ФЛУОРИМЕТРИЯ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ Выполнила: студентка 5 курса, 2 группы фармацевтического факультета Тришина Л.И. Проверил: ассистент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Транова Ю.С. ФЛУО РИМЕТ Р ИЯ (ИЛИ ФЛУО РЕ СЦЕ Н Т НА Я СПЕКТРОФОТОМ ЕТ РИ Я ) ЯВЛЯЕТСЯ МЕТОДОМ АНАЛИЗА, ОСНОВАН НЫ М НА ИЗМЕРЕНИИ ФЛУОРЕСЦЕ Н ЦИИ. ФЛ УОРЕСЦ ЕНЦ И Я – ИСПУСКАНИЕ СВЕТА ХИМИЧЕСКИМ ВЕЩЕСТВОМ, НАХОДЯЩ ИМС Я В ВО ЗБУЖДЁН НО М СО СТО ЯНИИ, ПРИ ПЕРЕХОДЕ В О СНО ВНО Е СО СТО ЯНИЕ. ПРИНЦИП ЯВЛЕНИЯ И ЕГО СУЩНОСТЬ ПРИНЦИ П ЯВЛЕНИЯ ФЛУОРЕС Ц ЕН Ц И И ЗАКЛЮЧАЕТС Я В СПОСОБН О СТ И ЭЛЕКТРОН О В П Е Р Е Х ОД И Т Ь М Е Ж Д У Э Н Е Р Г Е Т И Ч Е С К И М И У Р О В Н Я М И П ОД В О З Д Е Й С Т В И Е М В О З Б У Ж Д А Ю Щ Е Г О И З Л У Ч Е Н И Я , Т. Е . П Р О И С Х О Д И Т З А С Ч Ё Т П О ГЛ О Щ Е Н И Я И М И С В Е Т О В О Й Э Н Е Р Г И И П Р И О Б Л У Ч Е Н И И УЛ ЬТ РАФ И О Л Е Т О В Ы М , В И Д И М Ы М И Л И И Н Ы М Э Л Е К Т Р О М А Г Н И Т Н Ы М И З Л У Ч Е Н И Е М . П О С КО Л Ь К У П О Л ОЖ Е Н И Е Э Л Е К Т Р О Н А Н А О П Р Е Д Е Л Е Н Н О М Э Н Е Р Г Е Т И Ч Е С К О М У Р О В Н Е В АТ О М Е – РА В Н О В Е С Н О Е С О С Т О Я Н И Е , П Е Р Е В ОД И Л И В О З Б У Ж Д Е Н И Е Э Л Е К Т Р О Н А П Р И В ОД И Т К Н Е С ТА Б И Л Ь Н О С Т И С И С Т Е М Ы . Э ТА Н Е С ТА Б И Л Ь Н О С Т Ь П Р О Х ОД И Т С О В Р Е М Е Н Е М – В О З Б У Ж Д Е Н Н Ы Й Э Л Е К Т Р О Н В О З В РА Щ А Е Т С Я В С В О Е Н О Р М А Л Ь Н О Е С О С Т О Я Н И Е . РА З Н И Ц А Э Н Е Р Г И И М Е Ж Д У В О З Б У Ж Д Ё Н Н Ы М И О С Н О В Н Ы М С О С Т О Я Н И Я М И Э Л Е К Т Р О Н А Н Е М ОЖ Е Т И С Ч Е З АТ Ь Б Е С С Л Е Д Н О В С В Я З И С З А КО Н О М С О Х РА Н Е Н И Я Э Н Е Р Г И И , П О Э Т О М У О Н А РА С Х ОД У Е Т С Я Н А П Р О Ц Е С С Р Е Л А КС А Ц И И . ТА Ч А С Т Ь Э Н Е Р Г И И , КО Т О РА Я Н Е Б Ы Л А Н А Н Е Г О З АТ РАЧ Е Н А , И С П У С К А Е Т С Я В В И Д Е Ф О Т О Н А С С О О Т В Е Т С Т В У Ю Щ Е Й Э Н Е Р Г И Е Й . И С П У С К А Н И Е ТА КО Г О Ф О Т О Н А – О С Н О В Н О Й М Е Х А Н И З М ФЛУОРЕС Ц ЕН Ц И И . • Энергетическая схема многоатомной молекулы: • 1 – поглощение; • 2 – флуоресценция; • 3 – фосфоресценция; • 4 – внутренняя конверсия; • 5 – синглет-триплетная конверсия; • 6 – Т1 – S0 – конверсия; • 7 – колебательная релаксация; • 8 – синглет-синглетное и триплет-триплетное перепоглощение ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ ФОСФОРЕСЦЕНЦИЯ • ~10-8 c • >10-6с • При флуоресценции молекула переходит в основное состояние из короткоживущего возбужденного состояния. Она наблюдается сразу же после поглощения света, быстро спадает и исчезает в результате столкновений излучающей молекулы с другими молекулами в растворе (тушение флуоресценции). • Фосфоресценция наблюдается при переходе молекулы в основное состояние из относительно долгоживущего возбужденного состояния, так что между поглощением и испусканием света может пройти относительно много времени. • Это излучательный переход между двумя состояниями идентичной мультиплетности (в основном S1→S0) • Характерны большая длина волны излучения и меньшая интенсивность. • Это излучательный переход между двумя состояниями различной мультиплетности (например, T1→S0). О С Н О В НЫ Е З А КО НЫ , О ПР Е Д Е ЛЯ Ю ЩИ Е П Р И Н Ц И П Ы Л Ю М И Н Е С Ц Е Н Т Н Ы Х И С С ЛЕ Д О ВА Н И Й : Закон Стокса длина волны фотолюминесценции не меньше длины волны возбуждающего света. Правило Стокса означает, что молекула излучает не всю поглощенную энергию, часть поглощенной энергии тратится на внутримолекулярные преобразования. Правило Коши Спектр люминесценции не зависит от спектра и энергии возбуждения. Правило Левшина Спектры флуоресценции и поглощения зеркально симметричны. Закон Вавилова Квантовый выход фотолюминесценции не зависит от энергии возбуждающих люминесценцию квантов и определяется только веществом Следствие закона Вавилова - Спектр возбуждения фотолюминесценции совпадает со спектром собственного поглощения люминесцирующего вещества. Д Л Я ПР О В Е Д Е Н И Я ФЛ У О Р И М Е Т Р И Ч Е С КО Г О А Н А Л И З А И С ПОЛ Ь З У ЮТ ПР И БО Р Ы ДВУХ ТИПОВ: Ф И Л ЬТ РА Ц И О Н Н Ы Й ФЛ У О Р И М Е Т Р И С ПЕ К Т Р О ФЛ У О Р И М Е Т Р • Фильтрационный флуориметр Принципиальное устройство этого прибора включает в себя: 1. Источник излучения. Чаще всего для флуориметров возбуждающим излучателем выступает лазер, реже – ксеноновая газоразрядная или ртутная лампа, либо светодиоды и светодиодные матрицы. 2. Первичный фильтр длины волн. Этот компонент устраняет ультрафиолет, не позволяет превысить требуемую интенсивность возбуждающего излучения. 3. Вторичный фильтр. Пропускает флуоресценцию в нужные исследователю области длины волн. Блокирует рассеянный пробой возбуждающий пучок. 4. Детектор. Включает в себя фотоумножители для преображения светового сигнала в электрический. • Спектрофлуориметр • Отличается от фильтрующего в основном конструкцией светофильтров. Вместо спектральных фильтров в такие приборы устанавливаются различные монохроматоры: призмы или дифракционные решетки. • Параметры дифракционной решётки (ширина щелей или величина ячеек решётки) оказывают непосредственное влияние на точность, чувствительность и разрешение анализа. • Чаще всего решётки с меньшими ячейками показывают более высокую разрешающую способность и точность, но при этом заметно менее чувствительны к прохождению излучения через меньшие зазоры. • В остальном конструкция спектрофлуориметра не отличается от фильтрующего флуориметра. ИЗМЕР Е Н И Е ФЛУО РЕСЦЕН Ц И И • Интенсивность флуоресценции измеряется в условных единицах, пропорциональных отклику детектора и обозначается символом I. • Спектр испускания флуоресценции представляет собой зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны (в нм) или частоты (в см-1) при заданной длине волны возбуждения. • Спектр возбуждения флуоресценции представляет собой зависимость интенсивности излучения в максимуме испускания флуорофора от длины волны или частоты возбуждающего света. При этом спектр возбуждения обычно совпадает со спектром поглощения, также, как и интенсивность флуоресценции пропорциональна светопоглощению. • Флуоресценцию определяют в растворах с концентрацией от 10-5 М и менее, в диапазоне, для которого наблюдается прямая зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации. • В случае линейной зависимости интенсивности испускаемого света от концентрации вещества рассчитывают последнюю в испытуемом растворе (C) по формуле: • При более высоких концентрациях всё более значительная часть поступающего света абсорбируется образцом вблизи поверхности кюветы, и линейная зависимость величины сигнала от концентрации определяемого вещества нарушается. • где C0 – концентрация вещества в стандартном растворе; • I – интенсивность света, испускаемого испытуемым раствором; • I0 – интенсивность света, испускаемого стандартным раствором. • Если интенсивность флуоресценции не прямо пропорциональна концентрации раствора, измерение может быть произведено с использованием калибровочной кривой. В Н Е Ш Н И Е Ф А К Т О Р Ы , В Л И Я Ю Щ И Е Н А И Н Т Е Н СИ В Н О СТ Ь ФЛ У О Р Е СЦ Е Н Ц И И Температура Эффективность флуоресценции обратно пропорциональна температуре. Для некоторых веществ эффективность флуоресценции может снижаться на 1 – 2 % при повышении температуры на 1 оС. В таких случаях требуется термостатирование образцов. Растворитель Многие соединения, флуоресцирующие в органических растворителях, фактически не флуоресцируют в воде. Величина рН испытуемого раствора На интенсивность флуоресценции существенное влияние оказывает кислотность раствора. При этом изменяется и форма спектра. Характер зависимости от рН индивидуален для каждого исследуемого вещества. Поэтому рекомендуется аналитические определения проводить в буферных средах. Присутствие в растворе посторонних частиц Перед измерением флуоресценции из испытуемого раствора фильтрованием или центрифугированием должны быть удалены твёрдые частицы, так как они могут поглощать некоторую долю возбуждающей энергии, дезактивировать возбужденные молекулы или завышать измеряемую величину из-за многократных отражений в кювете с образцом. Концентрации кислорода в испытуемом растворе Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна концентрации кислорода, являющегося сильным гасителем флуоресценции. По степени тушения флуоресценции можно определять концентрацию кислорода в окружающей среде. Для удаления кислорода через испытуемый образец пропускают азот или гелий. Постороннее освещение Большинство флуоресцирующих веществ чувствительно к свету. Во время облучения во флуориметре они могут подвергаться фоторазложению с образованием других флуоресцирующих продуктов. Такие эффекты обнаруживаются при наблюдении за откликом детектора во времени и могут быть снижены путём приглушения света с помощью светофильтров или экранов. ПРИМЕНЕ Н И Е ФЛУОРИМЕ ТР И И В ФАРМАЦЕВТИЧ ЕСКО М АНАЛИЗ Е 1. Идентификация • Спектры флуоресценции специфичны для определяемых веществ. Поэтому флуоресценция может быть применена для их идентификации. • Из фармацевтических субстанций определению методом флуориметрии подлежат: аминокислоты (фенилаланин, триптофан, тирозин), алкалоиды (стрихнин, резерпин, хинин), витамины (фолиевая кислота, рибофлавин, ретинола ацетат), стероидные гормоны (этинилэстрадиол). • В основе флуорометрического метода анализа витамина В1 лежит реакция окисления в щелочной среде тиамина до тиохрома, который в УФ-свете имеет характерную синюю флуоресценцию. В качестве специфического окислителя применяют гексацианоферрат (III) калия. • Фолиевая кислота после окисления раствором перманганата калия образует 1-птеридин6карбоновую кислоту, флуоресцирующую голубым цветом (в очень кислой или щелочной среде флуоресценция исчезает) Обнаружение хинина гидрохлорида по флуоресценции Растворы хинина, подкисленные серной кислотой, имеют голубую флуоресценцию. Флуоресценция хинина как двухосновного основания зависит от рН среды: - в кислой среде хинин имеет голубую флуоресценцию - щелочной среде (рН~9) хинин имеет фиолетовую флуоресценцию - продукты окисления хинина имеют желтозеленую флуоресценцию 2. Количественный анализ • При количественных определениях интенсивность флуоресценции раствора испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции раствора стандартного образца флуоресцирующего вещества известной концентрации, измеренной в идентичных условиях на одном и том же приборе. Рибофлавин Растворяют 1 мг субстанции в 100 мл воды. В проходящем свете раствор должен иметь бледно-зеленовато-жёлтый цвет, в отражённом свете - интенсивную желтовато-зелёную флуоресценцию, которая должна исчезать при добавлении минеральных кислот или щелочей. К ЛАССИФИК АЦ И Я ФЛУО Р ЕСЦЕН Т Н ЫХ О РГАНИЧ ЕСК ИХ СО ЕДИН Е Н И Й Эндогенные флуорофоры • В их состав входят ароматические аминокислоты: фенилаланин, тирозин и триптофан. • Эти три молекулы возбуждаются в УФ-диапазоне. Наиболее выраженными люминесцентными свойствами обладает триптофан. Цианиновые красители. • Многочисленные цианины и связанные полиметиновые структуры могут использоваться в качестве метки для белков и ДНК. Но наиболее распространённое применение флуорофоры имеют в научных исследованиях. Флуоресцеин • Раствор флуоресцеина хорошо светится в ультрафиолетовых лучах и обладает жёлто-зелёной люминесценцией. Спектральные характеристики флуоресцеина имеют максимум поглощения при 490 нм и эмиссию в 514 нм, что делает его отличным средством для визуализации процессов в организме. Родамины • Родамины - это семейство флуороновых красителей, широко используемых в качестве флуорофоров. • Другими представителями этого класса являются: родамин 6в и родамин В. В возбуждённом состоянии их длина волны находится в жёлто-красной области спектра. Они проникают в клетки легче, чем производные флуоресцеина. • Находят своё применение родамины во флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и иммуноферментном анализе. Флуоресцентные белки • Флуоресцентные белки (ФБ) являются наиболее распространёнными флуоресцентными метками в молекулярной и клеточной биологии. • Органические красители, класс ФБ наделены способностью к формированию хромофоров - групп атомов, обуславливающего цвет химического соединения. Хромофор формируется из аминокислотных остатков, это делает возможным поглощение и испускание видимого света. • Первым представителем этого класса является ЗФБ - зелёный флуоресцентный белок с очень яркой флуоресценцией. Его спектры возбуждения лежат в пределах 395 и 475 нм, а максимум флуоресценции составляет 508 нм. Белок совершенно не токсичен и устойчив к фотообесцвечиванию, что позволяет проводить длительные исследования клеточной динамики. • Излучения полученных на сегодняшний день флуоресцентных белков покрывают почти весь видимый диапазон, начиная от голубого и расширяясь в ближний инфракрасный. ЗАКЛЮЧЕНИЕ • Таким образом, на основе всего вышеизложенного материала, можно сделать вывод о том, что флуориметрия является чувствительным и высокоселективным методом анализа. Плюсы: высокая точность; сравнительная простота пробоподготовки (при условии наличия подходящего оборудования); возможность контроля биохимических и биологических процессов. Наибольшее применение флуориметрия находит в качестве: o вспомогательного метода (для других спектрофотометрических видов анализа); o метода контроля процессов, носящих биохимическую природу. • При этом он имеет ряд недостатков, которые нивелируются современным оборудованием, но могут помешать проводить исследования с необходимой точностью. Минусы метода: заметная зависимость от условий окружающей среды; строгие требования к исследуемой пробе; невозможность определения некоторых веществ, не способных к флуоресценции.
