ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ Гель-фильтрация (синоним гель-хроматография) — метод разделения смеси веществ с различными молекулярными массами путем фильтрации через различные так называемые ячеистые гели. Гель-фильтрация широко используется для определения величин молекулярных масс, обессоливания растворов нативных белков, концентрирования растворов полимеров. В медицине Гель-фильтрация применяют для диагностического разделения белков сыворотки крови, например при макроглобулинемии, гемоглобинопатиях, при ранней диагностике беременности, для получения очищенных препаратов ферментов. Гель-фильтрация проводят на хроматографических колонках, заполненных набухшим гранулированным гелем, например гелем сефадексов (коммерческое название полисахаридов декстранов, прошедших специальную химическую обработку, в результате которой между линейными структурами их молекул образуется множество поперечных связей, или «сшивок»), биогелем и т.п., элюируют (вымывают) разделяемые вещества разбавленными солевыми или буферными растворами. Эффективность Гель-фильтрация определяется размерами пор между гранулами геля и величиной ячеек каждой гранулы: мелкие молекулы вещества (значительно меньше ячейки геля) диффундируют внутрь гранулы и задерживаются при фильтрации через эти своеобразные молекулярные сита, а более крупные молекулы не могут попасть в ячейки и проходят в поры между гранулами. Метод прост в исполнении и проводится в мягких условиях, исключающих денатурацию биологически активных белков, что важно при работе, например, с ферментами. Гель-фильтрационная, или молекулярно-ситовая, хроматография. Принцип разделения в таких системах несколько иной, чем в предыдущих случаях. Неподвижной фазой являются материалы, обычно гели, со строго контролируемой пористостью, в результате чего одни компоненты смеси в соответствии с размером и формой молекул могут проникать между частицами геля, а другие не могут. Наиболее часто этот вид хроматографии используется для разделения высокомолекулярных соединений. Один из вариантов применения этого метода – определение молекулярных масс разделяемых веществ, часто необходимых для химических исследований (рис. 1). Рис. 1. Схема разделения методом гель-хроматографии: а – начало разделения, б – разделение, в – конец разделения; большие кружки – частицы геля, большие точки – молекулы соединений с большой молекулярной массой, маленькие точки – молекулы соединений с меньшей молекулярной массой Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которыми обладают многие пористые материалы. Наиболее часто для этой цели применяют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Разделение веществ с помощью гелей, основанное в различиях в размере молекул, называется гель-фильтрацией. В последнее время в качестве молекулярного сита стали применять пористые стеклянные гранулы, а сам метод разделения получил название хроматографии фильтрованием через стекло с заданным размером пор. Понятие проникающая хроматография включает в себя все виды разделения молекул, основанные на принципе молекулярного сита. Принцип, лежащий в основе метода проникающей хроматографии, весьма прост. Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем или пористыми стеклянными шариками и уравновешивают с помощью соответствующего растворителя. Крупные молекулы, не проникающие в поры сита, проходят между частицами геля, в то время как небольшие молекулы «застревают» в них и движутся с меньшей скоростью. Три стадии такого разделения схематически изображены на рис.2 Рис.2 МАТЕРИАЛЫ для проникающей хроматографии К материалам для проникающей хроматографии относятся гели, в том числе и декстрины с поперечными сшивками (торговое название сефадекс), агарозные гели (сефароза, биогель А, сагавак), полиакриламидный гель, полиакрилоилморфин (энзокрилгель) и полистиролы (Био-Бидз S). Применяют также пористые стеклянные шарики (гранулы), известные под названием биоглас, и пористый кварц – порастил. Декстрановые гели получают поперечным сшиванием полисахаридных цепочек декстрана эпихлоргидрином, благодаря чему растворимый в воде декстран становится водонерастворимым, сохраняя при этом свои гидрофильные свойства и способность к быстрому набуханию в водной среде. Варьируя число поперечных сшивок, удалось получить несколько различных типов сефадексов, различающихся степенью пористости частиц, что позволяет применять их для разделения веществ с различными размерами молекул. Поскольку поперечные связи между цепочками распределены произвольно, размеры пор одного и того же геля варьируют в весьма широких пределах. Это означает что молекулы, размер которых меньше некоторого критического, могут полностью или частично проникать внутрь частиц геля. Каждый тип сефадекса характеризуется так называемой «величиной поглощения воды», т.е. количеством воды, приходящейся на 1 г сухого сефадекса в полностью набухшем геле (табл.1) Таблица 1 Гели сефадекса нерастворимы и стабильны в воде, солевых растворах и органических растворителях, а также в щелочных и слабокислых растворах. В сильнокислых растворах может произойти гидролиз гликозидных связей матрицы геля. Во влажном состоянии сефадекс можно стерилизовать в автоклаве при температуре 100С в течение 40 мин; свойства геля при этом не меняются. Агарозные гели, приготавливаемые из агара, - это линейные полисахариды, состоящие из чередующихся остатков D-галактозы и 3,6ангидро-L-галактозы. Свойства гелей им придают водородные меж- и внутримолекулярные связи. Благодаря своей гидрофильной природе и почти полному отсутствию заряженных групп агарозные гели, подобно декстрановым, лишь в незначительной степени вызывают денатурацию и адсорбцию лабильных биохимических соединений. Агарозные гели, отличающиеся высокой степенью пористости, хорошо дополняют декстрановые. В отличие от последних, которые применяются для фракционирования сферических молекул, таких, как глобулярные белки мол. весом примерно 800 000 или произвольно свернутые полимеры (например, декстран с мол весом до 200 000), агарозные гели применяются для разделения молекул и частиц с молекулярным весом порядка нескольких миллионов дальтон. В связи с этим они широко используются при изучении вирусов, нуклеиновых кислот и полисахаридов. Агарозные гели можно комбинировать с любыми водными буферами; они не разрушаются в растворах с высокой концентрацией солей, например в 7 М мочевине, устойчивы в 95%-ном спирте и при pH от 4 до 10, а иногда и до 13. Диапазон рабочих температур – 0-30˚С, при более высоких температурах гель размягчается, а замораживание вызывает необратимые нарушения его структуры. Агарозные гели обычно представляют собой густые суспензии в дистиллированной воде, содержащей какое-либо бактериостатическое вещество, например азид натрия в концентрации 0,02%. Таблица 2 Полиакриламидные гели получают путем полимеризации акриламиды и метиленбисакриламида. Изменяя соотношение между этими двумя мономерами, удается получить гели с различной степенью пористости. По своим свойствам они очень близки к декстрановым и агарозным гелям – стабильны в водных буферах в интервале значений pH от1 до 10, практически нейтральны и обладают одинаковой способностью связывать воду. Они имеют предел молекулярной эксклюзии в диапазоне молекулярных весов 1800 – 400 000 дальтон. Вместо гелей в ряде случаев применяются пористые стеклянные шарики из боросиликатного стекла, пронизанные множеством соединяющихся между собой пор заданного диаметра; эти шарики имеют предел молекулярной эксклюзии от 3000 до 9000 000 дальтон и выполняют роль частиц обычного геля, однако обладают по сравнению с ними рядом преимуществ, а именно: а) химически инертны ко всем реагентам, за исключением фтористого водорода и сильных оснований; б) обладают исключительно четкими пределами эксклюзии и поэтому характеризуются большей разрешающей способностью и обеспечивают лучшее разделение; в) дают возможность значительно сократить время подготовки колонки, поскольку не нужно тратить время на их набухание; г) шарики не слипаются между собой, поэтому растворитель можно пропускать с большой скоростью; д) размер пор стеклянных шариков не зависит от растворителя и pH, поэтому можно использовать любые растворители и растворители любой ионной силы, что дает возможность применять их при градиентной элюции; е) стеклянные шарики легко промывать и стерилизовать. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ. Теоретические основы Способность молекул анализируемого соединения проникать в растворитель, поглощенный частицами набухшего геля, зависит от степени пористости частиц геля и от размера молекул соединения. Распределение вещества на колонке, заполненной набухшим гелем, зависит от общего объема растворителя внутри и снаружи частиц геля. Для данного вида геля распределение анализируемого вещества в растворителе внутри и снаружи частиц геля определяется коэффициентом распределения Кd, который зависит от размера молекул вещества. Если молекулы крупные, в растворителе внутри частиц геля их не будет совсем; величина Кd в этом случае равна 0. Если молекулы вещества достаточно малы и могут беспрепятственно проникать внутрь частиц геля, Кd будет равен 1. Поскольку размеры пор варьируют, молекулы среднего размера будут проникать в растворитель, находящийся в порах, лишь частично; следовательно величина Кd в этом случае будет лежать между 0 и 1. Это позволяет разделять на данном геле вещества, молекулярные веса которых различаются лишь весьма незначительно. Объем выхода (т.е. объем элюата, собранного с момента внесения вещества на колонку до момента выхода его с колонки) Ve определяется объемом растворителя между гранулами геля V0 (так называемым внешним объемом), коэффициентом распределения вещества и объемом растворителя внутри частиц геля Vi. Таким образом, Ve = V0 + Kd * Vi (1) Внутренний объем Vi можно рассчитать, исходя из известного сухого веса геля a и величины поглощения воды W: Vi = aW (2) Численное значение Ve для данного вещества варьирует в зависимости от размера колонки, в то время как коэффициент распределения Kd является величиной постоянной и от геометрии колонки не зависит. Если два вещества имеют различающиеся молекулярные веса и разные Kd (обозначим их через Kd’ и Kd’’), то разность объемов выхода Vs будет определяться следующим уравнением: Vs = Ve’ – Ve’’ = (V0 + Kd’’Vi) – (V0 + Kd’’Vi), (3) Vs = (Kd’ – Kd’’)Vi Таким образом, для полного разделения двух веществ необходимо, чтобы объем исследуемого образца не превышал Vs; от соотношения между объемом образца и внутренним объемом Vi зависит как точность разделения, так и степень разведения образца. Для расчета оптимального объема столбика пользуются уравнениями 1 и 2. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ. Указания к проведению метода. При гель-фильтрации, как и при других видах хроматографии, необходимо пользоваться эффективными колонками, особенно в тех случаях, когда разделяют вещества с близкими значениями Kd. Объем наносимого образца должен быть по возможности небольшим; необходимо следить, чтобы в ходе элюции не происходило чрезмерного разведения или перемешивания уже разделенных компонентов. На основании характеристик различных гелий, приведенных в таблицах, и исходя из литературных данных о значении Kd для каждого конкретного случая можно выбрать тот или иной тип геля. Если необходимым требованиям одновременно удовлетворяют несколько гелей, то целесообразно выбирать гель с наименьшей величиной поглощения воды, т.е. с наибольшим числом поперечных связей. Большинство гелей выпускают двух типов – грубый и тонкий; они различаются по размеру частиц (300-100 мкм и 80-20 мкм в сухом состоянии соответственно). Тонкие гели наиболее эффективны, поскольку уравновешивание колонки в этом случае наступает быстрее; однако скорость протекания растворителя через колонку с тонким гелем относительно низка. Многие гели выпускают также в виде бусинок, что дает возможность повысить скорость протекания растворителя; таким образом, бусинки представляют собой улучшенную модификацию более ранних типов порошкообразных гелей. Перед заполнением колонки гель должен полностью набухнуть. Для этого навеску геля выдерживают в воде или лучше в слабом солевом растворе. В результате электростатического притяжения отдельные частицы геля могут слипаться; в растворах электролитов этого не происходит. Все гели набухают довольно быстро, однако для достижения равновесия все же требуется какоето время. Это в первую очередь относится к гелям пористого типа: так например, сефадексы G-25 и G-50 набухают в течение 8-10 ч, сефадекс G-75 – в течение суток, а сефадекс G-100 – 2 сут; для набухания сефадекса G-200 требуется не менее 3 сут. Если не дать гелю предварительно набухнуть, то окончательное набухание произойдет после внесения его в колонку, что значительно снизит скорость протекания растворителя из-за слишком плотной набивки колонки. Время набухания можно сократить до нескольких часов, нагревая суспензию геля в кипящей водяной бане в течение 1 – 5 ч (продолжительность нагревания зависит от типа геля). Колонку заполняют набухшим гелем, а затем обычным способом наносят образец, компоненты которого при непрерывном добавлении элюирующего раствора проходят через колонку. Элюат, объем которого измеряется с момента внесения в колонку образца, собирают в виде фракций, каждую из которых затем анализируют. Внешний объем определяют как объем, в котором из колонки выходит высокомолекулярное вещество, совершенно не проникающее в частицы геля (например, голубой декстран – высокомолекулярный полисахарид). Определив объем выхода данного вещества, можно рассчитать его коэффициент распределения. После элюирования из колонки всех компонентов исследуемого вещества гель можно использовать для дальнейших экспериментов без дополнительной регенерации. ТОНКОСЛОЙНАЯ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ (ТГФ) Тонкослойная гель-фильтрация имеет ряд общих черт с ТСХ, но между ними имеется также и существенное различие. При ТГФ слой набухшего геля наносят на поверхность стеклянной пластинки. Гранулы геля прилипают к пластинке без добавления закрепляющих агентов, образуя неподвижную фазу; подвижной фазой является буферный раствор. В отличие от ТСХ, при ТГФ слой геля не должен подсыхать; следовательно, в ГТФ «фронт» растворителя отсутствует. Пластинку для ГТФ помещают в герметичную камеру и соединяют с обеих сторон с резервуарами при помощи «мостиков» из фильтровальной бумаги. Пластинку устанавливают под углом 20˚, что облегчает прохождение подвижной фазы через слой. Для уравновешивания требуется не менее 12 ч. Цель уравновешивания – установить правильное соотношение между объемами подвижной и неподвижной фаз. Пластинку можно располагать горизонтально, а резервуары с растворителем помещать на разной высоте, благодаря чему будет обеспечиваться ток растворителя. Пробу наносят в виде пятна или полосы, а затем в течение определенного времени проводят хроматографирование. В то время как ТСХ применяют в основном для разделения аминокислот, сахаров и олигосахаридов, алкалоидов, стероидов и липофильных соединений, ТГФ используется для анализа высокомолекулярных гидрофильных соединений – белков, пептидов, нуклеиновых кислот, требующих более тонкой процедуры разделения. Основным преимуществом ТГФ перед гель-фильтрацией на колонке является то, что она позволяет хроматографировать в одинаковых условиях одновременно несколько проб, а также разделять очень малые количества материала, что делает ее незаменимой в клинических лабораториях.
