. Тем не менее, из рис. 3 видно, что пик патулина удовлетворительно разделен от пиков примесей; приемлемое разделение и отношение сигнал/шум позволили определить концентрацию патулина с хорошей точностью. Таким образом, концентрация 10 мкг/кг может рассматриваться как предел определения патулина во всех упомянутых объектах. Рисунок 10.10.3. Хроматограммы образца концентрата яблочного сока с натуральным загрязнением патулином (11.6 мкг/кг). a) исходный образец; б) образец с добавленным для идентификации патулином. Элюент 2. 1 – патулин, 2 – ОМФ. При появлении подозрения на содержание патулина выше ПДК, готовую пробу следует в обязательном порядке проанализировать с применением многоволнового детектирования, который может рассматриваться как арбитражный. Выводы Разработан новый метод определения микотоксина патулина в образцах фруктов, фруктовых соков, пюре, концентратов. Метод включает твердофазную экстракцию на сверхсшитом полистироле и анализ элюата методом нормально-фазовой хроматографии на силикагеле или методом ТСХ. Метод характеризуется хорошей воспроизводимостью, чувствительностью и высокой степенью извлечения патулина из различных матриц. По отношению к «классической» методике с применением жидкостной эстракции данный способ является также более экспрессным и экономичным. Список литературы 1. 2. 3. 4. M. Jimenez, V. Sanchis, R. Mateo, E. Hernandez, Mycotoxin Res. 4 (1988) 59. H. Stray, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61 (1978) 1359. K. Burda, J. Food Prot. 55 (1992) 796. S. Durakovic, B. Radic, F. V. Golem, Z. Durakovic, T. Beritic, L. M. Lalic, Arh. Hig. Rada Toksikol 441 (1993) 263. 5. M. Llovera, R. Viladrich, M. Torres, R. Canela, J. Food Prot. 62 (1999) 202. 6. A. R. Brause, M. W. Trucksess, F. S. Thomas, S. W. Page, J. AOAC Int. 9 (1996) 451. 7. M. W. Trucksess, Y. Tang, J. AOAC Int. 82 (1999) 1109. 8. M. P. Herry, N. Lemetayer, J. AOAC Int. 79 (1996) 1107. 9. G. S. Shephard, N. L. Leggot, J. Chromatogr. A 882 (2000) 17. 10. V. Davankov, M. Tsuyrupa, M. Ilyin, L. Pavlova, J. Chromatogr. A 965 (2002) 65. 11. V. A. Davankov, C. S. Sychov, M. M. Ilyin, K. O. Sochilina, J. Chromatogr. A 987 (2003) 67. 12. А. Гратцфилд-Хьюзген, Р. Шустер. Анализ пищевых продуктов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Справочное пособие. М.: Interlab, 2000. 13. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов. Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. М.: Брандес, Медицина, 1998, 340с. 14. V. Gokmen, J. Acar, J. Chromatogr. A 730 (1996) 53. 10. Сборник методик анализа 10.11. С.Н. Сычев. Определение витаминов А, Е, и Д в кормах, премиксах и витаминных смесях методом НФ ВЭЖХ Определение жирорастворимых витаминов А, Е, и Д в кормах, премиксах и витаминных смесях является обязательной процедурой при проверке качества кормов, премиксов и витаминных смесей. Применение элюента «гексан-изопропанол» в соотношении 98.5 :1.5 по объему при анализе витаминов А,Е и Д в премиксах и кормах [1] вполне достаточно при использовании колонок 80х2, заполненных Силасорбом 600 (5 мкм). Пробоподготовка, предложенная авторами работы [2], обеспечивает воспроизводимый анализ витаминов в кормах и премиксах. Серьезным недостатком хроматографических условий [1], особенно при анализе кормов, является одноволновая детекция, которая не позволяет в ряде случаев правильно идентифицировать витамины Е и Д. Использование элюентов гексан-изопропанол при небольших содержаниях изопропанола не позволяет на длительный срок стабилизировать времена удерживания компонентов разделяемой смеси, поэтому единственным надежным параметром для идентификации витаминов являются спектральные отношения. На рис. 8.4 показана хроматограмма, в которой только при многоволновой детекции видно различие между витамином Е и хроматографическим пиком, имеющим то же время удерживания. Рисунок 10.11.1. Хроматограмма жирорастворимых витаминов в премиксе. 2 - α-токоферол, 7 – Д3, 8 – цис-ретинол, 9 – транс-ретинол. Так как пробоподготовка, приготовление стандартных растворов и условия хроматографирования скомпанованы из разных работ и переработаны автором, в данном разделе методика приводится почти полностью. Подготовка пробы Навеску образца (5 г корма, 2 г премикса, 0.5 г витаминной смеси) помещают в колбу, приливают 50 мл спиртового раствора аскорбиновой кислоты, добавляют 5 мл 50% водного раствора гидроксида калия и проводят омыление в течение 20 минут при температуре 85-95 ОС. После омыления в колбу добавляют 50 мл воды и охлаждают; содержимое колбы переносят в делительную воронку и трижды экстрагируют 30 мл гексана. Объединённые вытяжки промывают водой до бесцветной реакции по фенолфталеину. Отмытый экстракт просушивают, пропуская тонкой струйкой через фильтр с безводным сульфатом натрия, и упаривают на роторном испарителе до объёма 5-10 мл. Упаренный экстракт переносят в колонку диаметром 1-2 см, заполненную силикагелем или окисью алюминия на 5 см, и элюируют 30 мл хлороформа или хлористого метилена. Элюат упаривают на роторном испарителе досуха, остаток растворяют в 5 мл гексана. Подготовка градуировочного раствора 25 мг чистого кристаллического витамина Д3 помещают в мерную колбу на 100 мл, растворяют в гексане, доводят объём до метки. 1 мл готового раствора витамина Д3, 102 мг αтокоферилацетата и 1 мл фармакопейного раствора ретинол-ацетата помещают в колбу для омыления. После омыления, экстракции и очистки на колонке с силикагелем элюат упаривают на роторном испарителе досуха. Остаток перерастворяют в 1 мл гексана. 1 мл градуировочного раствора соответствует 250 мкг или 10.000 МЕ витамина Д3, 1000 мкг витамина Е и 100.000 МЕ витамина А. Из исходного градуировочного раствора можно приготовить ряд растворов с меньшими концентрациями витаминов путём его разбавления гексаном. Градуировочные растворы можно хранить в холодильнике в течение месяца, внеся в них бутилокситолуол в расчёте 50 мг БОТ на 100 мл гексанового раствора. Хроматографический анализ Для хроматографического анализа применяются: колонка 100×2, заполненные адсорбентом Силасорб-600 (5 мкм), реактивы: гексан, изопропанол «осч». Условия хроматографического анализа: подвижная фаза гексан-изопропанол в объёмном соотношении 98.8:1.2, детектирование: 264, 290 нм, скорость подачи подвижной фазы − 150 мкл/мин, объём вводимой пробы − 5 мкл. Определение витамина Е в растительных маслах Содержание витамина Е в растительных маслах является не только обязательным параметром в технических условиях на продукцию данного вида, характеризующим качество масла, но и является показателем протекания технологического процесса. Определение витамина Е в растительных маслах значительно проще, чем в премиксах и кормах, так как при подготовке пробы не требуется проведение гидролиза. Вся методика сводится к растворению масла в гексане в соотношении 1:10 и анализу на хроматографе при использовании элюента «гексан – изопропанол» в соотношении 99:1 по объему. На рисунке 8.5 приведена хроматограмма стандартов – α- , β- , и γ- токоферолов на колонке 80х2, заполненной Силасорбом 600. Рисунок 10.11.2. Хроматограмма стандартной смеси токоферолов. 3 - α-токоферол, 5 - βтокоферол, 6 - γ-токоферол. Колонка 80х2 заполнена Силасорбом 600, элюент «гексан – изопропанол» (99:1 по объему), расход элюента 150 мм3, объем пробы 5 мм3, длины волн 230, 254 и 290 нм. При анализе растительных масел полезно использовать и короткие волны, например, 230 нм. Использование такой волны при многоволновом детектировании позволяет просмотреть фракционный состав анализируемого масла и сделать выводы о протекании технологического процесса дезодорирования масла (рис. 10.11.3). а 1 б 1 Рисунок 10.11.3. Хроматограммы растительного масла: а – плохо дезодорированное масло (Орловский масложиркомбинат), б – хорошо дезодорированное масло (Краснодарский край). Условия хроматографирования те же, что на рисунке 10.11.2. Из рисунка 8.6 следует неожиданный, на первый взгляд, вывод – чем лучше дезодорировано растительное масло, тем меньше в нем α-токоферола. Так в образце «а» содежание витамина Е – 10 мг на 100 г, а в образце «б» – 7 мг на 100 г масла (по техническим условиям – не менее 20 мг на 100 г). Таким образом, без дополнительной добавки витамина Е оба исследованных масла не соответствуют техническим условиям. Литература 1. Скурихин В.Н., Шабаев С.В. Методы анализа витаминов А, Е, Д и каротина в кормах, биологических объектах и продуктах животноводства. – М.; Химия, 1996. – 115 с. 2. Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы. Методическое руководство для зоотехнических лабораторий. – Сергиев Посад: ВНИИТИП, 1998. – 115 с. 10.12. С.Н. Сычев. Анализ подсластителей и консервантов в напитках Анализ подсластителей и консервантов в безалкогольных напитках обычно сводится к определению аспартама, сахарина, кофеина и бензойной кислоты. Известна утвержденная методика [1], непригодная для применения на хроматографах серии «Милихром» по причине уширения некоторых пиков, в особенности пика аспартама. Основным отличием предложенной хроматографической системы от использованной в методике [1] является добавление в элюент диэтиламина, которое позволяет эффективно использовать хроматографы серии «Милихром» для решения любой задачи подобного типа. Рисунок 10.12. Хроматограмма напитка «Земляника». Колонка 80х2, заполнена Диасорбом С16 (16% С). Элюент: буфер-ацетонитрил в соотношении 82:18. Буфер – 100 мл 0.0125М КН2РО4 + 1 мл ДЕА, рН = 3 о-фосфорной кислотой. 1 – сахарин, 2 – аспартам, 3 – бензойная кислота. Литература 1. Методические указания по определению сахарина, аспартама, кофеина и бензоата натрия в безалкагольных напитках методом ВЭЖХ.М.: Госстандарт РФ, 1996. – 14 с. 10.13. С.Н. Сычев. Исследование процесса разложения аскорбиновой кислоты Тепловая обработка продовольственного сырья всегда сопровождается частичным разрушением содержащихся в нем витаминов. Традиционные методы (метод нейтрализации, комплексонометричское титрование и фотометрия) не дают ясной картины кинетики деструкции витаминов в специфических условиях среды при обработке пищевой продукции. Значительно более наглядным методом исследования деструкции водорастворимых витаминов являеся обращенно - фазовый вариант ВЭЖХ . Результаты исследований деструкции витамина С при нагревании до 85° С в реакционной среде (состав реакционной среды: на 1 л раствора 0.7 мл 60%-ной фосфорной кислоты и 0.5 г лимонной кислоты) в течение 2 ч представлены на рис. 10.13. и табл. 10.13. Таблица 10. Кинетика деструкции аскорбиновой кислоты Время тепловой обработки, мин. 0 20 40 60 80 100 120 Оптическая плотность А витамина С на длине волны 230 нм 2.48 2.04 1.68 1.48 1.38 1.15 0.97 А (254 нм) продукта разложения 2 А (290 нм) продукта разложения 3 0 0 0.016 0.022 0.028 0.033 0.045 0 0.055 0.191 0.288 0.372 0.445 0.600 Рисунок 10.13. Хроматограммы аскорбиновой кислоты. а) после 20 мин. тепловой обработки, б) после 100 мин. Колонка 120х2 заполнена Диасорбом С16Т, расход 100 мкл/мин., длина волны 254 нм. Элюент ацетонитрил – буфер (0.03 М КН2РО4 + 0.02 М ДЭА, pH 3 фосф. к-той) в соотношении 9:91. 1 - аскорбиновая кислота, 2, 3, 4 – продукты разложения. 10.14. Анализ горьких кислот хмеля в его экстрактах Для анализа содержания горьких кислот хмеля в его экстрактах была разработана методика с применением метода ОФ ВЭЖХ, реализованного на хроматографах серии “Милихром-5” с многоволновой детекцией. Экспериментальная часть Хроматографический эксперимент проводился на хроматографе «Милихром-5-3» со сканирующим УФ-детектором. Хроматографические условия: 1. хроматографическая колонка КАХ-6-80-5, заполненная Диасорбом С16; 2. ступенчатое градиентное элюирование: - буфер – 500 мкл, из них 400 мкл расходуется на регенерацию колонки; - ацетонитрил – буфер в соотношении 15:85 – 1000 мкл; - ацетонитрил – буфер в соотношении 30:70 – 500 мкл; - ацетонитрил – буфер в соотношении 50:50 – 400 мкл. Буфер: к 100 мл 0.02 М КН2РО4 прибавляют 0.5 мл диэтиламина и доводят раствор до рН=3.5 орто-фосфорной кислотой. 3. расход элюента 100 мкл/мин.; 4. объем пробы 8 мкл; 5. длины волн 210, 220, 230, 254 и 280 нм ; Применяли два варианта подготовки аналитических проб: 1) 0.5 г гранулированного хмеля заливается 25 мл воды, нагретой до 87 – 90 0С. Смесь настаивается в течение 10 мин. Водная вытяжка фильтруется. Получается аналитическая проба № 1. 5 мл водной вытяжки заливается 5 мл раствора «гексан-изопропанол» в соотношении 9:1 по объему. Смесь встряхивается в течение 5 мин. После расслаивания анализируется водная вытяжка (аналитическая проба №2). 2) 0.5 г гранулированного хмеля заливается 25 мл раствора «гексан-изопропанол» в соотношении 9:1 по объему. Смесь настаивается в течение 10 мин. 5 мл гексан-изопропанольного экстракта заливается 5 мл воды. Смесь встряхивается в течение 5 мин. После расслаивания анализируется водная вытяжка (аналитическая проба № 3) Обсуждение результатов При отсутствии надежных стандартов α- и β - кислот было необходимо выяснить положение хроматографических пиков α- и β - кислот на обзорных хроматограммах водных экстрактов хмеля (аналитическая проба № 1). Известно, что α- и β - кислоты экстрагируют из хмеля смесью «петролейный эфир-этиловый спирт», α- кислоты фотометрируют на длинах волн 276-280 нм, при которых β-кислоты не поглощают. Таким образом, проэкстрагированный смесью «гексан-изопропанол» водный экстракт хмеля (аналитическая проба №2 ) должен содержать значительно меньшее количество α- и βкислот, чем исходный водный экстракт, причем β-кислоты не должны поглощать на длине волны 280 нм. Еще один способ определения положения α- и β - кислот на хроматограмме водного экстракта хмеля заключается в анализе водного экстракта гексано-изопропанольной вытяжки из хмеля (аналитическая проба № 3). Такая проба должна содержать преимущественно α- и βкислоты. Действительно, как видно из приведенных хроматограмм, эти предположения подтвердились, и нам удалось точно определить положение α- и β- кислот на обзорной хроматограмме водного экстракта хмеля. 2 1 Рисунок 10.14.1. Хроматограмма водного экстракта хмеля (аналитическая проба № 1). 1 – βкислоты, 2 – α-кислоты. Оптическая плотность пика 1 на длине волны 210 нм – 0.96 , оптическая плотность пика 2 на длине волны 210 нм – 1.57. 1 2 Рисунок 10.14.2. Хроматограмма водного экстракта хмеля (аналитическая проба № 2) проэкстрагированного гексано-изопропанольной смесью. 1 – β- кислоты, 2 – α-кислоты. Оптическая плотность пика 1 на длине волны 210 нм – 0.51, оптическая плотность пика 2 на длине волны 210 нм – 0.62. 2 1 Рисунок 10.14.3. Хроматограмма водного экстракта (аналитическая проба № 3) из гексаноизопропанольного экстракта хмеля. 1 – β-кислоты, 2 – α-кислоты. 10. Сборник методик анализа 10.15. С.Н. Сычев. Применение метода нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (НФ ВЭЖХ) для сравнительного анализа базовых моторных масел Основой любого минерального моторного масла служат базовые масла. Например, на Рязанском НПЗ в качестве базовых масел применяется масло И-20 (для зимних моторных масел) и масло И-40 (для летних моторных масел). Стандартизация базовых масел представляет серьезную технологическую и аналитическую проблему. Метод НФ ВЭЖХ в сочетании с многоволновой детекцией способен обеспечить как технологический контроль, так и проверку качества базовых масел в товарной продукции. Применение метода НФ ВЭЖХ для решения указанных задач продемонстрировано на примере выяснения причин несоответствия температуры замерзания (повышение) товарного образца масла М-8Г. Экспериментальная часть Эксперимент проводился на хроматографе «Милихром-5-3» со сканирующим УФ-детектором. Хроматографические условия для анализа базовых масел: 1. колонка КАХ-5-80-5, заполненная Силасорбом-600; 2. элюент - гексан; 3. расход элюента 150 мкл/мин.; 4. длины волн 220,230 и 254 нм; 5. температура окружающей среды 22+-2оС. Подготовка пробы 1) 2) Использовались два варианта подготовки пробы: 1 мл базового масла растворяют в 10 мл гексана; 5 мл моторного масла экстрагируют 10 мл раствора «ацетонитрил – вода» в объёмном соотношении 80:20, помещают в делительную воронку на 25 мл с притертыми пробками и встряхивают на встряхивающей машине АВУ-6С (или аналогичной) в течение 10 мин. После расслаивания фаз водно-ацетонитрильный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу (синяя лента) для отделения неотстоявшихся частиц. 1 мл оставшегося масла растворяют в 10 мл гексана. В результате получают две аналитические пробы: водо-ацетонитрильная, содержащая присадки в масле и гексановая, содержащая базовые масла. Обсуждение результатов Базовые масла И-20 и И-40 были растворены в гексане в соотношении 1:10 (масло:гексан) и проанализированы в приведенных условиях. Рисунок 10.15.1. Хроматограмма гексанового раствора базового масла И-20. Колонка 80х2 заполнена силикагелем Силасорб-600. Расход элюента 150 мкл/мин. УФ 220, 230 и 254 нм. Базовое масло И-20 в идеале вообще не должно поглощать в диапазоне УФ от 190 нм и выше, так как должно состоять из предельных углеводородов, не поглощающих в этой области. Тем не мнее поглощение есть, и довольно значительное. Это означает, что кроме предельных углеводородов, в масле находится какие-то другие классы соединений. Исходя из характеристик хроматографической системы и спектральных отношений, это могут быть только непредельные углеводороды: алкадиены и циклоалкадиены (например, у бензола VR = 310 мкл) На рис. 10.15.1 видны по крайней мере дае группы соединений (1 – VR 228 мкл, 2 – VR 282 мкл), поглощающих в УФ-диапазоне. Учитывая, что для циклических соединений характерен длинноволновой сдвиг по сравнению с линейными непредельными углеводородами, группу соединений 1 можно интерпретировать как ациклические алкадиены с сопряженной связью, а группу 2 как циклические определенного типа. Например, транс-бутадиен 1,3 имеет λм = 217 нм, что соответствует интенсивности хроматографического пика на рис.7.20 на длине волны 220нм, а 1,2 диметиленциклопентан имеет λм = 231 нм, что соответствует длине волны 230 нм на рис. 10.15.1. Существует простая зависимость между временами удерживания углеводородов и их температурами замерзания: чем меньше удерживание, тем ниже температура замерзания. Мертвый объем используемых хроматографических колонок порядка 180 мкл, а начало хроматографического пика 1 на рис. 10.15.1 соответствует 190 мкл. Исходя из этого следует признать, что масло И-20 по сравнению с маслом И-40 имеет более низкую температуру замерзания по диеновым углеводородам и может служить основой зимних моторных масел. Выводы по маслу И-20: 1. Базовое масло И-20 должно иметь низкую температуру замерзания. 2. Базовое масло И-20 может быть основой зимних моторных масел. 3. Существенным недостатком И-20 является большое содержание непредельных углеводородов, что неминуемо приводит к интенсивной полимеризации, осмолению и коксованию поршней, колец и стенок цилиндров. Рисунок 10.15.2. Хроматограмма гексанового раствора базового масла И-40. Колонка 80х2 заполнена силикагелем Силасорб-600. Расход элюента 150 мкл/мин. Длины волн 220, 230 и 254 нм, объем пробы 10 мкл. Базовое масло И-40 в идеале вообще не должно поглощать в диапазоне УФ от 190 нм и выше, так как должно состоять из предельных углеводородов, не поглощающих в этой области. Тем не мнее поглощение есть (рис. 10.15.2). Более того, в состав масла входят не такие УФпоглощающие вещества, как в масле И-20, что видно при сравнении хроматограмм 10.15.1 и 10.15.2. Исходя из характеристик хроматографической системы и спектральных отношений, просматриваются как минимум четыре типа соединений с удерживаемыми объемами VR 1 – 269 мкл, 2 – 285 мкл, 3 – 330 мкл, 4 – 400 мкл. 1 и 2-ой компоненты могут быть только непредельными углеводородами, скорее всего, циклоалкадиенами. 3-й и 4-ый компоненты являютя, по-видимости, ароматическими, причем, если 3-й компонент является, скорее всего, производными бензола, то 4ый может принадлежать производным нафталина. Масло И-20 содержит компоненты, способствующие понижению температуры замерзания (непредельные углеводороды), а масло И-40 – компоненты, способствующие ее повышению (ароматические соединения). Таким образом, масло И-40 может быть основой только для летнего моторного масла, но не зимнего. С другой стороны, масло И-40, содержащее значительно меньшее количество непредельных углеводородов, чем масло И-20, меньше осмоляется. 10.16.1. С.Н. Сычев. Определение содержания производных фурана в электроизоляционных маслах методом ОФ ВЭЖХ Основой твёрдой изоляции маслонаполненного оборудования (силовых и измерительных трансформаторов, реакторов) является целлюлоза. В процессе эксплуатации оборудования твёрдая изоляция подвержена процессам старения. Эти процессы сопровождаются химическими превращениями, в результате которых образуются вещества, характерные для процесса разрушения целлюлозы, в частности производные пятиатомного гетероциклического соединения фурана: фурфурол, 2-ацетилфуран, 5-метилфурфурол и 5-гидроксиметилфурфурол. Производные фурана, образующиеся вследствие старения целлюлозы, частично растворяются в масле, откуда они могут быть экстрагированы и проанализированы методом ВЭЖХ. Результаты анализа используются для диагностики состояния твёрдой изоляции оборудования без вывода его в ремонт и вскрытия. Содержание суммы фурановых соединений в эксплуатационном трансформаторном масле должно быть не более 0.001 – 0.0015% (весовых). Согласно существующей методике [1], экстракция фуранов проводится чистым ацетонитрилом, что приводит к уменьшению эффективности используемой хроматографической колонки, а также ее быстрому загрязнению сопутствующими углеводородами. Предлагаемый метод определения производных фурана в эксплуатационном трансформаторном масле включает экстракцию масла подвижной фазой (системой ацетонитрил – вода 15:85) и анализ экстракта методом обращённо-фазной ВЭЖХ на жидкостном хроматографе серии «Милихром». Подготовка пробы 5 г исследуемого трансформаторного масла экстрагируют 2 мл смеси ацетонитрил - вода в объёмном соотношении 15:85 в делительных воронках на 25 мл с притертыми пробками на встряхивающей машине АВУ-6С (или аналогичной) в течение 10 мин. После расслаивания фаз водно-ацетонитрильный экстракт дважды фильтруют через фильтровальную бумагу (белая лента) для отделения неотстоявшихся частиц масла. В результате получают аналитическую пробу в смеси ацетонитрил – вода 15:85 объёмом 2 мл. Подготовка градуировочного раствора В 5 г свежего товарного трансформаторного или минерального (вазелинового) масла растворяют по 5 мкл стандартных растворов фурфурола, 2 – ацетилфурана, 5 – метилфурфурола и 5 – гидроксиметилфурфурола в толуоле концентрации 10 мг/мл (ОРГРЭС, г. Москва); концентрация каждого фуранового производного в масле равна 10 мкг/г, общая концентрация - 40 мкг/г. Градуировочные растворы готовятся путем экстракции масляного раствора стандартов 2 мл смеси ацетонитрил - вода в объемном соотношении 15:85 (см. подготовка пробы). После расслаивания фаз водно-ацетонитрильный экстракт дважды фильтруется через фильтровальную бумагу (белая лента) для отделения неотстоявшихся частиц масла. В результате получают градуировочный раствор в смеси ацетонитрил – вода 15:85 объёмом 2 мл, соответствующий исходному раствору в масле. Хроматографический анализ Для хроматографического анализа применяются колонка 80×2, заполненная Диасорбом С16Т или аналогичным по свойствам адсорбентом, реактивы: вода дистиллированная, ацетонитрил для хроматографии «Криохром» 0-го ,1-го или 2-го сорта (г. Санкт-Петербург). Режим работы хроматографа: длина волны 280 нм, скорость подачи 100 мкл/мин., общий объем элюента – 2500 мкл, объем регенерации – 500 мкл, объем вводимой в колонку пробы – 8 мкл; элюент ацетонитрил-вода в соотношении 15:85 по объему (рис.10.16.1). По окончании каждого анализа колонку промывают 1000 мкл ацетонитрила. Эта операция осуществляется с целью отмывки хроматографической колонки от остатков трансформаторного масла. Требования к проведению хроматографического анализа Перед началом работы через колонку в ручном режиме прокачивают 2500 мкл ацетонитрила. Затем насос переворачивают, закрепляют в перевернутом виде и работают только с перевернутым насосом. Рисунок 10.16.1. Хроматограмма внесенных в трансформаторное масло и проэкстрагированных фурановых производных. 1 – оксиметилфурфурол, 2 – фурфурол, 3 – ацетилфурфурол, 4 – метилфурфурол. Литература 1. Костиков С.Ю. Определение содержания производных фурана в электроизоляционных маслах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. РД 34.43.206-97. 10.16.2. К.С. Сычев, С.Ю. Костиков. Определение содержания производных фурана в электроизоляционных маслах методом ТФЭ-ОФ ВЭЖХ Методики с применением жидкость-жидкостной переэкстракции для извлечения производных фурана из трансформаторных масел обладают одним общим недостатком. Степени извлечения аналитов, которые составляют в среднем 50%, могут достаточно сильно колебаться около этого значения, что зависит от марки масла, срока и условий его эксплуатации. Во избежание этой трудности для подготовки проб было предложено применять метод твердофазной экстракции (ТФЭ) на сверхсшитом полистироле. ТФЭ проводится из раствора масла в гексане, то есть в квази-нормально-фазовых условиях. Производные фуранов, ароматические соединения с электрон-акцепторными заместителями, адсорбируются на сверхсшитом полистироле за счет π-взаимодействий. При этом углеводородная основа масла, что очень важно, не удерживается и уходит в сброс. Картридж с 1 мл сверхсшитого полистирола Purosep200 кондиционировали 2 мл гексана. 2 г трансформаторного масла разбавляли гексаном до объема 10 мл. Весь объем раствора пропускали через картридж со скоростью 2 мл/мин. Картридж промывали 1 мл гексана. Гексан вытесняли воздухом, далее картридж осушали воздухом (несколько полных объемов 20мл шприца). Аналиты элюировали 5 мл ацетонитрила. Далее ацетонитрил вытеснялся воздухом. Процедура подготовки пробы занимает порядка 10 минут. При применении манифолда (то есть при пропускании раствора при помощи вакуума водоструйного насоса) можно готовить сразу несколько проб, причем время пробоподготовки при этом увеличивается незначительно. Метод гарантирует уверенное извлечение оксиметилфурфурола, фурфурола, ацетилфурфурола и метилфурфурола на уровне 85-90%. Проба в ацетонитриле анализируется методом обращенно-фазовой хроматографии (рис. 10.16.2). При этом рекомендуется применять предколонку для защиты основной колонки от остатков масляной основы. Промывок аналитической колонки ацетонитрилом не требуется. Рисунок 10.16.2. Хроматограмма фурановых производных. 250х4.6 Wakosil C18 AR. Элюент ацетонитрил-вода 15:85. 1 – оксиметилфурфурол, 2 – фурфурол, 3 – ацетилфурфурол, 4 – метилфурфурол. 10.17. С.Н. Сычев. Анализ присадок в моторных, турбинных и трансмиссионных маслах Введение в состав моторных, турбинных и трансмиссионных масел различного рода присадок значительно улучшает их эксплуатационные качества. Большое разнообразие и широкое применение присадок требует непрерывного совершенствования методов определения их качества, технологического контроля при изготовлении масел и определения количества и подлинности присадок в товарных маслах. Метод ВЭЖХ – один из немногих методов, способных хотя бы частично решить эту проблему. Основной целью данного раздела является выяснение возможностей метода ВЭЖХ при анализе около пятидесяти присадок, представляющих различные классы органических соединений, а также базовых минеральных масел. Экспериментальная часть Хроматографический эксперимент проводился на хроматографе «Милихром-5-3» со сканирующим УФ-детектором. Хроматографические условия для анализа присадок: хроматографическая колонка КАХ-680-5, заполненная Сепароном С18; элюент «ацетонитрил-вода» в соотношении 80:20 по объему; расход элюента 150 мкл/мин.; длины волн 210, 230, 254 и 280 нм; температура окружающей среды 22+-2оС. Подготовка проб присадок В зависимости от консистенции присадки использовались два варианта подготовки пробы: 1) 5 г твердой присадки растворяют в 5 мл гексана. 2 мл полученного раствора и 10 мл раствора «ацетонитрил – вода» в объёмном соотношении 80:20 помещают в делительную воронку на 25 мл с притертыми пробками и встряхивают на встряхивающей машине АВУ-6С (или аналогичной) в течение 10 мин. После расслаивания фаз (центрифугирование) водно-ацетонитрильный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу (синяя лента) для отделения неотстоявшихся частиц. В результате получают аналитическую пробу в смеси «ацетонитрил – вода» 80:20. 2) 1 г жидкой присадки и 10 мл раствора «ацетонитрил – вода» в объёмном соотношении 80:20 помещают в делительную воронку на 25 мл с притертыми пробками и встряхивают на встряхивающей машине АВУ-6С (или аналогичной) в течение 10 мин. После расслаивания фаз (центрифугирование) водно-ацетонитрильный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу (синяя лента) для отделения неотстоявшихся частиц. В результате получают аналитическую пробу в смеси «ацетонитрил – вода» 80:20. Результаты Некоторые присадки содержат небольшое число основных компонентов. К таким присадкам можно отнести следующие: агидол, ионол, фриктол; присадки к трансмиссионным маслам – INFINEUM T 4405, Хайтек 320, Хайтек 343; присадки к моторным маслам – Хайтек 8610, Хайтек 521F, Хайтек 8204, Хайтек 9250, Майкосойл-Депрессор, EMCARATE 1110, INFINEUM C 9353. Хроматограма присадки INFINEUM T 4405 приведена на рисунке 10.17.1. Хроматографические и спектральные характеристики указанных присадок приведены в таблице 10.17. Спектральные отношения являются отношениями оптического поглощения на двух различных длинах волн. Рисунок 10.17.1. Водо-ацетонитрильный экстракт присадки Infineum T 4405. Таблица 10.17. Хроматографические и спектральные характеристики некоторых присадок (колонка 80х2 заполнена Сепароном С18, элюент «ацетонитрил-вода» 80:20) Название присадки Агидол Ионол Фриктол Infineum T 4405 Хайтек 320 Хайтек 8610 Хайтек 521F Хайтек 8204 Хайтек 9250 МайкосойлДепрессор EMCARATE 1010 Infineum C 9353 Удерживаемый объем основных компонентов, мкл 795 820 652 1290 535 586 174 696 675 157 385 159 405 Спектральное отношение 230нм/210нм 0.30 0.32 0.87 0.28 0.17 0.20 0.35 0.26 0.29 0.33 0.20 0.37 0.24 Спектральное отношение 280нм/210нм 0.13 0.14 0.29 0.17 0.03 0.04 0.01 0.12 0.15 0.0 0.75 0.0 0.87 689 0.27 0.2 668 195 0.24 0.32 0.10 0.05 Очевидно, что соединения со спектральным отношением 230нм/210нм 0.27-0.32 и спектральным отношением 280нм/210нм 0.12-0.2 являются алкилфенолами, подобными ионолу. К присадкам, содержащим смесь большого числа компонентов, можно отнести следующие: КНД, LZ-600, LZ-5705, LZ-859, LZ-6661, Д-157, С-150. Хроматограмма присадки Д-157 приведена на рисунке 10.17.2. Рисунок10.17.2. Хроматограмма экстракта присадки Д-157. Обнаружение присадок в моторных маслах В зависимости от консистенции масла использовались два варианта подготовки пробы: 1) 5 г отработанного или чистого масла растворяют в 5 мл гексана. 2 мл полученного раствора и 10 мл раствора «ацетонитрил – вода» в объёмном соотношении 80:20 помещают в делительную воронку на 25 мл с притертыми пробками и встряхивают на встряхивающей машине АВУ-6С (или аналогичной) в течение 10 мин. После расслаивания фаз водно-ацетонитрильный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу (синяя лента) для отделения неотстоявшихся частиц. В результате получают аналитическую пробу в смеси ацетонитрил – вода 80:20. 2) 1 г чистого или отработанного масла и 10 мл раствора «ацетонитрил – вода» в объёмном соотношении 80:20 помещают в делительную воронку на 25 мл с притертыми пробками и встряхивают на встряхивающей машине АВУ-6С (или аналогичной) в течение 10 мин. После расслаивания фаз водно-ацетонитрильный экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу (синяя лента) для отделения неотстоявшихся частиц. В результате получают аналитическую пробу в смеси ацетонитрил – вода 80:20. На рис. 10.17.3 и 10.17.4. представлен пример обнаружения алкилсульфонатов кальция в свежем моторном масле М-8Г. Рисунок 10.17.3. Хроматограмма алкилсульфоната кальция. Анализируется экстракт (ацетонитрилвода 80:20 по объему). Колонка 80х2 заполнена Сепароном С18. Рисунок 10.17.4. Хроматограмма присадок в испытуемом масле М-8. Анализируется экстракт («ацетонитрил-вода» 80:20 по объему). Колонка 80х2 заполнена Сепароном С18. 10.18. К.С. Сычев. Анализ ароматических углеводородов в топливах. До недавнего времени существовало всего два основных способа анализа ароматических углеводородов методом ВЭЖХ: в нормально-фазовом и обращенно-фазовом режимах. Нормально-фазовое разделение ароматических углеводородов принято проводить на аминофазе. Элюирование чистым гексаном применяется для анализа моно, би и трициклических углеводородов. Для анализа полициклических углеводородов (ПАУ) в подвижную фазу на основе гексана вносят до 20 процентов полярной добавки – более порярного растворителя (к примеру, хлороформа или эфира). В настоящее время анализ ПАУ уже не проводят нормально-фазовым методом. Актуальной задачей остался нормально-фазовый анализ моно, би и трициклической ароматики. Причина заключается в том, что в этих условиях метиленовые гомологи ароматических углеводородов разделяются достаточно слабо, и группы гомолов элюируются в виде достаточно узких зон. Таким образом, нормально-фазовый метод применяется для оценки суммарной концентрации каждого типа ароматических углеводородов (моно, би и трициклических) в исследуемых образцах. Ограниченное применение данного метода обусловлено теми же причинами, по которым в свое время отказались от нормально-фазового анализа ПАУ. Прежде всего, метод характеризуется очень плохой воспроизводимостью. Времена элюирования сильно зависят от малейших колебаний концентрации влаги в элюенте, поэтому все применяемые реагенты должны тщательно и периодически осушаться. Пробы также не должны содержать влаги, что выполняется далеко не всегда. При анализе «грязных» проб, к примеру, образцов нефтей, колонка достаточно быстро выходит из строя, и регенерируется только последовательной промывкой безводным изопропанолом (желательно при повышенной температуре) и осушенным гексаном. Разделение зон моно и биароматических углеводородов критично, а их удерживание – очень слабое, то есть система не имеет запаса по разделительной способности. Как правило, анализ ароматических углеводородов проводят обращенно-фазовым методом. В обращенно-фазовых системах на С18 фазах метиленовые гомологи эффективно разделяются, при этом удерживание растет с увеличением длины алифатического заместителя (заместителей). Обращенно-фазовый метод на С18 фазах дает отличные результаты при разделении ПАУ. Анализ же моно, би и триароматических углеводородов этим методом имеет один недостаток: «соседние» зоны элюирования гомологов перекрываются, к примеру, зона элюирования моноароматических углеводородов перекрывается с зоной биароматических, зона элюирования биароматических – с зоной элюирования триароматических и т.д. (см.рис. 10.18.1а). В результате, при анализе реальных проб топлива с УФ детектированием бывает не ясно, к какой именно группе принадлежит тот или иной пик, что очень затрудняет анализ сложных образцов (рис. 10.18.1б). Рисунок 10.18.1(а). Модельная смесь ароматических углеводородов. 250х4.6 Inertsil ODS. Элюент ацетонитрил-вода 70:30. Рисунок 10.18.1(б). Хроматограмма ацетонитрильного экстракта нефти (после испарения моноароматических углеводородов). 250х4.6 Wakosil C18 HG. Элюент ацетонитрил-вода 75:25. Первый пик – нафталин, область элюирования трициклических ПАУ начинается от 8 минут, область элюирования диметилнафталинов заканчивается при 10 минутах. Недостатков обоих методов можно избежать, проводя анализ на фазе, заполненной нейтральным сверхсшитым полистиролом. Данный адсорбционный материал способен удерживать ароматические соединения за счет пи-взаимодействий, что наиболее ярко проявляется в неполярных средах. Тип удерживания ароматических соединений на сверхсшитом полистироле в неполярных средах был назван квази-нормально-фазовым. В полярных средах квази-нормально- фазовый тип удерживания становится минорным; на первый же план выходит обращенно-фазовый тип удерживания. Работа проводилась на фазе Chromalite 5HGN, заполненной 5-микронными частицами сверхсшитого полистирола. В обращенно-фазовом режиме на сверхсшитом полистироле зоны элюирования различных групп ароматических углеводородов четко разделяются. На рисунке 10.18.3. приведена хроматограмма топлива Аи-93. На хроматограмме видно, что нафталин элюируется только после наиболее замещенных алкилпроизводных бензола. Так же четко разделяются и группы би- и триароматических углеводородов (см. рис. 10.18.3). Рисунок 10.18.2. Хроматограмма топлива Аи-93. НФ: 250x4.6 Chromalite 5-HGN. ПФ: ацетонитрилизопропанол-вода 55:25:20. Детектирование: А) 220 нм, В) 254 нм. Рисунок 10.18.3. а) Хроматограмма топлива Аи-95, б) хроматограмма модельной смеси ароматических соединений. 250x4.6 Chromalite 5-HGN. Элюенты, А: ацетонитрил-изопропанол-вода 55:25:20, ПФ В: ацетонитрил-изопропанол 70:30, 100% А в течение 20 мин., затем 0-100% В за 35 мин. В квази-нормально-фазовом методе порядок элюирования ароматических углеводородов похож на таковой для нормально-фазового режима, поскольку удерживание также возрастает при увеличении сопряженной ароматической системы адсорбатов. Однако, как удерживание, так и селективность разделения ароматических углеводородов для квази-нормальной хроматографии значительно выше, чем для нормально-фазовой хроматографии. Более того, разделение не зависит от концентрации влаги в элюенте и пробах. Квази-нормально-фазовые системы с применением сверхсшитого полистирола обладают большой гибкостью, поскольку в неполярных элюентах в дополнение к основному квази-нормальнофазовому типу удерживания определенные вклады могут вносить также эксклюзионный и обращенно-фазовый типы. Эксклюзионный тип проявляется даже для мономолекулярных соединений, поскольку неподвижная фаза обладает молекулярными микропорами размера 20-30 ангстрем. Обращенно-фазовый тип проявляется даже в сравнительно неполярных средах по причине значительной гидрофобности сверхсшитого полистирольного материала. При элюировании гексаном с добавкой хлористого метилена группы ароматических углеводородов разделяются по квази-нормально-фазовому типу, а гомологи внутри групп – по эксклюзионному типу. Метиленовая группа имеет отрицательный вклад в удерживание; таким образом, удерживание уменьшается при увеличении объема алкильного заместителя. В системе с элюентом хлористый метилен-метанол отрицательный эксклюзионный вклад алкильных групп приблизительно нейтрализуется положительным вкладом обращенно-фазового типа. В результате, разделение гомологов подавляется; моно-, би- и триароматические углеводороды элюируются в виде трех достаточно узких пиков. Алифатические углеводороды и олефины элюируются в нулевом объеме. Эта система «смешанного» типа может применяться для группового анализа ароматических углеводородов в нефтях и различных топливах (см. рис. 10.18.4, 10.18.5). Рисунок 10.18.4. Хроматограммы топлива Аи-92 в квази-нормально-фазовом и смешанном режимах. НФ: 250x4.6 Chromalite 5-HGN. А) ПФ: гексан-хлористый метилен 80:20, В) ПФ: хлористый метилен-метанол 1:1. 1 – алифатические углеводороды, 2 – моноароматические углеводороды, 3 – бициклические углеводороды, 4 – полярные полиароматические углеводороды. Рисунок 10.18.5. Хроматограмма дизельного топлива в квази-нормально-фазовом и смешанном режимах. Вверху: хроматограмма в квази-нормально-фазовом режиме, внизу: хроматограмма в смешанном режиме. Условия как для рисунка 10.18.4. Рисунок 10.18.6. Хроматограмма фальсифицированного топлива Аи-92 в квази-нормально-фазовом режиме. НФ: 250x4.6 Chromalite 5-HGN. ПФ: гексан-хлористый метилен 80:20. Очевидно присутствие добавок бензола (1) и ряда неидентифицированных соединений (2-5). Рисунок 10.18.7. Хроматограмма топлива Аи-80 в квази-нормально-фазовом режиме. НФ: 250x4.6 Chromalite 5-HGN. ПФ: гексан-хлористый метилен 80:20. В топливе присутствует неидентифицированная присадка 1. 10. Сборник методик анализа 10.19. С.Н. Сычев. Анализ и подтверждение идентичности образцов опиума и героина Доказательство идентичности образцов наркотических веществ, изъятых у разных людей, является одной из важных задач криминалистической экспертизы. При исследовании на идентичность различных образцов веществ, содержащих опиумные алкалоиды, нами был применен универсальный элюент типа «ацетонитрил-фосфатный буфер-диэтиламин-фосфорная кислота». Использование для этих целей хроматографических систем, предложенных ЭКЦ МВД РФ, оказалось менее эффективным (рис. 10.19.1). Рисунок 10.19.1. Хроматограммы опиума. Вверху: градиентное элюирование, А - смесь 0.05 М КН2РО4 и 0.02 М ДЭА подкислена фосфорной кислотой до pH 2.6, В - ацетонитрил. 5, 10, 20, 30 и 40% (об.) «В» в «А» за 25 мин; колонка 80х2 заполнена Сепароном С18, расход элюента 100 мкл/мин., длины волн 218 и 228 нм; Внизу: хроматограмма опиума, полученная ЭКЦ МВД РФ (система без модифицирования ДЭА). Идентичность различных образцов опиума определялась по временам удерживания компонентов, их спектральным отношениям и соотношениям высот пиков. При совпадении всех указанных параметров с погрешностью: времен удерживания - (±) 1%, спектральных отношений (±) 6%, соотношений высот пиков - (±) 0.25% - образцы опиума считались идентичными. На рис. 10.19.2. приведены хроматограммы образцов опиума: 1 – смыв с ложки, 2 - образец массой 1.101 кг, 3 - образец массой 1.210 кг, 4 - образец массой 1.326 кг. 1 2 3 4 Рисунок 10.19.2. Хроматограммы опиума. Градиентное элюирование, А - смесь 0.05 М КН2РО4 и 0.02 М ДЭА подкислена фосфорной кислотой до pH 2.6, В - ацетонитрил. 5, 10, 20, 30 и 40% (об.) «В» в «А» за 25 мин.; колонка 80х2 заполнена Сепароном С18, расход элюента 100 мкл/мин., длины волн 218 и 228 нм. Описанная хроматографическая система прекрасно работает при анализе ацетилпроизводных морфина, в том числе – героина (см. рис. 10.19.3), причем определению героина не мешает присутствие часто подмешиваемого в героин прокаина или димедрола. Рисунок 10.19.3. Хроматограмма героина. Условия анализа аналогичны рис. 10.19.2. 11. Список международных сокращений, принятых в хроматографии A A – amino, амино Amino – аминофаза APS – aminopropylsilane, аминопропилированная фаза (аминофаза) B Butyl – бутил BIO – for bioseparations, для разделения пептидов, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот C С1, С4, С8, С18, С30 – углеводородные радикалы с соответствующим числом атомов углерода CN, Cyano – циано, нитрильная фаза CMC – critical micelle concentration, критическая концентрация мицеллообразования, ККМ CSP – chiral stationary phase, хиральная неподвижная фаза D Dansyl (5-N,N-dimethylaminonaphthylene-1-sulfonyl chloride), дансил (дериватизующий реагент на аминогруппу, гидроксильную группу) Dabsyl (4-N,N-dimethylaminoazobemzene-4-sulfonyl chloride), дабсил(дериватизующий реагент на аминогруппу, гидроксильную группу) DVB – divynilbenzene, дивинилбензол DEA – diethylamine, диэтиламин DEAE – diethylaminoethyl, диэтиламиноэтил DEAM – diethylaminomethyl, диэтиламинометил DMAC – dimethylacetamide, диметилацетамид (растворитель) DMF – dimethylformamide, диметилформамид (растворитель) DMSO – dimethylsulfoxide, диметилсульфоксид (растворитель) DNPH – dinitrophenylhydrazine, динитрофенилгидразин, ДНФГ (дериватизующий реагент на карбонильную группу) E EC – electrokinetic chromatography, электрокинетическая хроматография ECD – electrochemical detection, электрохимическая детекция ELSD – evaporative light scattering detector, испарительный детектор светорассеяния E – endcapped, эндкеппированный em – emission, длина волны эмиссии EPA – Environmental Protection Agency ex – excitation, длина волны возбуждения F FMOK – 9-fluorenylmethylchlorformate, (дериватизующий реагент для амикислот) FLD – fluorescence detector, флуоресцентное детектирование FPLC – fast protein liquid chromatography, метод жидкостной хроматографии для быстрого разделения белковых соединений G GFC – gel filtration chromatography, гель-фильтрационная хроматография GPC – gel permeation chromatography, гель-пермеационная хроматография H HETP – height equivalent to a theoretical plate, высота, эквивалентная теоретической тарелке, ВЭТТ Hexyl – гексил Hexyl-Phenyl – 1-фенилгексил HPLC – high performance liquid chromatography, высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ HPCE – high performance capillary electrophoresis, высокоэффективный капиллярный электрофорез, ВЭКЭ HP – hydrophilic polymer, гидрофильный полимер HFIP – hexafluoroisopropanol, гексафторизопропанол (растворитель для эксклюзионной хроматографии) HIC – hydrophobic interaction chromatography, гидрофобная хроматография HILIC – hydrophilic interaction chromatography, гидрофильная хроматография I IC – ion chromatography, ионная хроматография ID – internal diameter, внутренний диаметр IEC – ion-exchange chromatography, ионобменная хроматография IEX – ion-exclusion chromatography, ион-эксклюзионная хроматография IPA – isopropanol, изопропанол (растворитель) IP – ion-pair, ион-парный IR – infrared, инфракрасный L LEC – ligand-exchange chromatography, лигандобменная хроматография LC – liquid chromatography, жидкостная хроматография M MCX – medium cation-exchange, умеренная катионобменная фаза MAX – medium cation-exchange, умеренная анионобменная фаза MEKC – micellar electrokinetic (capillary) chromatography, мицеллярная электрокинетическая (капиллярная) хроматография MCAС – metal chelate affinity chromatography, металлохелатная афинная хроматография MOS – methyloctasilane, метилоктасилан, С8 обращенная фаза MS – mass spectrometry, масс-спектрометрическое детектирование MTBE – methyl tret-butyl ether, метилтретбутиловый эфир (растворитель) MW – molecular weight, молекулярная масса N N – efficiency, эффективность NE – non-endcapped, неэндкеппированный NH2 – amino, амино, аминофаза NMP – N-methyl pyrrolidone, (растворитель для эксклюзионной хроматографии) NO2 – nitro, нитро, нитрофаза NP – normal phase, нормально-фазовый O Octyl – октил OD – outer diameter, внешний диаметр ODS – octadecylsilane, октадецилсилан, ОДС (то же, что С18) OPA – o-phthalic aldehyde, о-фталевый альдегид (дериватизующий реагент на аминогруппу) P PAH – polyaromatic hydrocarbon, полиароматические углеводороды, ПАУ Ph, Phenyl – фенил PM – polar modified, модификация полярным реагентом PS – polystyrene, полистирол PVA – polyvinyl alcohol, поливиниловый спирт PVC – polyvinyl chloride, поливинилхлорид PHM – polyhydroxymethacrylate, полигидроксиметакрилат PMM – polymethylmethacrylate, полиметилметакрилат PE – polar-endcapped, полярный эндкеппинг PFP – pentafluorophenyl, пентафторфенил PEEK – polyetherether ketone, (полимерный материал, заменитель стали) PEG – polyethylene glycol, полиэтиленгликоль PEI – polyethyleneimine, полиэтиленимин PFA, PTFE – Teflon, тефлон PFPA – pentafluoropropionic acid, пентафторпропионовая кислота (ион-парный реагент, применяемый для анализа недериватизованных аминокислот) PITC – phenylisothiocyanate, фенилизотиоцианат, ФИТЦ (дериватизующий реагент на аминогруппу) PRP – polymeric reversed phase, полимерная обращенно-фазовая psi – pounds per square inch, единица давления, 1 atm = 14.68 psi PTH – phenylthiohydantoin, фенилгидантоин производные (дериватизованные ФИТЦ производные) Q QAA – quaternary alkyl ammonium, четвертичные аминогруппы R RP – reversed phase, обращенно-фазовый RI – refractive index, рефрактометрическое детектирование RSD – relative standard deviation, среднеквадратическое отклонение, СКО S SCX – strong cation-exchange, сильная катионобменная фаза SAX – strong anion-exchange, сильная анионобменная фаза Si, Sil – silica, силикагель SA – сульфированный S-DVB styrene-divinylbenzene, стирол-дивинилбензол SDS – sodium dodecyl sulfonate, додецилсульфонат натрия (ион-парный реагент) SEC – size exclusion chromatography, эксклюзионная хроматография SFC – supercritical fluid chromatography, сверхкритическая флюидная хроматография SFE – supercritical fluid extraction, сверхкритическая флюидная экстракция SPE – solid phase extraction, твердофазная экстракция, ТФЭ T TEA – triethylamine, триэтиламин, ТЭА TFA – trifluoroacetic acid, трифторуксусная кислота, ТФУ THF – tetrahydrofuran, тетрагидрофуран, ТГФ (растворитель) TLC – thin-layer chromatography, тонкослойная хроматография, ТСХ U UPLC – ultra-pressure liquid chromatography, жидкостная хроматография сверхвысокого давления UV – ultraviolet, детектирование в ультрафиолетовом диапазоне W WCX – weak cation-exchange, слабая катионобменная фаза WAX – weak anion-exchange, слабая анионобменная фаза Z Zir – zirconia, окись циркония
