Практическая работа №4 Тема: Обнаружение белков, углеводов и липидов в клетке. Белки как биокатализаторы. Цели работы: доказать присутствие в биологических объектах таких важных органических соединений, как белки, липиды, углеводы; установить роль белковферментов в обменных процессах клетки. 2 Выполнение работы: Материалы и оборудование: штатив с пробирками, пипетки на 1мл, 1%-ный раствор крахмала, 1%-ный раствор сульфата меди, 10%-ный раствор гидроксида натрия, раствор Люголя, дистиллированная вода, спиртовка, 96 %- ный спирт, 10% раствора соды Na2CO3, раствор КМnО4, 1%-ный раствор яичного белка, конц. азотная кислота, виноградный сок, нерафинированное растительное масло. Опыт 1. Определение глюкозы в виноградном соке К 2 см3 виноградного сока прилить 1 см3 раствора едкого натра и 3 капли раствора сульфата меди. Нагреть до кипения. Аналитический эффект: наблюдается образование желтого осадка Cu(OH)2, который при дальнейшем нагревании переходит в красный осадок Cu2О. Опыт 2. Реакция крахмала с йодом К 2 мл раствора крахмала прилить 1–2 капли раствора Люголя. Раствор окрашивается в синий цвет. Затем нагреть. Окраска исчезает, но окраска вновь появляется при охлаждении. Опыт 3. Физико-химические свойства жиров Взять 2 пробирки. В первую налить 2мл дистиллированной воды, во вторую – спирта. В каждую пробирку прилить по 5 капель растительного масла. Все пробирки хорошо взболтать и отметить растворение жира в разных веществах. Опыт 4. Эмульгирование жиров Взять 2 пробирки. В каждую из них налить по 3 мл дистиллированной воды и свежее растительное масло. Во вторую пробирку добавить несколько капель 10% раствора соды Na2CO3. Все пробирки закрыть, тщательно взболтать. Оставить на 5 мин стоять и наблюдать стойкость эмульсии. Опыт 5. Определение непредельности жира В пробирку внести 0,5-1г масла, прилить 2 капли КМnО4 и тщательно взболтать. Происходит обесцвечивание перманганата. Опыт 6. Биуретовая реакция на определение пептидной связи В пробирку внести 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, 3 капли 10-%- ного раствора NaOH и одну каплю 1%-ного раствора CuSO4 и перемешать. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание. Опыт 7. Ксантопротеиновая реакция К 5 каплям 1%-ного раствора яичного белка прилить 3 капли концентрированной азотной кислоты (осторожно!) и нагреть. Появится осадок желтого цвета. После охлаждения в пробирку прилить 5-10 капель 10%-ного раствора NaOH до появления оранжевого окрашивания (оно связано с образованием натриевой соли этих нитросоединений). 1 Опыт 8. Свертывание белков при нагревании В пробирку налить немного раствора белка. Нагреть раствор до кипения. Раствор мутнеет, белок выпадает в виде хлопьев. Свертывание белков при кипении - процесс необратимого осаждения, белковые молекулы меняют свою структуру. Опыт 9. Белки как биокатализаторы Оборудование: штатив с пробирками, пипетки на 1мл, водяная баня, электрическая плитка, 1%-ный раствор крахмала, 2%-ный раствор сахарозы, 1%-ный раствор иода, 5%-ный раствор сульфата меди, 10%-ный раствор гидроксида натрия, 0,2%ный раствор соляной кислоты. Ход работы: 1. Ферментативный гидролиз крахмала. В качестве фермента, гидролизующего крахмал на его составные части (мальтозу, глюкозу), выступает амилаза слюны. Оценка результатов опытов проводится с помощью цветных реакций с иодом и реакции Троммера. Соответственно продукты гидролиза крахмала не дают реакции с иодом, но положительно реагируют на реактив Троммера. В 2 пробирки налейте по 10 капель 1%-ного раствора крахмала. В пробирку №1 (контроль) внесите 4 капли воды, а в пробирку №2 – 4 капли раствора слюны, разведенной в 5 раз. Перемешайте и поставьте в водяную баню на 15 мин при 370С. Затем из пробирки возьмите 4 капли исследуемого вещества, которые внесите в 2 разные пробирки. В одну из них добавьте одну каплю 1%-ного раствора иода, а в другую – одну каплю 5%-ного раствора сульфата меди и 4 капли 10%-ного раствора гидроксида натрия, осторожно нагрейте до кипения (реакция Троммера). Аналогичную процедуру выполните с содержимым пробирки №2. Результат должен показать, что в присутствии воды гидролиза крахмала не происходит и реакция с иодом должна быть положительной, а реакция Троммера – отрицательной (гидрат окиси меди – голубой цвет), тогда как в присутствии амилазы слюны результаты должны быть противоположными, поскольку произошел гидролиз крахмала. Нет реакции с иодом и произошло окрашивание в кирпично-красный цвет (закись меди) в реакции Троммера. 3. Влияние рН среды на активность фермента. Для каждого фермента существует определенное значение реакции среды, при котором он проявляет наивысшую активность. Изменение рН вызывает снижение или полное торможение деятельности фермента. В 8 пробирок прилейте по 1 мл дистиллированной воды, а затем в пробирку № 1 внесите 1 мл 0,2%-ного раствора соляной кислоты, перемешайте, отберите из нее 1 мл смеси и перенесите в пробирку № 2. Перемешайте, отлейте 1 мл и перенесите в пробирку № 3 и т.д. из пробирки №8 отберите 1 мл и вылейте, таким образом получите различные рН среды. После этого в каждую пробирку добавьте по 2 мл 1%-ного раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны, разведенного 1:10. Пробирки встряхните и поставьте в термостат на 15 мин при 370С. Затем охладите и добавьте во все пробирки по 1 капле 1%-ного раствора иода. Полный гидролиз крахмала произойдет в пробирках №5 и №6, где рН среды раствора находится в пределах 6,8-7,2, т.е. оптимальных для действия амилазы. 2 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 3 Содержание отчета Лабораторная работа выполняется в рабочей тетради, которая является зачетным документом. Отчет по лабораторной работе оформите следующим образом: наименование работы; цель занятия; наименование опыта; материалы и оборудование; ход работы (отразить каждый этап работы, зарисовать и подписать); вывод по каждому проведенному опыту; вывод по лабораторной работе. 4 Контрольные вопросы 1. Дайте определение биогенным и органогенным элементам. Какое свойство является главным для биогенности? 2. Почему вода – основной неорганический компонент клеток? 3. Назовите основные органические вещества, из которых состоит клетка. Укажите их роль в жизнедеятельности клетки. 4. При окислении 1г белков и 1г углеводов выделяется одинаковое количество энергии (какое?). Почему энергетическая функция наименее характерна 5. для белков? 6. Опишите уровни организации белковой молекулы. Особое внимание уделите химическим связям, возникающим в молекуле в разных конфигурациях. 7. Когда возникает обратимая и необратимая денатурация белка? Свяжите 8. признак обратимости со структурой белковой молекулы. 9. Опишите основную роль углеводов, жиров, нуклеиновых кислот, которую они играют в клетке. 3
