Реакции АГ-АТ с использованием меченых АГ или АТ. Иммунный статус человека 1. Метки, применяемые в реакциях АГ-АТ Реакции с использованием меченых AT и Аг составляют основу методов экспрессдиагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и AT в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители-флюорохромы и изотопы. Метки: - радиоизотопы (изотопы иод131 и иод125 используют для мечения АТ, а изотопы фосфор32 и тритий – АГ) - ферменты (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза) - флюорохромы (флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), тетраметилромадинизотиоцианат (ТРИТЦ), которые излучают в зеленой части спектра, и фикоэритрин, который при возбуждении светом такой же длины волны дает красный свет), - металлы и металлопротеины Промежуточные связующие вещества: - биотин - дигоксин 2. Преимущества иммунологических реакций с метками Выделяют следующие виды иммунохимического анализа: Название метода Способ детектирования Радиоиммунный анализ (РИА) Радиоактивность Иммуноферментный анализ (ИФА) Ферментная активность Поляризационный флуороиммуноанализ (ПФИА) Интенсивность флуоресцентной поляризации Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА) Интенсивность люминесценции Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса; 2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания; 3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела – это белки класса иммуноглобулинов, которые вырабатываются в иммунной системе в результате проявления защитной функции (иммунитета) при попадании в организм чужеродного вещества – антигена. Достоинства метода: · Быстрота и простота определения; · Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях; · Не сложная пробоподготовка; · Высокая точность; · Не требуется дорогостоящей аппаратуры. Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы. 3. Варианты постановки РИФ и её учет Реакция иммунофлюоресценции — РИФ (метод Кунса) Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса служит методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Прямой метод РИФ основан на том, что препараты тканей или мазки микробов, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии, присоединившие меченые антитела люминесцирующей сыворотки, светятся в виде каймы зеленого цвета Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген–антитело с помощью антиглобулиновой (противантительной) сыворотки, меченной флюорохромом. 1. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. 2. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. 3. В результате образуется комплекс (микроб + антимикробные кроличьи антитела+антикроличьи антитела, меченные флюорохромом), обнаруживаемый с помощью люминесцентного микроскопа, как и при прямом методе 4. Сущность и недостатки РИА Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген–антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125I, 14С, 3 Н и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (E- или Jизлучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. При твердофазном варианте радиоиммунного анализа (РИА) один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода — конкурентный РИА: искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале. РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 10–12–10–15 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность. 5. Варианты постановки ИФА. Иммуноблотинг Иммуноферментный анализ (ИФА) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (антитела, меченные пероксидазой хрена, E-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Реакцию прерывают путем добавления кислоты для денатурации фермента. Твердофазный ИФА (прямой) — наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую (противочеловеческую) сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента. Конкурентный вариант ИФА (непрямрой): искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест — искомые антитела и меченые антитела конкурируют друг с другом за антигены. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 10– 10–10–12 г/л. Иммуноблотинг — метод идентификации Аг (или AT) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). Сочетание электрофореза или РИА или ИФА На практике применяют для идентификации Аг ВИЧ. Антигены разделяют по молекулярной массе с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем осуществляют блоттинг (от англ. blot — пятно), т.е. перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную мембрану, и проявляют невидимые «блоты» антигенов с помощью антител, меченных ферментами (ИФА). 6. Метод проточно-лазерной цитофлуометрии и его применение в иммунологии - это метод, основанный на измерении светорассеивания и специфической флуоресценции клеток (частиц) при освещении их лазером (ртутной лампой). Светорассеивание определяется размерами клеток, наличием гранул и других внутриклеточных органелл. Специфическая флуоресценция обусловлена окраской клеток моноклональными антителами против CD-антигенов, меченных флуорохромами. При измерении указанных свойств происходит анализ и распределение клеток по соответствующим признакам.Важнейшие области применения цитофлуориметрии: онкогематология (определение происхождения и степени диффе-ренцировки опухолей крови); трансплантация (аутотрансплантация) красного костного мозга и стволовых клеток; клиническая иммунология (морфофункциональный анализ состояния иммунокомпетентных клеток (ИКК) организма человека; научные исследования; 7. Иммунный статус организма и факторы, влияющие на него Иммунный статус — состояние иммунной системы человека, оцениваемое системой качественных и количественных клинико-лабораторных показателей. На иммунный статус оказывают влияние следующие факторы: • климато-географические; • социальные; • экологические (физические, химические и биологические); • «медицинские» (влияние лекарственных веществ, оперативные вмешательства, стресс и т. д.). 8. Оценка иммунного статуса организма: тесты 1-го и 2-го уровня Иммунологические тесты проводятся в целях диагностики иммунопатологии для своевременной ее терапии, а также для мониторинга состояния иммунной системы. Тесты, которые входят в оценку иммунного статуса, принято делить на тесты первого и второго уровня. В тесты первого уровня входят ориентировочные тесты, которые не требуют какихлибо усилий и дорогостоящих реактивов. С помощью тестов первого уровня можно выявить грубые нарушения в звеньях иммунной системы. К тестам первого уровня относятся: определение абсолютного и относительного количества лейкоцитов, Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, концентрации иммуноглобулинов, определение фагоцитарной активности лейкоцитов и др. Для постановки конкретного диагноза используются тесты второго уровня: очень трудоемкие, дорогостоящие, но дающие конкретный результат. Можно привести следующие примеры тестов, которые используются на этом уровне: определение субпопуляционного состава крови (определение TH1, TH2, TReg и др.), определение маркеров пролиферации и активации Т- и В-лимфоцитов (CD25 и др.), изучение апоптоза клеток, оценка выработки эффекторных молекул (цитокинов и др.) и иммуноглобулинов (IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE), определение экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета (TLR, NLR, RLR и др.), изучение процессов фагоцитоза и активации комплемента и др.
