Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кировский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Федоровская Надежда Станиславовна ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В СЕЛЕЗЕНКЕ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ЦИТОПЕНИЯХ ИММУННОГО ГЕНЕЗА (ИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ И АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ) 14.03.02 – Патологическая анатомия 03.03.04 – Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Петров Семен Венедиктович доктор медицинских наук, профессор Железнов Лев Михайлович Киров – 2020 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1 ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В СЕЛЕЗЕНКЕ В НОРМЕ И ПРИ ЦИТОПЕНИЯХ ИММУННОГО ГЕНЕЗА (ПЕРВИЧНОЙ ИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ И АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ) (обзор литературы) ........................................................................................................ 20 1.1 Современные представления о селезенке как вторичном органе лимфоидной системы ................................................................................................. 20 1.2 Морфофункциональная характеристика селезенки при первичной иммунной тромбоцитопении .................................................................................... 40 1.3 Морфофункциональная характеристика селезенки при апластической анемии ......................................................................................................................... 57 1.4 Общая оценка данных литературы ..................................................................... 67 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ......................................... 70 2.1 Материал исследования ....................................................................................... 70 2.2 Методы исследования .......................................................................................... 75 2.3 Статистическая обработка полученных результатов ....................................... 81 ГЛАВА 3 МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЕЛЕЗЕНКИ ЧЕЛОВЕКА .................................................................................................................... 83 3.1 Особенности гистоархитектоники белой и красной пульпы ........................... 83 3.2 Особенности морфологической структуры селезенки с учетом этапов иммунного ответа ....................................................................................................... 86 3.3 Особенности клеточного состава селезенки ..................................................... 90 ГЛАВА 4 ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ ИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ ................................... 101 4.1 Оценка гистоархитектоники селезенки при иммунной тромбоцитопении в зависимости от формы заболевания .................................................................... 101 4.2 Оценка гистоархитектоники белой пульпы селезенки и ее структурных составляющих при иммунной тромбоцитопении в зависимости от ответа на спленэктомию ...................................................................................................... 108 4.3 Особенности гистоархитектоники красной пульпы селезенки при иммунной тромбоцитопении в зависимости от ответа на спленэктомию ......... 111 4.4 Содержание популяций иммунокомпетентных клеток в селезенке при иммунной тромбоцитопении ........................................................................... 112 ГЛАВА 5 ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ ........................................................................ 130 3 5.1 Оценка гистоархитектоники белой пульпы селезенки и ее структурных составляющих при апластической анемии в зависимости от тяжести заболевания, сроков выполнения спленэктомии .................................................. 130 5.2 Особенности гистоархитектоники красной пульпы при апластической анемии ....................................................................................................................... 135 5.3 Характеристика клеточного состава селезенки у больных апластической анемией...................................................................................................................... 139 ГЛАВА 6 ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИМММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В СЕЛЕЗЕНКЕ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ЦИТОПЕНИЯХ ИММУННОГО ГЕНЕЗА (ИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ И АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ) Обсуждение полученных результатов .......... 156 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 182 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 184 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................... 188 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .............................. 189 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 191 ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное) Патенты на изобретение ..................................... 231 ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочное) Показатели массы функциональных зон селезенки в группе сравнения в зависимости от этапов иммунного ответа ......... 238 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. В настоящее время строение и функции селезенки человека широко отражены в работах отечественных и зарубежных авторов [15; 30; 109; 153; 176; 246; 247; 249; 270; 317; 318; 321; 329]. Однако имеются лишь единичные исследования, посвященные морфометрии гистоархитектоники функциональных зон селезенки, иммуноморфологических взаимоотношений иммунокомпетентных клеток (ИКК) в зависимости от активности иммунных процессов в норме и при патологических состояниях. Известные результаты измерений структурных составляющих белой пульпы (БП) и красной пульпы (КП) в норме чаще всего разрозненны и не представляют систематизированного обоснованного материала для возможного использования при анализе реактивных изменений, отражающих динамику иммунных процессов [15; 30; 45; 88]. Объяснение этому, по-видимому, кроется в недостаточной разработке методологии морфометрии органа, имеющего в своей структуре зоны с разным строением и функциями, включающими субпопуляции клеточных элементов, отличающихся по иммунофенотипу, что предопределяет специфические межклеточные взаимодействия. При этом для осуществления своих функций клетки в селезенке активно перемещаются в определенных направлениях [183; 246]. Селезенка, являясь многофункциональным органом, имеет разные точки приложения воздействия на кроветворение. Спленэктомия как хирургический метод лечения иммунных цитопений применяется в комплексе с иммуносупрессивной терапией. Наиболее часто эта операция выполняется при иммунной тромбоцитопении (ИТП), реже при апластической анемии (АА) [1; 25; 32; 54; 80; 103; 149; 156; 179; 189; 219; 211; 230; 263; 341]. У больных ИТП спленэктомия дает самый высокий уровень долгосрочного ответа (от 50 до 70% случаев) по сравнению с другими методами лечения [156; 186; 189; 211; 165]. Однако рецидивы наступают в 23% случаев, причем у 80% пациентов в течение 48 месяцев после операции [330]. Причины возникновения 5 резистентных к хирургическому лечению форм заболевания неизвестны. До сих пор нет четкого представления о том, в каком звене иммунного ответа (в В- или Тклеточном) происходит нарушение, приводящее к рефрактерному течению болезни. Необходимость знания иммуноморфологической характеристики структуры селезенки при иммунной тромбоцитопении очевидна для уточнения механизмов возникновения резистентных к терапии форм данной патологии. Апластическая анемия – заболевание системы крови, характеризующееся панцитопенией, обусловленной аплазией костного мозга, связанной с нарушением иммунных механизмов регуляции кроветворения, количественным дефицитом и функциональными дефектами стволовых кроветворных клеток [1; 2; 33; 42; 75; 171; 172; 193]. Иммунные механизмы развития этого патологического процесса включают в себя воздействие активированных Т-лимфоцитов на стволовые гемопоэтические клетки, в результате чего происходит нарушение их пролиферации и дифференцировки [33; 81; 83; 84; 85; 86; 92; 98; 143; 154; 212; 236; 237; 299]. Вопрос о значении удаления селезенки в лечении апластической анемии в литературе обсуждается давно, и мнения авторов противоречивы. Известно, что спленэктомия у этих пациентов рассматривается как альтернативный антилимфоцитарному глобулину метод терапии. Эффективность хирургического вмешательства при апластической анемии объясняется удалением большой массы активированных лимфоцитов, ответственных за выработку негативных регуляторов гемопоэза [54; 55; 103; 282]. Имеются лишь единичные работы, посвященные описанию строения селезенки при апластической анемии [1; 44; 80; 106]. Выявленные гистологические признаки изменения структуры этого лимфоидного органа не отражают в полной мере характера вовлечения селезенки в патологический процесс. Участие селезенки в патогенезе апластической анемии не может не сопровождаться развитием морфологических изменений как в белой, так и в красной пульпе органа, отражающихся на клеточном составе функциональных зон, а также на состоянии стромы. Изучение этих вопросов является чрезвычайно важным для понимания сущности реактивных процессов, происходящих в селезенке. 6 Проведенное исследование, позволившее сформировать иммуноморфологические закономерности течения процессов в селезенке при иммунных цитопениях, обосновывает новую методологию изучения данного вторичного лимфоидного органа. Исследования выполнены в рамках научных тем, проводившихся на базе ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России», № госрегистрации 01201150075 (с 2011 по 2013 г.) «Иммуноморфологическая характеристика структуры селезенки при цитопениях иммунного генеза» и № госрегистрации 01201451643 иммуноморфологических (с критериев 2014 по прогноза г.) «Разработка течения иммунной 2015 тромбоцитопении после спленэктомии». Степень разработанности темы исследования. В основу настоящего исследования легли труды отечественных и зарубежных авторов, посвященные морфологическому изучению структуры селезенки в норме и при цитопениях иммунного генеза: К.М. Абдулкадырова, С.С. Бессмельцева (1995, 2015), Ю.В. Анохиной (1969), И. Барта (1976), Н.А. Жариковой (1979), Т.П. Макалиша (2013), А.А. Молдавской (2007, 2009), И.Е. Павловой (2007), В.Д. Реука (1970), Е.Л. Семикиной (1970), Т.С. Смирновой, О.Д. Ягмурова (1993), О.Д. Ягмурова (2000), С.В. Чулковой (2014), В.П. Волкова (2015), S. Audia (2011, 2014, 2017), H. Barnard (1990), M.F. Cesta (2006), C. Daridon (2012), E.R. Eichner (1979), M.M. Hayes (1985), G. Kraal (1992, 2006), R.E. Mebius (2005), M.A. Nolte (2003,2004, 2017), B. Steiniger (2005, 2014, 2015), G. Tarantino (2011), M. Tavassoli (1975), P.G. Vasco (2010), L. Weiss (1974) и др. Большинство исследований селезенки направлены преимущественно на изучение процессов клеточных взаимодействий, миграционных свойств иммунокомпетентных клеток, цитокинового профиля иммунных реакций. В доступной литературе практически отсутствуют работы, посвященные характеристике иммуноморфологических процессов в селезенке в зависимости от этапов иммунного ответа. До настоящего времени не разработана методология морфометрических исследований селезенки, в связи, с чем имеющиеся данные о размерах структурных составляющих пульпы 7 и количественном составе иммунокомпетентных клеток в компартментах органа малочисленны и носят, как правило, разрозненный характер. С целью изучения патогенетических механизмов при цитопениях иммунного генеза (иммунной тромбоцитопении и апластической анемии) выполнено большое количество исследований. Между тем, до сих пор не установлены причины тромбоцитопении проведения изучения после возникновения спленэктомии. углубленного размеров рефрактерных Это морфометрического компартментов убеждает и форм в иммунной необходимости иммуногистохимического селезенки, распределения иммунокомпетентных клеток в органе в зависимости от формы болезни и ответа на хирургическое лечение. Спленэктомия входит в программную терапию апластической анемии. Вместе с тем, данная тактика лечения депрессии кроветворения в настоящее время используется в клинической практике крайне редко. В связи с этим, публикации, посвященные изучению размеров структурных составляющих селезенки и содержанию клеточного состава этого органа в зависимости от степени тяжести апластической анемии и сроков выполнения спленэктомии, практически отсутствуют. Выявленные закономерности иммуноморфологических процессов в селезенке позволяют методологически по-новому с помощью современных иммуногистохимических и морфометрических технологий охарактеризовать изменения структуры этого сложного органа и обосновывают способы прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении и апластической анемии после спленэктомии, что является актуальным и имеет важное фундаментальное и практическое значение. Цель исследования: выявление закономерностей иммуноморфологических процессов в селезенке человека в норме и при цитопениях иммунного генеза (ИТП и АА). Задачи исследования: 1. Описать морфометрические особенности белой и красной пульпы 8 селезенки человека в норме, охарактеризовать их клеточный состав (распределение В- и Т-лимфоидных элементов, мононуклеарных фагоцитов и др.) в зависимости от этапов иммунного ответа. 2. Обосновать методологию морфометрического исследования селезенки с оценкой показателей в абсолютных единицах при использовании параметров величины массы органа. 3. Изучить изменения функциональных зон селезенки в зависимости от формы заболевания и ответа на спленэктомию при иммунной тромбоцитопении; определить содержание клеточного состава в пульпе органа у пациентов с рефрактерными формами болезни. 4. Выявить характерные черты белой и красной пульпы селезенки, проанализировать содержание и распределение В- и Т-клеток, мононуклеарных фагоцитов и других клеточных форм в зависимости от тяжести болезни и длительности патологического процесса до спленэктомии при апластической анемии. 5. Обосновать закономерности развития иммуноморфологических процессов в селезенке в норме и при цитопениях иммунного генеза (иммунной тромбоцитопении, апластической анемии). 6. Выявить наиболее информативные морфологические критерии прогноза течения иммунных цитопений (иммунной тромбоцитопении и апластической анемии). Научная новизна. Впервые с помощью иммуногистохимических и морфометрических методов установлены закономерности течения иммуноморфологических процессов в селезенке человека в норме и при цитопениях иммунного генеза (иммунной тромбоцитопении и апластической анемии). Впервые охарактеризована селезенка на различных этапах иммунного ответа. Показано, что реактивные изменения, происходящие в селезенке, зависят от миграционных свойств иммунокомпетентных клеток в компартментах органа в сопоставлении с функциями данных клеток. Впервые доказано, что перераспределение клеточных элементов в процессе 9 иммунного ответа в пульпе селезенки влияет на размеры и массу ее компартментов. Установлено, что морфометрическое исследование селезенки с использованием параметров величины массы органа позволяет проводить оценку показателей в абсолютных единицах. Впервые проведена оценка особенностей структурных составляющих пульпы селезенки в зависимости от формы течения иммунной тромбоцитопении и ответа на хирургическое лечение. Установлено, что у больных иммунной тромбоцитопенией, ответивших на спленэктомию, увеличение размеров белой пульпы дает возможность охарактеризовать морфологию селезенки, как соответствующее I–II этапу иммунного ответа, а значимое увеличение размеров белой пульпы, а также расширение красной пульпы в группе с рефрактерным течением заболевания и у пациентов с персистирующей формой позволяет расценить состояние селезенки, как II–III этап иммунного ответа, что свидетельствует о более продолжительном или агрессивном течении болезни. Впервые проведено углубленное морфометрическое и иммуногистохимическое изучение распределения клеточных популяций в селезенке у больных с рефрактерным течением заболевания. Установлено, что изменения содержания клеточного состава в селезенке больных иммунной тромбоцитопенией характеризуются увеличением относительного и абсолютного количества иммунокомпетентных клеток: В- и Т-лимфоцитов в белой и красной пульпе, макрофагов, дендритных клеток, что подтверждает участие данных клеточных популяций в патогенезе заболевания. Впервые определены морфологические характеристики размеров пульпы селезенки и ее компонентов у больных с различной тяжестью апластической анемии и длительностью патологического процесса до спленэктомии. Впервые установлено, что содержание иммунокомпетентных клеток в селезенке пациентов с апластической анемией отражает патогенетические проявления активного иммунного процесса, присущего самому заболеванию, а также влияние проводимой до спленэктомии иммуносупрессивной терапии. Состав иммунокомпетентных клеток селезенки пациентов с нетяжелой апластической 10 анемией характеризуется снижением абсолютного содержания В-клеток (CD20) и Т-лимфоцитов (CD3; CD4) в белой пульпе, увеличением количества Влимфоцитов (CD20), Т-клеток (CD3; CD8) в красной пульпе, а также снижением величины субпопуляции (CD4) в красной пульпе. Данное состояние селезенки соответствует III этапу иммунного ответа. Особенности состава иммунокомпетентных клеток селезенки при тяжелой апластической анемии отличаются выраженным уменьшением массы Т-клеток (CD3) в белой пульпе; увеличением абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов (CD20), цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, макрофагов (CD68), а также снижением значений CD4+ Т-клеток в красной пульпе. Состояние селезенки позволяет расценить как II–III этап иммунного ответа. Впервые дана характеристика селезенки при апластической анемии в зависимости от длительности течения заболевания до спленэктомии. При раннем проведении спленэктомии – до двух месяцев от начала терапии апластической анемии, клеточный состав селезенки характеризовался увеличением содержания В-клеток, Т-клеток (CD3, CD8) в красной пульпе при снижении количества Тклеток (CD3) в белой пульпе (II-III этап иммунного ответа). При спленэктомии, проведенной позднее двух месяцев от начала лечения, изменения выражались в уменьшении содержания В-лимфоцитов (CD20), Т-клеток (CD3) в белой пульпе, снижении количества CD4-экспрессирующих Т-клеток в красной пульпе, а также в увеличении абсолютных и относительных значений CD8+-цитотоксических Тлимфоцитов в красной пульпе органа, что соответствует III этапу иммунного ответа. Впервые выявлены иммуноморфологические критерии прогноза течения иммунной тромбоцитопении и апластической анемии на основании морфометрических исследований селезенки при этих заболеваниях. На основании проведенного исследования с комплексным определением характерных иммуноморфологических признаков активности иммунных процессов в селезенке при цитопениях иммунного генеза с использованием полученных критериев прогноза сформулирована теоретическая концепция о 11 закономерной смене этапов иммунного ответа, обосновывающих тяжесть заболевания и эффективность проводимой спленэктомии. Наличие в селезенке признаков II этапа иммунного ответа соответствует лучшему ответу на хирургическое лечение. Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенное исследование имеет как фундаментальное, так и практическое значение. Селезенка является важным вторичным лимфоидным органом, участвующим во всех иммунопатологических процессах, и, следовательно, объективная оценка морфометрических показателей ее структур требуется при любых исследованиях как клинического, так и лабораторного характера. В современных руководствах по гистоморфометрии данные вопросы не имеют должного отражения. В работах с использованием классических методов гистологического исследования при морфометрических изучениях величины функциональных зон и содержания клеточного состава селезенки подсчет показателей проводится только в относительных величинах, не учитываются масса органа, а также этапы иммунного ответа, что имеет принципиальное значение. Представленная в настоящей работе методология, позволяющая на современном уровне при различных окрасках получать численные значения размеров компартментов селезенки, а также состава клеточных популяций как в относительных, так и в абсолютных цифрах, дает возможность оценивать процессы, происходящие в данном органе на различных этапах иммунного ответа. Количественные значения, полученные с учетом массы селезенки, являются существенным дополнением, необходимым для анализа иммунопатологических состояний, а также дающим возможность осуществлять оценку прогностических критериев. Результаты проведенных исследований позволили сформулировать закономерности, расширяющие представление о влиянии селезенки на патогенез иммунной тромбоцитопении и апластической анемии. Установленные с помощью морфометрических методов изучения структуры и клеточного состава селезенки иммуноморфологические факторы прогноза позволяют находить дополнительные 12 варианты терапевтического вмешательства после спленэктомии при цитопениях иммунного генеза и оптимизировать лечение пациентов. Методология и методы исследования. Исследования проводились при строгом соблюдении международных регламентов биоэтики. Протокол проведения исследований был одобрен комиссией локального этического комитета ФГБОУ ВО Кировский ГМУ Минздрава России. Выписка из протокола заседания Локального этического комитета от 01.03.2018 (протокол № 02/2018). Работа выполнена на кафедре патологической анатомии ФГБОУ ВО «Кировский государственный медицинский университет» Минздрава России, а также на базе лаборатории патоморфологии крови ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови» ФМБА России. В ней исследовали образцы селезенки больных цитопениями иммунного генеза (50 больных ИТП и 30 больных АА). Сравнительный анализ проводили с препаратами селезенок (архивный материал), взятых от 20 лиц, скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови, болезней печени, инфекционной и другой патологии, имеющей влияние на структуру селезенки. В настоящем исследовании для решения поставленных задач был использован комплекс морфологических методик: - гистологические исследования послеоперационных селезенок проводились на срезах с парафиновых блоков (окраска гематоксилином – эозином, азуром – эозином); иммуногистохимические исследования на ткани селезенки человека с антителами (CD20; CD3; CD4; CD8; CD57 (NK); MAC387; MPO; CD11c; CD68; CD35; S100; FVIII) и системой визуализации En VISION, PEROXIDASE (DAB) Dako в рабочих разведениях. - морфометрические методы – оценка результатов осуществлялась с помощью светового микроскопа Leica (Германия) со встроенной фотовидеокамерой и программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии М (в 20 полях зрения, об. х 10, х 20, х 100, ок. х 10). Принципиально новым методическим подходом настоящей работы к пониманию особенностей гистоархитектоники селезенки явился пересчет 13 морфометрических гистологическом окрашивании и показателей с учетом материале селезенок, морфометрии, получены ее массы. при В исследуемом иммуногистохимическом численные значения площадей компартментов функциональных зон, а также популяций иммунокомпетентных клеток, которые выявлялись в различных количествах в отделах пульпы. При этом определялись минимальные и максимальные величины относительных (%) и абсолютных значений (г). Оценку реактивных изменений, происходящих в селезенке при цитопениях иммунного генеза (иммунной тромбоцитопении и апластической анемии), проводили с учетом миграционных и функциональных особенностей иммунокомпетентных клеток в компартментах органа. Анализ полученных морфологических параметров селезенки у пациентов с различными формами заболеваний, а также в зависимости от сроков выполнения спленэктомии и ответа на хирургическое лечение сопоставляли с этапами иммунного ответа. Положения, выносимые на защиту: 1. Перераспределение клеточных элементов в процессе иммунных реакций в селезенке влияет на размеры и массу ее компартментов и имеет свое отражение в соответствующих этапах иммунного ответа. 2. Изменения морфометрических показателей функциональных зон селезенки и ее клеточного состава у больных ИТП в зависимости от фазы заболевания и ответа на спленэктомию выявляются как в относительных, так и в абсолютных значениях. 3. Определяющими неблагоприятный прогноз признаками содержания клеточных субпопуляций в селезенке у больных ИТП явились снижение массы CD4+-лимфоцитов ниже 20,5 г; увеличение массы CD8+-лимфоидных клеток более 9,75 г, а также значение индекса соотношения масс CD4+/CD8+ ниже 2,3. 4. Патогенетические проявления активного иммунного процесса, присущие АА, а также проведение до спленэктомии ИСТ оказывают влияние на размеры функциональных зон и содержание клеточного состава селезенки, что имеет свое отражение в морфометрических показателях как в абсолютных, так и в 14 относительных значениях у больных в зависимости от тяжести болезни и сроков выполнения спленэктомии. 5. Определяющими неблагоприятный прогноз у больных АА признаками являются: увеличение массы БП селезенки более 8,5 г и массы МЗ более 1,9 г, а также значение абсолютного количества CD4+ Т-клеток в селезенке менее 5,4 г и величина индекса соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов меньше или равна 1,0. Внедрение результатов исследования. Полученные результаты внедрены в учебный процесс лечебного и педиатрического факультетов на кафедрах патологической анатомии, гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВО «Кировский государственный медицинский университет» Минздрава России, в учебный процесс лечебного и педиатрического факультетов на кафедре общей патологии ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России, в учебный процесс лечебного и педиатрического факультетов на кафедре цитологии, гистологии и эмбриологии ФГБОУ ВО «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева», в учебную работу лечебного и педиатрического факультетов на кафедре нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, на кафедре гистологии и патологической анатомии Медицинского института ФГБОУ ВО «Чеченский государственный университет», в учебную работу кафедры морфологии и общей патологии ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России в курсе обучения студентов медико-биологического факультета, в учебную работу лечебнопрофилактического и педиатрического факультетов на кафедре нормальной анатомии и кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, в учебный процесс лечебного и педиатрического факультетов на кафедре анатомии и гистологии человека ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России. Разработки по теме диссертации внедрены в практику клинико-диагностической 15 лаборатории гематологической клиники ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России» и лаборатории иммуногистохимической диагностики опухолей Республиканского клинического онкологического диспансера Минздрава Татарстана. По результатам проведенного исследования получено 7 патентов на изобретение: № 2535059 от 08.10.2014 «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № 2555355 от 04.06.2015 «Способ морфометрической оценки прогноза течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № 2563284 от 21.08.2015 «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD8 + Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № 2594119 от 19 июля 2016 г. «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № 2599021 от 08 сентября 2016 г. «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н., Ванеева Е.В.); № 2621627 от 06 июня 2017 г. «Способ морфометрической оценки прогноза течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Ванеева Е.В.); № 2625036 от 11 июля 2017 г. «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по массе CD4+ T-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А.) [Приложение А]. Результаты работы могут быть востребованы при проведении учебного процесса в вузах и НИИ медицинского и морфологического профиля, а также в специализированных учреждениях здравоохранения. 16 Степень достоверности и апробация результатов. Высокий уровень достоверности результатов диссертационной работы, а также обоснованность выводов определяются достаточным числом наблюдений, продуманным методическим и методологическим дизайном исследования, использованием современных морфометрических и иммуногистохимических методов, позволяющих решить поставленные задачи, а также адекватных методов статистического анализа при помощи прикладных компьютерных программ STATISTICA Advanced 10 for Windows Ru, лицензионный номер 136-394-673; Microsoft Excel 2007. Материалы й диссертации Международной представлены научно-практической и обсуждены конференции на 7- «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» Астрахань, 2010, на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 75летию службы крови Челябинской области, Челябинск, 2010, на Х конгрессе Международной ассоциации морфологов, Ярославль, 2010, РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий, Минск, 2012, на Конгрессе гематологов России, Москва, 2012, на Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербург, 2012, на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», С.-Петербург, 2014, научно-практической конференции с международным участием, Киров, 2014, на II конгрессе гематологов России, 2014, Москва, на республиканской научнопрактической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии в клинической практике», Ижевск, 2014, на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции и инфекционная безопасность в гематологии и службе крови», С.-Петербург, 2014, 4th Annual International Conference on Health & Medical Sciences, 2-5 May 2016, Athens, Greece, International Scientific School «Paradigma», 2015, на научнопрактической конференции с международным участием, Киров, 2015, на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 17 Рязань, на 2016, Екатеринбург, Международной V 2016, на научно-практической межрегиональной заочной конференции, научно-практической Интернет-конференции, посвященной 90-летию со дня рождения первого заведующего кафедрой анатомии с топографической анатомии, Международной научно-практической курсом профессора А.В. оперативной Краева, конференции хирургии Киров, 2018, «Единство и на науки, образования и практики медицины будущего», Москва, 25 мая 2018 г., на ХIV конгрессе Международной ассоциации морфологов, Астрахань, 2018, на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Общегистологические аспекты современной медицины», Воронеж, 2018, на Международной научно-практической конференции, посвященной 170-летию кафедры патологической анатомии имени академика А.И. Струкова, Москва, 20 марта 2019 г. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует паспортам научных специальностей: 14.03.02 – патологическая анатомия (медицинские науки), специальность, занимающаяся решением проблем теории и практики с помощью современных методов исследования, в том числе иммуноморфологии и морфометрии, с целью совершенствования диагностических мероприятий, создания теоретической и практической базы для разработки новых средств профилактики и лечения болезней. Прижизненная диагностика и прогнозная оценка болезней на основе исследований биопсийного патологического процесса, (операционного) лежащего в материала, основе научный заболевания анализ (пункт 2), исследование патогенетических механизмов развития заболеваний в целом и отдельных их проявлений (симптомы, синдромы), создание основ патогенетической терапии (пункт 3). 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология (медицинские науки), область функционирования науки, занимающаяся клеток и тканей, их исследованием взаимодействия строения в и процессе жизнедеятельности организма, как в норме, так и при различных патологических 18 нарушениях. Изучение закономерностей цито- и гистогенеза, строения и функции клеток и тканей (пункт 1), системный анализ взаимоотношений клеток, тканей и функциональных систем организмов (пункт 3). Личный вклад автора и благодарности. Личный вклад соискателя составляет более 80% и состоит в непосредственном участии в проведении исследований на всех этапах работы. Формулировка цели и задач диссертационного исследования, определяющих общие концепции, разработка дизайна и методологии исследования, анализ и систематизация данных литературы проведены лично автором. Обсуждение полученных результатов, подготовка публикаций по теме диссертации осуществлялась автором совместно с научными консультантами. Автор выражает глубокую благодарность за поддержку и оказанную помощь в работе научным консультантам д.м.н., профессору С.В. Петрову и д.м.н., профессору Л.М. Железнову. Автор благодарит дирекцию и ученую часть Кировского НИИ гематологии и переливания крови и лично директора института д.м.н. Парамонова И.В. за помощь и содействие в проводимой работе. Иммуногистохимическое окрашивание выполнялось лично автором, морфометрический анализ исследуемого материала проводился автором совместно со старшим научным сотрудником лаборатории патоморфологии к.м.н. Дьяконовым Д.А., за что автор выражает ему искреннюю благодарность. Автор благодарит сотрудников лаборатории патоморфологии за помощь в проведении гистологических и иммуногистохимических исследований, сотрудников гематологической клиники за помощь в получении операционного материала, а также весь коллектив института. Особую признательность и благодарность за поддержку и консультативную помощь в работе автор выражает главному научному сотруднику ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России, лауреату Премии Правительства РФ в области науки и техники за 2017 год, д.м.н., профессору Орадовской И.В. Глубокую и искреннюю благодарность за оказанную помощь в работе автор выражает профессору кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Кировского медицинского университета д.м.н., профессору Зайцеву В.Б. 19 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 48 печатных работ, 18 статей в журналах перечня рецензируемых научных изданий Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора наук. Результаты 7 научных работ представлены в журналах, входящих в систему Scopus, получено 7 патентов на изобретение. Выпущено: 1 атлас селезенки, 1 учебное пособие. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о материале и методах исследования, 4 глав собственных исследований, сокращений заключения, и условных выводов, практических обозначений, списка рекомендаций, литературы, списка приложений. Диссертация изложена на 238 страницах печатного текста. Работа содержит 71 рисунок и 34 таблицы. В списке литературы – 362 источника, в том числе 118 отечественных и 244 иностранных авторов. 20 ГЛАВА 1 ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В СЕЛЕЗЕНКЕ В НОРМЕ И ПРИ ЦИТОПЕНИЯХ ИММУННОГО ГЕНЕЗА (ПЕРВИЧНОЙ ИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ И АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ) (обзор литературы) 1.1 Современные представления о селезенке как вторичном органе лимфоидной системы Селезенка (splen, lien) – это крупный вторичный лимфоидный орган, расположенный в брюшной полости. Селезенка выполняет фильтрационную, очистительную, иммунную, кроветворную и депонирующую функции [93; 147; 312; 321]. Обобщая литературные данные, можно отметить, что количество исследований по изучению структуры и функций селезенки в отечественной и зарубежной литературе в последние годы заметно увеличилось. Вместе с тем подавляющее число работ, посвященных этой проблеме, опубликовано иностранными авторами (Рисунки 1, 2). Рисунок 1 – Количество обзорных печатных работ, посвященных селезенке, опубликованных с 1983 по 2017 год (по данным Pubmed.com) 21 Рисунок 2 – Количество печатных работ отечественных и зарубежных авторов, посвященных изучению структуры и функций селезенки, опубликованных с 1983 по 2017 год (по данным Pubmed.com) Современные представления о морфологическом строении селезенки. Селезенка не является жизненноважным органом. Это, возможно, и нашло свое отражение в отставании изучения ее структуры и физиологии от исследований других органов [8; 15; 134; 321]. Малочисленность и противоречивость сведений относительно строения селезенки обусловлены и тем, что она быстро изменяется в зависимости от функционального состояния организма, а после смерти в ней рано начинаются аутолитические процессы [45]. Интерпретация экспериментальных исследований данного органа затруднена потому, что имеются межвидовые различия в гистоархитектонике селезенки млекопитающих и человека [39; 45; 66; 87; 88; 99; 108; 147; 153; 249; 252; 286; 298; 312; 318; 331; 334; 362]. Известно, что масса, объем и размеры селезенки могут значительно варьировать в зависимости от процессов депонирования крови и активности кроветворения [10; 15; 28; 96; 176]. Средний вес селезенки составляет 150 (100– 185) г. При этом масса органа у женщин не отличается от таковой у мужчин – 150 (100–225) г к 155 (100–150) г соответственно [96; 109; 321]. Селезенка человека покрыта интраперитонеально брюшиной и капсулой (capsula, tunica fibrosa) из плотной волокнистой ткани толщиной до 2 мм. Капсула 22 состоит из двух слоев, определяющихся за счет ориентации коллагеновых волокон. В поверхностном слое эти волокна более толстые и однородные, глубже они становятся тоньше. В капсуле выявляется небольшое количество гладких миоцитов [58; 59; 96]. Вместе с капсулой к опорно-сократительному и амортизирующему аппарату селезенки, способствующему при необходимости быстро изменять объем органа, относятся трабекулы (trabecula splenica). Они отходят от капсулы, разветвляются и анастомозируют друг с другом, проникая в пульпу [8; 28; 58; 59]. По данным А.А. Молдавской и др. (2009), общая площадь капсулы и трабекул изучалась многими авторами, отмечается большая индивидуальная вариабельность площади капсулы селезенки по сравнению с ее трабекулами, имеется возрастная зависимость соединительно-тканного остова, которая составляет: 8,79% в подростковом возрасте, у людей 22–35 лет – 13,57%, в 35–60-летнем возрасте 16,74% и в старшей возрастной группе 60–74 лет – 17,95% [58]. Между трабекулами находится пульпа селезенки (pulpa splenica, pulpa lienalis), основу которой составляет ретикулярная ткань. Структурно и функционально пульпу селезенки образуют два отдела, имеющие разное строение и функции: белая пульпа (БП) (pulpa alba) и красная пульпа (КП) (pulpa rubra) [8; 28; 93; 95; 270]. Согласно современным представлениям строение селезенки позволяет выполнять ей две основные функции – это фильтрация (очищение) кровотока, которая происходит преимущественно в КП, и участие в иммунных реакциях – в БП [19; 37; 39; 45; 105; 115; 174; 176; 247; 249; 293]. БП представляет собой плотные высокоорганизованные скопления Т- и Влимфоцитов вокруг артериол. Клеточный состав БП специфичен, кроме лимфоцитов она содержит плазматические клетки, макрофагальные элементы и дендритные клетки (ДК). Большинство Т- и В-лимфоцитов БП селезенки являются частью рециркулирующего пула. Лимфоциты непрерывно мигрируют по всему организму к лимфоидным органам [30; 108; 153; 253; 331]. В настоящее время БП подразделяют на маргинальную зону (МЗ), 23 периартериальные лимфоидные муфты (ПАЛМ) и первичные или вторичные лимфоидные узелки (ЛУ). Считается, что ретикулярная ткань, лежащая в основе БП селезенки, образует строму, волокна которой наиболее плотно лежат в области МЗ и ПАЛМ. В данных компартментах имеется большое количество ретикулярных клеток, которые содержат гладкомышечный актин и миозин, чего нет в КП [133; 204; 312; 317]. У этих клеток имеются длинные тонкие отростки, тесно связанные с ретикулиновыми волокнами. Белки, синтезированные стромальными клетками (коллаген III типа, ламинин, фибронектин, витронектин и тенасцин), а также хемокины CCL21 и CXCL13 играют важную роль в миграции лимфоцитов во время иммунного ответа. Данные клеточные элементы принимают участие в регуляции кровотока в селезенке [131; 137; 176; 249; 258; 329; 337]. Исследования M.A. Nolte (2003) свидетельствуют о наличии в селезенке системы каналов, образованных стромальной сетью, которые обеспечивают основу для направления миграции лимфоцитов и других клеточных элементов к отделам БП [257; 258]. Маргинальная (краевая) зона (zona marginalis pulpae albae splenis) граничит с КП и находится к периферии от ПАЛМ и ЛУ (первичных или вторичных). Кроме рециркулирующих клеток, проходящих через МЗ, этот отдел содержит некоторое количество нециркулирующих резидентных В-клеток – клеток памяти и клеток, которые могут вовлекаться в Т-зависимый и Т-независимый иммунный ответ. В-клетки важны не только для развития и поддержания функционального состояния МЗ, но и для организации ее микроструктуры [191; 197; 215; 240; 257; 329; 336]. По данным ряда исследований МЗ, играет важную роль в поглощении из периферической крови антигенов, вследствие гармоничного взаимодействия макрофагов и В-клеток [205; 242; 336; 338]. В ней происходят сортировка приходящих из крови лимфоцитов в Т- и В-зоны, задержка и фагоцитоз поврежденных эритроцитов, депонирование тромбоцитов для быстрого их выхода в кровоток [257; 309; 312]. 24 Исследования C.L. Zindll et al. (2009) на мышах показали, что сигналы рецептора LTα1β2 и LTβ контролируют правильное развитие и поддержание зрелой структуры маргинальных синусов и вводят адрессин MAdCAM-1 (mucosal adressin cell adhesion molecule-1) в структурирование эндотелиальных клеток маргинальных синусов, что важно для движения иммунных клеток в селезенке [359]. В настоящее время подтверждено, что в селезенке человека практически отсутствуют маргинальные синусы, разграничивающие зону мантии и МЗ, а также макрофаги, экспрессирующие сиалоадгезин [157; 245]. Однако существует мнение, что в селезенке человека, в отличие от мышей и крыс, вообще отсутствует МЗ [318]. Периартериальные лимфоидные муфты (vagina lymphoidea periarteriolaris) являются Т-зависимой зоной селезенки. Известно, что они окружают центральные артериолы в виде цилиндрических компактных скоплений лимфоидной ткани, содержащей Т-лимфоциты (преимущественно CD4+, а также в небольшом количестве CD8+-клетки), макрофаги и интердигитирующие дендритные клетки (ИДК) [30; 110; 310]. Лимфоидные узелки (ЛУ). Многочисленными исследованиями установлено, что по периферии к ПАЛМ плотно прилегают первичные или вторичные (активные) лимфоидные узелки (nodulus lymphoideus primaries, nodulus lymphoideus secundarius или nodulus lymphoideus splenicus) – это В-зависимая зона селезенки. Размеры этих узелков зависят прежде всего от дозы антигена и времени персистирования его в организме [30; 249; 310]. В последние годы получены доказательства, что первичные и вторичные ЛУ являются скоплениями В-клеток, «запутанных» в сети фолликулярных дендритных клеток (ФДК). ФДК имеют большое количество длинных тонких дендритных отростков, которые тесно контактируют с окружающими В-клетками. ФДК поддерживают выживание В-клеток и участвуют в их пролиферации [328]. ФДК строго экспрессируют рецепторы для комплементарных фрагментов и для Fc региона иммуноглобулинов (Ig) [190; 329]. 25 Первичные ЛУ имеют однородную структуру и состоят из малых рециркулирующих В-лимфоцитов, экспрессирующих IgM+ и IgD+. В течение иммунного ответа под влиянием антигенной стимуляции в первичных ЛУ образуются герминативные (зародышевые) центры (ГЦ), или центры размножения и узелки приобретают структуру вторичных ЛУ. Строение и функциональная активность узелков определяются тем, на какой стадии развития находятся их ГЦ. Они могут проходить период формирования, появления и нарастания числа делящихся клеток, активного функционирования и обратного развития [30; 109; 314]. Субпопуляция антиген-неиндуцированных зрелых наивных В-клеток оттесняется к периферии первичного фолликула, образуя зону мантии. Эта зона окружает ГЦ и состоит главным образом из плотно расположенных малых Влимфоцитов. Большинство из этих клеток несет на своей поверхности рецепторы к IgM+ и IgD+ [249; 312; 362]. Как уже отмечалось, иммуноглобулиновые рецепторы B-лимфоцитов связывают нативный антиген и, таким образом, не нуждаются в помощи других антигенпредставляющих клеток (АПК) [125]. Перифолликулярная зона (ПФЗ) была выявлена в селезенке человека и описана рядом исследователей. Полагают, что данная зона является компенсаторным компартментом вследствие недостаточного развития в селезенке человека маргинальных синусов. ПФЗ окружает маргинальную и состоит из небольших пространств, заполненных кровью, без эндотелия [308]. От КП она отличается клеточным составом, скоплениями гранулоцитов и моноцитов. Кроме того, в ПФЗ выявляются эллипсоиды, или периартериальные макрофагальные влагалища, состоящие из макрофагов, экспрессирующих сиалоадгезин и CD68+. В КП макрофаги, входящие в эллипсоиды, сиалоадгезин – негативны. В этой области может также обнаруживаться большое количество В-клеток памяти (IgD+/–, IgM+, CD27+/–). Основными функциями ПФЗ считаются депонирующая и фильтрационная, которые более свойственны КП [311; 345]. Известно, что КП включает в себя три вида сосудистых структур: тонкие 26 артериальные капилляры, синусоиды и пульпарные вены. Все эти сосуды поддерживаются ретикулярной стромой, которая образует селезеночные (пульпарные) тяжи (тяжи Бильрота). В пульпарных тяжах содержится большое количество различных внеклеточных белков: фибронектин, ламинин, витронектин, тенасцин, коллагены III и IV типов [249; 332; 337]. Подтверждено, что обширная артериальная сеть задерживает большой объем крови в КП, обуславливая ее функции. Количество макрофагов в этой области может быстро увеличиваться в результате поступления из кровотока моноцитов для их дальнейшей дифференцировки [109; 145]. Здесь происходят созревание ретикулоцитов и их превращение в эритроциты. В многочисленных исследованиях описаны особенности структуры синусоидов КП, имеющих характерный прерывистый эндотелий и базальную мембрану. Синусоиды выполняют фильтрационную функцию, регулируют потоки форменных элементов крови, отвечают за взаимодействие макрофагов с лимфоцитами и другими клетками, в них также продуцируется фактор Виллебранда (Factor VIII). Селезеночные (пульпарные) тяжи, расположенные между синусоидами, состоят из петель ретикулярной ткани и содержат макрофаги, а также скопления эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов [360]. Клетки крови постоянно мигрируют из пульпарных тяжей в просвет синусоидов. Старые, патологически измененные или поврежденные форменные элементы крови (в первую очередь эритроциты), неспособные к миграции в синусоиды, целиком фагоцитируются и перевариваются макрофагами [142; 145; 249; 312; 337; 360]. На основании современных представлений выявлены особенности кровообращения в селезенке. В ворота органа входит селезеночная артерия, ветви которой проникают в трабекулы (трабекулярные артерии) и далее – в пульпу (пульпарные артерии). В пульпе адвентиция артерии замещается оболочкой из лимфоидной ткани и получает название центральной артерии. Центральные артерии переходят в кисточковые артериолы, артериальные гемокапилляры в синусоиды, пульпарные венулы и вены и трабекулярные вены, которые дают 27 начало селезеночной вене, выходящей из ворот селезенки [96; 153; 309]. Центральная артерия по мере прохождения в БП образует коллатерали в виде капилляров, заканчивающихся в МЗ. Ветви центральных артерий повернуты под прямым углом. Кровь по центральной артерии протекает таким образом, что клетки движутся по центру сосуда, а плазма по периферии. Происходит разделение тока крови. Растворимые антигены с плазмой поступают в БП, где они захватываются АПК [249; 312]. Важно, что в селезенке человека большинство артериальных сосудов не имеют четкого перехода в венозные структуры, то есть преобладает «открытая» форма кровотока. Кисточковые артериолы напрямую открываются в селезеночные тяжи, минуя капилляры, и кровь, чтобы достичь синусоидов, выходит в окружающую их ретикулярную строму, пульпарные тяжи [313; 315; 337]. В том случае, если гемокапилляры открываются непосредственно в синусоиды, формируется закрытое кровообращение, при котором кровь всегда остается внутри сосудов. В стенке кисточковых артериол имеются утолщения, называемые гильзами, состоящие в основном из ретикулярных клеток. Эти клетки обладают высокой фагоцитарной активностью и выполняют фильтрационную функцию, а также обезвреживание артериальной крови, проходящей через селезенку [249; 315; 316]. При входе в синусоиды селезенки и в месте их перехода в вены имеются подобия мышечных сфинктеров. При открытых артериальных и венозных сфинктерах кровь свободно проходит по синусоидам в трабекулярные вены. Эти вены лишены собственного мышечного слоя, средняя оболочка в них выражена очень слабо. Наружная оболочка вен плотно сращена с соединительной тканью трабекул. Такое строение вен обусловливает их зияние и облегчает выброс крови из селезенки. Между артериями и венами в капсуле селезенки, а также между пульпарными артериями встречаются анастомозы [317]. По данным литературы считается, что лимфатическая система селезенки у человека развита слабо. Лимфатические сосуды присутствуют в БП, где они 28 переплетены с артериями. Эти сосуды проходят от БП в трабекулы и затем покидают селезенку через ворота органа. Селезеночные лимфатические сосуды хорошо развиты, но не видны, так как обычно переполнены лимфоцитами и имеют очень тонкие стенки. По этим сосудам перемещаются ИКК, рециркулирующие в лимфоидный пул. Ток лимфы в селезенке совпадает с направлением венозного потока и противоположен току артериальной крови [8, 28, 96]. Нервы селезенки со времен Абрикосова А.И. (1947) относят большей частью к симпатической нервной системе и отчасти к блуждающему нерву. Они проходят в трабекулах и по ходу сосудов [96; 123]. Вместе с тем установлено, что иннервация селезенки играет большую роль в циркуляции лимфоидных и других клеток, а также имеет влияние на иммунные процессы [234; 281]. Морфологические особенности фильтрационной функции селезенки. По данным большинства исследователей установлено, что селезенка является самым эффективным неспецифическим фильтром крови и имеет большое значение для устойчивости организма при инфекциях. Частично чужеродный материал удаляется из кровообращения фагоцитами ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) органа даже при отсутствии иммунного узнавания [21; 78; 146; 185]. Особый пример неиммунного очищения кровообращения – физиологическое удаление ослабленных или поврежденных эритроцитов и тромбоцитов. Точный механизм, которым эти клетки направляются на деструкцию, неясен [3; 142; 206; 250; 296]. При нормальной продолжительности жизни эритроцитов у человека (120 дней) большинство этих клеток удаляется из тока крови (приблизительно 2 x 1011 в день) посредством фагоцитоза макрофагами в тяжах красной пульпы. Вместе с тем эритроидные элементы с дефектами в структуре мембраны и измененной формы (типа серповидных или микросфероцитов) имеют большие затруднения в прохождении через пульпарные тяжи и щели между эндотелиальными клетками синусоидов. Это ведет к замедлению кровотока и повышению разрушения эритроцитов посредством 29 фагоцитоза макрофагами красной пульпы. В работе P.J. Buckley (1987) показано, что в селезенке присутствуют разные подмножества макрофагов и ДК и некоторые из них занимают микроанатомические структуры, свойственные только для этих субпопуляций. В КП определенные виды антигенов экспрессируются макрофагами, расположенными равномерно в пульпарных тяжах. С другой стороны, существуют антигены, присутствующие на разного размера кластерах макрофагов в КП. Макрофаги МЗ могут выявлять антигены, присутствующие на этих клетках только в данной зоне. В том же исследовании установлено, что макрофаги (tangible body) герминативных центров БП отличаются от таковых КП и МЗ по отношению к экспрессии некоторых антигенов. На основании полученных данных авторы сделали вывод о том, что присутствие фенотипически разных субпопуляций макрофагов и ДК в отделах селезенки и особенности их распределения могут свидетельствовать об их функциональной специализации [144]. Также обнаружено, что в разных отделах селезенки найдены популяции макрофагов, которые выполняют функции, свойственные их локализации. В ЛУ макрофаги аналогичны таковым, обнаруженным в лимфоузлах. Специфические для КП макрофаги занимаются очищением кровотока и утилизацией железа. В МЗ найдены два типа макрофагов, экспрессирующих SIGN-R1 и CD169 (siglec-1, sialoadgesin). Эти макрофаги помимо своих основных функций (участие в деградации и очистке от патогенов) могут синтезировать провоспалительные цитокины (интерферон-γ, ФНО-α, ИЛ-1), тем самым принимают участие в адоптивном иммунитете [166]. Макрофаги МЗ принимают участие в миграции лимфоцитов. На количество макрофагов МЗ влияют хемокины CCL19 (в большей степени) и CCL21, от чего зависит в свою очередь активность противоинфекционного иммунного ответа [99; 124]. В исследованиях M.M. Kay (1975) были обнаружены механизмы, с помощью которых макрофаги различают «зрелость» и «старение» эритроцитов. 30 Оказалось, что фагоцитозу подвергались клетки, которые были обработаны IgG. Сканирующая электронная микроскопия с использованием меченых анти-IgG, IgM, IgA показала, что молодые эритроциты не имеют Ig на поверхности, в отличие от старых красных клеток крови, на их поверхности определялся IgG [205]. Поглощение антигенов стромальными клетками в селезенке и других лимфоидных тканях важно не только для деструкции патогенов, но и является также первым этапом в индукции как первичного, так и вторичного иммунного ответа [199]. Различные отделы селезенки выполняют специфические функции, и в пределах каждого компартмента имеются определенные клетки, специализированные для локального захвата и процессинга антигенов с дальнейшей активацией окружающих лимфоцитов. Захват антигенов важен для того, чтобы их сконцентрировать в областях, богатых реактивными Влимфоцитами. Взаимодействие антигенсодержащих клеток с T-лимфоцитами – значительно более сложный процесс. Активация селезеночных Т-лимфоцитов в ответ на антиген требует, чтобы АПК захватили и отделили антиген от циркулирующей крови, транспортировали его в соответствующую микрозону в пределах селезенки. В течение этого процесса данный антиген распадается на пептиды, которые затем экспрессируются на поверхности клетки внутри пептидсвязывающего комплекса MHC-I или MHC-II главного комплекса гистосовместимости (MHC) [78; 199]. В недавних исследованиях S.M. Meinderts (2017) выяснилось, что нейтрофилы селезенки также фагоцитируют опсонизированные антителами эритроциты [250]. Ксенотрансплантация клеток стромы селезенки, по данным Г.Б. Беляевой (2005), приводит к формированию стромальной сети, которую заполняют клетки реципиента, и функциональное состояние пульпы восстанавливается [10]. Ксеноспленоперфузат вызывает реактивные изменения лимфоидной ткани селезенки: увеличивается количество ЛУ с центрами размножения, наблюдается гипертрофия ПАЛМ [37]. 31 Миграционные свойства клеточных элементов селезенки. Известно, что около 15–20% объема крови циркулирует через селезенку в любой момент времени и около 15% лимфоцитов находится в этом органе [235]. Кровь, поступающая в МЗ-зону, направляется выборочно по разным артериальным путям: лимфоциты и их сопровождающие клетки проходят к ПАЛМ и к первичным (вторичным) ЛУ; тромбоциты и эритроциты – в КП. В МЗ терминальные артериолы часто раздваиваются перед их завершением, что ведет к диспропоциональному увеличению количества артериол [249; 311; 337]. Установлено, что замедление скорости кровотока в МЗ способствует распознаванию антигенов макрофагами, которые обладают чрезвычайно мощной фагоцитирующей функцией, даже в отсутствие предварительной опсонизации. Антигены могут поступать в селезенку в комплексе с ДК, которые их представляют Т-клеткам в ПАЛМ. Антигены в МЗ могут также напрямую связываться с В-клетками памяти и находиться там длительный период времени в тесном контакте с макрофагами МЗ. В-клетки памяти могут также мигрировать в ПАЛМ и представлять антигены Т-клеткам [125; 257; 329; 336; 338; 359]. В настоящее время доказано, что в селезенку антиген может поступить в связанном с АПК (ДК) или в нативном состоянии. ДК, захватившие антиген на периферии, в процессе перемещения становятся зрелыми ИДК [78]. Для первичного иммунного ответа активация Т-хелперов зависит от взаимодействия с ИДК, приносящими антиген в ПАЛМ. Узнавание антигена Т-клеточным рецептором обеспечивает первый сигнал активации Т-клеток, но его недостаточно для достижения полной активации. Без следующего сигнала клетки остаются толерантными и анергичными [118; 190]. Активированные макрофаги и клетки стромы, а также Т- и В-лимфоциты выделяют «коктейль» провоспалительных цитокинов – ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-6, КСФ, хемокины и др., что обусловливает развитие сосудистых и клеточных реакций, свойственных воспалению. При этом повышаются интенсивность кровотока в селезенке, усиление рециркуляции и «улавливания» лимфоцитов и других клеток [233; 246; 253; 255]. 32 Поскольку В-лимфоциты рециркулируют через ПАЛМ или через MЗ с дальнейшей их миграцией в ПАЛМ, они могут связать антиген первыми. Независимо от начального участка столкновения эти В-лимфоциты сначала становятся активизированными и затем пролиферируют в зоне контакта с Тлимфоцитами. Далее после нескольких делений, через стадию Th0, из Т-клеток образуются субпопуляции Th1 и Th2, соотношение которых определяет преимущественное направление развития иммунных процессов в сторону клеточного или гуморального ответа. В ПАЛМ образуются преимущетсвенно Th1, которые не нуждаются в представлении антигена В-лимфоцитами, тогда как в зонах контакта В- и Т-клеток образуются в основном Th2-клетки [9; 92; 118]. Иммуноглобулиновые рецепторы B-лимфоцитов связывают нативный антиген и, таким образом, не нуждаются в помощи АПК. Однако В-лимфоцитам требуются дополнительные сигналы для последующего размножения и дифференцировки. Источником этих сигналов служат Т-хелперы [125]. События индуктивной фазы антителообразования структурно связаны с ГЦ ЛУ, реагирующими на антигенную стимуляцию. Как известно, в ЛУ до поступления антигена содержатся исключительно В-лимфоциты. Начальные события, связанные с распространением антигена и взаимодействием В- и Тлимфоцитов, происходят в окружении первичных ЛУ, на границе между В- и Тлимфоцитарными зонами. Результатом этого процесса является миграция в ЛУ Тлимфоцитов – преимущественно CD4+-хелперов. При участии последних и цитокина СХСL13 осуществляется образование ГЦ (зародышевых центров), в результате чего первичный ЛУ превращается во вторичный [299]. Организующую роль при этом играют ФДК. Главная функция этих клеток заключается в связывании и хранении антигена, как правило, в составе иммунных комплексов. Именно на этом этапе происходят события, определяющие созревание гуморального иммунного ответа. В исследовании A.M. Laan et al. (2014) доказано, что после острого инфаркта миокарда в сердечной мышце накапливаются моноциты селезенки. Моноциты считаются инициаторами восстановления пораженного участка, и их 33 миграция совпадает с уменьшением количества данных клеток в этом вторичном лимфоидном органе [225]. Морфологические основы иммунной функции селезенки. Согласно современным представлениям, прикрепление антител к антигенам формирует иммунные комплексы, которые через Fc-области Ig взаимодействуют с рецепторами на фагоцитах и других клетках стромы селезенки. Опсонизированные антителами циркулирующие антигены вовлекают в фагоцитоз FcR-положительные клетки, включая нейтрофилы и селезеночные макрофаги. В селезенке антигены могут быть или разрушены, или обработаны таким образом, что иммунная система усиливает свой ответ [78; 116; 309]. FcR-опосредованное поглощение антигенов повышает функциональную активность макрофагов и увеличивает переработку чужеродного материала. Комплекс антиген – IgG1, связанный с Fcγ-рецептором 1-го типа (FcγRI, или CD64), выраженный и на макрофагах, и на нейтрофилах, увеличивает фагоцитоз и в то же время вызывает внутриклеточную секрецию провоспалительных медиаторов [205; 217; 250]. Незрелые В-клетки образуются в костном мозге и созревают в периферических органах иммунной системы, в том числе в селезенке, генерируя два гистологически, фенотипически и функционально различающиеся зрелые Вклетки: фолликулярные В-клетки (ФВК) и маргинальной зоны В-клетки (МЗВК). ФВК являются мелкими рециркулирующими лимфоцитами (с низкими IgM и высокими IgD). Они формируют В-клеточные зоны БП – ЛУ. МЗВК – средних размеров (с высокими IgM и низкими IgD), локализующиеся в маргинальной зоне БП вместе гранулоцитами и ДК. МЗВК высоко экспрессируют CD21 и комплемент. Эти характеристики предполагают, что В-клетки играют специализированную функцию, которая действует в синергии и дополняет адаптивный иммунитет, который инициируют ФВК и Т-клетки [338; 345]. В настоящее время выделяют два основных вида межклеточных взаимодействий: 1) связанные с презентацией антигена. В них участвуют АПК 34 (ДК, макрофаги и В-лимфоциты) и Т-хелперы; 2) связанные с реализацией иммунного ответа. В них участвуют Т-хелперы и В-лимфоциты или предшественники эффекторных Т-цитотоксических лимфоцитов. Установлено, что в обоих случаях основой для контакта клеток служит распознавание антигенного эпитопа рецепторами лимфоцитов. В случае взаимодействия АПК и Т-хелперов – это распознавание комплекса антигенного пептида с молекулой МНС II класса Т-клеточным рецептором – СD3 (ТСR) при участии молекулы CD4. При взаимодействии В-клеток с Т-хелперами указанный тип распознавания также имеет место, поскольку В-лимфоцит выполняет функцию АПК. Причем В-клетки МЗ выявляют значительно большую активность в этом процессе, чем фолликулярные В-клетки [127; 198]. Cпецифичность ответа В-лимфоцитов определяется иммуноглобулиновым связыванием компонентом свободного В-клеточного рецептора антигена с (ВСR). В- лимфоциты выступают здесь одновременно как доноры и как акцепторы активационных сигналов, т.е. как АПК и как предшественники антителообразующих клеток [257]. Двунаправленность сигналов характерна для межклеточных взаимодействий. При этом всегда достигается активация обеих взаимодействующих клеток, что может инициировать самостоятельные цепи событий. Многочисленные исследования демонстрируют, что вход и задержание Т- и В-лимфоцитов, а также NK-клеток в белой пульпе являются сложным целенаправленным процессом [21; 134; 136; 235; 334; 342]. Это происходит за счет взаимодействия между лимфоцитами и другими клетками. Селектины и адрессины, в частности адрессин MAdCAM-1 (mucosal adressin cell adhesion molecule-1), обеспечивают относительно слабую адгезию клеток, однако достаточную для селективной остановки клетки в нужном месте. MAdCAM-1, присутствующий на эндотелиальных клетках терминальных артериол МЗ, регулирует движение лимфоцитов к зонам БП [155; 255]. Согласно современным представлениям, в селезенке, «проверяющей» кровь 35 на содержание в ней антигенных субстанций, T-зависимые (ТЗ) реакции протекают в несколько этапов: 1. Поступление в селезенку свободного антигена или связанного с АПК. 2. Улавливание в селезенке рециркулирующих лимфоцитов, относящихся к антиген-специфическим клонам. 3. Обработка антигена АПК и его презентация Т-хелперам. 4. Выбор пути дифференцировки CD4+-клеток в направлении Th1- или Th2-хелперов. 5. Гуморальный или клеточный иммунный ответ. Подтерждено, что ФДК связывают антиген только в форме Ig- или комплементсодержащих иммунных комплексов. Данные иммунные комплексы взаимодействуют прежде всего через рецепторы комплемента CR1 (CD35) и CR2 (CD21) на ФДК, хотя некоторое закрепление может также встречаться непосредственно на Fc-рецепторы. ФДК не фагоцитируют и никоим образом не разрушают антиген, они сохраняют его на поверхности клетки в устойчивом состоянии в течение длительного периода. Комплекс с ФДК в ЛУ может быть единственным участком в организме, в котором необработанный белковый антиген может быть сохранен в течение долгого времени [314; 329]. Архитектура ЛУ определяется взаимодействиями между лимфоцитами и ФДК. Фенотип ФДК включает экспрессию молекулы адгезии сосудистых клеток (VCAM-1). Появление антигенов VCAM-1 и MAdCAM-1 требует антигенного стимула, совпадает с образованием герминативных центров и может служить индикатором активации ФДК [30; 191; 255]. Известно, что цитокины ИФНα и ИЛ17 могут регулировать миграционные ответы В-клеток. Этот процесс включает в себя непрерывное перемещение антигеннесущих В-клеток между МЗ и ГЦ, что обеспечивает длительное стабильное взаимодействие В- и Т-клеток в ГЦ [255]. Таким образом, В-клетки инициируют реакцию в ГЦ ЛУ, в процессе которой они трансформируются в быстропролиферирующие центробласты, крупные клетки со светлыми ядрами и широкой цитоплазмой. В пределах ГЦ 36 различают «темную» и «светлую» зоны. В «темной» зоне преобладают центробласты, а «светлая» зона состоит преимущественно из центроцитов [109; 197]. В ГЦ кроме В-лимфоидных элементов (IgD–) содержится также небольшое количество Т-лимфоцитов – фолликулярных Т-хелперов (ФТХ). ФТХ были охарактеризованы как основное подмножество CD4+ Т-клеток, которое стимулирует продукцию антител антиген-специфическими В-клетками в пределах периферических лимфоидных органов [128]. В меньшем количестве в ГЦ присутствуют CD8+-лимфоидные клетки. Кроме того, ГЦ содержат специализированные ДК, которые представляют антиген фолликулярным Т-клеткам, и играют роль в их активации при взаимодействии с окружающими В-лимфоидными элементами. Макрофаги присутствуют как в первичных, так и во вторичных лимфоидных узелках. Они фагоцитируют апоптотические В-клетки, которые не пережили процессов мутации и выбора в ГЦ [109; 116; 249; 312]. ИДК имеют длинные разветвленные мембранные отростки и строго позитивны по МСН II класса. Также они экспрессируют высокий уровень костимулирующих молекул, таких как В7, и являются потенциальными клетками для процессинга и презентации антигенов для активации наивных Т-лимфоцитов. Вместе с тем ИДК также секретируют факторы, которые важны для регуляции гомеостаза в ПАЛМ-архитектуре [72; 78; 116; 117; 152; 246; 312]. ИДК – самый мощный антигенпредставляющий комплекс, для того чтобы активизировать наивные T-лимфоциты, но подобно В-лимфоцитам они не имеют внутриклеточных механизмов для обработки сложных антигенов [72; 190]. Такие антигены должны быть фагоцитированы и обработаны макрофагами перед представлением Т-лимфоцитам. Вместе с тем макрофаги намного хуже передают сигналы Т-лимфоцитам, чем ДК или В-клетки [116]. Частицы антигенов могут быть фагоцитированы и разрушены макрофагами в MЗ, затем переносятся к Влимфоцитам или ДК, которые затем транспортируют антиген в Макрочастицы могли также быть обработаны фагоцитами на периферии и БП. 37 переданы ДК для продвижения в селезенку. Таким образом, последовательная обработка некоторых антигенов различными типами клеток может играть критическую роль в индукции Т-лимфоцитарных иммунных ответов [72; 358]. Иммунный ответ В-лимфоцитов без участия Т-лимфоцитов – тимуснезависимый (ТН) иммунный ответ характеризуется рядом свойств: продуцирование антител только класса М (нет переключения классов), нет иммунологической памяти, нет «созревания» аффинности. Подобный иммунный ответ начинает защищать организм после проникновения антигена, пока тимусзависимого (ТЗ) ответа в эффекторной форме еще нет в силу естественной динамики [78; 118]. Антигены, способные вызывать ответ у мышей с мутацией xid, блокирующей дифференцировку В-лимфоцитов до стадии, на которой экспрессируется мембранный антиген Lyb-5, обозначают как тимуснезависимые антигены 1-го класса (ТН-1), а антигены, на которые эти мыши не отвечают, – как тимуснезависимые антигены 2-го класса (ТН-2). Ответы на ТН-2 антигены могут быть усилены цитокинами, которые обеспечиваются клетками типа естественных киллеров, ДК и макрофагов. Для ТН-1 антигенов важна их митогенная активность, в результате которой они поликлонально активизируют большинство В-лимфоцитов независимо от специфичности их поверхностных Ig [78; 116; 118]. Селезенка – главное место продукции иммунных ответов к ТН-2-антигенам. В-лимфоциты в селезенке специализированы для TН-реакций на углеводы независимо от способа инъекции антигена. Реакции на модель TН-антигенов, введенных подкожно, больше отмечаются в селезенке, чем в лимфатических узлах, несмотря на то, что антиген попадает сначала в лимфоузлы перед достижением селезенки через кровообращение. Наиболее специфически важным местом для отбора антигенов в реакциях ТН-2 является MЗ [157]. Однако точная роль MЗ в TН-реакции полностью еще не определена. Разрушение макрофагов MЗ или В-лимфоцитов не уменьшает В-лимфоцитарной реакции на все ТН-2антигены [116; 118]. В исследовании Balazs M.B. et al. (2002) показано, что происходящие из 38 крови нейтрофильные гранулоциты и CD11с незрелые ДК являются первичными клетками, которые эффективно захватывают и транспортируют бактерии в виде частиц в селезенку. При системной инфекции CD11c ДК обеспечивают сигналы в антиген-неспецифические В-клетки МЗ и способствуют их дифференцировке в плазмоциты, секретирующие IgM [132]. I. Puga et al. (2012) выявили нейтрофилы в области, окружающей МЗ селезенки. Эти клетки имели специфический иммунофенотип и взаимодействовали с В-клетками МЗ, специализирующихся на ТН-иммунных ответах. Селезеночные нейтрофилы активировали В-клетки и вызывали переключение класса Ig, соматическую гипермутацию и продукцию антител после приема сигналов перепрограммирования из селезеночных синусоидальных эндотелиальных клеток, включая ИЛ-10 [272]. В экспериментальной работе M.S. Matter et al. (2011) установлено, что заражение вирусом лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) у мышей вызывает избирательное разрушение CD4+ Т-клетками селезеночной МЗ, что включало снижение В-клеток МЗ, маргинальных макрофагов. Эти повреждения индуцировали ослабление защитных нейтрализующих иммунных ответов [245]. Вторичный иммунный ответ отличается несколько от первичной реакции, описанной выше. Существование ранее антител обеспечивает более быструю локализацию антигена в ЛУ. Кроме того, В-лимфоциты памяти, которые находятся в MЗ, мигрируют в больших количествах в ПАЛМ, стимулируют и активизируют Т-лимфоциты памяти. Вследствие чего эти клетки продвигаются к ЛУ и запускают реакцию ГЦ. Кроме того, во вторичной реакции есть еще много В-лимфоцитов, которые могут уловить антиген через их определенный антигеном поверхностный ВCR. Поскольку B-лимфоциты могут обработать растворимый белковый антиген, эти В-лимфоциты – главные АПК для Т-лимфоцитов во вторичной реакции. Таким образом, предварительно активизированная и расширенная популяция клеток-памяти T- и В-лимфоцитов вызывает быстрые реакции высокого титра антител [29]. Наивные T-лимфоциты, которые сталкиваются с антигеном в селезенке, 39 могут также дифференцироваться в эффекторные Т-лимфоциты, которые не нуждаются в помощи В-лимфоцитов. Субпопуляция Th1 CD4+ Т-лимфоцитов секретирует провоспалительные цитокины типа интерферона-γ, что способствует разнообразным воспалительным реакциям. Наивные Т-лимфоциты, активизированные ИДК в центральных ПАЛМ, могут дифференцироваться в Th1клетки и затем мигрировать к участкам депонирования антигена на периферии [246]. Точно так же CD8+ Т-лимфоциты рециркулируют через ПАЛМ, и, если они входят в контакт с родственным антигеном на АПК, они активируются, клонально пролиферируют и дифференцируются в цитотоксические Т-лимфоциты [108; 152]. Локализация CD8+ Т-лимфоцитов в центральных ПАЛМ, их контакт с антигеном и выход после активации и дифференцировки в КП, а затем и в периферические ткани регулируются хемокинами. Образующиеся в результате CD8+-эффекторные Т-клетки имеют важное значение в разнообразных реакциях организма, включая отторжение аллотрансплантата, защиту против многих вирусных инфекций и в аутоиммунных процессах. Кроме того, эффекторные Тклетки CD8+ могут дифференцироваться в долгоживущие клетки памяти [294;350]. В работе M.A. Notle et al. (2017) установлено, что Т-клетки памяти CD8 в костном мозге мыши не размножаются, но в значительной степени покоятся, что защищает их от элиминации цитостатичесим препаратом (циклофосфомидом), в отличие от селезенки, где они устраняются подобным лечением [259]. F.K. Swirski et al. (2009) показали, что в пульпарных тяжах субкапсулярной области КП находится депо моноцитов, которые организм использует как ресурс для участия в процессах воспаления в других органах. При экспериментальном инфаркте миокарда в очаге воспаления было обнаружено около 40% моноцитов из селезенки, которые участвовали в заживлении поврежденного участка [320]. В исследованиях J.I. Ellyard (2004) установлено, что в селезенке человека присутствует популяция иммуноглобулин секретирующих плазматических клеток, которая играет важную роль в гуморальном иммунитете как в норме, так и 40 при патологических состояниях, связанных с гиперактивностью или дефицитом В-клеток [175]. В исследовании T. Witte et al. (1989) обнаружено, что большинство NKклеток (NKH1+) были расположены в КП и МЗ, тогда как в ЛУ выявлялось лишь небольшое количество этих клеток. Кроме того, иммунофенотип NK-клеток, расположенных в разных зонах селезенки, имел некоторые различия [342]. Экспрессия CXCR4 и CXCR3 на клеточных поверхностях регулируется ИЛ-2 и указывает на роль этих хемокиновых рецепторов в регуляции миграции NKклеток в селезенке [136]. Вместе с тем есть исследования, в которых демонстрируется продуцирующая роль клеток селезенки гуморальных факторов, стимулирующих все ростки гемопоэза [178]. Таким образом, на основании литературных источников установлено, что селезенка является своеобразным фильтром, предназначенным для очищения кровотока. Все ее структурные составляющие имеют свои «функциональные обязанности», которые направлены на улавливание патологических частиц, их распознавание, уничтожение с помощью фагоцитоза и формирования иммунного ответа. 1.2 Морфофункциональная характеристика селезенки при первичной иммунной тромбоцитопении Особенности патогенеза первичной иммунной тромбоцитопении. Первичная иммунная тромбоцитопения (ИТП) относится к группе аутоиммунных гематологических заболеваний, характеризуется снижением содержания кровяных пластинок в периферической крови (ниже 100 х 109/л), возникает и/или сохраняется без каких-либо явных причин [46; 49; 195; 227; 256; 277]. До недавнего времени тромбоцитопенической аббревиатура ИТП пурпуре, но относилась к современные идиопатической знания об иммуноопосредованной природе заболевания и отсутствие или минимальные проявления кровоточивости в большинстве случаев болезни заставили 41 пересмотреть терминологию [49; 277]. Распространена ИТП в популяции с частотой 2–4 / 100 000 взрослого населения, с наибольшей встречаемостью в возрастной группе 18–40 лет. Заболеваемость мужчин ровна во всех возрастных группах, тогда как у женщин пик ее приходится на 30–60 лет [209; 227; 251]. Диагноз «первичной ИТП» выставляется при отсутствии других причин, которые могли бы быть ассоциированы с тромбоцитопенией. Большинство случаев относится к первичной иммунной тромбоцитопении (80%). Первичная ИТП является диагнозом исключения, патогномоничных клинических или лабораторных признаков в постановке диагноза не существует 25; 46; 49; 73; 105; 227; 278. Диагноз «вторичной ИТП» включает широкий спектр иммунообусловленных тромбоцитопений, которые возникают вследствие приема медикаментов или при ассоциации с другими заболеваниями (вирусный гепатит С, системная красная волчанка, ВИЧ-инфекция и т.п.) [27; 29; 36; 43; 77; 107; 161; 170; 202; 203; 209; 271; 277; 296]. Выделяют впервые диагностированную, персистирующую (продолжительностью 3–12 мес.) и хроническую (продолжительностью более 12 мес.) формы ИТП 271. У взрослых, в отличие от детей, начало ИТП, как правило, бессимптомное и не ассоциируется с наличием какого-либо предшествующего вирусного или иного заболевания [73; 209]. У части больных ИТП переходит в хроническую форму с широкой вариабельностью клинической картины: от отсутствия проявлений или наличия небольших геморрагий до тяжелых желудочно-кишечных и других кровотечений. Отмечена определенная связь тяжести тромбоцитопении и вероятности развития кровотечения 271; 278. Тромбоцитопения при беременности рассматривается как вариант первичной ИТП. Обычно уровень тромбоцитов беременных женщин ниже, чем у небеременных. Снижение содержания тромбоцитов примерно на 10% типично для третьего триместра беременности. Гестационная тромбоцитопения обусловлена гемоделюцией, повышенной активацией тромбоцитов и их 42 ускоренным выведением. Частота ИТП составляет 1 случай на 1000 беременностей [47; 335]. Диагноз ИТП при беременности ставится на основании исключения других причин тромбоцитопении, преэклампсии, HELLP-синдрома, дефицита фолиевой кислоты, массивного кровотечения в ходе беременности, антифосфолипидного синдрома, гипертензии, инфицирования ВИЧ и др. [47]. В работе S. Bernal-Macias (2015) представлен случай беременной женщины, у которой в первом триместре развилась ИТП, резистентная к медикаментозным средствам, но был получен благоприятный ответ на спленэктомию, и пациентка выносила беременность до срока и родила здоровую девочку [138]. Иммунная тромбоцитопения опосредуется антитромбоцитарными антителами, которые ускоряют разрушение тромбоцитов и ингибируют их продукцию. Дефекты иммунных регуляторных механизмов у больных ИТП различны, что затрудняет понимание процессов, лежащих в основе данной патологии, и приводит к наличию резистентных к лечению форм болезни. Существует много вопросов, требующих разрешения, связанных с патогенезом этого заболевания. Нарушения иммунных регуляторных механизмов при иммунной тромбоцитопении. Этиология первичной ИТП до сих пор не определена. Однако выделение как первичной, так и вторичной ИТП может быть весьма условным, так как основные клинические проявления и патогенетические механизмы весьма схожи. Вместе с тем процесс выявления новых факторов развития вторичной ИТП способствует созданию условий для реклассификации пациентов [23; 49]. В соответствии с имеющимися представлениями на поверхности тромбоцитов обнаружено несколько гликопротеинов, они участвуют во многих физиологических процессах [16; 50; 51]. К ним относятся комплексы: GPIb/IX/V – является основным тромбоцитарным рецептором для фактора Виллибранда, обеспечивает прикрепление тромбоцитов к субэндотелию; GPIa/IIa – способствует процессу адгезии к коллагену; GPVI – мембранный рецептор тромбоцитов к коллагену; GPIIb/IIIa – поверхностный рецептор предостовляющий возможность связывания тромбоцитов с фибриногеном [16]. 43 Кроме того, тромбоциты сами принимают участие в иммунных реакциях [292]. Поскольку альфа-гранулы тромбоцитов содержат множество факторов роста, цитокинов и хемокинов, которые коррелируют с количеством тромбоцитов в периферической крови, все это может быть свидетельством участия тромбоцитов в иммунных реакциях [180]. Физиологически гибель тромбоцитов в организме происходит в 2 основных случаях: при удалении тромбоцитов из кровотока в процессе обновления клеток крови и при их сверхактивации, когда формируются прокоагулянтные тромбоциты, играющие важную роль в процессе свертывания крови [6]. Определение факторов, которые вызывают ИТП, крайне сложно в связи с, вероятно, преходящим характером провоцирующего воздействия, что влияет на трудность ранней диагностики, обусловливает длительный период, при котором отсутствуют явные клинические признаки. В связи с этим исследования иммунных нарушений чаще всего происходят, когда аутоиммунный процесс уже в полном разгаре и толерантность к тромбоцитам уже нарушена [4; 79]. Систематизируя многочисленные исследования патогенеза ИТП, можно отметить, что центральным механизмом развития этого заболевания продолжает оставаться связывание кровяных пластинок с антитромбоцитарными антителами, ведущее к разрушению этих комплексов макрофагами в селезенке (и печени) 4; 40; 151; 203; 323. Вместе с тем в последние годы иммуноопосредованная концепция патогенетического понимания течения тромбоцитопении при ИТП существенно дополнилась более сложными механизмами, в которых играют роль процессы нарушения образования тромбоцитов, а также эффекты, обусловленные дисбалансом практически всех компонентов иммунной системы [119; 163; 326; 361]. Aнтитромбоцитарные антитела и комплемент. Немецкий врач и поэт P.G. Werlgof первый описал ИТП у 16-летней девочки в 1735 году [274]. Данные об антитромбоцитарном факторе плазмы были представлены W.J. Harrington и др. (1951), когда они показали, что инфузия плазмы пациентов с ИТП здоровым донорам вызывает тромбоцитопению [163; 192]. 44 R.J. Shulman и др. отметили (1965) дозозависимость тромбоцитопенического эффекта плазмы, что ее большее количество требовалось для достижения равного уровня тромбоцитопении у спленэктомированных реципиентов. Кроме того, исследователи продемонстрировали, что тромбоцитопенический фактор относится к IgG-фракции сыворотки и может реагировать с аутологичными тромбоцитами [163; 297]. Cпецифичность антитромбоцитарных антител к определенным гликопротеинам (GP), таким как GPIIb/IIIa, была показана E.F. van Leeuven et al. (1982) при использовании тромбоцитарного иммунофлюоресцентного теста (ТИФТ). В 32 случаях из 42 антитромбоцитарный IgG, полученный от пациентов с ИТП, связывался с нормальными тромбоцитами, но не с тромбоцитами от пациентов с тромбастенией Гланцмана, не имеющих GPIIb/IIIa. Было доказано, что главной целью тромбоцитарный антитромбоцитарных мембранный антител гликопротеин при IIb-IIIa, ИТП являются кальцийзависимый гетеродимерный мембранный рецептор фибриногена и другие лиганды [229]. Впоследствии были определены тромбоцитассоциированные антитела различной специфичности и чувствительности, чаще были обнаружены антитела против GPIIb/IIIa, реже – комплекс GPIb/IX [140]. J.H. Roark et al. (2002) показали, что развитие аутореактивных антител к тромбоцитам обусловлено встречей с различными антигенами кровяных пластинок через клональное расширение В-клеток с использованием генетически ограниченных и высокоспецифических комбинаций генных продуктов тяжелых и легких цепей [276]. Покрытые антителами тромбоциты функционально активны, поэтому у пациентов с ИТП очень редко наблюдаются сильные кровотечения при числе тромбоцитов более 50 х 109/л. Антитела делают тромбоциты мишенью для деструкции системой мононуклеарных фагоцитов, преимущественно в селезенке, но также – в печени и в костном мозге [186, 203]. Пациенты с хронической ИТП часто имеют антитромбоцитарные антитела, специфичные в отношении множества GP: анти-GPIIb/IIIa 40%, анти-GPIb/IX 28%, в отношении обоих 45 антигенов 32%, а также GPIа/IIa. Вместе с тем у части пациентов (40%) при постановке диагноза антитромбоцитарные антитела не обнаруживаются. В некоторых случаях это связано с методами выявления антител, специфичностью антигенов, их расположением на мегакариоцитах, а также не исключено наличие других иммунных механизмов развития заболевания [209; 256; 271]. Значение Fс-рецептора в патогенезе иммунной тромбоцитопении. Тромбоциты, покрытые антителами, являются мишенью для деструкции клетками системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) селезенки, причем Fс-рецептор (FcR) имеет в этом процессе первостепенное значение [129; 202; 207; 222; 284]. Связывающий эффект FcR основан на балансе взаимодействия покрытых антителами частей между активирующими (FcγRIIA и FcγRIIIA) и ингибирующим (FcγRIIВ) рецепторами. Чем определяется этот баланс, пока неизвестно. Роль FcγRI продолжает изучаться: в одном из исследований инфузия блокирующего его антитела повышала число тромбоцитов у части пациентов с ИТП, а в другом наблюдении увеличивала пролиферацию GPIIb/IIIa реактивных Т-клеток [209]. Рецептор для IgG-FcγRIIA экспрессируется на тромбоцитах, нейтрофилах, моноцитах, макрофагах. Он активирует эти клетки через связывание с клетками, покрытыми IgG- или IgG-содержащими иммунными комплексами. Через активацию FcγRIIA рецептора тромбоциты выделяют медиаторы функций сосудов и воспаления [50]. При исследовании in vivo впервые было показано, что антитела, активирующие тромбоциты в FcγRIIA-зависимой форме, могут вызывать не только тромбоцитопению, но и тромбоз, а также шок. Селезенка, которая очищает кровоток, в этом случае играет защитную роль [323]. Также при гепарининдуцированной тромбоцитопении антитела против гепарин PF4-комплекса могут активировать тромбоциты человека in vitro через FcγRIIA-рецептор [356]. Низкоаффинный рецептор IgG-FcγRIIВ экспрессируется большинством гемопоэтических клеток, в том числе В-лимфоцитами, тучными клетками и 46 моноцитами. В исследованиях на мышах было показано, что введение внутривенного иммуноглобулина индуцирует экспрессию ингибиторного FcγRIIВ-рецептора макрофагами селезенки. Также установлено, что эрадикация H. Pylori при ИТП сдвигает рецепторный баланс Fcγ рецептора в сторону ингибиторного FcγRIIВ [161; 202]. Роль Т- и В-клеток в патогенезе иммунной тромбоцитопении. Наличие аутореактивных в отношении тромбоцитов Т-клеток при ИТП впервые было описано Semple и др. (1996). В этом исследовании было показано, что Тлимфоциты периферической крови пациентов с ИТП секретируют ИЛ-2 после их стимуляции аутологичными тромбоцитами [290]. Позднее было доказано, что иммунодоминантные эпитопы, распознаваемые CD4+ T-клетками у пациентов с ИТП, расположены на аминоконцевых частях GPIIbα и GpIIIa [223]. Активация GPIIb/IIIa – реактивных Т-клеток и последующая продукция антитромбоцитарных антител происходят преимущественно в селезенке. Интересно, что аутологичные тромбоциты, полученные до спленэктомии, стимулируют продукцию анти-GPIIb/IIIa антител В-клетками in vitro в присутствии аутологичных Т-лимфоцитов и макрофагов, тогда как полученные в ремиссию аутологичные тромбоциты такого действия не оказывают [224]. Известно, что Т-клетки секретируют цитокины и модулируют клеточный иммунный ответ на антигены. Описаны два основных цитокиновых профиля: 1- й тип – (интерферон-γ, TNF-β и ИЛ-2) обусловливает участие в клеточно- опосредованных реакциях воспаления и гиперчувствительности замедленного типа; 2- й тип – (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-13) контролирует продукцию антител и связан с регуляцией аллергических нарушений, гиперчувствительности немедленного типа. Отмечено, что при ИТП соотношение 1-го и 2-го типов цитокиновых профилей является несбалансированным [202, 290, 333]. Пациенты с активным 47 заболеванием имели значительно более высокие отношения Th1 / Th2 и Тс1 / Тс2 в периферической крови и значительно более высокое отношение Th1 / Th2 в спленоцитах, чем в контрольной группе [333]. Первичная ИТП взрослых хронических больных характеризуется повышенным соотношением Th1 / Th2 (CD4+-клеток) и высоким коэффициентом Тс1 / Тс2 (CD8+-клетки). Кроме того, дисбаланс Th1 / Th2 имеет обратно пропорциональную зависимость с тяжестью заболевания, что означает, чем выше соотношение Th1 / Th2, тем ниже количество тромбоцитов [264; 327]. M. Jernas et al. (2013) обнаружили разные профили экспрессии генов у детей с впервые выявленной ИТП и у пациентов с хронической формой заболевания [200]. Уровни СXCL13 и ИЛ-21 в Т-клетках больных ИТП выявлялись повышенными по сравнению с контролем. Данные молекулы могут быть важными регуляторами, участвующими в потере толерантности [201]. Вместе с тем у пациентов с ИТП обнаружено сниженное содержание CD4+CD25+ Т-регуляторных клеток (Т-рег), которые снижают Т-клеточный иммунный ответ и поддерживают периферическую толерантность. Выявлено, что уменьшение числа Т-рег соответствует более тяжелому течению заболевания. Кроме того, снижение общего соотношения CD4/CD8 связано с выраженностью клинических проявлений болезни [158; 238; 351]. Заслуживают внимания исследования других популяций Т-клеток, секретирующих ИЛ-17, провоспалительный цитокин, участвующий в патогенезе многих аутоиммунных заболеваний. Отмечено, что при ИТП увеличено содержание Т-клеток, секретирующих ИЛ-17 как Th17 (CD4+), так и Tc17 (CD8+). Кроме того, увеличение популяции клеток Tc17 коррелирует с изменением соотношения CD4/CD8 в сторону ИТП [198]. Также при ИТП обнаружено увеличение количества Т-клеток Th22 (CD4+, ИФН-γ–, ФНО-α–, ИЛ17–, ИЛ22+), которые секретируют ИЛ22 и участвуют в аутоиммунных процессах при других патологиях. Повышенное содержание Th22 коррелировало с увеличенными значениями Th1 и Th17 клеток [269; 324; 325; 359]. ИЛ-21 – цитокин, способствующий дифференцировке Th17, ФТХ и 48 В-клеток, может играть важную роль в контроле аутоиммунных процессов при ИТП. Число продуцирующих ИЛ-21 Т-клеток было значительно выше у пациентов с ИТП и снижалось после лечения [198; 355]. Обладающий плейотропным иммуномодулирующим действием цитокин ИЛ-27 – отрицательно регулирует цитотоксичность Т-лимфоцитов по отношению к тромбоцитам при ИТП, уменьшая экспрессию гранзима В, что связано со снижением количества Т-bet [357]. Сниженный уровень ИЛ-10 у пациентов с ИТП поддерживает пролиферацию и хелперную активность CD4+ Т-клеток по стимулированию выработки В-клетками анти-GPIIb/IIIa антител. В исследовании in vitro на клетках периферической крови больных ИТП было показано, что при внутривенном введении анти-CD154 (моноклонального антитела, вызывающего блок взаимодействия CD40 рецептора антиген-презентирующих клеток и его лиганда – CD154 на активированных СD4+ клетках, которое необходимо для Т-клеточного гуморального ответа) индуцировалась анергия активированных CD4 + Т-клеток и снижалась их пролиферация при повторном введении. Анергии активированных CD4+ Т-клеток сопутствовали сниженные уровни ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-6, но продукция ИЛ-10 была сохранена. При добавлении же антитела ИЛ-10 супрессорный эффект анти-CD154 антител на активированные СD4+-лимфоциты отменялся [221]. Имеются данные, доказывающие прямой цитотоксический эффект Т-клеток [159; 292; 353]. У части больных ИТП в микрочипах ДНК была обнаружена повышенная экспрессия нескольких цитотоксических генов, таких как гранзим-А, гранзим-В и перфорин, а также генов, вовлеченных в Th1-клеточный иммунный ответ (ИФН-γ, ИЛ-2 рецептор-β). Вместе с тем была выявлена повышенная экспрессия семейства иммуноглобулин-подобного рецептора киллерных клеток (KИР) на CD3+ Т-клетках у пациентов с ИТП как в период ремиссии заболевания, так и при активном процессе. КИР тормозят ответы цитотоксических Тлимфоцитов (Тс) и натуральных киллеров (NК) путем связывания с молекулами МСН 1-го класса, предотвращая лизис клеток мишеней. Таким образом, 49 Тс вовлечены в патогенез ИТП. При использовании радиометок К562 in vitro был обнаружен прямой лизис тромбоцитов Т-клетками у большинства пациентов с активной формой заболевания, в то время как этого не отмечалось ни у одного пациента в период ремиссии. Установлено, что эффекторными при этом были CD3+CD8+ Т-клетки. Цитотоксические CD8+ Т-клетки были обнаружены у некоторых пациентов с ИТП, они непосредственно способны лизировать тромбоциты и накапливаться в костном мозге, что потенциально может ухудшить тромбоцитопоэз [227; 262; 327]. Исследования S. Audia et al. (2013) подчеркивают основную роль селезенки в активизации CD8+ лимфоцитов у пациентов с ИТП и участие этих клеток в разрушении тромбоцитов, чем и объясняется резистентность этих пациентов к ретуксимабу. Авторами доказано, что циркулирующие ИКК не полностью отражают иммунный ответ, который возникает в лимфоидных органах во время активности процесса [127]. Увеличение содержания Т-клеточной экспрессии VLA-4 и CX3CR1 в костном мозге больных ИТП может служить свидетельством о возможном органемишени аутоиммунного процесса – костном мозге [262]. Исследованиями X. Li (2012) установлено, что некоторые субпопуляции Влимфоцитов, обладающие регуляторными функциями, опосредованными частично ИЛ-10, у больных с ИТП были снижены. Это свидетельствует об ослаблении воздействия В-регуляторных лимфоцитов на активированные моноциты. Причем терапия препаратами ТПО способствовала увеличению содержания этой субпопуляции В-лимфоцитов и повышению показателей тромбоцитов [232]. Особенности мегакариоцитопоэза и продукции тромбоцитов при иммунной тромбоцитопении. Основные патогенетические механизмы мегакариоцитопоэза и тромбоцитопоэза, ответственные за возникновение ИТП, могут быть отнесены к категориям: линейных дефектов мегакариоцитов и их дифференцировки, тромбоцитов [177]. нарушений созревания мегакариоцитов и выброса 50 Всегда предполагалось, что при ИТП происходит компенсаторное, но неадекватное увеличение продолжительности жизни продукции тромбоцитов. тромбоцитов было В показано, исследованиях что продукция тромбоцитов являлась повышенной, но только в два или в три раза и не у всех пациентов. Предполагалось, что ускоренное выведение существенно превышало продукцию и время жизни тромбоцитов [50; 51]. Эффект антител на мегакариоциты согласуется с теми фактами, что мегакариоциты экспрессируют на своей поверхности GPIIb-IIa, GPIb-IX и большая часть антитромбоцитарных антител при ИТП реагирует с одним или обоими из этих GP-комплексов [50; 248]. Эффект плазмы взрослых пациентов с хронической ИТП на мегакариоцитопоэз in vitro изучали McMillan et al. (2004). Клетки CD34 + здоровых доноров культивировались с человеческим пегилированным рекомбинантным фактором роста и развития тромбоцитов (PEG-rHuM-GDF, форма TPO) и 10% плазмой больных ИТП или здоровых лиц. Культуры, содержащие плазму больных ИТП, показали значимое снижение в продукции мегакариоцитов, а также нарушение их созревания в сравнении с контрольными образцами [248]. В исследовании К. Eto (2016) обобщены основные генетические механизмы, связывающие тромбоцитопоэз и тромбоцитопению, – это дефекты дифференцировки и созревания мегакариоцитов, а также нарушения выброса тромбоцитов [177]. Другими исследователями было найдено укорочение легкой цепи антител у больных ИТП. ограниченности Эти два исследования антитромбоцитарных свидетельствуют антител, о клональной являющихся продуктом ограниченного числа В-клеток [276]. Исследования M. Jernas (2013) показали полное разделение профилей экспрессии генов у детей с острой и хронической формами заболевания. Были выявлены также различия в уровнях нескольких цитокинов у этих пациентов [200]. Изучение микро-РНК, кодирующих экспрессию генов, выявило у больных 51 ИТП потенциальные регуляторные молекулы Т-клеток, участвующие в потере толерантности [201]. Вирус-ассоциированная ИТП у детей часто развивается после перенесенного вирусного заболевания [73]. Вирусная инфекция излечивается, но инициирует ИТП, возможно, через молекулярную мимикрию или через Вклеточную стимуляцию, хотя точный механизм неизвестен. Заболевание может быть ассоциировано с вирусным гепатитом В, гепатитом С, вирусом Эпштейна– Барра. Лечение гепатита В и С противовирусными препаратами часто приводит к приросту тромбоцитов. ИТП при Helicobacter pylori может быть обусловлена молекулярной мимикрией, когда продукция антител на патоген вызывает продукцию аутоиммунных антител. Экспрессия Lews-антигенов Helicobacter Pylori стимулирует продукцию антитромбоцитарных антител, так как тромбоциты могут на себе абсорбировать Lews-антигены из сыворотки. Таким же образом хроническая инфекция может изменять цитокиновое микроокружение, вызывая потерю толерантности и стимуляцию В-клеток [161]. Место спленэктомии в лечении иммунной тромбоцитопении. Доминирующее положение глюкокортикостероидных гормонов (ГКГ) в терапии первой линии сохраняется более 50 лет и не подвергается сомнению до настоящего времени [35; 71; 76; 162; 227]. В терапии ГКГ нуждаются около 70% больных ИТП. Эти препараты подавляют Т- и В-клеточную реактивность [73, 76, 107, 256, 263]. Даже после 4 дней приема высокой дозы дексаметазона были выявлены снижение интерферона-γ, увеличение содержания ИЛ-4 и FcγRIIb на моноцитах. Кроме того, первая линия терапии ИТП также может включать введение внутривенного иммуноглобулина [76; 107; 195], или анти-D-глобулина. Механизм действия этих препаратов недостаточно изучен, но, как полагают, они восстанавливают иммунный баланс и толерантность путем индукции ингибирующих факторов в РЭС (FcγRIIb) и, возможно, за счет ингибирования, опосредованного комплементом повреждения клеток, подавляя В- и Т-лимфоциты и оказывая 52 непосредственное анти-идиотипическое влияние на циркуляцию антитромбоцитарных антител [107; 326]. Терапия ИТП второй линии также основана на иммуномодулирующем эффекте. Спленэктомия способствует удалению большой части ретикулоэндотелиальной системы («моноцитарно-макрофагальный фильтр»), обеспечивает восстановление иммунных функций [22; 162; 186; 189; 219; 230; 241; 256; 304]. Хирургическое лечение ИТП дает самый высокий уровень долгосрочного ответа (от 50% до 70%) по сравнению со всеми другими видами терапии этого заболевания [156; 186; 189; 211; 265]. Рефрактерные к хирургическому лечению формы наблюдались чаще у больных ИТП с кортикостероидной зависимостью [189]. N. Vianelli et al. (2005) проанализировали результаты спленэктомии в многоцентровых исследованиях и установили, что после хирургического лечения рецидивы наступали в 23% случаев, причем у большинства пациентов (80%) в течение 48 месяцев после операции [330]. В отечественной и иностранной литературе широко обсуждаются вопросы последствий спленэктомии и возможной профилактики осложнений (сепсис, гипоспленизм, тромбоз воротной вены и др.), однако общей концептуальной картины изменений в организме после удаления селезенки нет [36; 60; 61; 68; 70; 74; 114; 122; 139; 149; 168; 169; 173; 179; 216; 230; 241; 280; 303; 304; 324]. Иммуномодулирующие методы лечения могут быть также использованы в случаях ИТП, которые потерпели неудачу при терапии первой или второй линии. Например, ритуксимаб (анти-CD20) в сочетании с кортикостероидами предсказуемо уменьшает популяцию B-клеток в селезенке, но также длительно увеличивает содержание Т-рег и уменьшает обнаруживаемые явления олигоклональности в популяциях Т-клеток [126; 127; 160; 186; 187; 263; 268; 292; 306; 307]. Применяются и другие препараты, такие как даназол, циклофосфан, циклоспорин А, азатиоприн и винкристин, и уже известно их иммуномодулирующее действие [107; 239; 256; 269]. В последние годы арсенал препаратов, эффективных при рефрактерной 53 ИТП, расширился за счет появления нового класса – миметиков тромбопоэтина (ТПО), агонистов рецептора ТПО (ромиплостим, элтромбопаг). Миметики ТПО, как полагают, непосредственно взаимодействуют с рецепторами TПО на мегакариоцитах и стимулируют образование тромбоцитов [26; 76; 107; 186; 188; 220; 283]. Вместе с тем увеличение T-рег было обнаружено после воздействия тромбопоэтических препаратов, то есть они имеют иммунорегуляторную активность [135; 158]. Однако при длительном лечении больных ИТП ромиплостимом у части пациентов образуются нейтрализующие антитела к эндогенному ТПО и возобновлению тромбоцитопении [150]. Кроме того, у пациентов с ИТП в ряде доклинических и клинических исследований этих препаратов наблюдались случаи фиброза костного мозга (ретикулинового и коллагенового), который уменьшался при прекращении лечения [107]. Особенности иммуноморфологии селезенки при иммунной тромбоцитопении. Первое описание спленэктомии при ИТП было сделано Р. Kaznelson в 1916 году в Вене, когда он, будучи студентом-медиком, уговорил курирующего хирурга удалить селезенку у больного с этим заболеванием. После операции уровень тромбоцитов успешно нормализовался, и, таким образом, была обозначена ключевая роль селезенки в патогенезе данной болезни [209]. Однако причина тромбоцитопении оставалась неясной. Было неизвестно, разрушала ли селезенка тромбоциты или это было связано с секретом, ингибирующим продукцию тромбоцитов. А. Whipple в 1926 году описал 81 случай спленэктомии у больных ИТП. Автор отмечал беспрецедентную эффективность вмешательства и неблагоприятные отдаленные последствия, связанные с развитием инфекционных осложнений [339]. Спленэктомия на протяжении 25 лет оставалась единственным методом лечения заболевания до появления кортикостероидов. C.A. Doan и соавторы в 1960 году описали голубые селезеночные гистиоциты, заполненные липидами, предположив, что это и есть «деструкторы» тромбоцитов [170]. В 1961 году S.L. Saltzstein сравнил гистологические характеристики селезенок 7 больных ИТП и пациентов с болезнями Гоше, Нимана–Пика, гиперлипидемией. Автор сделал вывод, что гистологические 54 характеристики при ИТП не совпадают с таковыми перечисленных заболеваний, ни в одном из 7 случаев не было найдено перегруженных липидами клеток в костном мозге. При гиперлипидемии пенистые макрофаги располагались диффузно, в то время как при ИТП – перифолликулярно. Исследователь выяснил, что в цитоплазме пенистых макрофагов при данном заболевании были включения, содержащие фосфолипиды, источником которых может быть фагоцитоз тромбоцитов [284]. При гистологическом исследовании селезенки у больных ИТП Ю.В. Анохина и соавт. (1969) выявили гиперплазию лимфоидной ткани, увеличение числа и размеров ЛУ с крупными ГЦ. Авторы отмечали усиленную макрофагальную реакцию и широкую маргинальную зону. В КП встречалось большое количество эозинофилов, ретикулярных клеток и плазмоцитов, были выражены изменения сосудистой сети и стромы органа. На основании изучения острой формы болезни исследователи сделали вывод о том, что данные изменения в селезенке не могли развиться только в период клинического появления заболевания и что, по-видимому, существует «скрытая фаза», характеризующаяся нарастающей дезорганизацией соединительной ткани [4]. При анализе гистологической структуры селезенки у больных ИТП M. Tavassoli et al. (1975) установили, что БП характеризуется наличием большого количества лимфоидных узелков, содержащих высокореактивные герминативные центры. В МЗ была обнаружена сеть сосудов, окруженная плазматическими клетками. Авторы сделали вывод, что эти данные свидетельствуют об активном производстве антител и согласуются с концепцией о том, что селезенка является основным источником продуцирования антитромбоцитарных антител при ИТП. В пульпарных тяжах КП, и особенно в МЗ, было обнаружено большое количество тромбоцитов на разных стадиях разрушения. Они проявлялись как внеклеточно, так и в цитоплазме макрофагов [322]. РЭС селезенки играет важную роль в деструкции клеток, покрытых антителами. Отмечено, что при нормальной ее функции имеет место снижение продолжительности жизни тромбоцитов у пациентов с повышенными 55 тромбоцитассоциированными IgG-антителами. Вместе с тем у больных с увеличенным содержанием тромбоцитассоциированных IgG-антител и нарушением работы РЭС укорочение продолжительности жизни тромбоцитов наблюдалось не всегда. Блокада РЭС приводит к сохранению в циркуляции IgGсенсибилизированных клеток. Главным механизмом действия глюкокортикостероидов, применяемых в качестве терапии первой линии ИТП, является именно подавление функции РЭС. Кортикостероиды ингибируют Fcрецепторы на клетках РЭС, а также вызывают дозозависимое уменьшение их количества для IgG и С3. Аналогичный иммуномодулирующий механизм наблюдается и у даназола [207]. Патологические изменения селезенки у больных ИТП были показаны в работе M.M. Hayes et al. (1985). Авторы установили, что увеличение БП и ЛУ с ГЦ, а также большое количество гистиоцитов и макрофагов в КП встречается только у части больных. Предшествующая спленэктомии ИСТ не меняет морфологической картины селезенки [194]. C помощью сканирующего электронного микроскопа была изучена микроциркуляция селезенки больных ИТП. Установлена выраженная пролиферация артериол и капилляров в БП и МЗ в 92,3% фолликулов, кроме того, в них выявлено отсутствие маргинальных синусов (89,4%), что значительно увеличивает время прохождения опсонизированных антителами тромбоцитов по этим структурам в непосредственной близости макрофагов и приводит к повышенному разрушению кровяных пластинок [289]. G. Winde et al. (1996) подтвердили, что спленэктомия является лечением выбора при рецидивах после ИСТ. Авторы выявили, что изолированный тромбоцитолиз в селезенке, увеличение количества мегакариоцитов и гиперплазия БП коррелировали с лучшим послеоперационным исходом и могли служить возможными прогностическими факторами [341]. У пациентов с ИТП селезеночные макрофаги являются основными антигенпрезентирующими клетками, поддерживающими продукцию тромбоцитарных антител. Сочетание депонирующей роли и функций анти- 56 периферического иммунного органа способствует связыванию этих антител с мембранными рецепторами на тромбоцитах. Благодаря уникальным особенностям селезеночной микроциркуляции в ней замедлен кровоток, что дает возможность макрофагам разрушать сенсибилизированные клетки вследствие опосредованного Fc-рецепторами фагоцитоза [104; 216]. В работе A. Solanilla et al. (2005) установлено, что CD154, ассоциированный с тромбоцитами, может способствовать активации аутореактивных В-лимфоцитов в ИТП. Взаимодействие между активированными тромбоцитами и В- лимфоцитами может происходить в селезенке, которая считается основным местом для продукции антитромбоцитарных антител при ИТП [319]. В иммуногистохимическом исследовании C. Daridon (2012) показано, что в селезенках больных ИТП выявляются две различные структуры, содержащие пролиферирующие В-клетки: классические зародышевые центры и пролиферирующие ЛУ. При ИТП внутри пролиферирующих ЛУ в IgM, содержащем иммунные комплексы, плотно связанные с ФДК и приближенные к пролиферирующим В-клеткам, были обнаружены аутоантигены GPIIb/IIIa и GPIV. Аутоантигены не были выявлены в герминативных центрах пациентов с ИТП и в контрольных группах [164]. B. Olsson (2012) отметил в своей работе, что, несмотря на то, что спленэктомия нормализует количество тромбоцитов у 70% пациентов с ИТП, о селезенке при этом заболевании известно очень мало. В проведенном авторами исследовании морфологии селезенки выявлено увеличение количества Влимфоцитов в КП, содержание В-клеток в БП и Т-клеток в БП и КП было без изменений. В КП число В-клеток увеличивается вместе с Т-хелперами, Тцитотоксическими лимфоцитами и макрофагами, расположенными вдоль синусоидов, что способствует иммунологической атаке на тромбоциты при ИТП [261]. Z.N. Zhou at al. (2013) обнаружили повышенное содержание в селезенке больных ИТП миелоидных ДК, экспрессирующих CD86, особенно у лиц с рефрактерным течением заболевания [358]. 57 В исследованиях S. Audia (2014) показано, что ФТХ, расположенные в повышенном количестве в ГЦ ЛУ селезенки, являются основными CD4+ клетками, которые стимулируют выработку антител антиген-специфическими Влимфоцитами [128]. Y.H. Park et al. (2016) провели многоцентровое исследование по изучению клинических результатов и прогностических факторов у пациентов с ИТП пожилого возраста. Авторы определили, что возраст больше 60 лет не влиял на ответ на СЭ, но у пожилых пациентов было больше рецидивов и послеоперационных осложнений. Вместе с тем был сделан вывод, что СЭ может обеспечить долговременный ответ пожилым пациентам ИТП [265]. A. Furudoi et al. (2017) проанализировали гистологию и иммунофенотипы послеоперационных селезенок больных с ИТП в зависимости от ответа на предшествующие лечение и спленэктомию. Авторы отметили увеличение МЗ у больных с достигнутой ремиссией. У пациентов, получавших ретуксимаб, селезенка характеризовалась атрофией БП и МЗ, а также увеличением ПАЛМ [183]. Суммируя последние достижения отечественной и зарубежной литературы в изучении роли селезенки в патогенезе ИТП, а также выявления ее изменений при этом заболевании, можно заключить, что вопросы морфологической сущности явлений, происходящих в селезенке при данной патологии, остаются до настоящего времени очень сложной проблемой. 1.3 Морфофункциональная характеристика селезенки при апластической анемии Иммуноморфологические основы патогенеза апластической анемии. Апластическая анемия (АА) – заболевание системы крови, характеризующееся глубокой панцитопенией, развивающейся в результате угнетения костномозгового кроветворения [1; 2; 33; 75]. Приобретенная АА является редким заболеванием. Установлены основные критерии диагноза: трехростковая цитопения-анемия (гемоглобин меньше 58 110 г/л), гранулоцитопения (гранулоциты меньше 2,0 х 109/л), тромбоцитопения (тромбоциты меньше 100,0 х 109/л); снижение клеточности костного мозга и отсутствие мекгакариоцитов, по данным пунктата костного мозга; аплазия костного мозга в биоптате подвздошной кости (преобладание жирового костного мозга) [2; 33; 171; 172; 193]. Выделяют критерии тяжести АА: нетяжелая АА (НАА): гранулоцитопения > 0,5 х 109/л; тяжелая АА (ТАА): гранулоцитопения < 0,5 х 109/л, тромбоцитопения < 20,0 х 109/л; сверхтяжелая АА: гранулоцитопения < 0,2 х 109/л. Рефрактерная АА диагностируется в случае отсутствия эффекта от проводимой комбинированной ИСТ через 6–9 месяцев от начала лечения или после II этапа лечения [33]. Накоплено много доказательств полиэтиологического генеза АА. Среди причинных факторов, провоцирующих развитие недостаточности кроветворения, выделяют лекарственные и химические вещества, радиацию, вирусные, бактериальные и грибковые инфекции, гормональные и метаболические нарушения [2; 52; 102; 193]. По данным большинства исследователей, установить причину заболевания чаще всего не представляется возможным. Это обусловлено, сложностью установления сроков начала болезни, разной продолжительностью латентного периода, то есть интервала от воздействия провоцирующего агента до появления ведущих патологических симптомов. В среднем он составляет от 3 до 6 месяцев [102]. Достижения экспериментальной и клинической гематологии за последние годы позволили более подробно осветить некоторые стороны патогенеза АА [1; 2; 171; 193]. Одним из ведущих механизмов поражения кроветворения при АА считается иммунная агрессия, направленная на клетки-предшественники гемопоэза [33; 98]. Доказана функциональная и анатомическая дефектность гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Она включает в себя блокировку рецепторного аппарата клетки, уменьшение количества CD34+ ГСК, а также снижение их 59 пролиферативной способности. Косвенным доказательством внутреннего дефекта ГСК является успешная трансплантация костного мозга и связь АА с такими клональными заболеваниями, как миелодиспластический синдром, острый миелоидный лейкоз, пароксизмальная ночная гемоглобинурия [18; 57; 67; 121; 130; 148; 180; 260; 343; 348; 349]. Некоторые авторы считают, что изначально поражается стромальное микроокружение костного мозга с изменением генетических программ в этих клетках, что ведет к передаче извращенной информации в геном ГСК [86; 90; 94; 148; 231]. При исследовании профиля экспрессии генов первичных гемопоэтических стволовых клеток CD34 больных АА было установлено, что он соответствовал напряженной, умирающей и иммунологически активированной популяции клеток-мишеней [352]. Иммунные механизмы развития данной патологии включают в себя воздействие активированных Т-лимфоцитов на ГСК. Активация Т-лимфоцитов, экспансия цитотоксических Т-клонов и выброс медиаторов иммунной агрессии кроветворения (ИФН-γ, ФНО-α) или стимулирующих пролиферацию и активацию Т-лимфоцитов (ИЛ-2) приводят к нарушению процессов пролиферации и к стимуляции апоптоза клеток предшественников, вследствие чего происходит значительное уменьшение пула гемопоэтических клеток и развитие аплазии костного мозга [33; 81; 82; 83; 84; 87; 89; 93; 97; 143; 154; 212; 236; 237; 299]. К позитивным регуляторам гемопоэза относятся главным образом колонестимулирующие факторы, эритропоэтин, интерлейкины: ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ6, ИЛ-11. Эти факторы поддерживают пролиферацию полипотентных ГСК, а также миелоидных, предшественников, эритроидных, стимулируя мегакариоцитарных соответствующие и ростки лимфоидных кроветворения [82; 83; 85]. В работе X. Feng (2013) установлены данные о том, что у больных АА были обнаружены высокие уровни ТПО, Г-КСФ. Кроме того, низкие показатели CD40L, CXCL5, CCL5, VEGF и CCL11 коррелировали с количеством тромбоцитов у этих пациентов. Поскольку источником этих факторов роста могут 60 быть как тромбоциты, так и мегакариоциты, то это сообщение может иметь дополнительную информацию о роли тромбоцитов в патогенезе АА [180]. J. Ren et al. (2014) показали, что хемокиновый рецептор CX3CR1 играет ключевую роль в миграции Т-клеток в костный мозг при АА и является потенциальной терапевтической мишенью в лечении этого заболевания [275]. H. Kook et al. (2002) изучили степень и структуру вариабельного региона βцепи Т-клеточного рецепторного репертуара при АА до и после ИСТ. Исследователи установили, что множественные специфические клоны опосредуют иммунный процесс при этом заболевании [212]. J.P. Monteiro et al. (2005) в своей работе доказали, что в костном мозге находятся активированные CD4+ Т-клетки (1–3%), которые продуцируют цитокины, связанные с поддержанием кроветворения [254]. В последние годы в исследованиях S. Kordasti et al. (2012) отмечена важность влияния CD4+ Т-клеток на аутоиммунный ответ: CD4+ Т-клетки, продуцирующие γ-интерферон (Th1-клетки); CD4+ Т-клетки, продуцирующие ИЛ4 (Th2-клетки); CD4+ Т-клетки регуляторные (Т-рег); CD4+ Т-клетки, продуцирующие ИЛ-17 (Th17-клетки) [92; 213]. При АА отмечаются снижение содержания Т-регуляторных клеток и низкий уровень транскрипционного фактора Foxp3. В состав Т-регуляторных (СD4+) клеток входят несколько субпопуляций: находящиеся в покое (CD45RA+, Foxp3 low); активированные (CD45RA–, Foxp3 high) и цитокин-секретирующие (CD45RA–, Foxp3 low) [92; 213]. Разнообразие этих клеток может свидетельствовать об их функциональной гетерогенности. Некоторые Т-регуляторные клетки обладают супрессорной функцией, тогда как клеточные элементы других субпопуляций (CD4 +, CD25+, CD45RA–, Foxp3 low) секретируют провоспалительные цитокины, такие как ИЛ17, ИЛ-2, ИФН-γ, и имеют минимальные ингибиторные функции. Соотношение и функции этих клеток очень важны в оценке аутоиммунных нарушений при АА [116; 118; 130; 213; 226; 286; 302]. Исследования субпопуляций Т-рег клеток выявило две различные группы этих клеток, имеющие 61 корреляцию с ответом на ИСТ [214]. Исследования J. Shi et al. (2012) показали, что число Т-рег (CD4+CD25+) при АА снижено как в периферической крови, так и в костном мозге, кроме того, миграция этих клеток в крови нарушена за счет низкого содержания CXCR4. При АА Т-регуляторные клетки не способны ингибировать продукцию ИФН-γ эффекторными клетками in vitro. Все эти дефекты Т-рег могут способствовать ухудшению кроветворения, проводимого эффекторными Т-клетками [295]. Выявленные в недавних исследованиях снижения и функциональные нарушения Т-рег клеток у больных АА были определены преимущественно у пациентов с тяжелой формой заболевания. Кроме того, было доказано, что эффекторные клетки Т-лимфоциты) (CD8+ способны супрессировать Т- регуляторные клетки, что существенно дополняет понимание иммунных механизмов развития АА [213]. Установленная экспрессия Т-bet, транскрипционного регулятора, который является ключевым в дифференцировке наивных Т-клеток в Th1 CD4+, встречается у большинства больных АА. У пациентов с этим тяжелым заболеванием Т-bet связан непосредственно с проксимальным участком промоутера ИФН-γ, без какой-либо предшествующей стимуляции в отличие от здоровых лиц. Блокирование транскрипции ИФН-γ ингибиторами Itk-киназы приводит к снижению Т-bet и ИФН-γ [301]. J.E. Roderick внутриклеточного et al. NOTCH (2013) и T-bet, продемонстрировали, ключевого что фактора экспрессия транскрипции, регулирующего дифференцировку клеток Th1, была в клетках селезенки и костномозговой Т-клеточной инфильтрации во время активности заболевания [279]. B. Quarm et al. (2012) выявили, что Th1 и Th2 были значительно выше у пациентов с АА, чем у здоровых доноров. Содержание T-рег CD4+ у ТАА было ниже, чем у здоровых и НАА. Кроме того, было выявлено изменение функции Трег. Количество клеток Th17 у больных с ТАА было повышенным и без изменений – у НАА [273]. 62 Известно, что физиологически Т-клетки мигрируют в костный мозг в ответ на хемокины SDF-1α, лиганд для CXCR4. Ингибирование CXCR4 у мышей с АА с использованием CXCR4–/– спленоцитов значительно уменьшает инфильтрацию костного мозга Т-лимфоцитами [218]. Поиск антигенов-мишеней для цитотоксических СD8+ обнаружил, что кинектин, который экспрессируется на гемопоэтических предшественниках, может выполнять эту роль у пациентов с АА. Это является еще одним шагом к пониманию патофизиологии этого сложного заболевания [196]. В работе K.A. Ganapathi et al. у части больных АА была выявлена мутация гена GATA2, это является неблагоприятным фактором прогноза в плане развития МДС и ОМЛ у этих пациентов и имеет принципиальное значение при выборе тактики терапии, поскольку ТКМ является единственным адекватным способом лечения в данном случае [184]. Место спленэктомии в комплексном лечении апластической анемии. Известно, что цель терапии АА – восстановление нормальной функции костного мозга [33; 41; 42; 55]. Современная тактика лечения взрослых больных АА – это трансплантация аллогенного костного мозга (ТКМ) и/или комбинированная иммуносупрессивная терапия, включающая два основных препарата, обладающих выраженным иммуносупрессивным действием: антитимоцитарный глобулин (АТГ/АЛГ) и циклоспорин А (ЦсА) [33; 155]. Перспективным и патологически обоснованным методом выбора терапии является трансплантация костного мозга (ТКМ) от доноров-кровных родственников. Ряд авторов приводят сведения о выживаемости при ТКМ, составляющей 60–90% [18; 120; 210; 266; 344; 346; 347]. Отсутствие гистосовместимого донора у 2/3 больных, сложность данного способа лечения, высокий риск отторжения трансплантата, инфекционных осложнений, образование солидных опухолей и высокая стоимость данного вида лечения ограничивают его применение в 70–85% случаев [41; 100; 210; 267; 340; 349]. Есть данные, свидетельствующие о повышении выживаемости у пациентов, 63 получавших ИСТ совместно с аллогенной ТКМ [18; 346; 348]. Больным АА, перенесшим аллогенную ТКМ, для достижения наилучших результатов лечения, в режим кондиционирования кроме АТГ и циклофосфана (ЦФ) добавляли низкие дозы общего облучения тела [165]. Программы лечения больных АА могут включать и другие терапевтические воздействия, в частности спленэктомию [23; 31; 32; 53; 54; 56; 101; 102; 110; 282; 304]. Так называемым «золотым стандартом» лечения больных АА на сегодняшний день является сочетание АТГ/АЛГ и ЦсА как у взрослых, так и у детей [7; 33; 57; 113; 181; 182; 208; 243; 347]. К сожалению, далеко не все пациенты отвечают на первый курс АТГ/АЛГ. Применение же повторных приемов приводит к развитию аллергических реакций, опухолевых процессов, геморрагическому синдрому, инфекционным и другим тяжелым осложнениям [17; 34; 62; 63; 64; 65; 349]. Вторым, не менее важным компонентом, входящим в программу ИСТ больных АА, служит ЦсА [11; 31; 56; 208; 287; 348]. Его действие основано на подавлении продукции, селекции и прикрепления цитокинов (в первую очередь ИЛ-2 и ИФН-γ) к специфическим внутриклеточным рецепторам. Это приводит к селективному угнетению токсических Т-лимфоцитов [7; 31]. Многие авторы уделяют особое внимание использованию при лечении пациентов Г-КСФ. Имеются сведения, что одновременное с ИСТ введение такого рода препаратов не повышает выживаемости больных, но и снижает процент инфекционных осложнений [11; 130; 300; 325]. Результаты ряда исследований показали, что использование Г-КСФ в сочетании с ИСТ в лечении АА можно отнести к факторам риска возникновения поздних клональных осложнений (МДС и ОМЛ) [300]. Еще одним из применяемых иммуносупрессивных препаратов является ЦФ. Он действует на все фазы клеточного цикла, включая G0, обеспечивая тем самым более длительную ремиссию подобно ТКМ. Данные о приеме и необходимой дозировке данного лекарственного вещества варьируют [32; 141; 288; 354]. 64 В перспективе, в отсутствие подходящего донора для ТСК, рассматриваются для лечения рефрактерных форм АА такие препараты, как алемтузумаб (CD52) или элтромбопаг [167; 244; 285]. К дополнительным иммуносупрессивным средствам относятся препараты микофеноловой кислоты (селсепт, майфортик), которые могут улучшить результаты лечения пациентов с АА с непереносимостью ЦсА [111; 112]. Регулярные переливания эритроцитарной массы приводят к развитию перегрузки железом у больных АА, что может вызывать осложнения течения основного заболевания. Использование в лечении деферасирокса является эффективным и безопасным препаратом для лечения этой группы пациентов [228]. Согласно последним методическим рекомендациям, спленэктомия может быть включена в программу лечения взрослых больных АА в случае непереносимости АТГ или временного отсутствия препарата при лечении больных рефрактерной АА, то есть не ответивших на первый или второй этап ИСТ АТГ в течение 3–6 месяцев [33]. Вопрос о роли удаления селезенки в лечении АА в литературе обсуждается давно, и мнения авторов противоречивы. Есть мнение, что спленэктомию у этих пациентов можно рассматривать как альтернативный АЛГ-метод лечения НАА, а при тяжелой форме заболевания операцию применять с целью преодоления резистентности к проводимой терапии или в случае непереносимости АЛГ. Эффективность хирургического вмешательства, возможно, предопределена удалением большой массы активированных клеток, ответственных за выработку негативных регуляторов гемопоэза [54; 55; 103; 282]. Кроме того, считается, что спленэктомия влияет на снижение потребности в донорских тромбоцитах и частоту развития геморрагического синдрома, за счет того, что в селезенке происходит депонирование клеток крови и их разрушение. Авторы отмечают, что наиболее эффективно проведение этой операции в течение первых 3 месяцев после установления диагноза [102]. Удаление органа иммунной системы проводят в комплексе с приемом 65 других иммуносупрессивных лекарственных веществ. Так, например, сочетание спленэктомии с АЛГ и ЦсА приводит к снижению CD4 и CD8 лимфоидных клеток и нормализации инверсии CD4/CD8 соотношения. Комбинирование спленэктомии с ЦФ и ГКС повышает выживаемость больных до 81% при ТАА и до 92% при НАА [32; 101; 103]. B. Speck et al. (1996) провели оценку положительных и отрицательных последствий спленэктомии у 80 больных ТАА. Были сделаны выводы, что спленэктомия вызывает значительное увеличение нейтрофилов, ретикулоцитов, тромбоцитов периферической крови в течение 2 недель и после этого непрерывное улучшение кроветворения. Это не приводит к увеличению частоты поздних клональных осложнений. Спленэктомию у больных АА можно рассматривать как безопасный метод [304]. Имеются данные и об использовании лапароскопического удаления селезенки у пациентов с нетяжелой и тяжелой АА c одновременным применением АЛГ и ЦсА. При этом ремиссия достигается от 70% до 86% у ответивших на терапию больных, а 5-летняя выживаемость составляет 60–70%. Эффективность данного метода заключается в снижении потребности в заместительной гемотрансфузионной терапии [23; 24; 61]. В исследовании S. Roman et al. (1994) были подтвеждены выводы о том, что спленэктомия имеет положительное влияние на течение АА только у тех пациентов, у которых было увеличение числа экспрессирующих клеток CD3+CD8+FcR+ как в периферической крови, так и в селезенке [282]. Однако в литературных источниках встречаются и другие суждения. Так, есть мнение, что операция должна применяться лишь в тех случаях, когда нет эффекта от других видов терапии, или в качестве вспомогательного метода лечения. А.А. Махмануров в своей диссертации указывает на рациональность применения хирургического вмешательства только детям с нетяжелой формой АА [48]. Морфологическая структура селезенки при апластической анемии. Известно, что спленэктомия имеет положительное влияние на течение этого 66 тяжелого заболевания за счет удаления большой массы активированных лимфоцитов, провоцирующих супрессию гемопоэза. Кроме того, после операции в большинстве случаев отмечается снижение потребности в донорских тромбоцитах и частоты развития геморрагического синдрома [54; 103]. Однако литературных источников, посвященных изучению структуры селезенки при этом тяжелом заболевании, крайне мало. В ранних исследованиях, выполненных Абдулкадыровым К.М. и соав. (1995), установлено, что размеры и масса селезенки у пациентов с АА чаще всего не изменены. Масса органа в большинстве случаев составляла 81–150 г. При микроскопическом исследовании селезенки у больных АА выявлялись уменьшение в размерах лимфоидных фолликулов, их атрофия. Сохранившиеся фолликулы состояли в основном из зрелых лимфоцитов, иногда встречались бластные клетки. Кроме того, авторы отмечали, что в процессе течения болезни у пациентов с АА наблюдались нарушения структуры стенок внутриселезеночных сосудов, выражающиеся в утолщении и гомогенизации их стенок, гиперплазии эндотелия вплоть до полной облитерации просвета сосудов. Выявлялось развитие периваскулярного склероза, фиброадении пульпы и отложения гемосидерина в селезенке, что существенно нарушало процессы микроциркуляции в органе [1]. По мнению Н.Я. Лагутиной, актуальность изучения красной пульпы селезенки у больных АА обоснована тем, что в патогенезе геморрагического синдрома существенное место отводится не только состоянию внутреннего гемостаза, но и проницаемости сосудистой стенки [44]. Автором установлено, что мелкие сосуды поражаются в большей степени, чем крупные. В центральных артериях фолликулов определено выраженное плазматическое пропитывание сосудистой стенки, гиалиноз сосудов. Неравномерное утолщение и гомогенизация стенки артерий, разволокнение мышечного слоя и набухание основного вещества соединительной ткани, приводящее к утолщению стенок сосудов, которое сопровождалось отложением PAS-положительных веществ. Во всех трех слоях сосудов были выявлены дистрофические нарушения с вторичными пролиферативными и склеротическими изменениями, что похоже на морфологию 67 при системных васкулитах. Это позволило предположить участие аллергического и аутоиммунного механизмов в генезе развития кровоточивости при АА. Нарушение проницаемости сосудов при АА приводит к накоплению в стенках сосудов белков плазмы с последующим образованием гиалина [44]. В целом строма селезенки при АА полнокровна, бедна клеточными элементами. Наряду с лимфоцитами и ретикулярными клетками в ней встречаются эозинофилы, плазматические клетки. Часто встречаются глыбки гемосидерина, выявлено относительное увеличение содержания моноцитов [80; 106]. Таким образом, основываясь на данных литературы, очевидно, что структура селезенки при АА претерпевает определенные изменения в течение заболевания. В литературных источниках недостаточно полно рассмотрен вопрос относительно соотношений клеточных субпопуляций и возможного влияния их на течение АА. Полагаем, что положительное влияние спленэктомии на течение заболевания нельзя связать только с уменьшением после операции количества активированных лимфоидных элементов, так как аналогичных действием обладает консервативная ИСТ. Не исключено, что в процесс заболевания вовлекается вся строма селезенки, как белая, так и КП органа. 1.4 Общая оценка данных литературы Проведенный анализ источников отечественной и зарубежной литературы позволяет сделать следующее заключение, что имеется активный интерес к морфологической сущности селезенки как к вторичному органу лимфоидной системы. Суммируя данные отечественной и зарубежной литературы, можно заключить, что исследования структуры и функций селезенки в основном направлены на изучение морфологии функциональных зон, миграционных свойств ИКК, цитокинового профиля иммунных реакций, а также процессы клеточных взаимодействий. Вместе с тем в доступной литературе практически отсутствуют работы, посвященные характеристике иммуноморфологии БП и КП 68 селезенки в зависимости от активности иммунного процесса и этапов иммунного ответа. До настоящего времени не разработана методология морфометрических исследований селезенки, в связи с чем имеющиеся данные о размерах структурных составляющих пульпы и количественном составе ИКК в компартментах селезенки разрозненны и бессистемны. Нельзя не отметить, что большое количество исследований выполнено с целью изучения патогенетических механизмов, происходящих с участием селезенки при цитопениях иммунного генеза (ИТП и АА). Между тем исследовательский поиск показал, что до сих пор не установлены причины возникновения резистентных к ИСТ форм заболевания. Нет четкого представления, в каком звене иммунного ответа происходит нарушение, приводящее к рефрактерному течению болезни. Процессы, происходящие в селезенке, при различных формах течения ИТП изучены недостаточно. Это убеждает в необходимости поведения углубленного морфометрического и иммуногистохимического изучения распределения ИКК в селезенке с оценкой размеров структурных составляющих этого многофункционального органа в зависимости от формы болезни и ответа на хирургическое лечение. Несмотря на то, что рядом авторов доказана эффективность удаления лимфоидного органа при АА и спленэктомия входит в программную терапию заболевания, данная тактика лечения депрессии кроветворения в настоящее время используется в клинической практике крайне редко. Различия в ответах на хирургическое лечение, вероятно, указывают на связь заболевания не только с недостаточностью костного мозга, но и с возможными изменениями в структуре селезенки. Основываясь на данных литературы, не исключено, что нарушения в строме органа зависят от тяжести процесса, длительности заболевания и полученной ИСТ. Однако недостаточно опубликовано данных морфометрического анализа размеров структурных составляющих и клеточного состава этого органа в зависимости от степени тяжести АА и сроков выполнения спленэктомии. 69 Понимание иммунных механизмов требует дальнейших исследований в этом контексте более новыми и современными технологиями, позволяющими проводить и анализировать не только функциональные зоны селезенки, но и субпопуляционный состав клеток органа. Подобные изучения, возможно, расширят общее представление о патогенетических процессах при данной патологии и позволят более полно раскрыть особенности вовлечения селезенки в развитие аплазии костного мозга. Кроме того, полагаем, что изучение структуры органа в зависимости от тяжести и продолжительности заболевания до операции обоснуют факторы прогноза течения цитопений иммунного генеза. Выявление закономерностей иммуноморфологических процессов в селезенке позволит методологически по-новому с помощью современных иммуногистохимических и морфометрических технологий подходить к характеристике изменений структуры этого сложного органа и обосновать способы прогнозирования течения ИТП и АА после хирургического лечения, что является актуальным и имеет важное фундаментальное и практическое значение. 70 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материал исследования В работе исследовали послеоперационные селезенки (n = 80). Распределение по группам представлено в Таблице 1. Таблица 1 – Распределение образцов материала по группам Группы больных n Больные с иммунной тромбоцитопенией 50 Больные с апластической анемией 30 Группа сравнения 20 Всего: 100 Сравнительный анализ проводили с аутопсийными препаратами селезенок (архивный материал), взятых от 20 лиц, скончавшихся скоропостижно и не имевших в анамнезе заболеваний системы крови, болезней печени, инфекционной и другой патологии, имеющей влияние на структуру селезенки. Медиана возраста составила 39 (36,3; 50,5) лет. Мужчин было 12 (60,0%), женщин – 8 (40,0%). Средняя масса селезенки в группе сравнения была 122,5 (115,0; 143,8) г. В обследование вошли 50 больных ИТП, которым была проведена спленэктомия. Возраст пациентов на момент постановки диагноза варьировал от 18 до 66 лет, медиана – 38,0 (22,75; 52,0) лет. Большую часть больных составили лица женского пола – 32 (64%), мужчин было 18 (36%). Средняя масса селезенки больных ИТП составила 158,5 (138,8; 175,3) г. В зависимости от формы заболевания все больные ИТП были разделены на три группы (Таблица 2). 71 Таблица 2 – Характеристика больных ИТП Впервые Персистирующая Хроническая Характеристика диагностированная форма форма (n = 12) (n = 20) (n = 18) 36,0 35,5 38,5 Медиана возраста (18,3; 48,5) (21,5; 52,0) (23,8; 51,3) Средняя масса селезенки Получали ИСТ до спленэктомии Продолжительность наблюдения до спленэктомии, месяц Продолжительность наблюдения после спленэктомии, месяц 169,5 (137,1; 200,0) 155,0 (140,0; 177,8) 157,8 (131,3; 167,8) – 5 3 3,0 (1,6; 3,0) 7,0 (5,0; 10,0) 36,0 (20,0; 112,0) 111,0 (57,0; 174,0) 91,0 (73,0; 126,3) 185,5 (129,5; 202,0) При определении эффективности спленэктомии больные ИТП были разделены на подгруппы: - подгруппу 1 составили пациенты, у которых после спленэктомии установилась ремиссия (n = 32); - в подгруппу 2 были включены лица с рефрактерным течением заболевания после удаления селезенки (n = 18). Некоторые характеристики обследуемых больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию представлены в Таблице 3. Предполагаемую причину заболевания практически у половины пациентов установить не представилось возможным. Вместе с тем у 24% больных ИТП диагностировалась после острых инфекций (гепатит, острые инфекции верхних дыхательных путей), у 22% пациентов имелись хронические очаги инфекции (хронический тонзиллит, синуситы, пиелонефрит и др.) До спленэктомии все больные получали курсы (1–4 курса) терапии глюкокортикостероидами в дозе 0,9 ± 0,2 мг/кг/сутки в пересчете на преднизолон. Восьми пациентам до операции была проведена вторая линия терапии 72 иммунодепрессантами (винкристин, мекофенолат мофетил, азатиоприн). Умерших в группах пациентов с ИТП не было. Таблица 3 – Характеристики больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию Характеристика Медиана возраста 1-я подгруппа (n = 32) 2-я подгруппа (n = 18) 31,5 (20,3; 46,5) 51 (24,8; 59,0) Распределение по полу, абс. (%) - мужчин 12 (37,5%) - женщин 20 (62,5%) 6 (33,3%) 12 (66,7%) Средняя масса селезенки (г) 158,5 (142,5; 169,8) 153,0 (127,3; 192,5) 8 (25,0%) 7 (21,9%) 17 (53,1%) 4 (22,2%) 13 (72,2%) 1 (5,6%) 12,0 (3,0; 41,0) 5,0 (3,0; 7,0) 134,0 (70,0; 190,0) 89,0 (51,0; 132,5) Форма течения заболевания, абс. (%) - впервые выявленная - персистирующая - хроническая Продолжительность наблюдения до спленэктомии, месяц Продолжительность наблюдения после спленэктомии, месяц Проведено исследование селезенки у 30 больных АА. Возраст пациентов на момент постановки диагноза варьировал от 18 до 71 года. Медиана возраста составляла 21,0 (18,0; 38,3) лет. Количество больных мужского пола было 22 (73,3%), женского – 8 (26,7%). Диагноз устанавливали на основании общепринятых критериев [31]. Из возможных причин АА преобладали инфекционные заболевания (гепатит – 20%, острые инфекции верхних дыхательных путей – 33,4%), у 23,3% пациентов имелись хронические очаги инфекции (хронический тонзиллит), воздействие химических факторов составило 3,3%. У 20% пациентов с АА причина возникновения заболевания была неизвестна. После установления диагноза больным АА назначалось лечение по протоколу комбинированной иммуносупрессивной терапии больных АА, в котором предусматривается обязательное проведение спленэктомии [Югов Ю.И. 73 и др. Способ индукции ремиссии у больных приобретенной апластической анемией / патент на изобретение № 2412708 от 27.11.2008]. Согласно этому методу лечения операцию удаления селезенки проводили как можно раньше от начала терапии глюкокортикоидами. После спленэктомии больным назначали курсы циклоспорина-А и циклофосфамида. Компоненты крови и сопроводительное лечение применяли по общепринятым протоколам. Из 30 пациентов АА у 12 (40%) была установлена форма нетяжелой апластической анемии (НАА) и у 18 (60,0%) – тяжелая апластическая анемия (ТАА). Распределение по возрасту и полу в группах было сопоставимо с тенденцией некоторого увеличения возраста при ТАА. Все пациенты получали ГКС до операции в дозе 0,9 ± 0,2 мг/кг/сутки в пересчете на преднизолон, части больных АА до спленэктомии проводилась ИСТ. Средняя масса удаленных селезенок 90,4 – (70,9; 126,0) г. Продолжительность заболевания до спленэктомии колебалась от 1 до 15 месяцев. Процент умерших был выше в группе лиц с тяжелым течением заболевания (Таблица 4). В зависимости от длительности предоперационного периода все больные были разделены на две группы (Таблица 5): с продолжительностью от начала заболевания до спленэктомии: 2 месяца (1-я группа, n = 20) и более 2 месяцев (2-я группа, n = 10). Таблица 4 – Характеристика больных АА в зависимости от степени тяжести Характеристика больных АА НАА (n = 12) ТАА (n = 18) Медиана возраста Распределение по полу, абс. (%) - мужчин - женщин Получали ИСТ (циклоспорин-А) до спленэктомии, абс. (%) Средняя масса селезенки (г) Продолжительность заболевания до спленэктомии, месяцев Продолжительность наблюдения после спленэктомии, месяцев Количество умерших, абс. (%) 24,5 (20,0; 36,8) 30,5 (19,5; 46,5) 7 (58,3%) 5 (41,7%) 15 (83,3%) 3 (16,7%) 4 (33,3%) 10 (55,5%) 102,5 (80,0; 136,25) 120,0 ( 100,0; 155,3) 5,0 (1,0; 15,0) 2,0 (2,0; 5,0) 66,0 (28,0; 111,0) 26,0 (5,0; 73,5) 2 (16,6%) 8 (44,4%) 74 Таблица 5 – Характеристика больных АА в зависимости от срока выполнения спленэктомии Характеристика больных АА 1-я группа (n = 20) 2-я группа (n = 10) Медиана возраста 24,0 (19,3; 38,8) 33,0 (21,0; 59,0) Распределение по полу - мужчин - женщин 16 (80,0%) 4 (20,0%) 6 (60%) 4 (40%) Степень тяжести АА, абс. (%) - НАА - ТАА 7 (35,0%) 13 (65,2%) 5 (50%) 5 (50%) Получали ИСТ (циклоспорин-А) до 8 (40,0%) спленэктомии, абс. (%) 6 (60,0%) Средняя масса селезенки (г) 115,0 (90,0; 140,0) 100 (77,5; 167,0) Продолжительность жизни после спленэктомии, месяцев 66,0 (18,5; 131,0) 16,0 (6,0; 37,0) Количество умерших, абс. (%) 4 (20,0%) 6 (60%) Дизайн исследования представлен в Таблице 6. Все исследования проведены с соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной Медицинской организации (ВМА) «Этические принципы медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов», принятой на 8-й Генеральной Ассамблее ВМА, Хельсинки, Финляндия, июнь 1964, с изменениями, внесенными на 64-й Генеральной Ассамблее ВМА, Форталеза, Бразилия, октябрь 2013 [World Medical Association Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, adopted by the 18 th WMA General Assembly, Helsinki, Finland, June 1964, and amended by the 64th WMA General Assembly, Fortaleza, Brazil, October 2013], Основами законодательства Российской Федерации «Об охране здоровья граждан», Приказом МЗ РФ № 266 от 19.07.03 г. «Об утверждении правил клинической практики в Российской Федерации», Национальным стандартом Российской Федерации «Надлежащая клиническая практика», 2005 г. 75 Таблица 6 – Дизайн исследования I. Морфологическое исследование селезенки группы сравнения Методы исследования Группа сравнения (n) Гистологический анализ (окрашивание срезов 20 гематоксилином и эозином, азуром II и эозином) с морфометрическим исследованием Иммуногистохимический: окрашивание антителами (CD20; CD3; CD4; CD8; CD57 (NK); CD68; MAC387; 20 MPO; CD11c; S100; CD35; Factor VIII) с морфометрическим исследованием II. Морфологическое исследование селезенки группы больных ИТП Иммунная Методы исследования тромбоцитопения (n) Гистологический анализ (окрашивание срезов 50 гематоксилином и эозином, азуром II и эозином) с морфометрическим исследованием Иммуногистохимический: окрашивание антителами (CD20; CD3; CD4; CD8; CD57 (NK); CD68; MAC387; 50 MPO; CD11c; S100; CD35; Factor VIII) с морфометрическим исследованием III. Морфологическое исследование селезенки группы больных АА Апластическая анемия Методы исследования (n) Гистологический анализ (окрашивание срезов 30 гематоксилином и эозином, азуром II и эозином) с морфометрическим исследованием Иммуногистохимический: окрашивание антителами (CD20; CD3; CD4; CD8; CD57 (NK); CD68; MAC387; 30 MPO; CD11c; S100; CD35; Factor VIII) с морфометрическим исследованием Примечание: n – количество наблюдений в группе 2.2 Методы исследования В настоящем исследовании для решения поставленных задач был использован комплекс морфологических методик: 1) гистологический метод; 2) иммуногистохимический метод; 3) морфометрический метод. 76 С использованием данных методов нами получены следующие патенты: № 2535059 от 08.10.2014 «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № от 04.06.2015 2555355 «Способ морфометрической оценки прогноза течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № 2563284 от 21.08.2015 «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD8 + Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № 2594119 от 19 июля 2016 г. «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.); № 2599021 от 08 сентября 2016 г. «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н., Ванеева Е.В.); № 2621627 от 06 июня 2017 г. «Способ морфометрической оценки прогноза течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Ванеева Е.В.); № 2625036 от 11 июля 2017 г. «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по массе CD4+ T-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А.). Гистологический метод. Образцы селезенки фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине на фосфатном буфере (pH 7,2). Проводка ткани была сделана в стандартному гистопроцессоре протоколу. замкнутого Заливали типа материал Tissue-Tek®VIP™5Jr в парафин по «Гистомикс». Исследовались парафиновые гистологические срезы толщиной 3–5 мкм по стандартным методам окраски: гематоксилином и эозином, азуром II и эозином. Иммуногистохимический метод. Парафиновые гистологические срезы толщиной 3–5 мкм наносили на адгезивные стекла, обработанные полилизином 77 (Thermo, Великобритания). Для дифференцировки В- и Т-клеточных зон БП селезенки, а также для изучения особенностей распределения клеточных популяций в функциональных зонах органа основных использовалось иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание первичными антителами фирм Dako (Дания), BioGenex (США), Monosan (Нидерланды) в готовых разведениях, система визуализации EnVISION, PEROXIDASE (DAB+) фирмы Dako (Дания), Таблица 7. Таблица 7 – Характеристика используемых в работе антител МКАТ Клон Производитель Маркируемые клетки CD20 L26 Dako, Дания В-лимфоциты CD3 PS1 Dako, Дания Общая популяция Т-лимфоцитов CD4 4В12 BioGenex, США Т-хелперы CD8 C8/144B Dako, Дания Цитотоксические Т-лимфоциты CD57 NK1 Dako, Дания Натуральные киллеры CD68 PG-M1 Dako, Дания Тканевые макрофаги CD11c 5D11 Monosan, Нидерланды Дендритные клетки, гистиоциты MAC387 MAC387 Dako, Дания Гранулоциты, клетки моноцитарногистиоцитарного ряда MPO polyclone Dako, Дания Гранулоциты S100 polyclone Dako, Дания Интердигитальные дендритные клетки CD35 RLB25 BioGenex, США Фолликулярные дендритные клетки Factor VIII polyclone Dako, Дания Эндотелиоциты, мегакариоциты ИГХ окрашивание проводилось с помощью иммунопероксидазного метода. После депарафинизации и обезвоживания срезы с целью демаскировки антигенных детерминант подвергали температурной обработке в цитратном буфере, поместив образцы тканей в «Деклокинг». После отмывания в Трисбуферном растворе срезы обрабатывали 0,3% Н2О2 в течение 30 мин. с целью блокировки эндогенной пероксидазы. Затем промывали в Трис-буферном 78 растворе и наносили первичные антитела. Перечень МКАТ, используемых в работе при ИГХ-окрашивании, представлен в таблице 7. Инкубацию с первичными антителами выполняли во влажной камере в среднем от 30 до 45 мин. при комнатной температуре. После промывания препаратов в Трисбуферном растворе наносили систему визуализации EnVision+ (Dako), инкубация 30 мин. Выявление пероксидазной активности осуществляли с помощью DAB+ (Dako). Докрашивали срезы гематоксилином. При просмотре препаратов антигенпозитивные клетки распознавали по окрашиванию их структур в желтокоричневый цвет Морфометрический метод. Гистологическую и морфометрическую оценку результатов осуществляли в световом микроскопе со встроенной фото- и видеокамерой фирмы Leica. В исследовании использовалась компьютерная программа анализа изображений ImageScope Color М. Согласно инструкции, для точности морфометрии перед проведением измерений на изображении проводилась первичная калибровка со стандартизированной шкалой расстояний, данные которой были внесены в память программы объективов. Для вычисления размеров белой пульпы (БП) и красной пульпы (КП) микрофотосъемку проводили цифровой камерой в 20 полях зрения для каждого образца, начиная по направлению от капсулы в глубь селезенки. Исследование размеров компартментов БП выполнялось в не менее 20 фолликулярных структурах в каждом препарате. Для измерения площади и цифровых значений клеточного состава использовали пункт меню «Ручное выделение объектов». Средние площади БП и КП определяли при увеличении х 100; средние площади ПАЛМ, МЗ, ЛУ и ГЦ измеряли при увеличении х 200, цитоморфометрию проводили при увеличении х 1000. Программа автоматически высчитывала площадь, занимаемую тем или иным компартментом, в процентах к общей исследуемой площади среза. Аналогично вычислялись и относительные значения клеточного состава (Рисунок 3). Так как измерения в относительных величинах не отражают полностью размеров тех или иных значений функциональных зон 79 селезенки, а также количественной величины клеточного состава, нами был разработан метод определения абсолютных величин с использованием значения массы органа. Рисунок 3 – Иллюстрация анализа полученных изображений в программе ImageScope Color, версии M. Оценка CD4 положительных клеток при увеличении х 1000 Вычисления размеров функциональных зон и их компартментов проводились согласно патентам № 2535059 от 08.10.2014 и № 2555355 от 04.06.2015. Исходя из представленных технологий, определяли массу удаленной селезенки и выполняли гистологическую проводку образцов послеоперационного материала общепринятым способом. Морфометрический анализ выполняли в гистологических срезах с окраской гематоксилином и эозином (с окуляром x 10, при объективе x 10) с помощью компьютерной программы ImageScope Color, версии M. Подсчитывали среднюю площадь БП на каждом срезе селезенки. Для этого проводили ее измерения в 20 полях зрения для каждого образца, начиная расчеты по направлению от капсулы в глубь лимфоидного органа. 80 Из полученных результатов вычисляли массу БП и КП селезенки по формулам: b = mсел x D% / 100%, (1) где b – масса БП (г), mсел – общая масса селезенки (г), D – средняя площадь БП, %. p = mсел x G% / 100%, (2) где p – масса КП (г), mсел – общая масса селезенки (г), G – средняя площадь KП, %. Вычисления абсолютных значений клеточных элементов (г) выполняли согласно патентам: № 2563284 от 21.08.2015, № 2594119 от 19.07.2016, № 2599021 от 08.09.2016, № 2621627 от 06.06.2017, № 2625036 от 11.07.2017. Образцы с ИГХ-окрашиванием исследовали морфометрически с помощью той же программы, подсчитывая относительные значения количества клеток, экспрессирующих данный маркер, отдельно в каждой функциональной зоне (Рисунок 3). Исходя из полученных результатов вычисляли массу клеточных элементов в БП и КП селезенки по формуле: U = b x C% / 100%, (3) где U – масса В-лимфоцитов в БП (г), b – масса БП (г), С – среднее содержание В-лимфоцитов (%) в БП. Исходя из полученных результатов, вычисляют массу В-лимфоцитов в КП селезенки по формуле: Z = p x J% / 100%, где Z – масса В-лимфоцитов в KП (г), p – масса КП (г), J – среднее содержание В-лимфоцитов (%) в KП. (4) 81 Исходя из полученных расчетов содержание В-лимфоцитов в селезенке будет соответствовать: X = U + Z, (5) где X – содержание В-лимфоцитов в селезенке (г), U – масса В-лимфоцитов в БП (г), Z – масса В-лимфоцитов в KП (г). Y = X x 100% / mсел, (6) где Y – среднее содержание В-лимфоцитов в селезенке (%), X – содержание В-лимфоцитов в селезенке (г), mсел – общая масса селезенки (г). Статистическая обработка полученных результатов 2.3 Статистическая обработка результатов исследования включала описание и анализ полученных данных. Выполнена оценка нормальности распределения количественных учетных признаков с помощью критерия Шапиро-Вилка. Данная оценка показала, что часть количественных признаков имеет распределение, отличное от нормального, что обусловило применение непараметрических методов для описания и анализа количественных результатов исследования. Количественные данные представлены медианой, а также нижним (25%) и верхним (75%) квартилями для каждой группы. Качественные признаки представлены в виде абсолютных (N) и относительных (P, %) величин. Для оценки статистической показателями в значимости сравниваемых различий группах между использовали количественными непараметрические двусторонние критерии: Краскела-Уоллеса (множественные сравнения), МаннаУитни с поправкой Бонферони (апостериорные сравнения между отдельными выборками после применения критерия Краскела-Уоллеса). Для оценки статистической значимости различий выборочных качественных признаков использовался метод χ2 с поправкой на непрерывность Иетса. В случаях ограничения применения метода χ2 (низкие значения ожидаемых частот) сравнительный анализ проводился с помощью точного двухстороннего 82 критерия Фишера. В качестве критического уровня статистической значимости (p) различий выборочных данных взято значение p < 0,05. Анализ мощности используемых статистических критериев (power-analysis) показал, что мощность выбранных статистических критериев соответствует количеству наблюдений в сравниваемых выборках и критическому уровню статистической значимости различий выборочных данных (p) [12; 20]. Статистическая обработка выполнена с помощью программы STATISTICA Advanced 10 for Windows R», лицензионный номер 136-394-673. 83 ГЛАВА 3 МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЕЛЕЗЕНКИ ЧЕЛОВЕКА Особенности гистоархитектоники белой и красной пульпы 3.1 Известные результаты измерений структурных составляющих БП и КП селезенки в норме чаще всего разрозненны и не представляют систематизированного обоснованного материала, подходящего для использования при анализе реактивных изменений, отражающих динамику иммунных процессов. Объяснение этому, по-видимому, кроется в недостаточной разработке методологии морфометрии органа, имеющего в своей структуре зоны с разным строением и функциями, включающими субпопуляции клеточных элементов, отличающихся по иммунофенотипу. При этом для осуществления специфических межклеточных взаимодействий и других функций клетки в селезенке активно перемещаются в определенных направлениях. Принципиально новым подходом к оценке и пониманию особенностей структуры селезенки, размеров ее функциональных зон и распределения ИКК в норме явился пересчет морфометрических показателей с учетом массы органа. Исследовали образцы селезенки лиц, не имевших в анамнезе заболеваний системы кроветворения и другой патологии, которые условно были приняты за норму. В дальнейшем в понятие нормы вложены показатели группы сравнения. Данные представлены в Таблицах 8 и 9. Таблица 8 – Морфометрические параметры красной пульпы Значение Параметр Площадь, % КП 76,4 (74,6; 77,5) В результате гистологических, Масса, г 93,1 (86,5; 109,3) иммуногистохимических и морфометрических исследований получены величины относительных (%) и абсолютных значений (г) размеров КП, а также БП и ее компартментов. 84 Таблица 9 – Относительные и абсолютные значения величин компартментов белой пульпы человека в норме Значение Параметр Площадь, % Масса, г БП 10,6 (9,5; 12,5) 13,1 (11,9; 14,9) МЗ 1,2 (0,9; 2,1) 1,5 (0,9; 2,3) ПАЛМ 3,3 (2,6; 4,6) 4,6 (3,0; 5,2) ЛУ 5,8 (4,8; 6,8) 7,5 (5,5; 8,9) ГЦ 0,0 (0,0; 0,7) 0,0 (0,0; 1,0) Площадь БП селезенки человека в норме занимает значительно меньший объем по сравнению с КП (Рисунок 4). Рисунок 4 – Соотношение функциональных зон селезенки В капсуле, состоявшей из плотной волокнистой ткани, определялись два слоя за счет ориентации коллагеновых волокон. В поверхностном слое эти волокна были более толстые и однородные, глубже они выглядели более рыхло. Толщина капсулы на разных поверхностях была различной, наибольшие размеры ее отмечались в воротах селезенки. Данные толщины капсулы представлены в таблице 10. Вместе с капсулой к опорно-сократительному и амортизирующему аппарату селезенки, помогающему при необходимости быстро изменять объем органа, относятся трабекулы. Площадь трабекул составила 3,7 (1,9; 4,2)%. По данным исследований многих авторов, размер общей площади капсулы и трабекул имел колебания в зависимости от возраста и у людей 22–35 лет составлял 13,57% [56]. 85 Таблица 10 – Толщина капсулы селезенки человека Размер толщины капсулы селезенки, мкм Минимальный Максимальный Среднее значение 58,1 (44,8; 75,1) 153,1 (130,1; 179,1) 92,8 (56,3; 153,7) Для уточнения абсолютных значений размеров функциональных зон нами была определена медиана величины массы капсулы и трабекул, что, по нашим данным, соответствует 15,95 (15,0; 18,73) г. На Рисунке 5 показаны структурные составляющие БП (II этап иммунного ответа): периартериальные лимфоидные муфты (П – на рисунке) расположены вокруг центральной артериолы (ЦА), вторичные ЛУ с выраженными реактивными центрами (Ц – на рисунке) и зонами мантии (ЗМ), широкая маргинальная зона (МЗ) имеет четкие границы с красной пульпой. Красная пульпа (КП) умеренной клеточности. В небольшом количестве выявляются трабекулы (Т). Рисунок 5 – Структурные составляющие БП (II этап иммунного ответа). Окраска азуром II и эозином. Ок. х 10, об. х 10 Показатели массы функциональных зон селезенки, а также массы компартментов БП в зависимости от этапов иммунного ответа представлены в Приложении Б. Установлено, что колебания размеров параметров отделов, составляющих БП, зависят от степени активности иммунных процессов, происходящих в данной зоне, а также в КП. 86 3.2 Особенности морфологической структуры селезенки с учетом этапов иммунного ответа В соответствии с полученными данными нам представляется возможным выделить в исследуемых соответствующие трем образцах этапам морфологические течения особенности, иммунореактивных процессов в функциональных зонах селезенки. I этап. Распознавание антигена. Поступление в селезенку антигенов, свободных или связанных с антигенпрезентирующими клетками. Большая часть антигенов, поступающих с током крови в селезенку, приходит и задерживается в МЗ, взаимодействуя как с В-лимфоцитами, так и с макрофагами, что Рециркулирующие ведет клетки к увеличению (макрофаги объема и данного В-лимфоциты) компартмента. транспортируют связанные с ними антигены в другие отделы БП. Гистоархитектоника селезенки на данном этапе характеризуется: широкой МЗ, небольшими ПАЛМ и ЛУ без ГЦ, КП умеренной клеточности (Рисунок 6). Рисунок 6 – I этап иммунного ответа. БП (черная стрелка) представлена небольшими ПАЛМ и ЛУ без ГЦ. МЗ – широкая (синяя стрелка). КП умеренной клеточности (красная стрелка). Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 87 II этап. Формирование эффекторов: развитие иммунных реакций, презентация обработанных антигенов Т-хелперам; выбор пути дифференцировки CD4+ Т-клеток в направлении Th1- или Th2-хелперов; развитие гуморального иммунного ответа. ПАЛМ, являясь Т-зависимой зоной БП селезенки, содержат Т-лимфоциты (CD3), среди которых преобладают CD4+-Т-клетки, в меньшем количестве встречаются лимфоидные элементы, экспрессирующие цитотоксические CD8+ Тлимфоциты. Изменение размеров этой зоны отражает степень активности Тклеточных процессов, происходящих в БП (Рисунок 7). На рисунке видно, что отмечается увеличение размеров БП, преимущественно за счет МЗ (синяя стрелка), ПАЛМ (зеленая стрелка), ЛУ с выраженными ГЦ (черная стрелка). КП умеренной клеточности (красная стрелка). Рисунок 7 – Селезенка человека, II этап иммунного ответа. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 88 На величину ЛУ влияют вид антигена, его доза и время персистирования в организме. Как известно, в ЛУ до поступления антигена содержатся исключительно В-лимфоциты (CD20+). Начальные события, связанные с распространением антигена и взаимодействием В- и Т-лимфоцитов, происходят в окружении первичных ЛУ, на границе между В- и Т-лимфоидными зонами. При участии Т-лимфоцитов (CD4+ Т-хелперов) осуществляется образование ГЦ, в результате чего первичные ЛУ превращаются во вторичные. Именно на этом этапе происходит формирование гуморального иммунного ответа. Функциональная активность ЛУ определяется тем, на какой стадии развития находятся их герминативные центры. В период активности герминативных центров данная область увеличивается. Уменьшение параметра связано с процессом обратного развития ГЦ. В связи с описанными механизмами развития иммунных процессов определены характерные особенности селезенки на втором этапе: увеличение белой пульпы, преимущественно за счет маргинальных зон, периартериальных лимфоидных муфт и лимфоидных узелков с ГЦ при умеренной клеточности красной пульпы. III этап. Эффекторная часть иммунного ответа. Формирование эффекторного звена иммунной реакции происходит путем дифференцировки клона В-лимфоцитов и образования цитотоксических Т-лимфоцитов. Активированные макрофаги (CD68) и клетки стромы выделяют цитокины и хемокины, которые обусловливают развитие сосудистых и клеточных реакций. При этом повышаются интенсивность кровотока в селезенке, усиление рециркуляции и «улавливания» лимфоцитов в пульпе органа. Вместе с тем активированные Т-лимфоциты, плазматические клетки из различных отделов БП поступают в КП, а затем покидают селезенку для выполнения своих функций на периферии (Рисунки 8, 9, 10). 89 Рисунок 8 – Селезенка человека, III этап иммунного ответа. МЗ (синяя стрелка), ПАЛМ (зеленая стрелка), ЛУ и ГЦ (черная стрелка) – в стадии обратного развития; увеличение клеточного состава КП (красная стрелка). Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 9 – III этап иммунного ответа. Отмечается увеличение клеточного состава КП, синусоиды спавшиеся (красная стрелка). МЗ (синяя стрелка), ПАЛМ (зеленая стрелка), ЛУ (черная стрелка) – в стадии обратного развития. Окраска FVIII, polyclone, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 90 Рисунок 10 – С помощью поликлонального антитела FactorVIII окрашены эндотелиальные клетки синусоидов и тромбоциты. EnVision – DAB. Ок. х 10, об. х 100 Расширение КП может быть обусловлено ее повышенным кровенаполнением или увеличением количества клеточного состава в пульпарных тяжах. Обратные процессы ведут к уменьшению размеров КП. В соответствии с результатами настоящего исследования на третьем этапе развития иммунных реакций в селезенке уменьшаются размеры белой пульпы: МЗ, ПАЛМ, ЛУ и ГЦ претерпевают стадию обратного развития, а площадь красной пульпы расширяется за счет увеличения ее клеточного состава. 3.3 Особенности клеточного состава селезенки Клеточный состав БП структурно специфичен, кроме скоплений Т- и Влимфоцитов она содержит плазматические клетки, макрофагальные элементы и ДК. Часть Т- и В-лимфоидных элементов БП селезенки составляют рециркулирующий пул лимфоцитов, непрерывно мигрирующих по всем лимфоидным органам и другим тканям. Количественный состав ИКК в селезенке оценивался с использованием специфических иммуногистохимических маркеров. Данные представлены в Таблице 11. 91 Таблица 11 – Относительные и абсолютные значения состава популяций иммунокомпетентных клеток селезенки Параметр Селезенка Белая пульпа Красная пульпа CD20 (%) (г) CD3 (%) (г) CD4 (%) (г) CD8 (%) (г) CD68 (%) (г) CD11с (%) (г) CD57 (%) (г) МАС387(%) (г) MPO (%) (г) CD35 (%) (г) S100 (%) (г) 8,8 (7,0; 10,9) 11,2 (7,5; 16,2) 4,8 (1,1; 5,8) 8,3 (5,4; 11,0) 5,5 (4,2; 7,4) 6,7 (4,8; 9,4) 0,5 (0,3; 0,9) 0,6 (0,4; 1,1) 5,4 (4,0; 6,9) 5,9 (4,8; 8,9) 11,5 (8,5; 13,6) 13,3 (11,7; 17,8) 3,2 (2,3; 4,7) 4,2 (2,6; 6,5) 17,7 (11,9; 21,6) 20,1 (13,2; 26,1) 9,7 (8,2; 11,0) 11,4 (9,0; 15,8) 1,0 (0,7; 1,3) 1,2 (0,8; 1,9) 0,8 (0,6; 0,9) 1,0 (0,7; 1,3) 47,1 (34,3; 55,9)* 6,0 (4,7; 7,2) 13,2 (9,3; 20,4)* 2,0 (1,5; 4,3) 12,5 (9,1; 16,6)* 1,6 (1,2; 2,8) ∆ 0,0 (0; 0,6)* 0,0 (0; 0,7) 2,0 (1,2; 2,8)* 0,3 (0,2; 0,4) ∆ 13,1 (8,9; 16;9) 1,7 (1,5; 2,0) ∆ 3,1 (1,9; 4,8) 0,4 (0,3; 0,7) ∆ 0,0 0,0 0,0 0,0 1,3 (0,9; 1,7) 1,2 (0,8; 1,9) 1,1 (0,8; 1,2) 0,1 (0,1; 0,2) ∆ 5,0 (2,9; 8,4)* 4,5 (2,8; 7,8) 5,2 (4,4; 7,4)* 5,2 (3,5; 7,3) 4,6 (4,0; 6;8)* 4,9 (3,2; 6,2) ∆ 0,4 (0,3; 0,7)* 0,4 (0,3; 0,6) 6,0 (5,0; 8,5)* 5,5 (4,6; 8,2) ∆ 12,7 (9,6; 15,5) 11,2 (10,0; 14,3) ∆ 4,0 (2,5; 5,4) 3,8 (2,2; 5,9) ∆ 21,6 (15,3; 23,9) 20,1 (13,2; 26,1) 12,8 (10,9; 14,5) 11,4 (9,4; 15,8) 0,0 0,0 1,0 (0,5; 1,3) 0,9 (0,4; 1,4) ∆ Примечание: * – статистическая значимость различий между показателями БП и КП (%), p < 0,05. ∆ – статистическая значимость различий между показателями БП и КП (г), p < 0,05. В результате морфометрических исследований установлено, что процентное содержание CD20+ В-клеток преобладало в БП по отношению к таковым в КП (р < 0,05). В абсолютных числах количество В-лимфоцитов в БП не имело значимого превышения над значениями в КП (p > 0,05). Показатели общей популяции Т-лимфоцитов (CD3+) в процентном содержании также были больше в БП по сравнению со значениями в КП (р < 0,05), а при пересчете с учетом массы органа существенного преобладания данных клеток в КП не выявлено (p > 0,05). При сравнении содержания субпопуляции CD4+ Т-хелперов определялось значимое увеличение ее в БП в относительных значениях по отношению к КП (p < 0,05), а абсолютные показатели были существенно выше в КП (р < 0,05). 92 Процентное содержание цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов в КП значительно превышало таковое в БП (р < 0,05). Преимущественной зоной локализации популяции макрофагов (CD68) является КП, что подтверждается как относительными, так и абсолютными показателями (р < 0,05). Кроме того, на определенных этапах иммунного ответа в разных количественных соотношениях экспрессирующие CD68 клеточные элементы обнаруживались в МЗ и ГЦ, что подтверждается содержанием данных клеток в этой области. Имеются различия в относительных и абсолютных показателях моноцитарно-гистиоцитарных клеточных элементов и ДК, экспрессирующих CD11c. При анализе относительных значений содержания данных клеток в пульпе органа не выявлено значимых различий (p > 0,05) в БП и КП. Вместе с тем выражено количественное преобладание (р < 0,05) данных клеток в КП в абсолютных значениях (Рисунок 11). Из представленного рисунка видно, что показатели в абсолютных значениях, полученные с учетом массы функциональных зон селезенки, дополняют информацию о количественных соотношениях клеточных популяций в пульпе органа. 60 50 40 КП БП 30 20 10 0 % г CD20 % CD3 г % CD4 г % CD8 г % г CD68 % г CD11c Рисунок 11 – Соотношение содержания клеточных элементов в относительных (%) и абсолютных значениях (г) в белой и красной пульпе Мембранное окрашивание В-лимфоцитов (CD20+) представлено на Рисунке 12. Показано, что в БП выявляются все В-клеточные зоны: МЗ (черная 93 стрелка), в ЛУ происходит формирование ГЦ (зеленая стрелка). КП умеренной клеточности (красная стрелка), отмечаются периваскулярные скопления В-клеток в виде «муфт» (синяя стрелка). Рисунок 12 – В-клеточные зоны. I–II этапы иммунного ответа. Окраска CD20, сlone L26, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Общая популяция Т-лимфоцитов (CD3+), преимущественно состоящая из экспрессирующих CD4+-Т-хелперов, выявлялась в БП (в ПАЛМ). Цитотоксические Т-лимфоциты (CD8) определялись в пульпе органа в единичном количестве (Рисунки 13, 14, 15). На I–II этапах иммунного ответа видно, что ПАЛМ (синяя стрелка) – небольших размеров. МЗ (черная стрелка) – широкая, в ЛУ происходит формирование ГЦ (зеленая стрелка); КП умеренной клеточности (красная стрелка). Клетки, экспрессирующие CD57 (NK), обнаруживались в КП и БП органа. Выявлялось дискретное распределение этих клеточных элементов в МЗ, ЛУ и ПАЛМ (Рисунок 16). На Рисунке 16 видно, что ПАЛМ (синяя стрелка) – небольших размеров, МЗ (черная стрелка) – с нечеткими границами. В ЛУ происходит формирование ГЦ (зеленая стрелка). КП умеренной клеточности (красная стрелка). Отсутствие в селезенке строго определенной области 94 локализации для NK-клеток свидетельствует, что среди данной популяции клеточных элементов преобладает рециркулирующий пул. Рисунок 13 – I–II этапы иммунного ответа. Т-клеточные зоны. Окраска CD3, сlone PS1, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 14 – I–II этапы иммунного ответа. Распределение Т-хелперов. Окраска CD4, сlone 4В12, BioGenex, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 95 Рисунок 15 – Распределение цитотоксических Т-лимфоцитов. Окраска CD8, C8/144B, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 16 – I–II этапы иммунного ответа. Экспрессирующие CD57 (NK) клетки в БП и КП. Окраска CD57, сlone NK1, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 96 Большая часть тканевых макрофагов (CD68+) была локализована в КП селезенки, в меньшем количестве они отмечались в БП (в МЗ и реактивных центрах). Распределение макрофагов на I–II этапах иммунного ответа представлено на Рисунке 17. Рисунок 17 – I–II этапы иммунного ответа. Распределение макрофагов преимущественно в КП (красная стрелка); в МЗ CD68+-клетки отмечаются по периферии данного компартмента (черная стрелка); в ГЦ – дискретное расположение макрофагов (зеленая стрелка). Окраска CD68, сlone PG-M1, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Популяция гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда, экспрессирующих МАС387 и МРО, была расположена преимущественно в КП, в скоплениях по периферии МЗ в виде «ободка» (Рисунки 18, 19). Важную роль в активации и рекрутировании иммунных клеток (макрофагов, гистиоцитов и лимфоцитов) играют CD11c-положительные ДК. Было установлено, что их количество зависит в основном от степени активности иммунных процессов, а локализация – от того, в какой зоне эти явления происходят в момент исследования (Рисунки 20, 21). 97 Рисунок 18 – I–II этапы иммунного ответа. Скопление гранулоцитов и гистиоцитов в КП (красная стрелка). Окраска MAC387, сlone MAC387, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 19 – III этап иммунного ответа. Распределение гранулоцитов в КП (красная стрелка). Окраска MPO, polyclone, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 98 Рисунок 20 – I этап иммунного ответа. Распределение ДК преимущественно на границе БП и КП, а также в МЗ (черная стрелка) и в ПАЛМ (синяя стрелка). Окраска CD11с, 5D11, Monosan, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 21 – II этап иммунного ответа. Дискретное распределение ДК в БП, в МЗ (черная стрелка), в ГЦ (зеленая стрелка), в ПАЛМ (синяя стрелка). Окраска CD11с, 5D11, Monosan, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 99 Аналогичное распределение было выявлено и при изучении интердигитальных ДК (ИДК). Позитивно окрашенные S100 клетки определялись в виде отдельно лежащих клеточных элементов в БП и КП селезенки, их количество зависело от активности иммунных процессов (Рисунок 22). Экспрессирующие S100 ИДК выявляются дискретно в БП и КП. ПАЛМ (синяя стрелка) – небольших размеров. МЗ (черная стрелка) несколько расширена, границы четкие. ЛУ без ГЦ (зеленая стрелка). КП умеренной клеточности (красная стрелка). Рисунок 22 – I этап иммунного ответа. Экспрессирующие S100 ИДК в БП и КП. Окраска S100, polyclone, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Оценку ФДК осуществляли с помощью CD35. При обзорном просмотре образцов селезенки отмечалось преимущественное их расположение в ГЦ (Рисунок 23). Скопление экспрессирующих CD35 ФДК выявлялось в ГЦ (зеленая стрелка). Границы ПАЛМ (синяя стрелка) четко дифференцируются. МЗ (черная стрелка) несколько расширена, границы нечеткие. КП умеренной клеточности (красная стрелка). 100 Рисунок 23 – II этап иммунного ответа. Экспрессирующие CD35 ФДК в ГЦ лимфоидного узелка (зеленая стрелка). Окраска CD35, RLB25, BioGenex, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Следовательно, популяции иммунокомпетентных клеток в норме имеют строгие механизмы распределения в функциональных зонах селезенки. Подобные закономерности иммуноморфологических лимфоидного необходимо органа. особенностях Для понимание расширяют изучения явлений этого представления важного вторичного гистоархитектоники миграции клеточных об селезенки элементов, их перераспределения в белой и красной пульпе с учетом этапов иммунного ответа. Данные процессы влияют на массу функциональных зон органа и соответственно его компартментов. Морфометрическое исследование селезенки с использованием величины ее массы позволяет проводить оценку показателей в абсолютных единицах. Представленные параметры являются существенным дополнением в интерпретации изменений селезенки при диагностике заболеваний с поражением органов иммунной системы. 101 ГЛАВА 4 ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ ИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ 4.1 Оценка гистоархитектоники селезенки при иммунной тромбоцитопении в зависимости от формы заболевания При обзорном просмотре образцов селезенки (окраска гематоксилином и эозином) у больных ИТП гистологическая структура органа сохранена и представлена двумя функциональными зонами – БП и КП (Рисунок 24). Рисунок 24 – Селезенка больного ИТП. Персистирующая форма. ПАЛМ – небольших размеров (синяя стрелка). МЗ умеренно расширена, имеются признаки нарушения микроциркуляции (черная стрелка). ЛУ с нечетко выраженным ГЦ (зеленая стрелка). КП (красная стрелка) – клеточная, выявляются признаки деформации синусоидов. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 В результате морфометрического анализа установлено статистически значимое увеличение площади БП у всех больных ИТП по отношению к группе сравнения как в относительных, так и в абсолютных значениях, р < 0,05. Размеры 102 БП и ее компартментов у обследуемых в зависимости от фазы заболевания отражены в Таблице 12. Таблица 12 – Относительные и абсолютные значения размеров отделов БП селезенки больных ИТП в зависимости от формы заболевания ИТП Персистир. Хроническая Все Впервые Показатели форма, форма, пациенты, диагнстир., n = 20 n = 18 n = 50 n = 12 10,6 15,1 10,4 16,1 17,3 % (9,5; 12,5) (10,3; 18,0)* (8,0; 14,2) (10,2; 21,9) * (12,1; 18,0) * БП 13,1 20,9 17,3 21,8 23,9 г (11,9; 14,9) (13,9; 34,8)* (12,6; 38,2) (13,8; 39,8) * (14,0; 28,5) * 1,2 5,5 2,0 6,6 5,6 % (0,9; 2,1) (3,1; 7,2) * (2,0; 5,6) (3,1; 8,1) * (3,9; 6,4) * МЗ 1,5 7,8 5,6 11,8 6,6 г (0,9; 2,3) (5,3; 12,7) * (2,2; 12,2) * (6,5; 13,2) * (5,3; 9,3)* 3,3 1,7 1,6 1,6 2,0 % (2,6; 4,6) (1,4; 2,0) * (1,2; 1,83) * (1,2; 2,0) * (1,7; 2,3) * ПАЛ М 4,6 2,6 2,1 2,5 2,6 г (3,0; 5,2) (2,0; 3,5) * (1,7; 3,4) * (2,0; 3,2) * (2,2; 3,6) * 5,8 7,6 5,9 8,1 7,6 % (4,8; 6,8) ∆ ∆ (5,5; 9,5) * (6,2; 10,5) * (5,2; 7,1) (7,1; 9,7) * ЛУ 7,5 11,0 11,0 14,6 11,7 г (5,5; 8,9) (6,9; 15,7) * (6,43; 19,47) * (9,9; 16,8) * (6,5; 15,5) * 0,0 0,6 1,0 0,4 0,2 % (0,0; 0,7) (0,2; 1,2) (0,23; 1,2) (0,1; 1,2) (0,0; 1,3) ГЦ 0,0 0,7 0,93 0,6 0,3 г (0,0; 1,0) (0,1; 1,4) (0,17; 1,53) (0,1; 1,8) (0,0; 1,3) Примечание: * – статистическая значимость различий по отношению к данным группы сравнения, p < 0,05; ∆ – статистическая значимость различий между показателями ИТП при разных формах заболевания, p < 0,05. Группа сравнения, n = 20 При морфометрическом исследовании установлено: наиболее выраженные изменения величины БП, как в относительных, так и в абсолютных значениях, наблюдались преимущественно у лиц с персистирующей и хронической формами заболевания по сравнению с нормой (p < 0,05). У пациентов же с впервые диагностированной фазой болезни статистически значимых различий данных показателей установлено не было (р > 0,05). Полученные результаты отражают вовлечение БП в патологический процесс при ИТП и свидетельствуют о том, что 103 для прогрессирующего и хронического течения заболевания оно более характерно. В ходе проведения более детального изучения достоверных отличий размеров компартментов БП в селезенке больных ИТП обнаружено, что наибольшие изменения МЗ выявлялись у лиц с более длительным течением заболевания в отличие от лиц с впервые выявленной формой (p < 0,05) в относительных значениях (Рисунок 25). группа сравнения, n=20 30,0 25,0 ИТП, n=50 20,0 15,0 ИТП, впервые диагностир., n=12 ИТП, персистир., n=20 10,0 5,0 0,0 г % БП г % % МЗ г ПАЛМ г % ИТП, хронич., n=18 ЛУ Рисунок 25 – Соотношение размеров компартментов БП в относительных (%) и абсолютных (г) значениях при ИТП в зависимости от формы заболевания При пересчете данного показателя с учетом массы органа установлено существенное увеличение размеров МЗ во всех группах по сравнению с нормой (p < 0,05). При анализе структуры МЗ отмечались признаки нарушения микроциркуляции, маргинальные синусы в селезенках у лиц с ИТП были деформированы. Усиление васкуляризации МЗ было обнаружено в 89,5%. Более выраженные ее признаки определялись в 78,5% случаев. При этом выявленные структурные изменения не имели заболевания до операции (Рисунок 26). зависимости от продолжительности 104 У всех больных ИТП определялось уменьшение величины ПАЛМ, как в относительных, так и в абсолютных значениях, в сопоставлении с группой сравнения вне зависимости от формы заболевания (p < 0,05). Рисунок 26 – Хроническая форма ИТП. Функциональные зоны (БП и КП) хорошо дифференцируются. В МЗ выражены признаки нарушения микроциркуляции (черная стрелка). Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 У лиц с персистирующей и хронической формами заболевания выявлено достоверное увеличение размеров ЛУ в относительных числах по отношению к группе сравнения. Кроме того, отмечалось значимое отличие данного показателя в процентах у пациентов с впервые диагностированной формой заболевания от такового в группе с персистирующей формой (p < 0,05). Вместе с тем определялось существенное увеличение размеров ЛУ в абсолютных значениях во всех группах пациентов в сопоставлении с группой сравнения. ЛУ были преимущественно без ГЦ. Так, у больных ИТП на 938 проанализированных узелков отмечалось 45 (4,8%) ГЦ. Полученные данные не отличались от соответствующего показателя группы сравнения (р > 0,05), где их показатель составил 2,7%. При морфометрическом исследовании площади КП в зависимости от особенностей течения заболевания выявлено значимое увеличение абсолютных 105 показателей размеров КП при персистирующей форме ИТП (р < 0,05) по отношению к группе сравнения (Таблица 13). Масса капсулы, трабекул и сосудов составила 21,1 (14,3; 26,0) г. Таблица 13 – Относительные и абсолютные значения размеров КП селезенки больных ИТП в зависимости от формы заболевания ИТП Показатели Группа сравнения, n = 20 Все пациенты, n = 50 Впервые диагностир. форма, n =12 % 76,4 (74,6; 77,5) 72,8 (69,0; 76,9) г 93,1 (86,5; 109,3) 110,8 126,2 (90,9; 152,4) * (74,8; 179,0) Персистир. форма, n = 20 76,5 (72.8; 79,0) 72,5 (67,1; 77,2) Хроническая форма, n = 18 69,8 (69,0; 74,9) КП 115,1 109,4 (96,3; 152,4) * (73,0; 135,6) Примечание: * – статистическая значимость различий по отношению к показателям группы сравнения, p < 0,05. Сравнительная характеристика размеров БП и КП в зависимости от фазы ИТП представлена на Рисунке 27. 140,0 группа сравнения, n=20 120,0 100,0 ИТП, n=50 80,0 60,0 ИТП, впервые диагностир., n=12 40,0 ИТП, персистир., n=20 20,0 0,0 % г БП % г КП ИТП, хронич., n=18 Рисунок 27 – Характеристика размеров БП и КП в зависимости от формы ИТП 106 Установлены изменения стенки синусоидов: у пациентов с впервые выявленной ИТП отмечено умеренное ее утолщение, отмечался отек стромы КП; при персистирующей форме изменения сосудов носили более выраженный характер, в единичных случаях выявлялось заполнение их просвета ядросодержащими клетками крови. Наиболее существенные изменения были выявлены у лиц с хронической ИТП – отек стромы КП, утолщение и огрубение стенки синусоидов, сочетающиеся со значительной их деформацией (извитость структуры, расширение просвета). Кроме того, в процессе течения болезни синусоиды становились более мелкими, а их количество в поле зрения увеличивалось (Рисунок 28). При иммуногистохимической оценке структуры КП селезенки с помощью FactorVIII (маркер тромбоцитов и эндотелия) отмечалось, что экспрессия данного антитела подтверждает изменения в сосудах у пациентов с ИТП (Рисунки 29, 30). Рисунок 28 – ИТП, впервые диагностированная форма. Выражены признаки нарушения микроциркуляции в МЗ (черная стрелка). Деформации синусоидов КП (красная стрелка). Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 107 Рисунок 29 – Впервые диагностированная форма. Определяются признаки изменений стенки синусоидов и отек стромы (красная стрелка). Окраска FVIII, поликлон, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 30 – Хроническая форма. Выражены признаки деформации синусоидов (красная стрелка). Окраска FVIII, поликлон, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 20 108 В результате изучения особенностей структуры центральных артерий установлены уменьшение толщины их стенок и сужение просвета сосудов. При этом данные продолжительности изменения течения выявлены ИТП до вне зависимости спленэктомии. от Полученные результаты могут свидетельствовать о дистрофии стенки артерий за счет тромбоцитопении, а также дезорганизации соединительной ткани сосудов иммунного генеза (Рисунок 31). Рисунок 31 – Изменения в стенках центральных гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 100 артерий. Окраска Таким образом, выявлена зависимость выраженности структурных изменений селезенки от формы болезни. Эти явления отражают патогенетические процессы, происходящие в этом органе при ИТП. 4.2 Оценка гистоархитектоники белой пульпы селезенки и ее структурных составляющих при иммунной тромбоцитопении в зависимости от ответа на спленэктомию Абсолютные и относительные значения площадей БП и ее компартментов у обследуемых в зависимости от ответа на спленэктомию представлены в Таблице 14. 109 Таблица 14 – Относительные и абсолютные значения размеров отделов БП селезенки больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию ИТП Ед. БП МЗ ПАЛМ ЛУ ГЦ Группа сравнения, n = 20 Вся группа, n = 50 Ремиссия после спленэктомии (1-я подгруппа), n = 32 Рефрактерное течение (2-я подгруппа), n = 18 % 10,6 (9,5; 12,5) 15,1 (10,3; 18,0) * 17,1 (11,5; 19,65) *∆ 11,6 (9,4; 15,3) ∆ г 13,1 (11,9; 14,9) 20,9 (13,9; 34,8) * 23,2 (12,8; 38,2) * 18,3 (13,6; 24,6) * % 1,2 (0,9; 2,1) 5,5 (3,1; 7,2) * 5,7 (3,5; 7,5) * 5,6 (3,1; 7,6) * г 1,5 (0,9; 2,3) 7,8 (5,3; 12,7) * 7,2 (5,3; 12,6) * 8,2 (5,9; 12,9) * % 3,3 (2,6; 4,6) 1,7 (1,4; 2,0) * 1,8 (1,5; 1,9) * 1,5 (1,23; 2,0) * г 4,6 (3,0; 5,2) 2,6 (2,0; 3,5) * 2,3 (1,9; 3,5) * 2,6 (1,8; 3,6) * % 5,8 (4,8; 6,8) 7,6 (5,5; 9,5) * 7,8 (5,6; 10,3) * 7,4 (5,4; 8,1) г 7,5 (5,5; 8,9) 11,0 (6,9; 15,7) * 14,9 (7,6; 16,9) * 12,6 (8,6; 14,6) * % 0,0 (0,0; 0,7) 0,6 (0,2; 1,2) 0,7 (0,2; 1,2) 1,0 (0,3; 1,2) г 0,0 (0,0; 1,0) 0,7 (0,1; 1,4) 0,7 (0,2; 1,5) 1,1 (0,3; 1,8) Примечание: * – статистическая значимость различий по отношению к показателю группы сравнения, p < 0,05; ∆ – статистическая значимость различий между показателями ИТП в ремиссии и при рефрактерном течении, p < 0,05. При анализе полученных показателей у пациентов с ИТП в зависимости от ответа на хирургическое лечение было выявлено достоверное увеличение размеров БП у лиц 1-й подгруппы по отношению к группе сравнения, как в относительных, так и в абсолютных величинах (p < 0,05). Это свидетельствует о наличии в селезенке у данной категории больных активно выраженных иммунных процессов, что, возможно, и предопределило эффективность спленэктомии как результата патогенетического лечения. У обследованных пациентов с рефрактерной формой заболевания относительные показатели имели лишь тенденцию к увеличению, а абсолютные значения были достоверно повышены, аналогично как в 1-й подгруппе (Рисунок 27). Проведена сравнительная оценка размеров компартментов БП (МЗ, ЛУ, ПАЛМ) селезенки у пациентов с ИТП. Вне зависимости от ответа на 110 спленэктомию у всех пациентов с ИТП обнаружено достоверное увеличение МЗ, а также отмечались признаки нарушения микроциркуляции в МЗ (Рисунок 32). 25 группа сравнения, n=20 20 ИТП, n=50 15 10 ИТП, ответившие, n=32 5 ИТП, рефрактерные, n=18 0 г % БП г % % МЗ г г % ПАЛМ ЛУ Рисунок 32 – Соотношение размеров компартментов белой пульпы при ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию в относительных (%) и абсолютных (г) значениях Вместе с тем относительные значения величин ЛУ были повышены только в группе с достигнутой ремиссией, а абсолютные показатели были достоверно увеличены в обеих исследуемых когортах (p < 0,05). При оценке ЛУ отмечено, что их количество с ГЦ у больных ИТП составило 6,9%. У лиц с достигнутой ремиссией было установлено статистически значимое увеличение этого показателя (7,9%), отличающегося от значений в группе сравнения: (2,8%), χ2 = 15,87; p = 0,001 и пациентов с рефрактерным течением заболевания: (2,2%), χ2 = 4,87; p = 0,027. Вместе с тем ГЦ были небольших размеров, деление на темную и светлую зоны отсутствовало. В результате морфометрического исследования площадей ПАЛМ выявлялось их уменьшение у всех пациентов с ИТП как в относительных, так и в абсолютных значениях (p < 0,05). Это свидетельствует о выходе ИКК из этой области в другие зоны для осуществления своих функций, что, возможно, частично предопределено предшествующей терапией ГКС (Рисунок 32). 111 Таким образом, составляющих БП размеры селезенки и у гистоархитектоника больных ИТП имеют структурных различия в сопоставлении с группой сравнения и в зависимости от ответа на спленэктомию. При этом относительно низкие значения величины БП у больных с рефрактерным течением после спленэктомии (в процентах) в абсолютных величинах (в граммах) не нашли своего подтверждения. 4.3 Особенности гистоархитектоники красной пульпы селезенки при иммунной тромбоцитопении в зависимости от ответа на спленэктомию При анализе размера КП селезенки больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию выявлены разнонаправленные изменения в относительных и абсолютных значениях (Таблица 15). Таблица 15 – Относительные и абсолютные значения размеров КП селезенки больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию ИТП Группа сравнения, n = 20 Рефрактерное Ремиссия после Все пациенты, течение спленэктомии n = 50 (1-я подгруппа), (2-я подгруппа), n = 32 n = 18 69,9 75,5 76,4 72,8 % ∆ (74,6; 77,5) (69,0; 76,9)* (67,4; 75,5)* (71,7; 77,5) ∆ КП 93,1 110,8 110,7 127,6 г (86,5; 109,3) (90,9; 152,4)* (77,1; 130,8)* (90,0; 153,0)* Примечание: * – статистическая значимость различий по отношению к показателям группы сравнения, p < 0,05; ∆ – статистическая значимость различий между показателями больных ИТП, ремиссия и рефрактерное течение, p < 0,05. Ед. У лиц, ответивших на спленэктомию, определялось достоверное уменьшение ее площади (в процентах) по отношению к группе сравнения (р < 0,05). Однако в группе рефрактерных больных такой зависимости не выявлялось. Вместе с тем установлено статистически значимое увеличение размеров этой функциональной зоны у больных как в первой, так и во второй подгруппах (р < 0,05) в абсолютных значениях (Рисунок 33). С целью исследования гистоархитектоники КП селезенки была проведена 112 оценка состояния синусоидов и пульпарных тяжей. Признаки утолщения, уплотнения и огрубения стенок синусоидов, а также огрубение стромы КП отмечались в исследуемых препаратах вне зависимости от ответа на спленэктомию. 140 120 группа сравнения, n=20 100 80 ИТП, n=50 60 ИТП, ответившие, n=32 40 ИТП, рефрактерные, n=18 20 0 г % г % БП КП Рисунок 33 – Сравнительная характеристика размеров белой и красной пульпы в зависимости от ответа на спленэктомию Таким образом, выявлены морфологические особенности структуры БП и КП, а также изменения сосудов селезенки у пациентов с ИТП. Полученные результаты свидетельствуют, что в данном лимфоидном органе происходят иммуноморфологические процессы, которые отражаются на ее гистоархитектонике. 4.4 Содержание популяций иммунокомпетентных клеток в селезенке при иммунной тромбоцитопении Исследования клеточного состава селезенки больных ИТП были выполнены с целью более подробной оценки процессов, происходящих в данном органе при разных формах заболевания. При оценке содержания В-лимфоидной популяции в селезенке у больных ИТП было установлено, что CD20-экспрессирующие клетки 113 располагались преимущественно в В-клеточных зонах БП (МЗ и ЛУ). В КП данные клеточные элементы локализовались дискретно и в небольших периваскулярных скоплениях. В результате морфометрического исследования В-лимфоцитов (CD20+) на гистологических срезах селезенки у больных ИТП было установлено, что для всех пациентов характерно увеличение относительного и абсолютного количества В-лимфоидных элементов по отношению к группе сравнения (Таблица 16). При этом изменения были выявлены как в БП, так и в КП органа (р < 0,05). Таблица 16 – Содержание CD20+ В-лимфоцитов в селезенке больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию Ед. Селезенка БП КП Группа сравнения, n = 20 % 8,8 (7,0; 10,9) 47,1 (34,3; 55,9) 5,0 (2,9; 8,4) г 11,2 (7,5; 16,2) 6,0 (4,7; 7,2) 4,5 (2,8; 7,8) Все пациенты, n = 50 % 23,7 (16,0; 27,6) * 73,4 (63,0; 79,0) * 13,5 (9,8; 17,6) * г 32,8 (19,9; 49,9) ∆ 17,0 (10,4; 27,1) ∆ 16,7 (10,0; 21,4) ∆ Ремиссия после % 26,2 (15,8; 28,0) * 75,7 (63,0; 79,8) * 15,9 (9,0; 18,3) * спленэктомии (1-я подгруппа), г 31,8 (19,5; 52,1) ∆ 16,1 (9,7; 22,6) ∆ 16,7 (10,2; 29,5) ∆ n = 32 Рефрактерное % 17,5 (14,9; 22,18) * 75,3 (71,7; 78,8) * 11,4 (9,4; 14,4) * течение (2-я подгруппа), г 31,3 (18,8; 49,5) ∆ 14,1 (10,8; 29,7) ∆ 16,9 (6,7; 21,3) ∆ n = 18 Примечание: достоверность различий: * – по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05. При морфометрическом подсчете различий содержания в селезенке CD20 +экспрессирующих клеток у лиц с рефрактерным течением ИТП после спленэктомии и больных, ответивших на удаление, выявлено не было (р > 0,05). Полученные результаты свидетельствуют об участии В-лимфоцитов в патогенезе заболевания при всех формах иммунной тромбоцитопении вне зависимости от ответа на спленэктомию (Рисунки 34, 35). 114 Рисунок 34 – 1-я подгруппа. Персистирующая форма. В-клеточные зоны. БП увеличена за счет МЗ (черная стрелка), ПАЛМ – небольших размеров. КП – клеточная (красная стрелка), отмечаются периваскулярные скопления В-клеток в виде «муфт» (синяя стрелка). Окраска CD20, сlone L26, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 35 – 1-я подгруппа. Впервые диагностированная форма. В-клеточные зоны. Компартменты БП четко дифференцируются (ЛУ – зеленая стрелка, МЗ – черная стрелка). Маргинальные синусы сохранены (красная стрелка). В КП содержание В-клеток умеренно повышено. Окраска CD20, сlone L26, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 115 При морфологическом изучении особенностей распределения Т- лимфоидных элементов в селезенке было установлено, что общая популяция CD3+ Т-клеток определялась, как в ПАЛМ, ближе к центру, окружая сосуд в виде ободка (Т-клеточная зона), так и в МЗ, в меньшем количестве в ЛУ. В КП органа CD3экспрессирующие клетки располагались диффузно в умеренном количестве. По содержанию CD3+-Т-элементов (в относительных и абсолютных значениях) выявлено увеличение их количества у всех больных ИТП по отношению к группе сравнения вне зависимости от ответа на спленэктомию, р < 0,05 (Таблица 17). При этом статистически значимое повышение уровня данной клеточной популяции было установлено преимущественно как в БП, так и в КП селезенки (Рисунки 36, 37). Таблица 17 – Содержание CD3+ Т-лимфоцитов в селезенке больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию Ед. Селезенка БП КП Группа сравнения, n = 20 % 4,8 (1,1; 5,8) 13,2 (9,3; 20,4) 5,2 (4,4; 7,4) г 8,3 (5,4; 11,0) 2,0 (1,5; 4,3) 5,2 (3,5; 7,3) Все пациенты, n = 50 % 17,6 (14,4; 21,7) * 29,5 (18,9; 37,7) * 18,1 (15,0; 23,9) * г 27,4 (22,7; 32,9) ∆ 4,9 (3,7; 7,7) ∆ 19,1 (16,0; 26,8) ∆ Ремиссия после спленэктомии (1-я группа), n = 32 Рефрактерное течение (2-я группа), n = 18 % 18,2 (11,6; 25,1) * 28,1 (13,1; 38,9) * 16,8 (11,8; 23,2) * г 26,2 (17,6; 31,7) ∆ 5,1 (3,0; 9,2) ∆ 16,9 (12,8; 21,7) ∆ % 20,0 (15,4; 21,6) * 31,4 (23,9; 35,4) * 19,1 (17,0; 24,0) * г 29,4 (24,3; 39,0) ∆ 4,9 (4,4; 5,9) ∆ 24,0 (18,4; 33,8) ∆ Примечание: достоверность различий * – по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05. 116 Рисунок 36 – 1-я подгруппа. Персистирующая форма ИТП. Т-лимфоциты, окраска CD3, определяются в ПАЛМ (синяя стрелка), в ГЦ (зеленая стрелка) и красной пульпе (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 37 – 2-я подгруппа. Хроническая форма ИТП. Т-лимфоциты, окраска CD3, определяются в ПАЛМ (синяя стрелка) и красной пульпе (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 117 Дальнейшее исследование было направлено на более детальный анализ Тклеточных субпопуляций. Так, при морфометрическом изучении относительного и абсолютного содержания CD4+-лимфоидных элементов выявлено увеличение их количества у всех больных ИТП по отношению к группе сравнения вне зависимости от ответа на спленэктомию, р < 0,05 (Таблица 18). При этом статистически значимое повышение уровня данной клеточной субпопуляции было установлено преимущественно как в БП, так и КП селезенки. Вместе с тем существенное увеличение массы CD4+-Т-клеток было выявлено у больных, ответивших на хирургическое лечение, по сравнению с пациентами с рефрактерным течением заболевания, р < 0,05 (Рисунки 38, 39). Таблица 18 – Содержание CD4+ Т-лимфоцитов в селезенке больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию Ед. Группа сравнения, n = 20 Все пациенты, n = 50 Ремиссия после спленэктомии (1-я подгруппа), n = 32 Рефрактерное течение (2-я подгруппа), n = 18 Селезенка БП КП % 5,5 (4,2; 7,4) 12,5 (9,1; 16,6) 4,6 (4,0; 6;8) г 6,7 (4,8; 9,4) 1,6 (1,2; 2,8) 4,9 (3,2; 6,2) % 11,1 (8,8; 14,6) * 25,4 (19,7; 34,0) * 10,1 (7,1; 11,5) * г 16,9 (12,3; 21,9) ∆ 4,8 (3,7; 9,4) ∆ 11,93 (7,0; 14,2) ∆ % 12,6 (9,8; 16,4) * 26,0 (13,7; 35,1) * 10,4 (7,2; 13,3) * г 20,4 (14,3; 26,0) ∆ 9,9 (5,8; 13,6) ∆● 11,5 (7,0; 14,3) ∆ % 10,4 (7,9; 12,7) * 23,5 (20,0; 30,9) * 9,6 (7,1; 10,6) * г 16,0 (11,2; 18,2) ∆ 4,1 (3,8; 5,0) ∆● 11,5 (9,0; 12,7) ∆ Примечание: достоверность различий * – по отношению к подгруппе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – по отношению к подгруппе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05; ● – между 1-й и 2-й подгруппами в абсолютных значениях, p < 0,05. 118 Рисунок 38 – 1-я подгруппа. Персистирующая форма ИТП. CD4+ Т-хелперы. Окраска CD4+ Т-хелперов; определяются в ПАЛМ (синяя стрелка) и красной пульпе (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 39 – 2-я подгруппа. Хроническая форма ИТП. CD4+ Т-хелперы. Окраска CD4+. Определяются в ПАЛМ (синяя стрелка) и в КП (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 119 В результате полученных морфометрических характеристик абсолютного содержания CD4+-Т-лимфоцитов нами обоснован способ прогнозирования течения ИТП после спленэктомии, характеризующийся тем, что при значениях массы данной субпопуляции клеток в селезенке ≤ 20,5 г наблюдалась чаще всего рефрактерная форма заболевания (патент № 2599021 от 08.09.2016) и более низкие показатели CD4+ Т-клеток наблюдались в БП. В то время как в КП увеличенные значения таковых были у всех пациентов с ИТП, независимо от ответа на спленэктомию. При исследовании содержания CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке было отмечено, что они располагались преимущественно в КП. В результате морфометрического анализа данной клеточной популяции в лимфоидном органе установлено достоверное увеличение их количества (p < 0,05) в относительных и абсолютных величинах у всех больных ИТП по отношению к группе сравнения, причем за счет их повышенного содержания в КП (Таблица 19). Как в первой, так и во второй подгруппе установлено статистически значимое увеличение уровня CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке у больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию по отношению к группе сравнения, р < 0,05. При этом большее количество данной клеточной популяции по абсолютному содержанию было выявлено в КП органа. Кроме того, существенные различия в содержании CD8+ Т-клеток в КП были выявлены у пациентов с рефрактерным течением заболевания по отношению к обследованным, ответившим на спленэктомию, р < 0,05. Полученные данные указывают на перераспределение Т-лимфоцитов в КП, что свидетельствует о наличии прямого цитотоксического эффекта Т-клеток (CD3+, CD8+) у пациентов в активной стадии ИТП. Значительное увеличение содержания цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов в КП позволяет сделать вывод о том, что у рефрактерных больных в разрушении тромбоцитов в данной зоне наряду с макрофагами участвуют и лимфоциты. 120 Таблица 19 – Содержание CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию Ед. Селезенка БП КП % 0,5 (0,3; 0,9) 0,0 (0; 0,6) 0,4 (0,3; 0,7) г 0,6 (0,4; 1,1) 0,0 (0; 0,7) 0,4 (0,3; 0,6) % 5,1 (2,8; 6,1) * 3,6 (2,4; 5,9) * 6,1 (3,7; 7,1) * г 7,7 (4,2; 12,0) ∆ 0,8 (0,5; 1,1) 5,6 (3,8; 10,2) ∆ Ремиссия после спленэктомии (1-я подгруппа), n = 32 % 3,7 (2,0; 5,3) * 2,7 (2,0; 4,5) * 4,7 (2,2; 6,4) * г 5,1 (2,5; 10,3) ∆ 0,7 (0,4; 0,9) 5,0 (2,3; 7,0) ∆● Рефрактерное течение (2-я подгруппа), n = 18 % 6,2 (5,2; 7,9) * 5,6 (3,4; 7,4) * 7,1 (6,1; 9,5) * г 11,3 (6,9; 15,6) ∆ 1,1 (0,7; 1,5) 10,1 (8,6; 15,9) ∆● Группа сравнения, n = 20 Все пациенты, n = 50 Примечание: достоверность различий * – по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05; ● – между 1-й и 2-й подгруппами в абсолютных значениях, p < 0,05. Выявленные изменения позволили обосновать способ прогнозирования рефрактерного течения заболевания по содержанию CD8-положительных цитотоксических лимфоцитов в селезенке больных ИТП. Масса данных клеток, превышающая 9,75 г, свидетельствовала о неблагоприятном прогнозе болезни после спленэктомии (патент № 2563284 от 21.08.2015. При этом Т-клеточные элементы, экспрессирующие CD8+ преимущественно в КП (Рисунки 40, 41). Т-лимфоциты, располагались 121 Рисунок 40 – 1-я подгруппа. Персистирующая форма ИТП. Цитотоксические Тлимфоциты, окраска CD8, определяются в ПАЛМ (синяя стрелка) и красной пульпе (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 41 – 2-я подгруппа. Хроническая форма ИТП. Цитотоксические Тлимфоциты, окраска CD8, определяются в ПАЛМ (синяя стрелка) и КП (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 122 Кроме того, у больных ИТП в селезенке отмечалась положительная реакция с CD8 в эндотелиальных клетках синусоидов КП, что, возможно, имеет также патогенетическое значение (Рисунок 42). Рисунок 42 – 2-я подгруппа. Хроническая форма ИТП. Цитотоксические Тлимфоциты, окраска CD8 (синяя стрелка), и эндотелий синусоидов экспрессирует CD8 (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 40 В результате вычисления индекса соотношения масс CD4+/CD8+, полученных при исследовании селезенки больных с разным течением ИТП после спленэктомии, было обнаружено, что при значениях индекса менее 2,3 прогнозируется рефрактерная форма заболевания. Показатели данного индекса ≥ 2,4 свидетельствуют о более благоприятном течении болезни (патент № 2621627 от 06.06. 2017). Известно, что у пациентов с ИТП селезеночные макрофаги являются основными антигенпрезентирующими клетками, поддерживающими продукцию антитромбоцитарных антител, а также разрушают сенсибилизированные кровяные пластинки вследствие опосредованного Fc-рецепторами фагоцитоза. Макрофаги в селезенке располагались вдоль синусоидов, а также перифолликулярно, что является отражением иммунологической атаки на тромбоциты в данных зонах при ИТП (Рисунки 43, 44, 45, 46). 123 Рисунок 43 – 1-я подгруппа. Персистирующая форма ИТП. Признаки нарушения микроциркуляции МЗ (красная стрелка). «Пенистые» макрофаги, определяются перифолликулярно в КП (зеленая стрелка). Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 20 Рисунок 44 – 1-я подгруппа. Персистирующая форма ИТП. Макрофаги, окраска CD68, определяются в белой и красной пульпе (зеленая стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 124 Рисунок 45 – 2-я подгруппа. Хроническая форма ИТП. Макрофаги, окраска CD68, определяются в белой и красной пульпе (зеленая стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 46 – 2-я подгруппа. Хроническая фаза ИТП. Макрофаги, окраска CD68, определяются в КП вдоль синусоидов (зеленая стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 40 125 В части препаратов были выявлены так называемые «пенистые» макрофаги, в цитоплазме которых при данном заболевании были включения, содержащие фосфолипиды, источником которых являются фагоцитированные тромбоциты (Рисунок 43). При анализе состояния тканевых макрофагов, экспрессирующих CD68, в гистологических препаратах селезенки выявлено повышенное содержание этих клеточных элементов у всех пациентов с ИТП. При оценке данной клеточной популяции в зависимости от ответа после спленэктомии выявлены различия показателей (p < 0,05) по отношению к группе сравнения. Значимые изменения содержания клеток с маркером CD68+, связанные с ответом на спленэктомию, свидетельствуют о прямой зависимости активности аутоиммунного процесса от состояния макрофагального звена в селезенке у больных ИТП. Сравнительная характеристика содержания основных популяций клеточных элементов представлена на Рисунке 47. 80 Группа сравнения (n=20) ИТП (n=50) 70 60 50 40 1 группа (n=32) 30 20 2 группа (n=18) 10 0 % г CD20 % CD3 г % CD4 г % CD8 г % г CD68 Рисунок 47 – Сравнительная характеристика содержания основных клеточных популяций в селезенке больных ИТП Содержание в селезенке незрелых ДК (Рисунок 48), транспортирующих антигены в данный лимфоидный орган и экспрессирующих CD11c+ (маркер рецептора CR4, предназначенного для распознавания опсонизированных клеток и регуляции иммунных процессов), не отличалось от нормальных значений в обеих группах больных ИТП, p > 0,05 (Таблица 20). 126 Таблица 20 – Содержание в селезенке популяций клеток системы мононуклеарных фагоцитов и ДК у больных ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию, г Группы исследования Группа сравнения, n = 20 Ремиссия после спленэктомии (1-я подгруппа), n = 32 Рефрактерное течение (2-я подгруппа), n = 18 CD68 CD11с S100 CD35 5,9 (4,8; 8,9) 13,3 (11,7; 17,8) 0,1 (0,07; 0,13) 0,1 (0,08; 0,2) 40,3 (34,3; 47,6) *∆ 15,5 (9,9; 15,7) 0,3 (0,1; 0,3)* 0,4 (0,3; 0,5)* 68,3 (61,4; 73,5) *∆ 10,3 (7,1; 14,5) 0,3 (0,1; 0,3)* 0,4 (0,3; 0,5)* Примечание: достоверность различий * – по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05; ∆ – между 1-й и 2-й подгруппами в абсолютных значениях, p < 0,05. Интердигитирующие дендритные клетки (S100+), а также ФДК (CD35+) кроме непосредственной антигенпрезентирующей функции участвуют в секреции факторов, которые важны для регуляции гомеостаза в гистоархитектонике ПАЛМ и в образовании ГЦ. Рисунок 48 – 2-я подгруппа. Хроническая фаза ИТП. Дендритные клетки и гистиоциты, окраска CD11с, определяются в белой (синяя стрелка) и красной (красная стрелка) пульпе. Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 127 При морфометрическом исследовании выявлено увеличение содержания клеток, экспрессирующих CD35+ и S100+ в селезенке больных ИТП по отношению к группе сравнения (p < 0,05). Возможно, это свидетельствует о нарушениях структурирования составляющих БП компартментов при наличии активных иммунных процессов (Рисунок 49). Рисунок 49 – 1-я подгруппа. Персистирующая фаза ИТП. Интердигитирующие дендритные клетки (S100+) определяются дискретно в белой и красной пульпе (синяя стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 У всех пациентов с ИТП КП была клеточной. В большом количестве встречались гистиоциты и гранулоциты (МАС387+, MPO+). Содержание этих клеточных популяций в группе больных ИТП не отличалось от группы сравнения (Рисунки 50, 51). На Рисунке 50 при окраске МАС387 + видны крупные скопления гранулоцитов и гистиоцитов в КП (синяя стрелка) на границе с БП в виде «ободка». На Рисунке 51 показано распределение в КП гранулоцитов, экспрессирующих МРО (красная стрелка). 128 Рисунок 50 – 1-я подгруппа. Персистирующая фаза ИТП. Окраска MAC387, сlone MAC387, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 51 – 2-я подгруппа. Хроническая фаза ИТП. Окраска MPO, polyclone, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 129 Полученные результаты указывают на наличие у больных ИТП изменений гистоархитектоники селезенки и характерных особенностей перераспределения ИКК в зависимости от ответа на спленэктомию, что свидетельствует о различных иммунных нарушениях в этих группах пациентов. 130 ГЛАВА 5 ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ 5.1 Оценка гистоархитектоники белой пульпы селезенки и ее структурных составляющих при апластической анемии в зависимости от тяжести заболевания, сроков выполнения спленэктомии При обзорной микроскопии препаратов селезенки больных АА отмечено, что гистологическая структура органа сохранена. Функциональные зоны БП и КП дифференцируются. МЗ – с нечеткими контурами, ПАЛМ – небольших размеров, ЛУ – преимущественно без ГЦ. КП – клеточная, выявляются признаки деформации синусоидов, а также отек и огрубение стромы. Выраженных различий морфологии органа в зависимости от тяжести заболевания не выявлено (Рисунки 52, 53). Рисунок 52 – Нетяжелая АА. ПАЛМ – небольших размеров (синяя стрелка). МЗ – с нечеткими контурами (черная стрелка). ЛУ без ГЦ (зеленая стрелка). КП (красная стрелка) – клеточная, выявляются признаки деформации синусоидов. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 131 Рисунок 53 – Тяжелая АА. ПАЛМ – небольших размеров (синяя стрелка). МЗ – с нечеткими границами (черная стрелка), в данной зоне определяется кровоизлияние. ЛУ без ГЦ (зеленая стрелка). КП (красная стрелка) – клеточная, выражены признаки деформации синусоидов, огрубение стромы пульпарных тяжей. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 10 Проведена морфометрическая оценка размеров БП селезенки и ее компартментов у пациентов с НАА и ТАА (Таблица 21). Сравнительный анализ относительных и абсолютных значений размеров БП установил статистически значимую ее редукцию у больных нетяжелой АА, в отличие от пациентов, имеющих тяжелую форму заболевания, и группы сравнения (р < 0,05). В связи с тем, что иммуносупрессивное лечение ГКС получали все пациенты до спленэктомии, это указывает на большее влияние ИСТ на структуру органа у лиц с нетяжелой формой, чем при тяжелой АА. На основании полученных данных был разработан метод оценки прогноза течения АА после спленэктомии, согласно которому снижение массы БП селезенки ниже 8,4 г свидетельствует о благоприятном прогнозе течения апластической анемии, а повышение – более 8,5 г указывает на неблагоприятное 132 течение заболевания. Способ позволяет дифференцированно решать показания к ИСТ у пациентов с данной патологией после спленэктомии (патент № 2535059 от 08.10.2014 г.). Таблица 21 – Относительные и абсолютные значения размеров отделов белой пульпы селезенки больных АА в зависимости от тяжести заболевания Ед. БП МЗ ПАЛМ ЛУ ГЦ АА Группа сравнения, n = 20 Все пациенты, n = 30 НАА, n = 12 ТАА, n = 18 % 10,6 (9,5; 12,5) 9,5 (6,9; 13,2) 7,0 (3,8; 10,6)* ∆ 11,9 (7,9; 14,2) ∆ г 13,1 (11,9; 14,9) 9,9 (6,4; 16,3) 7,9 ( 4,3; 9,9)* ∆ 14,0 (9,4; 18,6) ∆ % 1,2 (0,9; 2,0) 2,0 (1,2; 2,6)* 1,7 (0,5; 2,4) 2,0 (1,3; 2,7)* г 1,5 (0,9; 2,3) 2,0 (1,4; 3,0)* 1,44 (0,7; 2,7) 2,2 (1,6; 3,4)* % 3,3 (2,6; 4,6) 0,8 (0,5; 1,7)* 0,7 (0,4; 1,6)* 1,0 (0,6; 1,7)* г 4,6 (3,0; 5,2) 0,9 (0,6; 2,0)* 0,8 (0,4; 1,4)* 1,5 (0,7; 2,4)* % 5,8 (4,8; 6,7) 6,1 (4,1; 9,7) 4,9 (3,1; 6,0) ∆ 8,7 (4,5; 11,1) ∆ г 7,5 (5,5; 8,9) 6,5 (4,4; 11,3) 4,6 (3,3; 6,4)* ∆ 10,6 (6,3; 14,1) ∆ % 0,0 (0,0; 0,7) 0,4 (0,2; 1,1) 0,2 (0,0; 0,9) 0,7 (0,2; 1,2) г 0,0 (0,0; 1,0) 0,6 (0,1; 1,3) 0,3 (0,0 ;0,8) 0,8 (0,1; 1,4) Примечание: * – достоверность различий по отношению к показателям группы сравнения, p < 0,05; ∆ – достоверность различий между показателями групп с НАА и ТАА, p < 0,05. Исследование площади маргинальной зоны, содержащей как рециркулирующий, так и резидентный пул В-клеток, участвующих в Т-зависимом и в Т-независимом иммунном ответе, показало существенное ее увеличение у больных с тяжелой АА, в отличие от показателей группы сравнения (р < 0,05). Вероятно, такие изменения связаны с перераспределением ИКК в МЗ как отражение степени активности иммунного процесса. Вычисление массы МЗ у больных апластической анемией позволило найти способ морфометрической оценки прогноза течения заболевания после спленэктомии. При значениях массы МЗ < 1,9 г определялся благоприятный прогноз болезни, а при > 1,9 г констатировалось неблагоприятное течение АА. Использование данного метода возможно в качестве дополнительного критерия 133 для дифференцированного подхода при назначении терапии после спленэктомии (патент № 2555355 от 04.06.2015 г.). В результате оценки размеров ПАЛМ (Т-клеточной зоны) выявлено статистически значимое уменьшение данного отдела БП у всех обследуемых с апластической анемией по отношению к группе сравнения (р < 0,05). Достоверных отличий показателей среди больных нетяжелой и тяжелой степенью заболевания установлено не было (Рисунок 54). Возможно, это объясняется тем, что предшествующая операции ИСТ имела большее влияние на подавление иммунных процессов в данном компартменте и перераспределение ИКК в другие зоны. 16 группа сравнения, n=20 14 12 все больные АА, n=30 10 8 6 НАА, n=12 4 2 ТАА, n=18 0 г % БП г % МЗ % г ПАЛМ г % ЛУ Рисунок 54 – Соотношение размеров компартментов белой пульпы в относительных (%) и абсолютных (г) значениях при АА в зависимости от тяжести болезни Исследование ЛУ определило снижение их размеров у больных НАА по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях (р < 0,05). Кроме того, установлено статистически значимое уменьшение данных показателей у лиц с нетяжелой формой заболевания в отличие от обследуемых с ТАА (р < 0,05). Уменьшение размеров данного отдела БП, вероятно, связано с большим влиянием 134 иммуносупрессивной терапии на ЛУ у обследованных с нетяжелой АА, чем при тяжелой степени заболевания. Практически у всех больных АА в ЛУ отсутствовали ГЦ. Достоверных различий в наличии ГЦ в зависимости от тяжести АА и по отношению к группе сравнения выявлено не было. Существенных изменений показателей площади БП в зависимости от продолжительности болезни до спленэктомии не обнаружено. Вместе с тем отмечалось достоверное увеличение размеров МЗ в абсолютных значениях в 1-й группе лиц, которые были прооперированы в первые 2 месяца от начала лечения, что соответствует 1 этапу иммунного ответа. Эти изменения в МЗ у пациентов, получивших хирургическое лечение в ранний период течения заболевания, являются отражением активности иммунного процесса при апластической анемии (Таблица 22). Таблица 22 – Относительные и абсолютные значения размеров отделов БП селезенки больных апластической анемией в зависимости от продолжительности заболевания до спленэктомии АА Ед. Группа сравнения, БП МЗ ПАЛМ ЛУ ГЦ изм. n = 20 Все пациенты, n = 30 1 группа, n = 20 2 группа, n = 10 % 10,6 (9,5; 12,5) 9,5 (6,9; 13,2) 11,1 (6,6; 13,5) 9,2 (6,2; 11,9) г 13,1 (11,9; 14,9) 9,9 (6,4; 16,3) 12,4 (9,4; 17,4) 9,4 (6,0; 14,6) % 1,2 (0,9; 2,0) 2,0 (1,2; 2,6)* 2,0 (1,2; 2,7) 1,8 (0,6; 2,2) г 1,5 (0,9; 2,3) 2,0 (1,4; 3,0)* 2,2 (1,7; 3,5)* 1,7 (0,9; 3,0) % 3,3 (2,6; 4,6) 0,8 (0,5; 1,7)* 0,9 (0,6; 1,7)* 1,2 (0,5; 2,2)* г 4,6 (3,0; 5,2) 0,9 (0,6; 2,0)* 1,4 (0,7; 2,0)* 0,9 (0,5; 2,5)* % 5,8 (4,8; 6,7) 6,1 (4,1; 9,7) 7,0 (4,4; 9,8) 5,8 (2,8; 7,9) г 7,5 (5,5; 8,9) 6,5 (4,4; 11,3) 8,5 (4,9; 12,4) 5,9 (4,1; 7,6) % 0,0 (0,0; 0,7) 0,4 (0,2; 1,1) 0,8 (0,2; 1,2) 0,1 (0,0; 0,3) г 0,0 (0,0; 1,0) 0,6 (0,1; 1,3) 0,8 (0,3; 1,8) 0,1 (0,0; 0,5) Примечание: * – достоверность различий по отношению к соответствующим показателям группы сравнения, p < 0,05. Уменьшение размеров ПАЛМ имелось у всех пациентов с АА независимо от сроков выполнения спленэктомии (р < 0,05). Анализ размеров ЛУ и ГЦ в 135 зависимости от длительности течения предоперационного периода не выявил изменений размеров данных компартментов как в 1-й группе, так и во 2-й – с течением заболевания до спленэктомии более двух месяцев, относительно группы сравнения (р > 0,05). Таким образом, исследование структурных составляющих белой пульпы у больных с различными формами апластической анемии показало зависимость ее редукции от тяжести заболевания и проводимой до операции ИСТ. Эти изменения в большей степени были характерны для пациентов с нетяжелой АА и связаны с процессами, происходящими непосредственно в ЛУ и ПАЛМ. У пациентов с тяжелой АА площадь БП была достоверно больше, чем при НАА, преимущественно за счет МЗ и ЛУ. Данные изменения, возможно, свидетельствуют о том, что предоперационная ИСТ имеет меньшее влияние на изменение размера структурных составляющих БП селезенки у больных ТАА по сравнению с НАА. МЗ была больше у больных с ТАА и у пациентов 1-й группы, которые получили хирургическое лечение в первые 2 месяца от начала заболевания. Это отражает функциональные особенности этой зоны и свидетельствует о том, что ранние, наиболее активные процессы происходят именно в ней. Величина герминативных центров не зависела ни от тяжести заболевания, ни от сроков выполнения спленэктомии. 5.2 Особенности гистоархитектоники красной пульпы при апластической анемии При сравнительной оценке размеров КП в зависимости от тяжести апластической анемии определены большие ее размеры в относительных числах у больных нетяжелой АА (Таблица 23). Данные значения достоверно отличались как от показателей у пациентов с тяжелой формой заболевания, так и от группы сравнения (p < 0,05). Вместе с тем в абсолютных цифрах сравнительная характеристика размеров КП в зависимости от степени тяжести АА не выявила значимых изменений величины данной функциональной зоны (Рисунок 55). 136 Таблица 23 – Относительные и абсолютные значения размеров КП селезенки больных апластической анемией в зависимости от тяжести заболевания АА Ед. Группа сравнения, n = 20 % 76,4 (74,6; 77,5) 77,5 (73,9; 80,2) 80,0 (76,5; 83,3)* ∆ 74,5 (70,9; 78,8) ∆ г 93,1 (86,5; 109,3) 80,5 (64,5; 109,7) 74,1 (63,2; 109,9) 84,9 (72,9; 110,6) Все пациенты, n = 30 НАА, n = 12 ТАА, n = 18 КП Примечание: * – достоверность различий по отношению к показателям группы сравнения, p < 0,05; ∆ – достоверность различий между показателями при НАА и ТАА, p < 0,05. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 группа сравнения, n=20 все больные АА, n=30 НАА, n=12 ТАА, n=18 г % БП г % КП Рисунок 55 – Сравнительная характеристика размеров белой и красной пульпы в зависимости от степени тяжести апластической анемии Изменений относительных и абсолютных показателей величины КП в зависимости от сроков выполнения операции и по отношению к группе сравнения не обнаружено (Таблица 24). 137 Таблица 24 – Относительные и абсолютные значения размеров КП селезенки больных апластической анемией в зависимости от продолжительности заболевания до спленэктомии КП Ед. Группа сравнения, n = 20 % 76,4 (74,6; 77,5) г 93,1 (86,5; 109,3) АА Все пациенты, n = 30 1-я группа, n = 20 2-я группа, n = 10 77,5 (73,9; 80,2) 75,9 (73,5; 80,5) 77,8 (75,2; 80,9) 80,5 (64,5; 109,7) 88,6 (73,9; 115,3) 76,7 (59,6; 116,2) Структурные изменения синусоидов КП разной степени выраженности определялись у всех обследуемых с АА (FactorVIII). В части образцов, полученных в ранние сроки проведения операции, наблюдались как отек стромы, так и более грубые деформации стенок синусоидов КП (неравномерное расширение). У больных, прооперированных позднее двух месяцев от начала заболевания, чаще выявлялись выраженные признаки нарушения микроциркуляции в КП (Рисунки 56, 57). Рисунок 56 – Тяжелая АА. Определяются признаки деформации стенки синусоидов и отек стромы (красная стрелка). Окраска FVIII, поликлон, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 138 Вместе с тем в большей мере эти явления отмечались у пациентов, имеющих в анамнезе очаги хронической инфекции и хронический гепатит. Обнаружение выраженных деструктивных изменений синусоидов в ранний период течения болезни может свидетельствовать о начале появления дистрофических патологических признаков в селезенке на фоне хронических очагов инфекции до клинической манифестации апластической анемии. Рисунок 57 – Тяжелая апластическая анемия. Определяются признаки деформации стенки синусоидов и отек стромы (красная стрелка). Окраска FVIII, поликлон, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 40 При оценке состояния стенок центральных артерий селезенки у больных апластической анемией выявлялись изменения сосудов за счет неравномерного утолщения, разволокнения мышечного слоя и набухания основного вещества. Обнаруженные изменения независимо от степени тяжести заболевания и сроков выполнения операции, вероятно, связаны с иммунной дезорганизацией соединительно-тканных волокон сосудов и дистрофическими нарушениями эндотелия вследствие тромбоцитопении, микроциркуляцию в органе (Рисунок 58). что может иметь влияние на 139 Рисунок 58 – Тяжелая АА. Изменения в стенках центральных артерий: неравномерное утолщение, разволокнение мышечного слоя и набухание основного вещества. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. х 10, об. х 100 5.3 Характеристика клеточного состава селезенки у больных апластической анемией Одним из механизмов влияния спленэктомии на течение АА считается удаление большой массы активированных лимфоидных клеток, участвующих в патогенезе патологического процесса. Однако данных о количественном содержании лимфоцитов селезенки у лиц с АА в зависимости от степени тяжести болезни и ее продолжительности до спленэктомии в литературе не встретилось. С целью изучения клеточного состава в гистологических срезах селезенки были проведены исследования с применением современных технологий, таких как иммуногистохимия и компьютерная морфометрия. В результате морфометрических исследований популяции ИКК селезенки у больных апластической анемией отмечено статистически значимое увеличение количества в относительных значениях CD20-экспрессирующих клеток в селезенке как при нетяжелой, так и при тяжелой формах заболевания по отношению к группе сравнения (р < 0,05). Полученные результаты представлены в Таблице 25. 140 Таблица 25 – Содержание CD20+-лимфоцитов в селезенке больных апластической анемией в зависимости от тяжести болезни Ед. Селезенка БП КП Группа сравнения, n = 20 % 8,8 (7,0; 10,9) 47,1 (34,3; 55,9) 5,0 (2,9; 8,4) г 11,2 (7,5; 16,2) 6,0 (4,7; 7,2) 4,5 (2,8; 7,8) Все пациенты, n = 30 % 15,9 (11,9; 18,5)* 37,1 (32,8; 46,1) 15,2 (10,6; 18,2)* г 17,0 (12,4; 22,3) ∆ 4,7 (3,0; 6,4) ∆ 11,8 (8,1; 17,2) ∆ НАА, n = 12 % 15,6 (9,5; 17,4)* 40,5 (30,0; 46,8) 13,6 (9,9; 16,3)* г 13,5 (9,0; 19,3) ● 2,9 (1,9; 4,4) ∆● 10,6 (6,9; 12,0) ∆ ТАА, n = 18 % 15,9 (12,9; 18,4)* 36,3 (32,8; 43,9) 16,2 (12,6; 18,8)* г 20,6 (16,2; 24,9) ∆ ● 5,5 (4,1; 7,0) ● 15,1 (11,3; 18,4) ∆ Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05; ● – достоверность различий между группами НАА и ТАА в абсолютных значениях, p < 0,05. Выявлена зависимость изменений абсолютных показателей содержания Влимфоцитов от степени тяжести заболевания. У пациентов с тяжелой АА отмечалось достоверно большее количество данных клеток по отношению к таковым в группе с нетяжелой АА и к группе сравнения (р < 0,05). При исследовании содержания CD20-положительных В-клеток в функциональных зонах селезенки было выявлено статистически значимое уменьшение их количества в белой пульпе по абсолютным значениям, преимущественно у лиц с НАА (р < 0,05). Увеличение процентного и абсолютного содержания В-лимфоцитов в красной пульпе у всех пациентов с АА независимо от тяжести болезни и по отношению к группе сравнения свидетельствует о перераспределении данной популяции клеток в процессе заболевания в КП органа (Рисунок 59). 141 Рисунок 59 – Тяжелая апластическая анемия. В-клеточные зоны. МЗ (черная стрелка) – небольших размеров, ЛУ без ГЦ (зеленая стрелка). КП – клеточная (красная стрелка), отмечаются скопления В-клеток (синяя стрелка). Окраска CD20, сlone L26, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Вместе с тем при анализе В-клеточной популяции у пациентов в различные сроки проведения спленэктомии было установлено, что у обследуемых 1-й группы количество CD20+-лимфоидных элементов было выше по отношению к группе сравнения (р < 0,05) в относительных и абсолютных значениях. У больных второй группы имелось увеличение содержания В-лимфоцитов по относительным значениям (р < 0,05). Данные представлены в Таблице 26. Кроме того, выявлено, что В-лимфоидная популяция преобладала в КП, как в первой, так и во второй группах, то есть независимо от сроков проведения хирургического лечения. Причем большее количество этих клеток было обнаружено у лиц, прооперированных в сроке до 2 месяцев от начала терапии (р < 0,05). Возможно, полученные результаты указывают на активацию Вклеточного звена иммунитета в первые месяцы заболевания. Более низкие показатели CD20-экспрессирующих лимфоцитов у лиц с продолжительностью апластической анемии более 2 месяцев, отражают последующее истощение 142 данной популяции клеток в селезенке в процессе болезни вне зависимости от тяжести АА, на фоне проводимой иммуносупрессивной терапии. Таблица 26 – Содержание CD20+-лимфоцитов в селезенке больных апластической анемией в зависимости от продолжительности заболевания до спленэктомии Ед. Селезенка БП КП Группа сравнения, n = 20 % 8,8 (7,0; 10,9) 47,1 (34,3; 55,9) 5,0 (2,9; 8,4) г 11,2 (7,5; 16,2) 6,0 (4,7; 7,2) 4,5 (2,8; 7,8) Все пациенты, n = 30 % 15,9 (11,9; 18,5)* 37,1 (32,8; 46,1) 15,2 (10,6; 18,2)* г 17,0 (12,4; 22,3) ∆ 4,7 (3,0; 6,4) ∆ 11,8 (8,1; 17,3) ∆ 1-я группа, n = 20 % 16,9 (14,8; 19,5)* 37,1 (32,7; 45,5) 17,0 (12,6; 19,4)* ● г 20,6 (16,4; 24,3) ∆ 5,1 (3,7; 6,5) 15,1 (11,0; 18,0) ∆ ● 2-я группа, n = 10 % 12,2 (9,8; 15,9)* 41,6 (22,4; 46,9) 9,2 (7,7; 11,9)* ● г 12,1 (7,8; 18,3) 3,4 (2,6; 6,5) ∆ 7,3 (6,5; 10,9) ● Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05; ● – достоверность различий между 1-й и 2-й группами в абсолютных значениях, p < 0,05. Анализ содержания Т-лимфоидных элементов в селезенке у всех пациентов с депрессией кроветворения установил, что наряду со снижением абсолютного количества CD3+-экспрессирующих клеток в абсолютных значениях в БП, у пациентов как с нетяжелой АА, так и с тяжелой формой АА отмечается достоверное увеличение данной популяции ИКК в относительных и абсолютных значениях в КП по отношению к группе сравнения, (р < 0,05). Данные представлены в Таблице 27. При анализе Т-клеточной популяции у пациентов с различной продолжительностью предоперационного периода выявлено, что абсолютное содержание CD3-положительных клеток уменьшено в БП и увеличено в КП у пациентов с АА во всех группах (Рисунок 60). Вместе с тем отмечалось, что количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD3 в КП у пациентов 1-й группы, прооперированных в первые 2 месяца от начала заболевания, было существенно 143 больше, чем в группе с более длительным предоперационным периодом, p < 0,05 (Таблица 28). Таблица 27 – Содержание CD3+ Т-лимфоцитов в селезенке больных АА в зависимости от тяжести болезни Ед. Селезенка БП КП Группа сравнения, n = 20 % 4,8 (1,1; 5,8) 13,2 (9,3; 20,4) 5,2 (4,4; 7,4) г 8,3 (5,4; 11,0) 2,0 (1,5; 4,3) 5,2 (3,5; 7,3) Все пациенты, n = 30 % 8,5 (6,7; 10,9)* 13,6 (7,5; 18,1) 7,9 (7,0; 10,0)* г 10,0 (7,8; 13,0) 1,5 (0,7; 2,0) ∆ 7,3 (5,7; 10,3) ∆ НАА, n = 12 % 8,0 (7,3; 9,8)* 18,0 (9,5; 25,2) 8,5 (7,5; 10,6)* г 8,0 (6,5; 10,7) 1,2 (0,4; 1,9) ∆ 6,7 (5,2; 10,0) ∆ ТАА, n = 18 % 8,9 (6,4; 10,9)* 10,1 (6,4; 13,9) 7,7 (6,3; 10,1)* г 9,1 (7,5; 11,5) 1,6 (0,8; 2,2) ∆ 7,4 (6,1; 10,4) Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05. Рисунок 60 – Тяжелая апластическая анемия. Т-лимфоциты, окраска CD3, определяются в ПАЛМ (синяя стрелка), МЗ и ЛУ (зеленая стрелка) и КП (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 144 Таблица 28 – Содержание CD3+ Т-лимфоцитов в селезенке больных апластической анемией в зависимости от продолжительности заболевания до спленэктомии Ед. Группа сравнения, n = 20 Все пациенты, n = 30 1-я группа, n = 20 2-я группа, n = 10 Селезенка БП КП % 4,8 (1,1; 5,8) 13,2 (9,3; 20,4) 5,2 (4,4; 7,4) г 8,3 (5,4; 11,0) 2,0 (1,5; 4,3) 5,2 (3,5; 7,3) % 8,5 (6,7; 10,9)* 13,6 (7,5; 18,1) 7,9 (7,0; 10,0)* г 10,0 (7,8; 13,0) 1,5 (0,7; 2,0) ∆ 7,3 (5,7; 10,3) ∆ % 8,5 (6,7; 10,7)* 14,7 (8,5; 22,4) 8,0 (7,2; 10,8)* г 9,3 (7,7; 11,7) 1,2 (0,7; 2,6) ∆ 7,8 (6,2; 10,5) ∆/*** % 8,0 (6,1; 10,0)* 10,5 (6,3; 21,4) 7,6 (5,2; 9,4)* г 9,2 (6,4; 11,3) 1,1 (0,4; 1,7) ∆ 5,7 (4,4; 7,2) *** Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05; *** – достоверность различий между 1-й и 2-й группами в абсолютных значениях, p < 0,05. При оценке субпопуляционного состава Т-лимфоцитов выявлено снижение CD4+-Т-клеток у всех пациентов с депрессией кроветворения как в абсолютных, так и в относительных значениях, причем в БП и КП – при нетяжелой апластической анемии, а при тяжелой апластической анемии – преимущественно в КП (Рисунок 61). Вместе с тем, уменьшение абсолютного значения показателя было преимущественно во 2-й группе с рефрактерным течением заболевания, p < 0,05 (Таблицы 29 и 30). На основании морфометрических исследований установлено, что при значениях массы CD4+-Т-лимфоцитов более или равной 5,4 г отмечалось благоприятное течение апластической анемии, а при абсолютных значениях менее 5,4 г выявлялся плохой прогноз заболевания (патент № 2625036 от 11 июля 2017 г.). 145 Таблица 29 – Содержание CD4+ Т-лимфоцитов в апластической анемией в зависимости от тяжести болезни Ед. Селезенка БП селезенке больных КП Группа сравнения, n = 20 % 5,5 (4,2; 7,4) 12,5 (9,1; 16,6) 4,6 (4,0; 6;8) г 6,7 (4,8; 9,4) 1,6 (1,2; 2,8) 4,9 (3,2; 6,2) Все пациенты, n = 30 % 4,0 (3,0; 5,3)* 13,5(7,0; 17,6) 3,3 (2,7; 5,0)* г 4,6 (3,5; 5,4) ∆ 1,4 (0,6; 2,0) ∆ 3,4 (2.0; 4,5) ∆ НАА, n = 12 % 4,7 (3,4; 5,7) 17,0 (9,5; 25,2) 3,7 (2,9; 5,2) г 4,2 (3,5; 5,3) ∆ 1,2 (0,4; 2,0) ∆ 3,5 (1,5; 4,1) ∆ ТАА, n = 18 % 3,3 (2,7; 4,9)* 9,7 (5.9; 13,9) 3,3 (2,5; 5,0)* г 4,7 (3,6; 5,5) ∆ 1,4 (0,7; 2,2) 3,2 (2,3; 5,0) ∆ Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05. Таблица 30 – Содержание CD4+ Т-лимфоцитов в селезенке больных апластической анемией в зависимости от продолжительности заболевания до спленэктомии Ед. Селезенка БП КП Группа сравнения, n = 20 % 5,5 (4,2; 7,4) 12,5 (9,1; 16,6) 4,6 (4,0; 6,8) г 6,7 (4,8; 9,4) 1,6 (1,2; 2,8) 4,9 (3,2; 6,2) Все пациенты, n = 30 % 4,0 (3,0; 5,3)* 13,5 (7,0; 17,6) 3,3 (2,7; 5,0)* г 4,6 (3,5; 5,4) ∆ 1,4 (0,6; 2,0) ∆ 3,4 (2.0; 4,5) ∆ 1-я группа, n = 20 % 4,0 (3,1; 6,0) 14,3 (8,0; 17,9) 3,3 (2,5; 5,1) г 4,8 (3,1; 6,5) 0,8 (0,6; 2,4) 3,6 (2,0; 4,9) 2-я группа, n = 10 % 3,1 (2,4; 4,8)* 10,5 (4,7; 21,4) 3,2 (2,9; 5,0) г 3,9 (3,1; 4,6) ∆ 0,9 (0,4; 1,7) ∆ 2,5 (1,3; 3,5) ∆ Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05. 146 Рисунок 61 – Тяжелая АА. Т-хелперы, окраска CD4, определяются в ПАЛМ (синяя стрелка), МЗ с четкими контурами (зеленая стрелка); ЛУ без ГЦ (черная стрелка); КП (красная стрелка). Dak», ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+), как известно, ответственны за выработку негативных регуляторов гемопоэза, основными из которых являются ИНФ и ФНО-. Количество этих клеток в селезенке было значительно повышено во всех группах больных АА по отношению к группе сравнения (р < 0,05), как в относительных, так и в абсолютных значениях (Таблицы 31 и 32). Увеличение числа CD8+-экспрессирующих клеток определялось в КП органа у всех лиц с АА и не зависело от тяжести болезни и сроков проведения хирургического лечения (Рисунки 62, 63, 64). Вычисление индекса соотношения масс (ИСМ) CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов позволило установить фактор прогноза заболевания, при котором при значениях > 1,0 отмечалось благоприятное течение АА, а при ИСМ ≤ 1,0 – неблагоприятное (патент № 2594119 от 19.07.16 г.). 147 Таблица 31 – Содержание CD8+ Т-лимфоцитов в апластической анемией в зависимости от тяжести болезни Ед. Селезенка БП селезенке больных КП Группа сравнения, n = 20 % 0,5 (0,3; 0,9) 0,0 (0,0; 0,6) 0,4 (0,3; 0,7) г 0,6 (0,4; 1,1) 0,0 (0,0; 0,7) 0,4 (0,3; 0,6) Все пациенты, n = 30 % 3,7 (3,0; 4,2)* 2,2 (0,0; 4,8) 4,6 (3,8; 5,6)* г 4,0 (2,8; 4,8) ∆ 0,3 (0,0; 0,5) 3,6 (2,8; 4,7) ∆ НАА, n = 12 % 3,7 (3,3; 4,2)* 2,7 (0,0; 5,0) 4,6 (4,1; 5,3)* г 4,0 (3,1; 5,1) ∆ 0,1 (0,0; 0,7) 3,6 (3,0; 4,9) ∆ ТАА, n = 18 % 3,6 (2,6; 4,2)* 2,2 (0,0; 4,2) 4,6 (3,2; 5,6)* г 4,2 (2,5; 4,9) ∆ 0,3 (0,0; 0,5) 3,7 (2,8; 4,8) ∆ Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ** – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05. Таблица 32 – Содержание CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке больных апластической анемией в зависимости от продолжительности заболевания до спленэктомии Ед. Селезенка БП КП Группа сравнения, n = 20 % 0,5 (0,3; 0,9) 0,0 (0,0; 0,6) 0,4 (0,3; 0,7) г 0,6 (0,4; 1,1) 0,0 (0,0; 0,7) 0,4 (0,3; 0,6) Все пациенты, n = 30 % 3,7 (3,0; 4,2)* 2,2 (0,0; 4,8) 4,6 (3,8; 5,6)* г 4,0 (2,8; 4,8) ∆ 0,3 (0,0; 0,5) 3,6 (2,8; 4,7) ∆ 1-я группа, n = 20 % 3,7 (3,3; 4,2)* 2,4 (0,0; 4,6) 4,9 (4,4; 5,6)* г 4,2 (3,2; 4,9) ∆ 0,3 (0,0; 0,5) 4,1 (3,2; 4,9) ∆ 2-я группа, n = 10 % 3,3 (2,7; 3,7)* 2,1 (0,0; 4,9) 4,5 (3,4; 4,7)* г 3,6 (2,4; 5,1) ∆ 0,3 (0,0; 0,8) 3,2 (2,3; 4,2) ∆ Примечание: * – достоверность различий по отношению к группе сравнения в относительных значениях, p < 0,05; ∆ – достоверность различий по отношению к группе сравнения в абсолютных значениях, p < 0,05. 148 Рисунок 62 – Тяжелая АА. Цитотоксические Т-лимфоциты, окраска CD8, в небольшом количестве определяются в ПАЛМ (синяя стрелка) и преобладают в КП (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 63 – Нетяжелая АА. Цитотоксические Т-лимфоциты, окраска CD8 (синяя стрелка) и синусоиды экспрессируют CD8 (красная стрелка). Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 20 149 Сравнительная характеристика относительного и абсолютного состава основных популяций ИКК селезенки представлена на Рисунке 64. 25 группа сравнени я, n=20 20 все больные АА, n=30 15 10 НАА, n=12 5 ТАА, n=18 0 % г CD20 % г CD3 г % CD4 г % CD8 % г CD68 Рисунок 64 – Сравнительная характеристика содержания клеточных элементов в селезенке в зависимости от степени тяжести АА При изучении звена мононуклеарных фагоцитов в клеточном составе селезенки установлено, что большая часть тканевых макрофагов (CD68 +) как в норме, так и у пациентов с апластической анемией была локализована в КП органа, в меньшем количестве они определялись и в маргинальной зоне, и лимфоидных узелках (Рисунки 65, 66). При морфометрическом анализе выявлено увеличение процентного содержания CD68-экспрессирующих клеток при тяжелой форме заболевания (p < 0,05). Статистически значимое повышение относительного количества макрофагальных элементов отмечено у пациентов с менее длительным периодом течения апластической анемии до удаления селезенки (р < 0,05). 150 Рисунок 65 – Тяжелая АА. Макрофаги (красная стрелка), окраска CD68, определяются преимущественно в КП. Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Рисунок 66 – Нетяжелая АА. Макрофаги (красная стрелка), окраска CD68, определяются преимущественно в красной пульпе. Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 40 151 При подсчете относительного и абсолютного количества МАС387- и МРОэкспрессирующих элементов у всех больных АА обнаружено достоверное снижение (р < 0,05) вне зависимости от тяжести процесса и срока выполнения операции (Таблицы 33 и 34). Популяция гранулоцитов и клеток моноцитарногистиоцитарного ряда, экспрессирующих МАС387 и МРО, была расположена преимущественно в КП и в скоплениях по периферии МЗ в виде «ободка» (Рисунки 67, 68). В БП выявлялись единичные клетки. Данный факт объясняется патогенезом самого заболевания, т.е. процессами костномозговой недостаточности и панцитопении, отражающимися на количестве поступающих из крови в селезенку клеток. В меньшей степени изменения коснулись тканевых макрофагов, при анализе которых было выявлена умеренная макрофагальная реакция у пациентов с тяжелой АА и в группе с ранним сроком (до 2 месяцев от начала болезни) проведенной спленэктомии в относительных значениях. Таблица 33 – Относительные и абсолютные значения ИКК селезенки больных апластической анемией в зависимости от тяжести заболевания АА CD68 MAC 387 MPO CD57 CD35 S100 Ед. Группа сравнения, n = 20 % 5,4 (4,0; 6,9) 6,8 (5,4; 8,4)* 6,0 (4,7; 8,9) 7,3 (5,2; 8,5)* г 5,9 (4,8; 8,9) 7,4 (4,4; 12,2) 7,2 (3,4; 12,7) 10,2 (5,2; 12,5) % 17,7 (11,9; 21,6) 10,1 (7,4; 15,0)* 9,9 (7,7; 15,0)* 10,5 (5,7; 14,9)* г 20,1 (13,2; 26,1) 11,4 (6,2; 18,6)* 9,8 (6,6; 16,5)* 11,9 (7,6; 20,9)* % 9,7 (8,2; 11,0) 7,0 (5,4; 8,5)* 7,1 (6,1; 9,0)* 6,2 (4,4; 7,5)* г 11,9 (9,4; 15,8) 7,1 (4,6; 11,1)* 8,1 (5,0; 10,5)* 7,2 (5.2; 13,9)* % 3,2 (2,3; 4,7) 3,6 (2,4; 4,9) 3,4 (2,7; 4,9) 3,7 (2,1; 5,2) г 4,2 (2,6; 6,5) 3,5 (2,9; 5,1) 3,5 (3,1; 4,2) 4,8 (3,1; 5,5) % 1,0 (0,7; 1,3) 2,8 (1,8; 4,2)* 2,6 (2,0; 5,2)* 2,9 (1,4; 4,0)* г 1,2 (0,8; 1,9) 2,8 (2,0; 4,2)* 2,8 (2,1; 3,8)* 3,5 (2,2; 4,6)* % 0,8 (0,6; 0,9) 2,1 (1,6; 2,6)* 2,5 (1,8; 2,9)* 2,1 (1,5; 2,9)* г 1,0 (0,7; 1,3) 2,2 (1,4; 3,2)* 2,1 (1,6; 2,8)* 2,6 (1,6; 4,4)* Все пациенты, n = 30 НАА, n = 12 ТАА, n = 18 Примечание: * – достоверность различий по отношению к показателям группы сравнения, p < 0,05. 152 Таблица 34 – Относительные и абсолютные значения ИКК селезенки больных апластической анемией в зависимости от продолжительности заболевания до спленэктомии АА Ед. CD68 MAC 387 MPO CD57 CD35 S100 % Группа сравнения, n = 20 5,4 (4,0; 6,9) Все пациенты, n = 30 6,8 (5,4; 8,4)* 1-я группа, n = 20 7,7 (6,0; 8,6)* 2-я группа, n = 10 4,6 (3,8; 8,2) г 5,9 (4,8; 8,9) 7,4 (4,4; 12,2) 7,4 (4,9; 12,1) 5,6 (2,9; 14,1) % 17,7 (11,9; 21,6) 10,1 (7,4; 15,0)* 11,3 (8,8; 15,0)* 7,7 (5,4; 11,7)* г 20,1 (13,2; 26,1) 11,4 (6,2; 18,6)* 14,9 (9,4; 19,6)* 6,6 (4,9; 19,7)* % 9,7 (8,2; 11,0) 7,0 (5,4; 8,5)* 6,5 (4,7; 7,9)* 7,3 (5,2; 10,0) г 11,4 (9,0; 15,8) 7,1 (4,6; 11,1)* 7,8 (5,3; 11,7)* 6,6 (3,5; 9,6)* % 3,2 (2,3; 4,7) 3,6 (2,4; 4,9) 3,4 (2,4; 4,7) 4,3 (1,9; 5,7) г 4,2 (2,6; 6,5) 3,5 (2,9; 5,1) 3,6 (3,4; 5,1) 4,1 (2,8; 6,4) % 1,0 (0,7; 1,3) 2,8 (1,8; 4,2)* 2,2 (1,1; 3,4)* ∆ 5,2 (3,7; 8,1)* ∆ г 1,2 (0,8; 1,9) 2,8 (2,0; 4,2)* 2,5 (1,7; 3,6)* ∆ 4,2 (3,3; 8,3)* ∆ % 0,8 (0,6; 0,9) 2,1 (1,6; 2,6)* 2,1 (1,7; 2,6)* 1,7 (1,0; 3,0)* г 1,0 (0,7; 1,3) 2,2 (1,4; 3,2)* 2,6 (1,7; 3,3)* 1,7 (1,2; 4,1)* Примечание: * – достоверность различий по отношению к показателям группы сравнения, p < 0,05; ∆ – достоверность различий между показателями 1-й и 2-й групп, p < 0,05. Рисунок 67 – Нетяжелая АА. Скопление гранулоцитов и гистиоцитов в красной пульпе (синяя стрелка) на границе с белой пульпой в виде нечеткого «ободка». Окраска MAC387, сlone MAC387, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 153 Рисунок 68 – Нетяжелая АА. Распределение гранулоцитов в красной пульпе (красная стрелка). Окраска MPO, polyclone, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 Различия в содержании CD57 (NK)-позитивных клеточных элементов в селезенке среди всех исследуемых групп больных АА не были достоверны (p > 0,05). Распределение этих лимфоидных элементов на гистологических срезах представлено на Рисунке 69. Рисунок 69 – Нетяжелая АА. Экспрессирующие CD57 (NK)-клетки (красная стрелка) определяются дискретно в БП и КП. Окраска CD57, сlone NK1, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 10 154 Клетки, экспрессирующие CD57 (NK)+, определялись преимущественно дискретно в МЗ и КП органа. Единичные клеточные элементы с CD57 (NK)+ обнаруживались в ПАЛМ и ЛУ. Отсутствие четкой зональной привязанности данной популяции клеток в структурах селезенки, дает основания полагать, что ключевых позиций эти клеточные элементы в развитии иммунных процессов при апластической анемии не выполняют. Оценку интердигитальных дендритных клеток осуществляли с помощью поликлонального антитела S100. Выявлено увеличение содержания данной популяции клеток у всех пациентов с депрессией кроветворения. При обзорном просмотре образцов селезенки при апластической анемии отмечалось дискретное расположение данных клеточных элементов в маргинальной зоне, и в большем количестве эти клетки встречались в периартериальных лимфоидных муфтах (Рисунок 70). Рисунок 70 – Нетяжелая АА. Экспрессирующие S100 интердигитальные ДК (красная стрелка) выявлялись преимущественно в БП. Окраска S100, polyclone, Dako, ИПМ. Ок. х 10, об. х 20 Подсчет фолликулярных дендритных CD35-позитивных клеток выявил статистически значимое увеличение их относительного и абсолютного количества 155 в селезенке у всех больных апластической анемией, причем как у пациентов с НАА, так и у лиц с тяжелой степенью депрессии кроветворения (р < 0,05). Кроме того, установлено существенное повышение данных показателей у больных с предоперационным периодом более 2 месяцев (p < 0,05). Увеличение содержания данной популяции клеточных элементов свидетельствует об участии этих антигенпрезентирующих клеток в поддержании активности иммунных процессов в селезенке при АА. Таким образом, с помощью гистологических, иммуногистохимических и морфометрических исследований удалось установить совокупность устойчивых признаков, характеризующих особенности гистоархитектоники селезенки у больных АА в зависимости от тяжести процесса и сроков выполнения спленэктомии. Достоверность полученных результатов свидетельствует об участии данного вторичного лимфоидного органа в патогенезе депрессии кроветворения. 156 ГЛАВА 6 ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИМММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В СЕЛЕЗЕНКЕ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ЦИТОПЕНИЯХ ИММУННОГО ГЕНЕЗА (ИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ И АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ) Обсуждение полученных результатов Селезенка является одним из самых сложноустроенных вторичных органов лимфоидной системы. Малочисленность и противоречивость сведений относительно морфологического строения селезенки обусловлены тем, что изучение ее структуры чаще всего проводится у различных видов лабораторных животных. Исследовательские работы, выполненные с использованием гистологического материала селезенки человека, не отражают в полной мере всех сторон морфометрического изучения размеров компартментов пульпы органа и состояния его клеточного состава и носят единичный характер [45; 153; 249; 318]. В данной работе проведено исследование гистологических, иммуногистохимических и морфометрических особенностей селезенки человека в норме и при цитопениях иммунного генеза (иммунной тромбоцитопении и апластической анемии). Уникальность селезенки заключается в том, что ее паренхима состоит из двух зон, имеющих разное строение и функции. Орган также содержит субпопуляции ИКК, отличающиеся по иммунофенотипу, что сопровождается особенностями клеточных взаимодействий. Кроме того, клетки в селезенке для выполнения своих функций активно перемещаются по определенным направлениям. С целью выявления закономерностей иммуноморфологических процессов в селезенке в норме и при заболеваниях, в патогенезе которых принимает участие данный вторичный лимфоидный орган (иммунной тромбоцитопении и апластической анемии), было проведено настоящее исследование. В гистологическом материале селезенок при окраске гематоксилином и эозином, а также при ИГХ-окрашивании и морфометрии получены численные 157 значения размеров компартментов функциональных зон и популяций ИКК, которые выявлялись в различных количествах в отделах пульпы в зависимости от формы заболевания, тяжести болезни и сроков выполнения спленэктомии. Миграционные свойства клеточных элементов селезенки изучены многими авторами, установлены функциональные обязанности ИКК в компартментах органа [235; 240; 246; 249; 359]. Вместе с тем в доступной литературе практически отсутствуют работы, посвященные характеристике иммуноморфологических процессов в БП и КП в зависимости от этапов иммунного ответа. Эта задача и явилась первоочередной при выполнении данного исследования. Следуя принципу диалектического единства структуры и функции, лежащему в основе всех реакций организма, а также понимания, что функция должна иметь свое отражение в материальном субстрате, нами была создана концептуальная схема обоснования морфометрических характеристик функциональных зон селезенки, а также содержания клеточного состава в ее отделах, соответствующая трем этапам течения иммунореактивных процессов в данном вторичном лимфоидном органе. В представленной схеме выделено три этапа. I этап. Распознавание антигена. Поступление в селезенку антигенов, свободных или связанных с антигенпрезентирующими клетками (АПК). Известно, что при поступлении антигенов в селезенку, в том числе и аутоантигенов, прежде всего они попадают в МЗ, где взаимодействуют как с макрофагами, так и с B-лимфоцитами, что подтверждается многими исследованиями. Вместе с тем на развитие и активацию В-клеток МЗ влияют также некоторые члены семейства ФНО [204; 242; 336; 338]. Следовательно, гистоархитектоника селезенки на данном этапе характеризуется: расширением БП за счет МЗ, небольшими ПАЛМ и ЛУ без ГЦ, при КП умеренной клеточности. II этап. Формирование эффекторов: развитие иммунных реакций, презентация обработанных антигенов Т-хелперам; выбор пути дифференцировки CD4+ Т-клеток в направлении Th1- или Th2-хелперов; развитие гуморального 158 иммунного ответа. Широко изучен процесс развития иммунных реакций [78; 116]. Поскольку АПК (ДК, макрофаги, В-лимфоциты) рециркулируют через ПАЛМ или через MЗ, с дальнейшей их миграцией в ПАЛМ, антиген-специфический сигнал эти клетки передают Т-хелперам для запуска тимусзависимого гуморального, а также цитотоксического Т-клеточного иммунных ответов. В ПАЛМ образуются Th1, которые не нуждаются в представлении антигена В-лимфоцитами, тогда как в зонах контакта В- и Т-клеток образуются в основном Th2-клетки [9; 92; 118]. Следовательно, материальным субстратом данных процессов является увеличение ПАЛМ и соответственно расширение БП. Гуморальный иммунный ответ развивается после того, как В-лимфоцит получает специфический антигенный сигнал и ряд дополнительных сигналов от Т-хелперов [132; 197]. В результате происходит активация В-лимфоцитов, их пролиферация и дифференцировка [217; 309]. Индукция антителообразования структурно связана с ГЦ, реагирующими на антигенную стимуляцию. После того как ограниченные в ЛУ, активированные В-лимфоциты взаимодействуют с антигеном, который был захвачен ФДК, происходит их дальнейшая стимуляция, вызывающая увеличение ГЦ [217; 249; 309]. В связи с описанными механизмами развития иммунных процессов нами определены характерные морфологические особенности селезенки на втором этапе: увеличение БП, преимущественно за счет МЗ, так как активные процессы продолжаются в данном отделе. Расширение ПАЛМ и ЛУ с ГЦ отражают реакции, происходящие в этих зонах. КП умеренной клеточности. III этап. Эффекторная часть иммунного ответа. Формирование эффекторного звена иммунной реакции происходит путем дифференцировки клона В-лимфоцитов и образования цитотоксических Т-лимфоцитов. Бласттрансформированные В-клетки дифференцируются в клетки памяти и плазматические клетки, секретирующие антитела. Значительная часть плазматических клеток мигрирует в МЗ и в КП селезенки, а затем покидает этот лимфоидный орган [175]. Субпопуляция Th1 CD4+ Т-лимфоцитов (эффекторные 159 Т-клетки) в центральных ПАЛМ секретирует провоспалительные цитокины (типа интерферона-γ), что способствует разнообразным воспалительным реакциям. Эти клеточные элементы могут поступать в КП и затем мигрировать к участкам депонирования антигена на периферии [294; 240]. Точно так же CD8+ Т-лимфоциты рециркулируют через ПАЛМ, и, если они входят в контакт с родственным антигеном на АПК, они активируются, клонально пролиферируют и дифференцируются в цитотоксические Т-лимфоциты. Образующиеся эффекторные Т-клетки (CD8+) имеют важное значение в разнообразных реакциях организма, включая отторжение аллотрансплантата, защиту против многих вирусных инфекций и в аутоиммунных процессах [246; 259; 294; 350]. Поглощение антигенов клетками стромы КП важно не только для деструкции патогенов, но и является первым этапом в индукции как первичного, так и вторичного иммунного ответа [207; 257; 258; 360]. Задержка антигенов в КП, прикрепление к ним антител формируют иммунные комплексы, которые через Fc-области Ig взаимодействуют с рецепторами на фагоцитах и других клетках стромы органа. Опсонизированные антителами циркулирующие антигены вовлекают в фагоцитоз FcR-положительные клетки, включая макрофаги и нейтрофилы КП [142; 145; 249; 312; 337; 360]. В соответствии с результатами настоящего исследования на третьем этапе развития иммунных реакций в селезенке площадь КП расширяется за счет увеличения ее клеточного состава. Соответственно компартменты БП: МЗ, ПАЛМ, ЛУ и ГЦ – уменьшаются, так как претерпевают стадию обратного развития. Схема морфометрических характеристик функциональных зон селезенки на этапах иммунного ответа представлена на рисунке 71. Изложенные выше сведения позволяют сформулировать первую закономерность: реактивные изменения, происходящие в селезенке, зависят от миграционных свойств ИКК в компартментах органа, а также функций данных клеток, что влияет на динамику и численность их распределения в белой и красной пульпе. Сопоставление с этапами иммунного ответа 160 морфологического строения селезенки обусловливает понимание реакций, происходящих в этом сложном органе. СХЕМА МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЗОН СЕЛЕЗЕНКИ НА ЭТАПАХ ИММУННОГО ОТВЕТА • Поступление в МЗ селезенки антигенов, взаимодействие их с макрофагами и лимфоцитами I этап. Распознавание антигена • Расширение БП за счет МЗ, небольшие ПАЛМ и ЛУ без ГЦ, при КП умеренной клеточности • Презентация обработанных антигенов Т-хелперам в ПАЛМ; выбор пути дифференцировки CD4+ Т-клеток в направлении Th1- или Th2- хелперов; развитие гуморального иммунного ответа в ЛУ и ГЦ II этап. Формирование эффекторов: • Увеличение размеров всех компартментов БП (МЗ, ПАЛМ, ЛУ и ГЦ). КП развитие иммунных умеренной клеточности реакций • Формирование эффекторного звена иммунной реакции: дифференцировка клона В-лимфоцитов и образования цитотоксических Т-лимфоцитов III этап. Эффекторная часть иммунного ответа • Расширение КП за счет увеличения ее клеточного состава, компартменты БП: МЗ, ПАЛМ, ЛУ и ГЦ – претерпевают стадию обратного развития Рисунок 71 – Схема морфометрических характеристик функциональных зон селезенки на этапах иммунного ответа С целью изучения реактивных изменений селезенки, получения количественных значений размеров функциональных зон и их компартментов многие авторы прибегают к морфометрическим методам измерений, чтобы объективизировать полученные результаты, получить квалифицированный анализ 161 наблюдений, сформировать стройную систему доказательств, установить закономерности морфогенеза [15; 45; 58; 59; 88; 108; 261]. Однако в большинстве исследовательских работ используются критерии оценки морфофункционального состояния селезенки, базирующиеся на относительных показателях без учета массы органа. Интерпретация таких результатов в сравнительном плане, на наш взгляд, крайне затруднена и не позволяет объективно проанализировать иммуноморфологические процессы, происходящие в структурных компартментах пульпы данного вторичного лимфоидного органа. Принципиально новым методическим подходом настоящей работы к пониманию особенностей морфометрических гистоархитектоники показателей с учетом селезенки ее массы. явился В пересчет исследуемом гистологическом материале селезенок, при ИГХ-окрашивании и морфометрии, получены численные значения площадей компартментов функциональных зон, а также популяций ИКК, которые выявлялись в различных количествах в отделах пульпы. При этом определялись минимальные и максимальные величины относительных (%) и абсолютных значений (г). Подобный подход вычисления размеров функциональных зон и их компартментов, а также абсолютных значений клеточных элементов (г) проводился по нашим оригинальным методикам, которые нашли свое отражение в патентах на изобретения [Приложение А.]: 1. № 2535059 от 08.10.2014 «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.). 2. № 2555355 от 04.06.2015 «Способ морфометрической оценки прогноза течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.). 3. № 2563284 от 21.08.2015 «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.). 162 4. № 2594119 от 19 июля 2016 г. «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.). 5. № 2599021 от 08 сентября 2016 г. «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD4 + Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н., Ванеева Е.В.). 6. № 2621627 от 06 июня 2017 г. «Способ морфометрической оценки прогноза течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Ванеева Е.В.). 7. № 2625036 от 11 июля 2017 г. «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по массе CD4+ T-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А.). Конкретные примеры применения данных методик будут приведены в дальнейшем обсуждении иммуноморфологических полученных особенностей результатов селезенки изучения при иммунной тромбоцитопении и апластической анемии. Из всего вышеизложенного можно вывести следующую закономерность, которая характеризуется тем, что перераспределение клеточных элементов в процессе иммунного ответа в пульпе селезенки влияет на массу функциональных зон органа и их компартментов. Морфометрическое исследование селезенки с использованием параметров величины ее массы позволяет проводить оценку показателей в абсолютных единицах. К группе аутоиммунных гематологических заболеваний относится ИТП, которая характеризуется снижением содержания кровяных пластинок в периферической крови преимущественно за счет их повышенного разрушения [46; 49; 195; 227; 277]. Селезенка занимает центральное место в патогенезе этого заболевания. Сочетание депонирующей роли и функций вторичного лимфоидного 163 органа способствует образованию в ней антитромбоцитарных антител и связыванию их с мембранными рецепторами на тромбоцитах. Известно, что опсонизация антителами не только ускоряет деструкцию тромбоцитов в пульпе селезенки, а также может изменить их функцию и повлиять на образование кровяных пластинок в костном мозге [46; 49; 227; 278]. Спленэктомия входит в программу стандартной терапии ИТП, однако положительный результат после операции отмечается у 60–80% больных. У части пациентов (23%) через некоторое время наступает рецидив [330]. Причины возникновения рефрактерных форм ИТП неизвестны. В последние тромбоцитопении механизмами. годы при традиционная ИТП Имеются концепция существенно литературные патогенеза дополнилась данные, более развития сложными доказывающие прямой цитотоксический эффект CD3+CD8+ Т-клеток [261]. Изучение иммуноморфологической характеристики структуры селезенки при ИТП является актуальным и имеет большое практическое значение. В доступной литературе имеются единичные исследования данного вторичного лимфоидного органа в сопоставлении с клиническими особенностями течения болезни. С целью изучения изменений функциональных зон селезенки и ее клеточного состава в зависимости от формы заболевания и ответа на спленэктомию были проведены гистологические и морфометрические исследования 50 образцов селезенки взрослых пациентов с ИТП. Морфологические изменения селезенки при ИТП характеризовались: увеличением размеров БП при персистирующей форме 16,1 (10,2; 21,9)%; 21,8 (13,8; 39,8) г и хронической форме 17,3 (12,1; 18,0)%; 23,9 (14,0; 28,5) г по отношению к группе сравнения 10,6 (9,5; 12,5)%; 13,1 (11,9; 14,9) г соответственно, (p < 0,05), вне зависимости от ответа на спленэктомию, преимущественно за счет расширения МЗ, размеры которой составляли: 6,6 (3,1; 8,1)%; 11,8 (6,5; 13,2) г – при персистирующей фазе и 5,6 (3,9; 6,4)%; 6,6 (5,3; 9,3) г – у хронических больных по отношению к группе сравнения 164 1,2 (0,9; 2,1)%; 1,5 (0,9; 2,3) г соответственно, (p < 0,05). Полученные результаты свидетельствуют об активности иммунных процессов в компартменте, в котором происходят взаимодействие макрофагов и лимфоцитов с антигенами, продукция антител и иммунных медиаторов, а также депонирование тромбоцитов. Изменения БП и МЗ при ИТП были отмечены многими авторами [341], вместе с тем наши наблюдения, связанные с формами болезни и ответом на спленэктомию, уточняют и дополняют сведения, которые в доступной литературе практически отсутствуют. При анализе структуры МЗ у больных ИТП выявлены признаки нарушения микроциркуляции, маргинальные синусы в селезенках у пациентов с ИТП были деформированы вне зависимости от ответа на хирургическое лечение и фазы болезни. Выявленные нами изменения подтверждают данные о патогенетическом усилении васкуляризации МЗ и расширении маргинальных синусов, что ведет к замедлению скорости кровотока и способствует увеличению распознавания антигенов крови макрофагами [289]. Полученные результаты дополняют исследования авторов [322], обнаруживших в МЗ большое количество тромбоцитов на разных стадиях разрушения, при которых кровяные пластинки выявлялись как внеклеточно, так и в цитоплазме макрофагов. В настоящей работе установлено, что размер ЛУ был увеличен у всех больных ИТП: 7,6 (5,5; 9,6)%, 11,0 (6,9; 15,7) г, по отношению к группе сравнения 5,8 (4,8; 6,8)%, 7,5 (5,5; 8,9) г соответственно, (p < 0,05). Вместе с тем ГЦ в ЛУ селезенки у большинства пациентов с ИТП отсутствовали. При сравнении количества ГЦ у лиц с ответом на спленэктомию (1-я группа): 7,9%, по отношению к группам сравнения: 2,8% (χ2 = 15,87; p = 0,001) и рефрактерных больных (2-я группа): 2,2% (χ2 = 4,87; p = 0,027) – выявлено достоверное увеличение данного показателя в первой группе пациентов. Вместе с тем ГЦ были небольших размеров, деления на темную и светлую зоны (признаков активных Вклеточных пролиферативных процессов) не было выявлено. В представленных ранних литературных источниках [4; 194] авторами определялась гиперплазия лимфоидной ткани c увеличением числа и размеров ЛУ с крупными ГЦ, что, 165 вероятно, было связано с отсутствием в то время препаратов ИСТ и тем, что больные оперировались без проведения терапии первой линии. Это подтверждается более поздними исследованиями [183], в которых отмечена атрофия БП и ЛУ у пациентов, получающих до спленэктомии ИСТ. В результате морфометрического исследования размеров ПАЛМ было выявлено статистически значимое уменьшение размеров данного компартмента БП у всех обследованных с ИТП вне зависимости от фазы болезни и ответа на операцию по отношению к группе сравнения: 1,7 (1,4; 2,0)%; 2,6 (2,0; 3,5) г и 3,3 (2,6; 4,6)%; 4,6 (3,0; 5,2) г соответственно, (p < 0,05). Можно предположить, что данные изменения являются следствием перераспределения Т-клеток в КП, а также результатом предшествующей ИСТ. Вместе с тем уменьшение содержания Т-клеток в БП (как в ПАЛМ, так и в ЛУ) свидетельствует о снижении Т лимфоцитарного контроля, что является морфологическим отражением патогенеза заболевания [164]. Обнаружение у пациентов 1-й группы увеличение размеров БП за счет МЗ и ЛУ дает возможность морфологически охарактеризовать состояние селезенки как соответствующее I–II этапам иммунного ответа. Это дополняет и уточняет данные литературы о том, что гиперплазия БП коррелировала с лучшим послеоперационным исходом и могла служить прогностическим фактором [183; 341]. Считаем, что достоверное увеличение размеров БП за счет МЗ и ЛУ, а также расширение КП в группе рефрактерных больных дают возможность расценить состояние селезенки как II–III этапы иммунного ответа, свидетельствующее о более продолжительном или агрессивном течении заболевания. В иммуногистохимических исследованиях [164] показано, что на структуру селезенки пациентов с ИТП ИСТ не влияет. Представленная двойственность ситуации в нашей работе подтверждается тем, что морфологические изменения селезенки зависят от тяжести болезни. Отмеченное активное воздействие на структуру органа проводимой до операции ИСТ в большей степени выявляется на ранней стадии заболевания и у больных, 166 ответивших на хирургическое лечение, что ранее не находило отражения в материалах по данному вопросу. Расширение КП выявлялось в абсолютных показателях при персистирующей фазе ИТП: 115,1 (96,3; 152,4) г по отношению к группе сравнения 93,1 (86,5; 109,3) г за счет увеличения клеточности в данной функциональной зоне, что, на наш взгляд, предопределяет стадию иммунного ответа у этой категории больных. Отек стромы, утолщение и огрубение стенок синусоидов КП, отмечающиеся при впервые выявленной фазе, и более выраженные деформации синусоидов (извитость структуры, расширение просвета), определяющиеся при хронической ИТП, отражают динамику процесса, происходящего в данной функциональной зоне. В нашем исследовании грубые нарушения сосудов КП были обнаружены также у пациентов на ранней стадии течения ИТП, свидетельствующие о наличии «скрытой» фазы аутоиммунного процесса. Полученные результаты уточняют и дополняют изученные ранее характеристики нарастающей дезорганизации соединительной ткани в КП селезенки при ИТП [4]. Изменения морфометрических показателей функциональных зон селезенки в зависимости от фазы заболевания и ответа на спленэктомию при ИТП были изучены в относительных и абсолютных значениях, что позволило сформировать следующие закономерности: выявленное у больных, ответивших на спленэктомию, увеличение размеров БП за счет МЗ и ЛУ дает возможность морфологически охарактеризовать состояние селезенки как соответствующее I–II этапам иммунного ответа. Достоверное увеличение размеров БП за счет МЗ и ЛУ, а также расширение КП в группе с рефрактерным течением заболевания и у пациентов с персистирующей фазой позволяет расценить состояние селезенки как II–III этапы иммунного ответа, что свидетельствует о более продолжительном или агрессивном течении болезни. Установленное статистически значимое уменьшение размеров ПАЛМ у всех обследованных с ИТП вне зависимости от ответа на 167 операцию является отражением патогенеза заболевания, а также результатом воздействия ИСТ на Т-клеточную зону БП. Исследование содержания клеточного состава в селезенке при ИТП было проведено у пациентов, ответивших на хирургическое лечение, и лиц с рефрактерной формой заболевания. Увеличение 32,8 (19,9; 49,9) относительного г количества 23,7 (16,0; 27,6)% В-лимфоидных и (CD20+) абсолютного элементов в гистологических срезах селезенки у больных ИТП по отношению к группе сравнения 8,8 (7,0; 10,9)% и 11,2 (7,5; 16,2) г соответственно, (р < 0,05) подтверждает участие В-лимфоцитов в патогенезе данного заболевания, вне зависимости от ответа на спленэктомию. При этом изменения были выявлены как в БП, так и в КП органа. Наши данные согласуются и дополняют исследования A. Solanilla et al. (2005), в которых установлено, что CD154 (ассоциированный с тромбоцитами) способствует активации аутореактивных В-лимфоцитов при ИТП. Взаимодействие между активированными тромбоцитами и В-лимфоцитами происходит в селезенке, которая считается основным местом для продукции антитромбоцитарных антител при данной патологии [319]. При исследовании содержания общей популяции Т-лимфоцитов выявлено увеличение количества CD3+ клеточных элементов (в относительных и абсолютных значениях) у всех больных ИТП: 17,6 (14,4; 21,7)%; 27,4 (22,7; 32,9) г – по отношению к группе сравнения: 4,8 (1,1; 5,8)%; 8,3 (5,4; 11,0) г соответственно, вне зависимости от ответа на спленэктомию, р < 0,05. О наличии данных изменений у больных ИТП свидетельствуют работы многих авторов [227; 230; 262; 327]. Вместе с тем статистически значимое повышение уровня Т-клеточной популяции, установленное как в БП, так и в КП селезенки, независимо от ответа на спленэктомию существенно уточняет известные данные. Увеличение содержания CD4+ Т-лимфоцитов у пациентов с ИТП определялось в селезенке в относительных: 11,1 (8,8; 14,6)%, а также в абсолютных: 16,9 (12,3; 21,9) г значениях по отношению к группе сравнения: 168 5,5 (4,2; 7,4)% и 6,7 (4,8; 9,4) г соответственно, (р < 0,05). Вместе с тем при показателях массы данной субпопуляции клеток в селезенке менее и равной 20,5 г наблюдалась чаще всего рефрактерная форма заболевания («Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки», патент на изобретение № 2599021 от 08 сентября 2016 г.). Более низкие значения CD4+ Т-клеток выявлялись в БП органа у рефрактерных больных: 4,1 (3,8; 5,0) г по отношению к пациентам с ответом на спленэктомию 9,9 (5,8; 13,6) г, (р < 0,05); при 1,6 (1,2; 2,8) г – в группе сравнения, (р < 0,05). В то время как в КП увеличенные показатели таковых отмечались у всех пациентов с ИТП, независимо от ответа на спленэктомию как в относительных: 10,1 (7,1; 11,5)%, так и в абсолютных значениях: 11,93 (7,0; 14,2) г по отношению к группе сравнения: 4,6 (4,0; 6;8)%; 4,9 (3,2; 6,2) г соответственно, (р < 0,05). Наши результаты согласуются с исследованиями S. Audia (2014), в которых было показано, что фолликулярные Т-хелперы, расположенные в повышенном количестве в ГЦ ЛУ селезенки больных ИТП, являются основными CD4+-клетками, которые стимулируют выработку антител антигенспецифическими В-лимфоцитами [128]. Выявленные нами более низкие значения CD4+ Т-клеток в БП, соответствующие рефрактерному течению заболевания, могут свидетельствовать об участии в патогенезе данного заболевания других субпопуляций Т-клеток, влияющих на ответ на хирургическое лечение. Снижение субпопуляций Т-клеток в ЛУ при ИТП было отмечено C. Daridon и соавт. (2012), причем как фолликулярных Т-хелперов, так и Трегуляторных клеток, чем авторы объясняют дефект Т-клеточного контроля. Кроме того, в ЛУ с отсутствующими ГЦ при ИТП, в IgM (содержащем иммунные комплексы, плотно связанные с ФДК и приближенные к пролиферирующим Вклеткам) были обнаружены аутоантигены гликопротеина тромбоцитов (GP) IIb/IIIa, а также GPIV [164]. Увеличение количества CD8+ Т-лимфоцитов селезенки выявлялось у всех больных ИТП в относительных 5,1 (2,8; 6,1)% и в абсолютных 7,7 (4,2; 12,0) г значениях по отношению к группе сравнения: 0,5 (0,3; 0,9)%; 0,6 (0,4; 1,1) г 169 соответственно, (р < 0,05). Масса данных клеток в селезенке, превышающая 9,75 г, свидетельствовала о неблагоприятном прогнозе болезни после операции («Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD8+ Т-лимфоцитов селезенки», патент на изобретение № 2563284 от 21.08.2015). Кроме того, существенные различия в содержании CD8+ Т-клеток в абсолютных цифрах были выявлены преимущественно в КП у пациентов с рефрактерным течением заболевания: 10,1 (8,6; 15,9) г по отношению к обследованным, ответившим на спленэктомию: 5,0 (2,3; 7,0) г, р < 0,05. Значимое увеличение количества цитотоксических CD8 + Т-клеток в КП позволяет сделать вывод о том, что в разрушении тромбоцитов у рефрактерных больных наряду с макрофагами активно участвуют и лимфоциты. Вычисление индекса соотношения масс CD4+/CD8+, полученных при морфометрическом исследовании селезенки больных с разным течением ИТП после операции, показало, что при значениях такового менее 2,3 прогнозируют рефрактерную форму свидетельствует о заболевания. более Величина благоприятном данного течении индекса болезни ≥ 2,4 («Способ морфометрической оценки прогноза течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки», патент на изобретение № 2621627 от 06.06.2017). Обнаружение экспрессии CD8 на клетках РЭС в КП, возможно, свидетельствует об ее участии в деструкции тромбоцитов, покрытых антителами. Известно, что при блокаде РЭС происходит сохранение в циркуляции IgG-сенсибилизированных клеток, с чем связывают эффект воздействия ГКС, применяемых в качестве терапии первой линии [207]. Прямую зависимость активности аутоиммунного процесса при ИТП от состояния макрофагального звена (CD68+) в селезенке подтверждает достоверное повышенное содержание данных клеточных элементов у всех пациентов с ИТП по сравнению с нормой, а также установленные различия показателей в зависимости от ответа после спленэктомии: 40,3 (34,3; 47,6) г – у лиц с полученной ремиссией; 68,3 (61,4; 73,5) г – у рефрактерных больных; 170 5,9 (4,8; 8,9) г – в группе сравнения (p < 0,05). Кроме того, выявлено большое количество макрофагов, расположенных вдоль синусоидов КП, а также перифолликулярные скопления липофагов у части пациентов с ИТП. Выявленные в настоящей работе факты уточняют известные многочисленные исследования селезеночных макрофагов у пациентов с ИТП и свидетельствуют о том, что данная клеточная популяция выполняет основную антигенпрезентирующую роль, поддерживающую продукцию антитромбоцитарных антител, а также занимает ключевую позицию в разрушении сенсибилизированных кровяных пластинок вследствие опосредованного Fc-рецепторами фагоцитоза [104; 216]. Наши данные не противоречат доказательствам того, что в цитоплазме пенистых макрофагов при этом заболевании были обнаружены включения, содержащие фосфолипиды, источником которых может быть фагоцитоз тромбоцитов [284]. Вместе с тем полученные различные количественные результаты макрофагальных элементов в КП у пациентов с ИТП в зависимости от ответа на спленэктомию являются новой важной дополнительной информацией. Установленное в настоящей работе увеличение содержания всех популяций ИКК (В- и Т-лимфоцитов, макрофагов) в селезенке больных ИТП по отношению к группе сравнения свидетельствует об активных иммунных процессах в этом органе у обследованных пациентов. Известны проведенные B. Olsson (2012) исследования морфологии селезенки, в которых выявлено увеличение количества В-лимфоцитов в КП, а изменений содержания В-клеток в БП и Т-клеток в БП и КП не было найдено. Авторами отмечалось, что в КП число В-клеток увеличивается вместе с Т-хелперами, Т-цитотоксическими лимфоцитами и макрофагами, расположенными вдоль синусоидов, что способствует иммунологической атаке на тромбоциты при ИТП [261]. По нашим данным, отражающим количественные характеристики как в относительных, так и в абсолютных значениях, существенные дополнения вносят исследования клеточного состава функциональных зон селезенки с использованием массы органа, а также изучение распределения ИКК в пульпе органа у пациентов с различными ответами на спленэктомию. 171 Содержание в селезенке незрелых ДК, транспортирующих антигены в данный лимфоидный орган и экспрессирующих CD11c+ (маркер рецептора CR4, предназначенного для распознавания опсонизированных клеток и регуляции иммунных процессов), не отличалось от значений в группе сравнения и в группах пациентов с ИТП, p > 0,05. При морфометрическом изучении селезенки больных ИТП обнаружено увеличение содержания ФДК, экспрессирующих CD35: 0,4 (0,3; 0,5) г – у пациентов с ремиссией; 0,4 (0,3; 0,5) г – у рефрактерных больных; соответственно по отношению к группе сравнения: 0,1 (0,08; 0,2) г, p < 0,05, а также интердигитальных ДК (S100+): 0,3 (0,1; 0,3) г – в 1-й группе; 0,3 (0,1; 0,3) г – во 2-й, по отношению к группе сравнения: 0,1 (0,07; 0,13) г, p < 0,05. Исследование ДК другими авторами выявило повышенное содержание АПК у больных ИТП [358]. В связи с тем, что данные клеточные элементы отвечают за гистоархитектонику компартментов БП, обнаруженные в настоящей работе изменения их содержания, на наш взгляд, свидетельствуют о нарушениях структурирования составляющих БП при наличии активных иммунных процессов. Полученные нами морфометрические результаты содержания В- и Тлимфоидных и других популяций в функциональных зонах селезенки в группах с различным ответом на спленэктомию обосновывают необходимость исследования количественных показателей клеточных элементов в абсолютных значениях, которые способствуют получению информативных критериев, факторов прогноза в зависимости от динамики процесса. Изложенные выше сведения позволяют сформулировать следующие закономерности: Изменения содержания клеточного состава в селезенке больных ИТП характеризуются увеличением относительного и абсолютного количества ИКК: В- и Т-лимфоцитов в БП и КП, макрофагов, ДК, что подтверждает участие данных клеточных популяций в патогенезе заболевания. Повышение содержания в БП и КП лимфоидных элементов, экспрессирующих CD4+, а также CD8+-лимфоцитов в КП свидетельствует о многофакторности возникновения аутоиммунных расстройств при ИТП. 172 Выявленные в БП у рефрактерных больных более низкие показатели CD4+ Т-клеток по сравнению с пациентами, у которых была получена ремиссия после спленэктомии, возможно, объясняют патогенетический дефект Т-клеточного контроля, обусловленного субпопуляциями как фолликулярных Т-хелперов, так и Т-регуляторных клеток. Значимое увеличение количества цитотоксических CD8+ Т-клеток и макрофагов в КП у больных с рефрактерным течением заболевания по сравнению с лицами, ответившими на спленэктомию, свидетельствует о том, что в разрушении тромбоцитов у рефрактерных больных наряду с макрофагами активно участвуют и лимфоциты. Определяющими неблагоприятный прогноз признаками содержания клеточных субпопуляций в селезенке явились: снижение массы CD4+-лимфоцитов ниже 20,5 г; увеличение массы CD8+-лимфоидных клеток более 9,75 г, а также значение индекса соотношения масс CD4+/CD8+ ниже 2,3. Апластическая анемия – заболевание системы крови, характеризующееся панцитопенией, обусловленной аплазией костного мозга, связанной с нарушением иммунных механизмов регуляции кроветворения, количественным дефицитом и функциональными дефектами стволовых кроветворных клеток [1; 2; 33; 42]. Для лечения больных АА применяют два основных метода – аллогенную ТКМ и комбинированную ИСТ. В определенных случаях (отсутствие эффекта, рецидивы, высокая зависимость от гемотрансфузий, непереносимость препаратов) выполняют спленэктомию [33; 54; 55]. Известно, что одним из важных звеньев патогенеза АА является дизрегуляция Т- и В-клеточной системы иммунитета. Это подтверждается повышением увеличением зрелых продукции активированных ИЛ-2, -ИФН цитотоксических и ФНО- Т-лимфоцитов, данными клетками, ингибирующими гемопоэз в костном мозге и чувствительность стволовых клеток к гемопоэтическим факторам [82; 84; 346]. Эффективность спленэктомии до сих пор является предметом обсуждения. Это связано прежде всего с малой изученностью самого лимфоидного органа при 173 этом заболевании, а также и механизма положительного влияния операции на дальнейшее течение болезни. Наши исследования селезенки были выполнены на операционном материале от 30 больных АА с целью выявления характерных черт БП и КП в зависимости от тяжести болезни и длительности патологического процесса до спленэктомии. Значимое уменьшение размеров БП в относительных и абсолютных значениях определялось у пациентов с НАА: 7,0 (3,8; 10,6)% и 7,9 (4,3; 9,9) г, по отношению к группе сравнения: 10,6 (9,5; 12,5)% и 13,1 (11,9; 14,9) г соответственно, p < 0,05. Снижение показателей размеров БП у данной категории больных сопровождалось уменьшением величины ПАЛМ у всех пациентов с АА независимо от тяжести болезни и сроков выполнения операции: 0,8 (0,5; 1,7)% и 0,9 (0,6; 2,0) г – по отношению к группе сравнения: 3,3 (2,6; 4,6)% и 4,6 (3,0; 5,2) г, соответственно p < 0,05; а также уменьшением ЛУ в абсолютных цифрах 4,6 (3,3; 6,4) г по отношению к группе сравнения: 7,5 (5,5; 8,9) г. Изучение структурных составляющих БП у больных с различными формами АА показало зависимость ее редукции от тяжести заболевания. У пациентов с ТАА размер БП в относительных и абсолютных значениях 11,9 (7,9; 14,2)% и 14,0 (9,4; 18,6) г был достоверно больше, чем у больных НАА: 7,0 (3,8; 10,6)%; 7,9 (4,3; 9,9) г соответственно, p < 0,05. Данные изменения констатировались преимущественно за счет ЛУ как в относительных, так и в абсолютных показателях: у ТАА – 8,7 (4,5; 11,1)% и 10,6 (6,3; 14,1) г; у НАА – 4,9 (3,1; 6,0)% и 4,6 (3,3; 6,4) г соответственно, p < 0,05. Кроме того, размер МЗ был существенно больше у ТАА: 2,0 (1,3; 2,7)% и 2,2 (1,6; 3,4) г – по отношению к группе сравнения: 1,2 (0,9; 2,0)% и 1,5 (0,9; 2,3) г соответственно, p < 0,05. Уменьшение площади БП и атрофию «лимфоидных фолликулов» отмечали также другие авторы [1]. На наш взгляд, данные изменения, возможно, свидетельствуют о том, что предоперационная ИСТ имеет меньшее влияние на изменение размера структурных составляющих БП селезенки у больных ТАА по сравнению с НАА. МЗ и ЛУ были существенно больше у больных с ТАА. Это 174 характеризует функциональные особенности данных компартментов и отражает то, что наиболее активные процессы (I–II этапы иммунного ответа) происходят именно в ней. Отсутствие ГЦ наблюдалось практически у всех пациентов с АА, что на наш взгляд, связано с предшествующей ИСТ. Изучение размеров БП и ее составляющих в зависимости от сроков проведения спленэктомии выявило достоверное увеличение абсолютных значений МЗ: 2,2 (1,7; 3,5) г в 1-й группе пациентов, получивших хирургическое лечение в течение первых двух месяцев от начала заболевания по отношению к группе сравнения: 1,5 (0,9; 2,3) г, p < 0,05. Полученные результаты морфометрического исследования БП и МЗ у больных АА позволили разработать методы оценки прогноза течения данного заболевания после спленэктомии, согласно которым снижение массы БП селезенки ниже 8,4 г свидетельствует о благоприятном прогнозе течения апластической анемии, а увеличение ее более 8,5 г указывает на неблагоприятное течение заболевания («Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии», патент на изобретение № 2535059 от 08.10.2014). При значениях массы МЗ < 1,9 г констатируется благоприятное течение болезни, а при > 1,9 г – неблагоприятное течение АА («Способ морфометрической оценки прогноза течения апластической анемии после спленэктомии», патент на изобретение № 2555355 от 04.06.2015). Данные способы являются новыми дополнительными критериями течения дифференцированно решать показания к заболевания ИСТ пациентов и позволяют с депрессией кроветворения после спленэктомии. Морфологические изменения состояния стенок центральных артерий селезенки (неравномерное утолщение, разволокнение мышечного слоя и набухание основного вещества) были обнаружены у больных АА независимо от степени тяжести заболевания и сроков выполнения операции. Подобные нарушения структуры сосудов селезенки были описаны в работах некоторых авторов [1; 44]. А то, что данные признаки определялись при различных формах болезни, несомненно, дополняет и подтверждает патогенетические механизмы, 175 свидетельствующие об иммунной дезорганизации соединительно-тканных волокон сосудов и дистрофических нарушениях эндотелия за счет тромбоцитопении. Размеры КП были существенно больше в относительных единицах у пациентов с НАА: 80,0 (76,5; 83,3)% – по сравнению с ТАА: 74,5 (70,9; 78,8)% и группой сравнения: 76,4 (74,6; 77,5)% соответственно, p < 0,05. Однако подтверждения в абсолютных значениях данное изменение не нашло, что также свидетельствует о необходимости пересчета морфометрических показателей с учетом массы органа. Структурные изменения синусоидов КП разной степени выраженности (расширение и деформации), а также отек стромы определялись у всех обследуемых с АА, вне зависимости от тяжести болезни и сроков проведения операции. Вместе с тем в большей мере эти явления отмечались у пациентов, имеющих в анамнезе очаги хронической инфекции и хронический гепатит. Обнаружение выраженных деструктивных изменений синусоидов в ранний период течения заболевания может свидетельствовать о начале появления патологических признаков в селезенке на фоне хронических очагов инфекции до клинической манифестации АА. Нам не удалось найти в доступной литературе исследований гистоархитектоники селезенки при различных формах АА, что обеспечивает полученные в работе сведения несомненной новизной. Таким образом, по морфометрическим показателям БП и КП селезенки в зависимости от тяжести заболевания и сроков выполнения спленэктомии при АА можно сформулировать следующие закономерности: увеличение размеров БП, за счет МЗ и ЛУ, прямо пропорционально тяжести заболевания. Проводимое иммуносупрессивное лечение до операции в большей степени влияет на перераспределение клеток в Т-клеточных зонах (ПАЛМ), что свидетельствует об уменьшении данного компартмента у всех больных АА. МЗ и ЛУ (В-клеточные компартменты) оказываются менее подвержены воздействию ИСТ. Вместе с тем полученной ИСТ до спленэктомии оказывается недостаточно, особенно при ТАА, для компенсации активности иммунного процесса. 176 Определяющими неблагоприятный прогноз признаками явились: увеличение массы БП селезенки больных АА более 8,5 г и массы МЗ – более 1,9 г. С целью анализа содержания ИКК в селезенке при АА была проведена оценка распределения В- и Т-лимфоцитов, мононуклеарных фагоцитов и других клеточных форм в функциональных зонах органа в зависимости от тяжести заболевания и сроков выполнения операции. При морфометрическом исследовании содержания В-клеточной популяции в селезенке выявлено статистически значимое увеличение относительного и абсолютного количества CD20 – экспрессирующих клеток у всех больных АА, независимо от тяжести болезни, преимущественно в КП: 15,2 (10,6; 18,2)%; 11,8 (8,1; 17,2) г, по отношению к группе сравнения: 5,0 (2,9; 8,4)%; 4,5 (2,8; 7,8) г соответственно, p < 0,05. В то же время в БП селезенки у пациентов с АА наблюдалось снижение количества В-клеток (CD20+) в абсолютных значениях: 4,7 (3,0; 6,4) г по отношению к группе сравнения: 6,0 (4,7; 7,2) г, p < 0,05. Причем у пациентов с НАА выявлялись более низкие показатели содержания Влимфоцитов в БП: 2,9 (1,9; 4,4) г, по сравнению с тяжелой формой заболевания: 5,5 (4,1; 7,0) г, p < 0,05. Данное явление, на наш взгляд, объясняется тем, что при НАА и ТАА отмечалось перераспределение В-клеточной популяции из БП в КП. Кроме того, при НАА выявлялась супрессия иммунных процессов в БП, а у больных с тяжелой формой заболевания в БП активность В-клеточного иммунитета была выражена. Вместе с тем определялось увеличение количества Вклеток в КП органа у лиц, прооперированных в ранние сроки течения болезни: 17,0 (12,6; 19,4)%; 15,1 (11,0; 18,0) г, по отношению к группе сравнения: 5,0 (2,9; 8,4)%; 4,5 (2,8; 7,8) г соответственно, p < 0,05. У пациентов, получивших хирургическое лечение позднее двух месяцев от начала заболевания, увеличения содержания В-лимфоцитов в абсолютных значениях в КП не наблюдалось: 7,3 (6,5; 10,9) г. Более низкие показатели количества CD20+ клеток в КП у больных, прооперированных в отдаленный период, можно объяснить истощением данного клеточного пула в связи с проводимой ИСТ. 177 Изучение Т-клеточного звена иммунитета в селезенке выявило снижение содержания в абсолютных цифрах CD3+ клеток в БП у всех больных АА, независимо от тяжести заболевания и сроков выполнения операции: 1,5 (0,7; 2,0) г, по отношению к группе сравнения: 2,0 (1,5; 4,3) г, p < 0,05. В то же время в КП абсолютные значения количества общей популяции Т-клеток в группе пациентов с НАА: 6,7 (5,2; 10,0) г – и с ранним сроком хирургического лечения: 7,8 (6,2; 10,5) г – были выше показателей в группе сравнения: 5,2 (3,5; 7,3) г соответственно, p < 0,05. Таким образом, обнаружены признаки перераспределения CD3-положительных клеток из БП в КП преимущественно в группе пациентов с НАА, а также у лиц, у которых спленэктомия была проведена в первые два месяца от начала лечения. Анализ содержания CD4+ Т-лимфоцитов в селезенке больных АА показал снижение данной субпопуляции в относительных и абсолютных значениях: 4,0 (3,0; 5,3)%; 4,6 (3,5; 5,4) г – по отношению к группе сравнения: 5,5 (4,2; 7,4)%; 6,7 (4,8; 9,4) г соответственно, p < 0,05. На основании полученных данных был получен прогностический индекс, свидетельствующий о том, что при определении массы CD4+ Т-клеток в селезенке более или равной 5,4 г отмечалось благоприятное течение АА, а при абсолютных значениях менее 5,4 г выявлялся плохой прогноз заболевания («Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по массе CD4+ T-лимфоцитов селезенки», патент на изобретение № 2625036 от 11.07.2017). Вместе с тем отмечено уменьшение абсолютных показателей CD4-экспрессирующих клеток в БП у пациентов с НАА: 1,2 (0,4; 2,0) г, по отношению к группе сравнения: 1,6 (1,2; 2,8) г, p < 0,05; а также в КП в группах НАА и ТАА: 3,5 (1,5; 4,1) г и 3,2 (2,3; 5,0) г, по отношению к группе сравнения: 4,9 (3,2; 6,2) г соответственно, p < 0,05. При оценке данного показателя у больных АА в зависимости от сроков выполнения спленэктомии обнаруживалось его снижение в БП: 0,9 (0,4; 1,7) г и КП: 2,5 (1,3; 3,5) г в группе лиц, прооперированных позднее двух месяцев от начала терапии, по сравнению с нормальными значениями: 1,6 (1,2; 2,8) г и 4,9 (3,2; 6,2) г соответственно, p < 0,05. Изучению функциональной 178 гетерогенности CD4+ Т-клеток и влияния данной субпопуляции на костномозговое кроветвотрение при АА посвящены работы многих авторов [128; 211; 212; 224; 252]. В исследованиях J. Shi et al. (2012) при АА установлено, что ухудшению гемопоэза способствует снижение содержания в периферической крови и костном мозге Т-регуляторных CD4+CD25+- лимфоцитов за счет нарушения ингибирования данными клетками продукции γИНФ, синтезируемого эффекторными Т-лимфоцитами [295]. Кроме того, выявленные снижения и функциональные нарушения Т-регуляторных клеток у больных АА были определены преимущественно у пациентов с тяжелой формой заболевания [213]. Полученные нами сведения, свидетельствующие о содержании CD4+ T-клеток в селезенке у больных АА, согласуются с известными литературными данными и вместе с тем являются новой дополнительной информацией. При морфометрическом подсчете количества цитотоксических CD8+ Тлимфоцитов в селезенке при АА установлено увеличение содержания данной субпопуляции преимущественно в КП: 4,6 (3,8; 5,6)%; 3,6 (2,8; 4,7) г, по отношению к группе сравнения: 0,4 (0,3; 0,7)%; 0,4 (0,3; 0,6) г, соответственно (p < 0,05), независимо от тяжести болезни и сроков выполнения операции. Вычисление индекса соотношения масс (ИСМ) CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов позволило определить фактор прогноза заболевания, при котором при значениях > 1,0 отмечают благоприятное течение АА, а при ИСМ ≤ 1,0 – неблагоприятное («Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по индексу соотношения масс селезенки», патент на изобретение № 2594119 от 19.07.2016). Влияние цитотоксических CD8+ Тлимфоцитов на развитие аплазии кроветворения за счет выброса медиаторов иммунной агрессии (γ-ИНФ, α-ФНО) описано многими авторами [31; 82; 87; 141; 152; 210; 235; 297]. Кроме того, известно, что Т-эффекторные клетки (CD8+) способны супрессировать Т-регуляторные лимфоциты [213]. Полученные в результате нашей работы данные увеличения содержания цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов в КП, а также оценка взаимодействия 179 CD4+ и CD8+ Т-клеток в селезенке больных АА существенно дополняют понимание иммунных механизмов свидетельствуют об участии этого развития аплазии вторичного кроветворения лимфоидного органа и в патогенезе заболевания. Различия в содержании CD57 (NK)-позитивных клеточных элементов в селезенке среди всех исследуемых групп больных АА не были достоверны (p>0,05). Клетки, экспрессирующие CD57 (NK)+, определялись преимущественно дискретно в МЗ и КП органа. Единичные клеточные элементы с CD57 (NK)+ обнаруживались в ПАЛМ и ЛУ. Отсутствие четкой зональной привязанности данной популяции клеток в структурах селезенки дает основания полагать, что ключевых позиций эти клеточные элементы в развитии иммунных процессов при апластической анемии не имеют. При морфометрическом анализе клеточного звена системы мононуклеарных фагоцитов установлено увеличение процентного содержания CD68- экспрессирующих клеток при ТАА: 7,3 (5,2; 8,5)% и у пациентов с коротким предоперационным периодом: 7,7 (6,0; 8,6)% по отношению к группе сравнения: 5,4 (4,0; 6,9)% соответственно, p < 0,05. Оценка состояния популяции гранулоцитов и клеток моноцитарно-гистиоцитарного ряда выявила достоверное снижение относительного и абсолютного количества МАС387- и МРОэкспрессирующих элементов у всех больных АА вне зависимости от тяжести процесса и срока выполнения операции по отношению к группе сравнения за счет патогенетического дефицита клеточных элементов данных ростков кроветворения. Подсчет интердигитальных ДК (S100+): 2, 1(1,6; 2,6)%, 2,2 (1,4; 3,2) г и ФДК – CD35-позитивных клеточных элементов: 2,8 (1,8; 4,2)%, 2,8 (2,0; 4,2) г выявил статистически значимое увеличение их относительного и абсолютного количества в селезенке у всех больных АА по отношению к группе сравнения S100+: 0,8 (0,6; 0,9)%, 1,0 (0,7; 1,3) г, CD35+: 1,0 (0,7; 1,3)%, 1,2 (0,8; 1,9) г соответственно, p < 0,05. Кроме того, определено существенное повышение данных показателей у пациентов в зависимости от периода проведения 180 спленэктомии. Выявлено повышенное содержание ФДК (CD35+) у лиц, прооперированных в более поздние сроки, – 5,2 (3,7; 8,1)% и 4,2 (3,3; 8,3) г, по сравнению с пациентами, у которых спленэктомия была проведена в первые 2 месяца от начала болезни, – 2,2 (1,1; 3,4)% и 2,5 (1,7; 3,6) г соответственно, p < 0,05. Это свидетельствует об активности иммунных процессов при АА и участии АПК в патогенезе заболевания. Учитывая, что ключевая роль ФДК – это связывание и хранение антигена, увеличение содержания данной популяции клеточных элементов свидетельствует об участии этих антигенпрезентирующих клеток в поддержании активности иммунных процессов при АА. Таким образом, учитывая влияние на клеточный состав селезенки как патогенетических проявлений активного иммунного процесса, присущего самому заболеванию, так и проводимой до спленэктомии ИСТ, можно вывести закономерности: Состав ИКК селезенки пациентов с НАА характеризуется снижением абсолютного содержания В-клеток (CD20) и Т-лимфоцитов (CD3; CD4) в БП, увеличением количества В-лимфоцитов (CD20), Т-клеток (CD3; CD8) в КП, а также снижением величины субпопуляции (CD4) в КП. Данное состояние селезенки соответствует III этапу иммунного ответа. Состав ИКК селезенки больных ТАА имеет особенности, выраженные уменьшением массы Т-клеток (CD3) в БП, увеличением абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов (CD20) и CD8+-цитотоксических Т-лимфоцитов, также макрофагов (CD68) в КП, при сниженных значениях CD4+ Т-клеток в КП. Состояние селезенки можно расценить как II–III этапы иммунного ответа. В 1-й группе (при раннем проведении спленэктомии – до двух месяцев от начала терапии АА) клеточный состав селезенки характеризовался увеличением содержания В-клеток, Т-клеток (CD3, CD8) в КП при снижении количества Т-клеток (CD3) в БП (II–III этапы иммунного ответа). Изменения клеточного состава во 2-й группе выражались в уменьшении содержания Влимфоцитов (CD20), Т-клеток (CD3) в БП, снижении количества CD4экспрессирующих Т-клеток в КП, а также увеличении абсолютных и 181 относительных значений CD8+-цитотоксических Т-лимфоцитов в КП органа, что соответствует III этапу иммунного ответа. Факторами неблагоприятного прогноза можно считать значение абсолютного количества CD4+ Т-клеток в селезенке менее 5,4 г, а также величину индекса соотношения масс (ИСМ) CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов меньше или равную 1,0. 182 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Малочисленность и противоречивость сведений, касающихся строения селезенки, обусловлено тем, что ее морфологическое состояние зависит от активности иммунных процессов, проходящих в ней, а также от миграционных свойств и взаимодействий иммунокомпетентных клеток. Результаты нашей работы показали, что перераспределение иммунокомпетентных клеток в селезенке при различных этапах иммунного ответа имеет свое отражение в морфологических изменениях ее компартментов. Морфометрическая оценка состояния гистоархитектоники селезенки в абсолютных значениях, с использованием величины массы органа, явилась принципиально новым подходом, позволяющим наиболее объективно проанализировать иммуноморфологические процессы, происходящие в ее структурах. Полученные в результате нашей работы морфологические характеристики функциональных зон и их компартментов в зависимости от формы иммунной тромбоцитопении и ответа на спленэктомию при данной патологии дают основание более полному пониманию патогенеза заболевания. Выявленные изменения клеточного состава в селезенке больных иммунной тромбоцитопенией, характеризующиеся увеличением относительного и абсолютного количества В- и Т-лимфоцитов, макрофагов (CD68+), дендритных клеток (CD35+, S100+), а также повышение содержания в белой и красной пульпе CD4+ Т-клеток и CD8+ Тлимфоцитов в красной пульпе свидетельствует о многофакторности развития аутоиммунных расстройств. Выявленные у рефрактерных больных иммунной тромбоцитопенией в белой пульпе более низкие показатели CD4 + Т-клеток по сравнению с пациентами, у которых была получена ремиссия после спленэктомии, подтверждают наличие патогенетического дефекта Т-клеточного контроля при данной патологии. Проведенное морфометрическое исследование селезенки при апластической анемии демонстрирует увеличение размеров белой пульпы за счет маргинальной 183 зоны и лимфоидных узелков, напрямую связанное с тяжестью заболевания. Уменьшение размеров периартериальных лимфоидных муфт у всех больных апластической анемией по отношению к группе сравнения свидетельствует о том, что проводимое иммуносупрессивное лечение до спленэктомии в большей степени влияет на перераспределение клеток в Т-клеточных зонах, В-клеточные компартменты (маргинальная зона и лимфоидные узелки) оказываются менее подверженными воздействию предоперационной терапии. Наши исследования показали, что состав иммунокомпетентных клеток селезенки пациентов с нетяжелой апластической анемией характеризует состояние лимфоидного органа, соответствуещее III этапу иммунного ответа, а у пациентов с тяжелой формой заболевания его можно расценить как II–III этапы иммунного ответа. При раннем проведении спленэктомии – до двух месяцев от начала терапии апластической анемии – клеточный состав селезенки соответствовал II–III этапам иммунного ответа, а при спленэктомии, проведенной позднее двух месяцев от начала лечения – III этапу иммунного ответа. Полученные данные указывают на то, что при тяжелой апластической анемии в ранние сроки проведенная спленэктомия, возможно, имела больший иммуносупрессивный эффект. Выполненные исследования позволили выявить иммуноморфологические критерии прогноза течения иммунной тромбоцитопении и апластической анемии на основании морфометрического анализа селезенки при этих заболеваниях. Комплексное определение характерных иммуноморфологических признаков активности иммунных процессов в селезенке при цитопениях иммунного генеза с использованием полученных критериев прогноза позволили сформулировать теоретическую концепцию о закономерной смене этапов иммунного ответа, обосновывающих спленэктомии. тяжесть заболевания Установленные факторы и эффективность прогноза проводимой позволяют находить дополнительные варианты терапевтического вмешательства после спленэктомии при цитопениях иммунного генеза и оптимизировать лечение пациентов. 184 ВЫВОДЫ 1. Иммуноморфологические изменения селезенки зависят от этапов иммунного ответа и миграционных свойств иммунокомпетентных клеток. Установлено, что I этап иммунного ответа характеризуется: расширением белой пульпы за счет маргинальной зоны, небольшими периартериальными лимфоидными муфтами и лимфоидными узелками без герминативных центров, при умеренноклеточной красной пульпе; при II этапе отмечается увеличение размеров всех компартментов белой пульпы, красная пульпа – умеренноклеточная; на III этапе происходит расширение красной пульпы за счет увеличения ее клеточного состава, компартменты белой пульпы претерпевают стадию обратного развития. 2. Перераспределение клеточных элементов в процессе иммунного ответа в пульпе селезенки влияет на массу функциональных зон органа и их компартментов. Морфометрическое исследование селезенки с использованием параметров величины массы органа позволяет проводить оценку показателей в абсолютных единицах. 3. У больных иммунной тромбоцитопенией, ответивших на спленэктомию, увеличение размеров белой пульпы за счет маргинальной зоны и лимфоидных узелков дает возможность морфологически охарактеризовать состояние селезенки как соответствующее I–II этапам иммунного ответа. Достоверное увеличение размеров белой пульпы за счет маргинальной зоны, лимфоидных узелков, а также расширение красной пульпы в группе с рефрактерным течением заболевания и у пациентов с персистирующей формой позволяют расценить состояние селезенки, как II–III этапы иммунного ответа, что свидетельствует о более продолжительном или агрессивном течении болезни. 4. Установленное статистически значимое уменьшение размеров периартериальных лимфоидных муфт при иммунной тромбоцитопении вне зависимости от ответа на операцию по отношению к группе сравнения (p < 0,05) является отражением патогенеза заболевания, а также результатом воздействия 185 иммуносупрессивной терапии на Т-клеточную зону белой пульпы. Выявленные у рефрактерных больных иммунной тромбоцитопенией в белой пульпе более низкие показатели CD4+-Т-клеток: 4,1 (3,8; 5,0) г по сравнению с пациентами, у которых была получена ремиссия после спленэктомии: 9,9 (5,8; 13,6) г, (р < 0,05), объясняют патогенетический дефект Т-клеточного контроля, возможно, обусловленного субпопуляциями как фолликулярных Т-хелперов, так и Трегуляторных клеток. 5. Изменения клеточного состава в селезенке больных иммунной тромбоцитопенией характеризуются увеличением относительного и абсолютного количества В- и Т-лимфоцитов в белой и красной пульпе, макрофагов (CD68+), дендритных клеток (CD35+, S100+). Повышение содержания в белой и красной пульпе лимфоидных элементов, экспрессирующих CD4+, а также CD8+ Тлимфоцитов в красной пульпе свидетельствует о многофакторности развития аутоиммунных расстройств при данном заболевании. Значимое увеличение количества цитотоксических CD8+-Т-клеток и CD68+-макрофагов в красной пульпе у больных с рефрактерным течением иммунной тромбоцитопении по сравнению с лицами, ответившими на спленэктомию (р < 0,05), свидетельствует, что в разрушении тромбоцитов у пациентов с резистентным к хирургическому лечению течением заболевания наряду с макрофагами активно участвуют и цитотоксические Т-лимфоциты. 6. Определяющими тромбоцитопении неблагоприятный признаками явились: прогноз снижение течения иммунной содержания клеточных субпопуляций в селезенке CD4+ Т-лимфоцитов ниже 20,5 г; увеличение количества CD8+ лимфоидных клеток более 9,75 г, а также значение индекса соотношения масс CD4+/CD8+ ниже 2,3. 7. Увеличение размеров белой пульпы за счет маргинальной зоны и лимфоидных узелков прямо пропорционально тяжести апластической анемии. Уменьшение размеров периартериальных лимфоидных муфт у всех больных апластической анемией по отношению к группе сравнения (p < 0,05) свидетельствует, что проводимая иммуносупрессивная терапия до спленэктомии 186 в большей степени влияет на перераспределение клеток в Т клеточных зонах, Вклеточные компартменты (маргинальная зона и лимфоидные узелки) оказываются менее подверженными воздействию предоперационной ИСТ. 8. Состав иммунокомпетентных клеток селезенки пациентов с нетяжелой апластической анемией характеризуется снижением абсолютного содержания Вклеток (CD20) и Т-лимфоцитов (CD3; CD4) в белой пульпе, увеличением количества В-лимфоцитов (CD20), Т-клеток (CD3; CD8) в красной пульпе, а также снижением величины субпопуляции (CD4) в красной пульпе. Данное состояние селезенки соответствует III этапу иммунного ответа. 9. Особенности состава иммунокомпетентных клеток селезенки при тяжелой апластической анемии отличаются выраженным уменьшением массы Тклеток (CD3) в белой пульпе; увеличением абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов (CD20), цитотоксических CD8+-Т-лимфоцитов, макрофагов (CD68), а также снижением значений CD4+-Т-клеток в красной пульпе. Состояние селезенки позволяет расценить как II–III этапы иммунного ответа. 10. При раннем проведении спленэктомии – до двух месяцев от начала терапии апластической анемии – клеточный состав селезенки характеризуется увеличением содержания В-клеток, Т-клеток (CD3, CD8) в красной пульпе при снижении количества Т-клеток (CD3) в белой пульпе (II–III этапы иммунного ответа). При спленэктомии, проведенной позднее двух месяцев от начала лечения, изменения выражаются в уменьшении содержания В-лимфоцитов (CD20), Тклеток (CD3) в белой пульпе, снижении количества CD4-экспрессирующих Тклеток в красной пульпе, а также в увеличении абсолютных и относительных значений CD8+-цитотоксических Т-лимфоцитов в красной пульпе органа, что соответствует III этапу иммунного ответа. 11. При подсчете интердигитальных ДК (S100+) и фолликулярных ДК (CD35+) выявляется статистически значимое увеличение их количества в селезенке у всех больных апластической анемией по отношению к группе сравнения (p < 0,05). Повышенное содержание фолликулярных ДК (CD35+) у лиц, 187 прооперированных позднее 2 месяцев от начала болезни по сравнению с пациентами, у которых спленэктомия была проведена в более ранние сроки – (p < 0,05), свидетельствует об участии данных клеток в поддержании активности иммунных процессов при данном заболевании. 12. Оценка состояния популяции гранулоцитов и клеток моноцитарногистиоцитарного ряда в селезенке больных апластической анемией выявляет достоверное снижение относительного и абсолютного количества МАС387+ и МРО-экспрессирующих элементов вне зависимости от тяжести процесса и срока выполнения операции по отношению к группе сравнения (p < 0,05), за счет патогенетического дефицита клеточных элементов данных ростков селезенке больных кроветворения. 13. Клетки, апластической экспрессирующие анемией (NK)+ CD57 определяются в преимущественно дискретно в маргинальной зоне и красной пульпе органа. Единичные клеточные элементы с CD57 (NK)+ обнаруживаются в периартериальных лимфоидных муфтах и лимфоидных узелках. Отсутствие четкой зональной привязанности данной популяции клеток в структурах селезенки дает основания полагать, что ключевых позиций эти клеточные элементы в развитии иммунных процессов при депрессии кроветворения не имеют. 14. Неблагоприятный прогноз течения апластической анемии после спленэктомии определяют: увеличение массы белой пульпы селезенки более 8,5 г и массы маргинальной зоны – более 1,9 г, значение абсолютного количества CD4 + Т-клеток в селезенке менее 5,4 г, а также величину индекса соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов меньше или равную 1,0. 188 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При морфометрических исследованиях размеров функциональных зон селезенки и их компартментов, а также оценки ее клеточного состава необходимо учитывать величину массы органа. 2. Результаты иммуноморфологических исследований селезенки как клинического, так и лабораторного характера, изучение морфометрических показателей ее структур следует интерпретировать с учетом этапов иммунного ответа. 3. При гистологическом исследовании селезенки при иммунных цитопениях (иммунной тромбоцитопении и апластической анемии) целесообразно дополнительно к общепринятым стандартным подходам использовать комплекс иммуногистохимических и морфометрических технологий, направленных на оценку прогноза заболевания. 4. При определении факторов неблагоприятного прогноза течения иммунной тромбоцитопении при иммуногистохимических и морфометрических исследованиях селезенки (снижение массы CD4+ лимфоцитов ниже 20,5 г; увеличение массы CD8+ лимфоидных клеток более 9,75 г, а также значение индекса соотношения масс CD4+/CD8+ ниже 2,3) необходимо проведение профилактических и лечебных противорецидивных мероприятий, а также активное динамическое наблюдение за пациентами. 5. Выявление признаков, определяющих неблагоприятный прогноз течения апластической анемии после спленэктомии (увеличение массы белой пульпы селезенки больных с депрессией кроветворения более 8,5 г и массы маргинальной зоны – более 1,9 г, а также значение абсолютного количества CD4+ Т-клеток в селезенке менее 5,4 г и величина индекса соотношения масс CD4+/CD8+ Тлимфоцитов меньше или равная 1,0), обосновывает индивидуальный подход к проведению дальнейших курсов иммуносупрессивной терапии у категории больных. данной 189 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ АА АПК АТГ/АЛГ БП ГКС ГСК ГЦ ДК ИГХ ИДК ИКК ИЛ ИСТ ИТП ИФН-γ KИР КП КСФ ЛУ МДС МЗ МЗВК МНС МПО НАА NK ОМЛ ПАЛМ ПФЗ РЭС СМФ ТАА ТЗ ТКМ ТН Т-рег Тс ТПО ФВК ФДК ФНО-α ФТХ – апластическая анемия – антигенпредставляющие клетки – антитимоцитарный/лимфоцитарный глобулин – белая пульпа – глюкокортикостероиды – гемопоэтические стволовые клетки – герминативные центры – дендритные клетки – иммуногистохимия – интердигитальные дендритные клетки – иммунокомпетентные клетки – интерлейкин – иммуносупрессивная терапия – иммунная тромбоцитопения – интерферон-γ – рецептор киллерных клеток – красная пульпа – колониестимулирующие факторы – лимфоидные узелки – миелодиспластический синдром – маргинальная зона – маргинальные зоны В-клетки – главный комплекс гистосовместимости – миелопероксидаза – нетяжелая апластическая анемия – натуральные киллеры – острый миелоидный лейкоз – периартериальные лимфоидные муфты – перифолликулярная зона – ретикулоэндотелиальная система – система мононуклеарных фагоцитов – тяжелая апластическая анемия – тимусзависимые – трансплантация костного мозга – тимуснезависимые – Т-регуляторные клетки – цитотоксические Т-лимфоциты – тромбопоэтин – фолликулярные В-клетки – фолликулярные дендритные клетки – фактор некроза опухоли-α – фолликулярные Т-хелперы 190 ЦсА ЦФ ВСR CD GPIIb/IIIa Ig MAdCAM-1 SIGN-R1 (CD169, siglec-1) T-bet TCR Th Th17 ТН-1 ТН-2 FcR – циклоспорин А – циклофосфан – В-клеточный рецептор – (cluster differentiation) – маркеры клеток – гликопротеин IIb-IIIa – иммуноглобулин – (mucosal adressin cell adhesion molecule-1) – адрессин – сиалоадгезин – транскрипционный фактор – Т-клеточный рецептор – Т-хелперы – Т-клетки, продуцирующие ИЛ-17 – тимуснезависимые антигены 1-го класса – тимуснезависимые антигены 2-го класса – Fc-рецептор 191 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абдулкадыров, К.М. Апластическая анемия [Текст] / К.М. Абдулкадыров, С.С. Бессмельцев. – СПб : Наука; KN, 1995. – 232 с. 2. Абдулкадыров, К.М. Комплексная программа диагностики апластической анемии с определением прогностически значимых патогенетических особенностей заболевания [Текст] : метод. рекомендации / К.М. Абдулкадыров, С.С. Бессмельцев, А.В. Чечеткин. – СПб : ВиТ-принт, 2015. – 32 с. 3. Амирханян, Е.С. Наш опыт продления сроков ремиссии при аутоиммунных цитопениях [Текст] / Е.С. Амирханян, А.Г. Межлумян // Гематология и трансфузиология. – 2000. – Т. 45, № 5. – С. 38–39. 4. Анохина, Ю.В. Изменения в селезенке при острой форме болезни Верльгофа [Текст] / Ю.В. Анохина, Л.С. Цепа // Проблемы гематологии. – 1969. – № 10. – С. 28–31. 5. Аношина, М.Ю. Эндогенная интоксикация, перекисное окисление липидов и проницаемость мембраны эритроцитов у больных апластической анемией / М.Ю. Аношина, Н.М. Третяк, А.И. Коваль и др. // Новое в гематологии и трансфузиологии. – 2005. – Вып. 3. – С. 81–85. 6. Артеменко, Е.О. Программируемая клеточная смерть тромбоцитов при их сверхактивации [Текст] / Е.О. Артеменко, А. Н. Свешникова, М.А. Пантелеев // Онкогематология. – 2014. – № 3. – С. 63–66. 7. Баранова, Р.З. Эффективность ЦсА в терапии приобретенной апластической анемии у детей [Текст] / Р.З. Баранова, И.О. Омарова, К.А. Мажибаев // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2005. – Т. 4, № 2. – С. 16–19. 8. Барта, И. Селезенка: Анатомия, физиология, патология и клиника [Текст] / пер. с перераб. нем. изд. д-р М. Сиза. – Будапешт : Изд-во Акад. наук Венгрии, 1976. – 264 с. 9. Бельская, Н.В. Влияние естественных супрессорных клеток на продукцию цитокинов Th1- и Th2-типов и пролиферацию поляризованных Т-лимфоцитов 192 [Текст] / Н.В. Бельская, Ю.П. Бельский, М.Г. Данилец и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – Т. 141, № 4. – С. 425–428. 10. Беляева, Г.Б. Восстановление утраченной функции селезенки методом ксенотрансплантации культур клеток [Текст] / Г.Б. Беляева, О.В. Габилин, Т.В. Вавилова и др. // Вестник гематологии. – 2005. – Т. 1, № 3. – С. 40–46. 11. Богачева, И.Ю. Динамика количества гранулоцитов в периферической крови у детей с приобретенными апластическими анемиями, получивших лечение антитимоцитарным глобулином, циклоспорином А и гранулоцитарным колонестимулирующим фактором [Текст] / И.Ю. Богачева, Г.А. Новичкова, Д.В. Литвинов и др. // Терапевтический архив. – 2002. – № 12. – С.71–77. 12. Боев, В.М. Руководство по обеспечению решения медико-биологических задач с применением программы Statistica 10.0 [Текст] / В.М Боев, Е.Л. Борщук, А.К. Екимов, Д.Н. Бегун. – Оренбург : ОАО «ИПК ”Южный Урал”», 2014. – 208 с. 13. Виноградова, М.А. Инфекционные осложнения в дебюте апластической анемии [Текст] / М.А. Виноградова, Г.А. Клясова, Е.Е. Трушина и др. // Гематология и трансфузиология. – 2007. – Т. 52, № 4. – С. 16–21. 14. Виноградова, Ю.Е. Состав популяций и клонов лимфоцитов при цитопенических состояниях гемопоэза [Текст] / Ю.Е. Виноградова // Терапевтический архив. – 2006. – № 7. – С. 94–98. 15. Волков, функциональной В.П. Новый иммуноморфологии алгоритм селезенки морфометрической [Электронный оценки ресурс] / В.П. Волков // Universum: Медицина и фармакология : электронный научный журнал. – 2015. – № 5-6 (18). – Режим доступа: http://7universum.com/ru/med/ archive/item/2341. – (Дата обращения: 14.04.2017). 16. Воронина, Е.Н. Мембранные рецепторы тромбоцитов: функции и полиморфизм [Текст] / Е.Н. Воронина, М.Л. Филипенко, Д. Сергеевичев и др. // Вестник Вавиловского общества генетиков и селекционеров. – 2006. – Т. 10, № 3. – С. 553–564. 17. Ганапиев, А.А. Частота и характер осложнений терапии антилимфоцитарным глобулином у больных с апластической анемией [Текст] / 193 А.А. Ганапиев, К.М. Абдулкадыров, Б.В. Афанасьев // Терапевтический архив. – 2003. – № 8. – С. 68–71. 18. Ганапиев, А.А. Применение аллогенной трансплантации костного мозга и иммуносупрессивная терапия при лечении больных приобретенной апластической анемией [Текст] / А.А. Ганапиев, И.К. Голубовская, Ю.Р. Залялов [и др.] // Терапевтический архив. – 2010. – № 7. – С. 48–52. 19. Гасанов, А.Б. Функциональная морфология органов иммунной системы при опиатной наркомании [Текст] / А.Б. Гасанов // Современные проблемы науки и образования. – 2009. – № 6. – С. 47–51. 20. Гланц, С. Медико-биологическая статистика [Текст] / пер. с англ. – Москва : Практика, 1998. – 459 с. 21. Горская, Ю.Ф. Продукция цитокинов стромальными клетками костного мозга и селезенки под влиянием препаратов микробных клеток in vitro [Текст] / Ю.Ф. Горская, Т.А. Данилова, М.В. Мезенцева [и др.] // Иммунология. – 2011. – № 5. – С. 236–239. 22. Гржимоловский, А.В. Лапароскопическая спленэктомия у гематологических больных : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 14.00.29, 14.00.27 / Гржимоловский Александр Вадимович; Гематол. науч. центр РАМН. – М., 2004. – 25 с. 23. Данишян, К.И. Лапароскопическая спленэктомия в лечении больных апластической анемией [Текст] / К.И. Данишян, А.В. Гржимоловский, С.Р. Карагюлян и др. // Вестник гематологии. – 2007. – № 2. – С. 55–56. 24. Детская гематология: клинические рекомендации [Текст] / под ред. А. Г. Румянцева, А. А. Масчана, Е. В. Жуковской. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015. – 647 с. 25. Донюш, Е.К. Современное состояние вопроса об идиопатической тромбоцитопенической пурпуре у детей [Текст] / Е.К. Донюш // Педиатрия. – 1999. – № 2. – С. 56–77. 26. Дудина, Г.А. Элтромбопаг при резистентном течении первичной иммунной тромбоцитопении: собственное наблюдение [Текст] / Г.А. Дудина, 194 И.Н. Контиевский, В.Н. Перова // Клиническая онкогематология. – 2013. – № 1. – С. 97–98. 27. Ермакова, Н.Г. Иммунные механизмы в патогенезе хронических воспалительных заболеваний [Текст] / Н.Г. Ермакова, В.С. Пауков, Б.Б. Салтыков // Вестник новых медицинских технологий. – 1999. – Т. VI, № 2. – С. 62–64. 28. Жарикова, Н.А. Периферические органы системы иммунитета: Развитие, строение, функция [Текст] / Н. А. Жарикова. – Минск : Беларусь, 1979. – 206 с. 29. Желтова, О.И. Особенности иммунитета больных с хроническими рецидивирующими инфекциями [Текст] / О.И. Желтова, Н.М. Старостина, М.А. Тихонова // Иммунология. – 2011. – № 4. – С. 205–209. 30. Зайцев, В.Б. Иммуноморфология селезенки человека [Текст] / В.Б. Зайцев, Н.С. Федоровская, Д.А. Дьяконов [и др.] // Морфология. – 2013. – Т. 143, № 3. – С. 27–31. 31. Ильинская, А.Н. Влияние отечественного циклоспорина А на функциональную активность лимфоцитов человека [Текст] / А.Н. Ильинская, Л.В. Пичугина, Г.О. Бахус и др. // Иммунология. – 2002. – № 4. – С. 208–210. 32. Истомина, Л.А. Применение циклофосфана при апластической анемии после спленэктомии : дис. ... канд. мед. наук : 14.00.29 / Истомина Лилия Арленовна. – М., 1996. – 147 с. 33. Клинические рекомендации по лечению апластической анемии [Текст] : утв. на II Конгрессе гематологов России (апрель 2014 г.) / Национальное гематологическое общество; под ред. В.Г. Савченко; Е.Н. Парвичникова, Е.А. Михайлова [и др.]. – М. : Национальное гематологическое общество, 2014. – 24 с. 34. Клясова, Г.А. Алгоритмы лечения и профилактики кандидоза и аспергиллеза у взрослых больных лейкозами, лимфомами и депрессиями кроветворения [Текст] / Г.А. Клясова, Е.Н. Паровичникова, Г.М. Галстян [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2007. – № 4. – С. 3–7. 35. Ковалева, Л.Г. Клинико-статистические данные и оценка различных методов терапии идиопатической тромбоцитопенической пурпуры [Текст] / 195 Л.Г. Ковалева, Е.И. Пустовая, Т.И. Сафонова [и др.] // Терапевтический архив. – 2011. – № 4. – С. 60–65. 36. Колесников, А.П. Диагностика вторичных иммунодефицитов [Текст] / и А.П. дифференцированное Колесников, А.С. лечение Хабаров, В.А. Козлов // Терапевтический архив. – 2001. – № 4. – С. 55–59. 37. Кормилина, Н.В. Гистотопографические показатели лимфоидной ткани селезенки при действии комплекса биологически активных веществ животного происхождения [Текст] / Н.В. Кормилина, Н.Н. Чучкова, С.Н. Стяжкина // Морфологические ведомости. – 2006. – № 3/4. – С. 30–33. 38. Котоян, Э.Р. Клиническая гематология [Текст] : руководство для врачей / Э.Р. Котоян. – М. : Медицинское информационное агентство, 2003. – 245 с. 39. Кроткова, О.С. Структурные изменения селезенки мышей при воздействии иглоукалывания и лазера во временном аспекте : дис. … канд. мед. наук: 03.03.04 / Кроткова Ольга Сергеевна; [Место защиты: Казанский государственный медицинский университет]. – Чебоксары, 2015. – 174 с. 40. Кузник, Б.И. Геморрагические и тромботические заболевания и синдромы у детей: патогенез, клиника, диагностика, терапия и профилактика [Текст] / Б.И. Кузник, В.Г. Стуров, О.Г. Максимова. – Новосибирск : Наука, 2012. – 456 с. 41. Кулагин, А.Д. Диагностика и лечение приобретенной апластической анемии [Текст] / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, И.В. Крючкова и др. // Терапевтический архив. – 2006. – Т. 28, № 11. – С. 48–53. 42. Кулагин, А.Д. Апластическая анемия: иммунопатогенез, клиника, диагностика, лечение [Текст] / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, В.А. Козлов. – Новосибирск : Наука, 2008. – 236 с. 43. Куртов, И.В. Нарушение гемостаза у больных хроническим гепатитом и циррозом печени вирусной этиологии (HCV), осложненных тромбоциопенией [Текст] / И.В. Куртов, И.Л. Давыдкин, Р.К. Хайретдинов и др. // Вестник Российского университета дружбы народов, серия «Медицина». – 2010. – № 3. – С. 139–141. 196 44. Лагутина, Н.Я. Иммуногистохимическое исследование сосудов при гипопластической анемии [Текст] / Н.Я. Лагутина, Б.Б. Салтыков, Н.С. Розанова [и др.] // Проблемы гематологии и переливания крови. – 1972. – Т. 17, № 2. – С. 12–16. 45. Макалиш, Т.П. Морфофункциональные особенности селезенки при воздействии на организм факторов различного генеза [Текст] / Т.П. Макалиш // Таврический медико-биологический вестник. – 2013. – Т. 16, № 61. – С. 265–269. 46. Масчан, А.А. Современные методы диагностики и лечения первичной иммунной тромбоцитопении (по итогам совещания совета экспертов) [Текст] / А.А. Масчан, Л.Г. Ковалева, А.Г. Румянцев // Вопросы гематологии, онкологии и иммунологии в педиатрии. – 2010. – Т. 9, № 4. – С. 5–14. 47. Масчан, А.А. Иммуно-опосредованные тромбоцитопении новорожденных: дифференциальный диагноз и принципы терапии (обзор литературы) [Текст] / А.А. Масчан, А.Г. Румянцев // Вопросы гематологии, онкологии и иммунологии в педиатрии. – 2010. – Т. 9, № 3. – С. 13–18. 48. Махмануров, А.А. Клинико-лабораторные особенности гемопоэза у детей с апластической анемией и идиопатической тромбоцитопенической пурпурой в процессе реабилитации в условиях среднегорья Тянь-Шань : дис. ... канд. мед. наук: 14.00.29 / Махмануров Абдухолик Абдулхаевич; [Место защиты: ГОУВПО «Алтайский государственный медицинский университет»]. – Бишкек, 2004. – 106 с. 49. Меликян, диагностике и А.Л. лечению Национальные клинические идиопатической рекомендации тромбоцитопенической по пурпуры (первичной иммунной тромбоцитопении) у взрослых (редакция 2016 г.) [Текст] / А.Л. Меликян, Е.И. Пустовая, Н.В. Цветаева [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2017. – Т. 62, № 1. – С. 3–24. – Приложение 1. 50. Мининкова, А.И. Структура и функции тромбоцитов (обзор литературы). I часть [Текст] / А.И. Мининкова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 11. – С. 21–26. 51. Мининкова, А.И. Исследование тромбоцитов методом проточной 197 цитофлюориметрии (обзор литературы). II часть [Текст] / А.И. Мининкова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2011. – № 4. – С. 25–30. 52. Михайлова, (постгепатитные Е.А. Апластические апластические анемии) анемии и [Текст] / вирусные Е.А. гепатиты Михайлова, В.Н. Ядрихинская, В.Г. Савченко // Терапевтический архив. – 1999. – № 7. – С. 64–69. 53. Михайлова, Е.А. Результаты программной терапии взрослых больных апластической анемией [Текст] / Е.А. Михайлова, В.Г. Савченко, Е.Н. Устинова [и др.] // Проблемы гематологии. – 2003. – № 3. – С. 14. 54. Михайлова, Е.А. Спленэктомия в программной терапии апластической анемии [Текст] / Е.А. Михайлова, В.Г. Савченко, Е.Н. Устинова [и др.] // Терапевтический архив. – 2006. – № 8. – С. 52–57. 55. Михайлова, Е.А. Программное лечение больных апластической анемией [Текст] / Е.А. Михайлова, Е.Н. Устинова, Г.А. Клясова // Программное лечение лейкозов / под ред. В.Г. Савченко. – М. : Изд-во Гематологического научного центра РАМН, 2008. – С. 328–342. 56. Михайлова, Е.А. Эффективность ЦсА в лечении взрослых больных апластической анемией [Текст] / Е.А. Михайлова, В.Г. Савченко, Е.Н. Устинова [и др.] // Терапевтический архив. – 2001. – Т. 73, № 7. – С. 56–61. 57. Михайлова, больных Е.А. Комбинированная апластической анемией: иммуносупрессивная эффективность антитимоцитарного глобулина [Текст] / Е.А. повторных Михайлова, З.Т. терапия курсов Фидарова, Е.Н. Устинова [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2014. – № 4. – С. 11–18. 58. Молдавская, А.А. Морфологические критерии строения селезенки в постнатальном онтогенезе [Текст] / А.А. Молдавская, А.В. Долин // Морфологические ведомости. – 2007. – № 3/4. – С. 268–269. 59. Молдавская, дефинитивной А.А. структуры Сравнительная селезенки на фоне характеристика изменений хронической алкогольной интоксикации в эксперименте и у человека [Текст] / А.А. Молдавская, А.В. Долин // Успехи современного естествознания. – 2009. – № 2. – С. 11–14. 198 60. Морозов, Д.А. Постспленэктомический гипоспленизм / Д.А. Морозов, С.А. Клюев // Вестник РАМН. – 2015. – № 4. – С. 413–418. 61. Мустафакулов, Г.И. Профилактика осложнений при спленэктомии у гематологических больных [Текст] / Г.И. Мустафакулов, Л.Т. Наджмитдинов, Э.Ш. Шоабдукаримов // Новое в гематологии и трансфузиологии. – 2006. – Вып. 4. – С. 203–206. 62. Новичкова, Г.А. Роль трансфузионных донорских гранулоцитов в терапии инвазивных аспергиллезов у детей с апластической анемией [Текст] / Г.А. Новичкова, Д.Н. Балашов, П.Е. Трахтман [и др.] // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2005. – Т. 4, № 1. – С. 37–40. 63. Новичкова, Г.А. Диагностика, клиника и лечение инвазивного аспергиллеза у детей с приобретенной апластической анемией: ретроспективный анализ 20 случаев [Текст] / Г.А. Новичнова, О.В. Горонкова, Д.Н. Балашов [и др.] // Гематология и трансфузилогия. – 2006. – Т. 51, № 6. – С. 17–23. 64. Новичкова, Г.А. Эффективность и безопасность повторного применения лошадиного АТГ в лечении приобретенной апластической анемии у детей [Текст] / Г.А. Новичкова, Е.Г. Кравченко, М.А. Масчан [и др.] // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2004. – Т. 3, № 3. – С. 76–78. 65. Новичкова, Г.А. Опыт применения интраконазола в суспензии у детей с онкологическими заболеваниями и приобретенной апластической анемией [Текст] / Г.А. Новичкова, Д.В. Литвинов, Е.Г. Кравченко [и др.] // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2005. – Т. 4, № 1. – С. 87–91. 66. Обернихин, С.С. Динамика морфофункциональных изменений органов иммунной системы мышей BALB/c при экспериментальном гепатите [Текст] / С.С. Обернихин, О.В. Макаров, В.В. Малайцев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – Т. 141, № 4. – С. 451–454. 67. Ольшанская, Ю.В. Клональные хромосомные перестройки у больных апластической анемией в начале заболевания и при трансформации [Текст] / Ю.В. Ольшанская, Е.А. Михайлова, Е.В. Домрачева [и др.] // Терапевтический архив. – 2006. – № 7. – С. 31–37. 199 68. Павлова, И.Е. Состояние иммунной системы после органосохраняющих операций на селезенке, выполненных в связи с травмой: отдаленные результаты [Текст] / И.Е. Павлова, Л.Н. Бубнова, В.Д. Каргин // Медицинская иммунология. – 2006. – Т. 8, № 2/3. – С. 391. 69. Павлова, И.Е. Функциональная активность нейтрофилов у больных хронической аутоиммунной тромбоцитопенической пурпурой и наследственной микросфероцитарной анемией, перенесших спленэктомию [Текст] / И.Е. Павлова, Ж.В. Чубукина // Трансфузиология. – 2006. – Т. 7, № 3. – C. 43–48. 70. Павлова, И.Е. Особенности функционирования иммунной системы после спленэктомии у пациентов с заболеваниями системы крови и травмами селезенки : автореф. дис. ... д-ра мед. наук: 14.00.29, 14.00.36 // Павлова Ирина Евгеньевна; [Место защиты: Рос. науч.-исслед. ин-т гематологии и трансфузиологии РФ]. – СПб, 2007. – 42 с. 71. Панин, Л.Е. Роль аполипопротеина А-I, стероидных гормонов и их комплексов в регуляции биосинтеза белка и ДНК в лимфоцитах селезенки [Текст] / Л.Е. Панин, Е.Ю. Клейменова // Иммунология. – 2002. – № 5. – С. 206–208. 72. Пащенков, М.В. Роль дендритных клеток в регуляции иммунного ответа [Текст] / М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин // Иммунология. – 2002. – № 4. – С. 313–321. 73. Петров, В.Ю. Сравнительная характеристика острой тромбоцитопенической пурпуры у детей, ассоциированной с ОРВИ и гриппом [Текст] / В.Ю. Петров, Л.Н. Якунина, Т.Г. Плахута [и др.] // Педиатрия. – 2004. – № 2. – С. 30–36. 74. Поляков, постспленэктомических А.В. Патофизиологические иммунологических нарушений и механизмы возможность их коррекции: клинико-экспериментальное исследование : дис. кандидата медицинских наук: 14.03.03 / Поляков Александр Вячеславович; [Место защиты: Морд. гос. ун-т им. Н.П. Огарева]. – Саранск, 2012. – 142 с. 75. Пономаренко, В.М. Нарушения межклеточной регуляции при апластической анемии [Текст] / В.М. Пономаренко, В.И. Ругаль // Гематология и 200 трансфузиология. – 1994. – Т. 39, № 1. – С. 26–29. 76. Птушкин, В.В. Лечение больных с резистентной иммунной тромбоцитопенией: обзор литературы и клинические наблюдения [Текст] / В.В. Птушкин, С.В. Миненко, Э.Р. Биячуев [и др.] // Онкогематология. – 2011. – № 1. – С. 56–63. 77. Пшеничная, Н.Ю. Взаимосвязь нарушений в рецепторном аппарате тромбоцитов к тромбопоэтину и развития тромбоцитопении у больных хроническим гепатитом С [Текст] / Н.Ю. Пшеничная, Г.В. Кузнецова, Д.С. Колпаков // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 7. – С. 375–378. 78. Рабсон, А. Основы медицинской иммунологии [Текст] / А. Рабсон, А. Ройт, П. Делвз ; пер. с англ. Л.А. Певницкого. – М. : Мир, 2006. – 318 с. 79. Рейзис, А.Р. TTV-инфекция и заболевания системы кроветворения у детей [Текст] / А.Р. Рейзис, Д.В. Литвинов, А.К. Дрондина [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2002. – № 4. – C. 22–26. 80. Реук, В.Д. Цитологические особенности селезенки больных гипопластической и апластической анемией : автореф. дис. ... канд. биолог. наук: 14.03.03 / Реук В.Д.; [Место защиты: Центр. ин-т гематологии и переливания крови]. – М., 1970. – 12 с. 81. Розанова, О.Е. Продукция цитокинов клетками периферической крови и костного мозга больных апластической анемией [Текст] / О.Е. Розанова, Л.Н. Бубнова, Т.В. Глазанова [и др.] // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. – 2001. – № 1. – С. 58–59. 82. Розанова, О.Е. Цитокинопосредованные аспекты иммунопатогенеза апластической анемии [Текст] / О.Е. Розанова, Л.Н. Бубнова // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 4. – С. 34–38. 83. Розанова, О.Е. Способность мононуклеаров периферической крови и костного мозга больных апластической анемией к продукции мульти- колониестимулирующего фактора интерлейкина-3 [Текст] / О.Е. Розанова // Медицинская иммунология. – 2005 – Т. 7, № 4. – С. 421–424. 84. Розанова, О.Е. Соотношение основных цитокинов – позитивных и 201 негативных регуляторов гемопоэза – у больных апластической анемией в различные фазы заболевания: рецидиве и ремиссии [Текст] / О.Е. Розанова, Л.Н. Бубнова // Медицинская иммунология. – 2006. – Т. 8, № 2/3. – С. 423–424. 85. Розанова, О.Е. Соотношение основных оппозитных цитокинов у больных апластической анемией в различные фазы заболевания: в рецидиве и ремиссии [Текст] / О.Е. Розанова, Л.Н. Бубнова, К.М. Абдулкадыров // Вестник гематологии. – 2007. – Т. 3, № 3. – С. 45–49. 86. Ругаль, В.И. Структурные особенности кроветворного микроокружения при тяжелой апластической анемии [Текст] / В.И. Ругаль, В.М. Пономаренко, К.М. Абдулкадыров // Мед. академ. журн. – 2004. – Т. 4, № 1. – С. 53–56. 87. Рыбакина, Е.Г. Экспрессия с-Fаs-гена в клетках гипоталамических структур и цитотоксическая активность естественных клеток-киллеров селезенки крыс после введения цитоксана [Текст] / Е.Г Рыбакина, Н.С. Новикова, Т.В. Абрамова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – Т. 141, № 4. – C. 375–381. 88. Рябикина, А. И. Возрастная иммуноархитектоника селезенки: экспериментальное исследование : дис. … канд. мед. наук: 14.00.02 / Рябикина Александра Ивановна; [Место защиты: ГОУВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»]. – Волгоград, 2008. – 148 с. 89. Саркисян, Г.П. Иммунофенотипическая и функциональная характеристика лимфоцитов крови у больных апластической анемией на фоне иммуносупрессивной терапии [Текст] / Г.П. Саркисян, И.А. Калинина, Т.И. Булычева [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2003. – Т. 48, № 3. – С. 23–26. 90. Свинарева, Д.А. Исследование параметров дифференцировки мезенхимных стромальных клеток у здоровых доноров и больных апластической анемией [Текст] / Д.А. Свинарева, Т.В. Петрова, И.Н. Шипунова (Нифонтова) [и др.] // Терапевтический архив. – 2009. – № 7. – С. 66–70. 91. Семикина, Е.Л. Мембранные маркеры и рецептор к интерлейкину-2 лимфоцитов селезенки у детей с апластической анемией: выявление активных 202 субпопуляций [Текст] / Е.Л. Семикина, Н.А. Торубарова, В.Н. Жаров // Гематология и трансфузиология. – 1990. – Т. 35, № 8. – С. 24–26. 92. Сенников, С.В. Роль субпопуляций Т-клеток в индукции иммунологической толерантности [Текст] / С.В. Сенников, Ю.Н. Хантакова // Иммунология. – 2017. – Т. 38, № 4. – С. 239–244. 93. Синельников, Р.Д. Атлас анатомии человека [Текст]. В 3 т. Т. 2 : Учение о внутренностях и сосудах : [для мед. ин-тов] / Р. Д. Синельников, проф. – 3-е изд., перераб. и доп. – М. : Медгиз, 1963. – С. 474–477. 94. Смирнова, Е.А. Исследование эритроклазических кластеров в костном мозге больных апластической анемией [Текст] / Е.А. Смирнова, Д.И. Бельченко, Е.Л. Кривошеина // Педиатрия. – 2002. – № 6. – С. 11–13. 95. Смирнова, Т.С. Строение и функции селезенки [Текст] / Т.С. Смирнова, О.Д. Ягмуров // Морфология. – 1993. – Т. 104, № 5/6. – С. 142–156. 96. Соседко, Ю.И. Судебно-медицинская экспертиза повреждений селезенки при травме тупыми твердыми предметами [Текст] / Ю.И. Соседко, В.В. Колкутин, М.В. Федулова [и др.] ; под общ. ред. проф. В.В. Колкутина. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : Медицина, 2010. – 128 с. 97. Сучков, С.В. Постинфекционный аутоиммунный синдром: особенности патогенеза и современные протоколы клинической иммунодиагностики [Текст] / С.В. Сучков, З.С. Шогенов, А.Н. Хитров [и др.] // Терапевтический архив. – 2007. – № 4. – С. 71–76. 98. Торубарова, Н.А. Клиническое значение антигенов лимфоцитов при апластической анемии у Н.А. Торубарова, Н.В. Кошель, Э.Д. Алымкулова дифференцированных детей // [Текст] / Гематология и трансфузиология. – 1987. – Т. 32, № 12. – С. 5–20. 99. Туманов, А.В. Развитие вторичных лимфоидных органов [Текст] / А.В Туманов // Иммунология. – 2004. – Т. 25, № 2. – C. 120–128. 100. Фарманкулов, Х.К. Получение и применение стволовых клеток сиблингов больных острыми лейкозами и апластической анемией [Текст] / Х.К. Фарманкулов, М.А. Махмудова, А.Х. Уринов и др. // Новое в гематологии и 203 трансфузиологии. – 2006. – № 4. – C. 87–94. 101. Федоровская, Н.А. Современная программа терапии апластической анемии [Текст] / Н.А. Федоровская, Ю.И. Югов // Актуальные вопросы современной медицины (Епифановские чтения). – 2003. – C. 42-44. 102. Федоровская, Н.А. Клинические, морфологические, иммунологические особенности и дифференцированная терапия гипопластической (апластической) анемии: (14.00.29) : дис. … д-ра мед. наук / Ленингр. НИИ гематологии и переливания крови. – Ленинград, 1986. – 316 с. 103. Федоровская, Н.А. Роль спленэктомии в лечении тяжелой апластической анемии [Текст] / Н.А. Федоровская, Ю.И. Югов, Н.М. Поздеев // Гематология и трансфузиология. – 1995. – № 6. – С. 19. 104. Федоровская, Н.С. Морфометрическая характеристика белой пульпы селезенки и особенности ее микроциркуляции у больных иммунной тромбоцитопенией [Текст] / Н.С. Федоровская, Д.А. Дьяконов, Н.А. Федоровская [и др.] // Гематология и переливание крови. – 2012. – № 36. – С. 301–306. 105. Федоровская, Н.С. Морфоиммунологическая характеристика селезенки человека [Текст] / Н.С. Федоровская, Д.А. Дьяконов, А.М. Федоровский [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012. – № 5 (42). – С. 62–66. 106. Федоровская, Н.С. Характеристика функциональных зон селезенки при приобретенной апластической анемии в зависимости от тяжести болезни [Текст] / Н.С. Федоровская, Д.А. Дьяконов // Врач-аспирант. – 2013. – № 2 (57). – С. 43–49. 107. Фиясь, А.Т. Клиника, диагностика и лечение первичной иммунной тромбоцитопении (часть I) [Текст] / А.Т. Фиясь, Б.И. Френкель // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. – 2011. – № 2. – С. 3–7. 108. Чейдо, М.А. Особенности распределения клеточных субпопуляций в селезенке и периферической крови у мышей линии СВА в условиях активации мю- и дельта-опиоидных систем [Текст] / М.А. Чейдо, М.М. Геворгян // Иммунология. – 2011. – № 5. – С. 248–250. 204 109. Чулкова, С.В. Селезенка – периферический орган иммунной системы. Влияние спленэктомии на иммунный статус [Текст] / С.В. Чулкова, И.С. Стилиди, Е.В. Глухов [и др.] // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2014. – Т. 25, № 1/2. – С. 21–24. 110. Цуря, В.М. Сравнительная эффективность спленэктомии и ЦсА в терапии апластической анемии у детей [Текст] / В.М. Цуря, А.Г. Румянцев // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2004. – Т. 3, № 2. – С. 22–25. 111. Шилова, Е.Р. Препараты микофеноловой кислоты в терапии больных идиопатической тромбоцитопенической пурпурой (ИТП) и апластической анемией (АА) [Текст] / Е.Р. Шилова, С.В. Грицаев, А.А. Кузяева и др. // Вестник гематологии. – 2010. – Т. 6, № 2. – С. 98–99. – [Материалы Всероссийской научнопрактической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения опухолевых заболеваний кроветворной и лимфатической ткани» (СПб, 19–20 апреля 2010 г.)]. 112. Шилова, Е.Р. Препараты микофеноловой кислоты в лечении больных апластической анемией [Текст] / Е.Р. Шилова, С.В. Грицаев, И.И. Кармацкая [и др.] // Вестник гематологии. – 2014. – Т. 10, № 1. – С. 40–47. 113. Шишина, Р.Н. Иммунокорригирующие препараты в терапии больных апластической анемией / Р.Н. Шишина, И.А. Быкова, В.Н. Столпникова [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 1999. – № 5. – С. 10–13. 114. Шутов, С.А. Лапароскопическая комбинированная спленэктомия при спленомегалии [Текст] / С.А. Шутов, А.В. Гржимоловский, Д.С. Карагюлян [и др.] // Проблемы гематологии. – 2005. – № 2. – C. 44–52. 115. Ягмуров, О.Д. Функциональная морфология селезенки в условиях развития и прогрессирования хронической почечной недостаточности [Текст] / О.Д. Ягмуров // Нефрология. – 2000. – Т. 4, № 2. – C. 47–50. 116. Ярилин, А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа [Текст] / А.А. Ярилин // Иммунология. – 1999. – № 1. – С. 17–24. 205 117. Ярилин, А.А. Возрастные изменения тимуса и Т-лимфоцитов [Текст] / А.А. Ярилин // Иммунология. – 2003. – № 2. – С. 117–128. 118. Ярилин, А.А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов [Текст] / А.А. Ярилин // Иммунология. – 2004. – № 5. – С. 312–320. 119. Abadi, U. Immune thrombocytopenia: recent progress in pathophysiology and treatment / U. Abadi, O. Yarchovsky-Dolberg , M.H. Ellis // Clinical and applied thrombosis/hemostasis. – 2015. – Vol. 21(5). – P. 397–404. 120. Ades, L. Long-term outcome after bone marrow transplantation for severe aplastic anemia / L. Ades, J.Y. Mary, M. Robin et al. // Blood. – 2004. – Vol. 103, № 7. – P. 2490–2497. 121. Afable II, M.G. SNP array–based karyotyping: differences and similarities between aplastic anemia and hypocellular myelodysplastic syndromes / M.G. Afable II, M. Wlodarski, H. Makishima // Blood. – 2011. – Vol. 117, № 25. – P. 6876–6884. 122. Al-Raimi, K. Postoperative outcomes after open splenectomy versus laparoscopic splenectomy in cirrhotic patients: a meta-analysis / K. Al-Raimi, S.S. Zheng // Hepatobiliary Pancreat Dis Int. – 2016. – Vol. 15 (1). – P. 14–20. 123. Anagnostou, V.K. Ontogeny of intrinsic innervation in the human thymus and spleen / V.K. Anagnostou, I. Doussis-Anagnostopoulou, D.G. Tiniakos [et al.] // J. Histochemistry Cytochemistry. – 2007. – Vol. 55. – P. 813–820. 124. Ato, M. Localization of marginal zone macrophages is regulated by CC Chemokine Ligands 21/19 / M. Ato, H. Nakano, T. Kakiuchi [et al.] // J. Immunology. – 2004. – № 173. – P. 4815–4820. 125. Attanavanich, K. Marginal zone, but not follicular B cells, are potent activators of naïve CD4 T cells / K. Attanavanich, J.F. Kearney // J. Immunology. – 2004. – Vol. 172, № 2. – P. 803–811. 126. Audia, S. Immunologic effects of rituximab on the human spleen in immune thrombocytopenia / S. Audia, M. Samson, J. Guy [et al.] // Blood. – 2011. – Vol. 118, № 16. – P. 4394–4300. 127. Audia, S. Preferential splenic CD8(+) T-cell activation in rituximab- 206 nonresponder patients with immune thrombocytopenia / S. Audia, M. Samson, M. Mahévas [et al.] // Blood. – 2013. – Vol. 122, № 14. – P. 2477–2486. 128. Audia, S. Splenic TFH expansion participates in B-cell differentiation and antiplatelet-antibody production during immune thrombocytopenia / S. Audia, M. Rossato, K. Santegoets et al. / Blood. – 2014. – Vol. 124, № 18. – P. 2858–2866. 129. Audia, S. Fcγ receptor expression on splenic macrophages in adult immune thrombocytopenia / S. Audia, K. Santegoets, A.G. Laarhoven [et al.] // Clin. Exp. Immunol. – 2017. – Vol. 188 (2). – P. 275–282. 130. Bacigalupo, A. Aplastic anemia: pathogenesis and treatment / A. Bacigalupo // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 2007. – P. 23–28. 131. Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone / M. Bajenoff, N. Glichenhaus, R.N. Germain // The Journal of Immunology. – 2008. – Vol. 181, № 6. – P. 3947–3954. 132. Balazs, M. Blood dendritic cells interact with splenic marginal zone B cells to initiate T-independent immune responses / M. Balazs, F. Martin, T. Zhou [et al.] // Immunity. – 2002. – Vol. 17, № 3. – P. 341–352. 133. Balogh, P. Immunoarchitecture of distinct reticular fibroblastic domains in the white pulp of mouse spleen / P. Balogh, G. Horváth, A.K. Szakal // J. Histochemistry Cytochemistry. – 2004. – Vol. 52. – P. 1287–1298. 134. Barnard, H. The ruptured spleen. A histological, morphometrical and immunohistochemical study / H. Barnard, E.J. Dreef, J.H.J. M. van Krieken // Histol Histopath. – 1990. – Vol. 5. – P. 299–304. 135. Bao, W. Improved regulatory T-cell activity in patients with chronic immune thrombocytopenia treated with thrombopoietic agents / W. Bao, J.B. Bussel, S. Heck [et al.] // Blood. – 2010. – Vol. 116, № 22. – P. 4639–4645. 136. Beider, K. Involvement of CXCR4 and IL-2 in the homing and retention of human NK and NK T cells to the bone marrow and spleen of NOD/SCID mice / K. Beider, A. Nagler, O. Wald [et al.] // Blood. – 2003. – Vol. 102, № 6. – P. 1951– 1958. 137. Beltrami, C.A. Storage cells of spleen and bone marrow in thalassemia: an 207 ultrastructural study / C.A. Beltrami, I. Bearzi, G. Fabris // Blood. – 1973. – Vol. 41, № 6. – P. 901–911. 138. Bernal-Macias, S. Refractory immunological thrombocytopenia purpura and splenectomy in pregnancy / S. Bernal-Macias, L.M. Fino-Velasquez, F.E. VargasBarato [et al.] // Case Reports Immunol. – 2015. – 2015:216362. Doi : 10.1155/2015/216362. Epub 2015. – Dec 22. 139. Boyle, S. Splenectomy and the incidence of venous thromboembolism and sepsis in patients with immune thrombocytopenia / S. Boyle, R.H. White, A. Brunson [et al.] // Blood. – 2013. – Vol. 121, № 23. – P. 4782–4790. 140. Brighton, T.A. Prospective evaluation of the clinical usefulness of an antigen-specific assay (MAIPA) in idiopathic thrombocytopenic purpura and other immune thrombocytopenias / T.A. Brighton, S. Evans, P.A. Castaldi [et al.] // Blood. – 1996. – Vol. 88, № 1. – P. 194–201. 141. Brodsky, R.A. High-dose cyclophosphamide for severe aplastic anemia: long-term follow-up / R.A. Brodsky, A.R. Chen, D. Dorr [et al.] // Blood. – 2010. – Vol. 115, № 3. – P. 2136–2141. 142. Brousse, V. The spleen and sickle cell disease: the sick (led) spleen / V. Brousse, P. Buffet, D. Rees // British Journal of Haematology. – May 2014. – P. 1–12. 143. Bruin, A.M. Interferon-γ impairs proliferation of hematopoietic stem cells in mice / A.M. de Bruin, O. Demirel, B. Hooibrink // Blood. – 2013. – Vol. 121, № 18. – P. 3578–3585. 144. Buckley, P.J. Human spleen contains phenotypic subsets of macrophages and dendritic cells that occupy discrete microanatomic locations / P.J. Buckley, M.R. Smith, M.F. Braverman [et al.] // American Journal of Pathology. – 1987. – Vol. 128, № 3. – P. 505–520. 145. Buffet, P.A. The pathogenesis of Plasmodium falciparum malaria in humans: insights from splenic physiology / P.A. Buffet, I. Safeukui, G. Deplaine [et al.] // Blood. – 2011. – Vol. 117, № 2. – P. 381–392. 146. Buffet, P.A. Ex vivo perfusion of human spleens maintains clearing and 208 processing functions / P.A. Buffet, G. Milon, V. Brousse [et al.] // Blood. – 2006. – Vol. 107, № 9. – P. 3745–3752. 147. Burn, S.F. The dynamics of spleen morphogenesis / S.F. Burn, M.J. Boot, C. Angelis // Developmental Biology. – 2008. – Vol. 318, № 2. – P. 303–311. 148. Calado, R.T. Mutations in the SBDS gene in acquired aplastic anemia / R.T. Calado, S.A. Graf, K.L. Wilkerson [et al.] // Blood. – 2007. – Vol. 110. – P. 11411146. 149. Cameron, P.U. Splenectomy associated changes in IgM memory B cells in an adult spleen registry cohort / P.U. Cameron, P. Jones, M. Gorniak [et al.] // PLoS ONE. – 2011; 6:e23164. doi :10.13717 / journal.pone.0023164. 150. Carpenedo, M. Response loss and development of neutralizing antibodies during long-term treatment with romiplostim in patients with immune thrombocytopenia: a case series / M. Carpenedo, S. Cantoni, V. Coccini [et al.] // European Journal of Haematology. – 2015. – Vol. 97, № 1. – P. 101–103. 151. Casari, C. Accelerated uptake of VWF/platelet complexes in macrophages contributes to VWD type 2B-associated thrombocytopenia / C. Casari, V. Du, Ya.P. Wu [et al.] // Blood. – 2013. – Vol. 122, № 16. – P. 2893–2902. 152. Caton, M. Notch-RBP-J signaling controls the homeostasis of CD8dendritic cells in the spleen / M.L. Caton, M.R. Smith-Raska, B. Reizis // J. Experim. Medicine. – 2007. – Vol. 204, № 7. – P. 1653–1664. 153. Cesta, M.F. Normal Structure, Function and Histology of the Spleen / M.F. Cesta // Toxicologic Pathology. – 2006. – № 34. – P. 455–465. 154. Chaix, J. Cutting edge: CXCR4 is critical for CD81 memory T cell homeostatic self-renewal but not rechallenge selfrenewal / J. Chaix, S.A. Nish, W.H. Lin [et al.] // Journal of Immunology. – 2014. – Vol. 193 (3). – P. 1013–1016. 155. Champlin, R.E. Bone marrow transplantation for severe aplastic anemia: a randomized controlled study of conditioning regimens outcome / R.E. Champlin, W.S. Perez, J.R. Passweg [et al.] // Blood. – 2007. – Vol. 109, № 10. – P. 4582–4585. 156. Chaturvedi, S. Splenectomy for immune thrombocytopenia: down but not out / S. Chaturvedi, D.M. Arnold, K.R. McCrae // Blood. – 2018. – Vol. 131, № 11. – 209 P. 1172–1182. 157. Chen, Y. Defective microarchitecture of the spleen marginal zone and impaired response to a thymus-independent Type 2 antigen in mice lacking scavenger receptors MARCO and SR-A1 / Y. Chen, T. Pikkarainen, O. Elomaa [et al.] // Journal of Immunology. – 2005. – № 175. – P. 8173–8180. 158. Chong, B.H. ITP: Tregs come to the rescue / B.H. Chong // Blood. – 2010. – Vol. 116, № 22. – Р. 4388–4390. 159. Chow, L. A murine model of severe immune thrombocytopenia is induced by antibody- and CD8+ T cell–mediated responses that are differentially sensitive to therapy / L. Chow, R. Aslam, E.R. Speck [et al.] // Blood. – 2010. – Vol. 115, № 6. – P. 1247–1253. 160. Chugh, S. Rituximab plus standard of care for treatment of primary immune thrombocytopenia: a systematic review and meta-analysis / S. Chugh, S. DarvishKazem, W. Lim [et al.] // Lancet Haematol. – 2015. – Feb. 2 (2) : e75-81. Doi : 10.1016/S2352-3026(15)00003-4. – Epub. 2015. – 5 Feb. 161. Cines, D.B. The ITP syndrome: pathogenic and clinical diversity / D.B. Cines, J.B. Bussel, H.A. Liebman [et al.] // Blood. – 2009. – Vol. 113, № 26. – Р. 6511–6521. 162. Cines, D.B. How I treat idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) / D.B. Cines, J.B. Bussel // Blood. – 2005. – Vol. 106, № 7. – Р. 2244–2251. 163. Cooper, N. The pathogenesis of immune thrombocytopenic purpura / N. Cooper, J. Bussel // British Journal of Haematology. – 2006. – Vol. 133. – P. 364-374. 164. Daridon, C. Splenic proliferative lymphoid nodules distinct from germinal centers are sites of autoantigen stimulation in immune thrombocytopenia / C. Daridon, C. Loddenkemper, S. Spieckermann [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 120, № 25. – Р. 5021–5031. 165. Deeg, H.J. Optimization of conditioning for marrow transplantation from unrelated donors for patients with aplastic anemia after failure of immunosuppressive therapy / H.J. Deeg, M. O’Donnell, J. Tolar [et al.] // Blood. – 2006. – Vol. 108, № 5. – 210 P. 1485–1491. 166. Den Haan, J.M. Innate immune functions of macrophage subpopulations in the spleen / J.M. Den Haan, G. Kraal // Journal of Innate Immunity. – 2012. – Vol. 4. – P. 437–445. 167. Desmond, R. Eltrombopag restores trilineage hematopoiesis in refractory severe aplastic anemia that can be sustained on discontinuation of drug / R. Desmond, D.M. Townsley, B. Dumitriu [et al.] // Blood. – 2014. – Vol. 123, № 12. – P. 1818– 1825. 168. Di Sabatino, A. Post-spelenectomy and hyposplenic states / A. Di Sabatino, R. Carsetti, G.R. Corazza // Lancet. – 2011. – Vol. 378. – P. 86–97. 169. Di Sabatino, A. Is it worth investigating splenic function in patients with celiac disease? / A. Di Sabatino, L. Brunetti, G. Carnevale Maffè // J. Gastroenterol. – 2013. – Vol. 19. – P. 2313–2318. 170. Doan, C.A. Idiopathic and secondary thrombocytopenic purpura: clinical study and evaluation of 381 cases over a period of 28 years / C.A. Doan, B.A. Bouroncle, B.K. Wiseman // Annals of Internal Medicine. – 1960. – Vol. 53. – P. 861–876. 171. Dolberg, O.J. Idiopathic aplastic anemia: diagnosis and classification / O.J. Dolberg, Y. Levy // Autoimmun Rev. – 2014. – Vol. 13, № 4/5. – P. 569–573. 172. Dufour, C. Severe aplastic anemia – Working Party of the EBMT. Front-line immunosuppressive treatment of acquired aplastic anemia / C. Dufour, J. Svahn, A. Bacigalupo // Bone Marrow Transplant. – 2013. – Vol. 48, № 2. – P. 174–177. 173. Edgren, G. Splenectomy and the risk of sepsis / G. Edgren, R. Almquist, M. Hartman [et al.] // Annals of Surgery. – 2014. – Vol. 260, № 6. – P. 1081–1087. 174. Eichner, E.R. Splenic function: normal, too much and too little / E.R. Eichner // The American Journal of Medicine. – 1979. – Vol. 66, № 4. – P. 311–320. 175. Ellyard, J.I. Antigen-selected, immunoglobulin-secreting cells persist in human spleen and bone marrow / J.I. Ellyard, D.T. Avery, T.G. Phan [et al.] // Blood. – 2004. – Vol. 103, № 10. – P. 3805–3812. 211 176. Elmore, S.A. Enhanced histopathology of the spleen / S.A. Elmore // Toxicologic pathology. – 2006. – Vol. 34, № 5. – Р.648–655. 177. Eto, K. Linkage between the mechanisms of thrombocytopenia and thrombopoiesis / K. Eto, S. Kunishima // Blood. – 2016. – Vol. 127, № 10. – P. 1234– 1241. 178. Fabian, I. Human spleen cell generation of factors stimulating human pluripotent stem cell, erythroid, and myeloid progenitor cell growth / I. Fabian, D. Douer, L. Levitt [et al.] // Blood. – 1985. – Vol. 65, № 4. – P. 990–996. 179. Feng, S. Laparoscopic versus open splenectomy in children: a systematic review and meta-analysis / S. Feng, Y. Qiu, X. Li [et al.] // Pediatric Surgery International. – 2015. – Dec. 11. [Epub ahead of print]. 180. Feng, X. Decreased plasma cytokines associate with low platelet counts in aplastic anemia and immune thrombocytopenic purpura / X. Feng, P. Scheinberg, L. Samsel [et al.] // Journal of Thrombosis and Haemostasis. – 2012. – Vol. 10, № 8. – P. 1616–1623. 181. Frickhofen, N. Antithymocyte globulin with or without cyclosporin A: 11year follow-up of a randomized trial comparing treatments of aplastic anemia / N. Frickhofen, H. Heimpel, J.P. Kaltwasser [et al.] // Blood. – 2003. – Vol. 101, № 4. – P. 1236–1242. 182. Fuhrer, M. Immunosuppressive therapy for aplastic anemia in children: a more severe disease predicts better survival / M. Fuhrer, U. Rampf, I. Baumann [et al.] // Blood. – 2005. – Vol. 106, № 6. – Р. 2102–2104. 183. Furudoï, A. Adult primary immune thrombocytopenia: spleen histology findings and outcomes according to rituximab use based on analysis of 41 cases / A. Furudoï, E. Rivière, E. Lazaro [et al.] // The American Journal of Surgical Pathology. – 2018. – Vol. 42, № 3. – P. 401–412. 184. Ganapathi, K.A. GATA2 deficiency-associated bone marrow disorder differs from idiopathic aplastic anemia / K.A. Ganapathi, D.M. Townsley, A.P. Hsu [et al.] // Blood. – 2015. – Vol. 125, № 1. – P. 56–70. 185. Geissmann, F. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells 212 / F. Geissmann, M.G. Manz, S. Jung [et al.] // Science. – 2010. – Vol. 327, № 5966. – P. 656–661. 186. Ghanima, W. How I treat immune thrombocytopenia: the choice between splenectomy or a medical therapy as a second-line treatment / W. Ghanima, B. Godeau, D.B. Cines [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 120, № 5. – P. 960–969. 187. Godeau, B. Rituximab efficacy and safety in adult splenectomy candidates with chronic immune thrombocytopenic purpura: results of a prospective multicenter phase 2 study / B. Godeau, R. Porcher, O. Fain [et al.] // Blood. – 2008. – Vol. 112, № 4. – Р. 999–1004. 188. Gómez-Almaguer, D. Eltrombopag and high-dose dexamethasone as frontline treatment of newly diagnosed immune thrombocytopenia in adults / D. Gómez-Almaguer, Miguel A. Herrera-Rojas, José C. Jaime-Pérez [et al.] // Blood. – 2014. – Vol. 123. – P. 3906–3908. 189. Guan, Y. Long-term results of splenectomy in adult chronic immune thrombocytopenia / Y. Guan, S. Wang, F. Xue [et al.] // European Journal of Haematology. – 2017. – Vol. 98, № 3. – P. 235–241. 190. Gustafsson, T. The role of dendritic cells in Adjuvant – induced immune responses / T. Gustafsson; Department of Microbiology and Immunology; Institute of Biomedicine; University of Gothenburg. – Gothenburg : Printed by Kompendiet, 2013. – 79 p. 191. Guo, F. Constitutive alternative NF-κB signaling promotes marginal zone Bcell development but disrupts the marginal sinus and induces HEV-like structures in the spleen / F. Guo, D. Weih, E. Meier [et al.] // Blood. – 2007. – Vol. 110, № 7. – Р. 2381–2389. 192. Harrington, W.J. Demonstration of a thrombocytopenic factor in the blood of patients with thrombocytopenic purpura / W.J. Harrington, V. Minnich, J.W. Hollingsworth [et al.] // Journal of Clinical Medicine Research. – 1951. – Vol. 38 (1). – P. 1–10. 193. Hartung, H.D. Acquired aplastic anemia in children / H.D. Hartung, T.S. Olson, M. Bessler // Pediatric Clinics of North America. – 2013. – Vol. 60 (6). – 213 P. 1311–1336. 194. Hayes, M.M. Splenic pathology in immune thrombocytopenia / M.M. Hayes, P. Jacobs, J. Wood [et al.] // Journal of Clinical Pathology. – 1985. – Vol. 38, № 9. – P. 985–988. 195. Heitink-Polle, K.M.J. Clinical and laboratory predictors of chronic immune thrombocytopenia in children: a systematic review and meta-analysis / K.M.J. HeitinkPolle, J. Nijsten, C.W.B. Boonacker [et al.] // Blood. – 2014. – Vol. 102, № 22. – Р. 3295–3307. 196. Hirano, N. Autoantibodies frequently detected in patients with aplastic anemia / N. Hirano, M.O. Butler, M.S. von Bergwelt-Baildon [et al.] // Blood. – 2003. – Vol. 102, № 13. – Р. 4567–4575. 197. Hoek, K.L. Follicular B cell trafficking within the spleen actively restricts humoral immune responses / K.L. Hoek, L.E. Gordy, P.L. Collins [et al.] // Immunity. – 2010. – Vol. 33. – P. 254–265. 198. Hu, Y. Elevated profiles of Th22 Cells and correlations with Th17 cells in patients with immune thrombocytopenia / Y. Hu, H. Li, L. Zhang [et al.] // Human Immunology. – 2012. – Vol. 73, № 6. – P. 629–635. 199. Hume, D.A. Macrophages as APS and the dendritic cell myth / D.A. Hume // The Journal of Immunology. – 2008. – Vol. 181, № 9. – P. 5829–5835. 200. Jernas, M. Differences in gene expression and cytokine levels between newly diagnosed and chronic pediatric ITP / M. Jernas, Y. Hou, F. Stromberg Celind [et al.] // Blood. – 2013. – Vol. 122, № 10. – P. 1789–1792. 201. Jernas, M. MicroRNA regulate immunological pathways in T-cells in immune thrombocytopenia (ITP) / M. Jernas, I. Nookaew, H. Wadenvik [et al.] // Blood. – 2013. – Vol. 121, № 11. – P. 2095–2098. 202. Johnsen, J. Pathogenesis in immune thrombocytopenia: new insights / J. Johnsen // Hematology. American Society of Hematology. Education Program. – 2012. – P. 306–312. 203. Karpatkin, S. Autoimmune thrombocytopenic purpura / S. Karpatkin // Blood. – 1980. – Vol. 56, № 3 – Р. 329–343. 214 204. Katakai, T. Marginal reticular cells: a stromal subset directly descended from the lymphoid tissue organizer / T Katakai // Frontiers in Immunology. – 2012. – Vol. 181, № 3 – P. 6189–6200. 205. Kay, M.B. Mechanism of removal of senescent cells by human macrophages in situ / M.B. Kay // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1975. – № 81. – Р. 5753–5757. 206. Koulnis, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response / M. Koulnis, Y. Liu, K. Hallstrom K. [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6 (7). – e21192. 207. Kelton, J.G. The relationship among platelet-associated IgG, platelet lifespan, and reticuloendothelian cell function / J.G. Kelton, C.J. Carter, C. Rodger [et al.] // Blood. – 1984. – Vol. 63. – P. 1434–1438. 208. Killick, S.B. Guidelines for the diagnosis and management of adult aplastic anaemia / S.B. Killick, N. Bown, J. Cavenagh [et al.] // British Journal of Haematology. – 2016. – Vol. 172, № 2. – P. 187–207. 209. Kistanguri, G. Immune Trombocytopenia / G. Kistanguri // Hematol. Oncol. Clin. North. Am. – 2013. – Vol. 27 (3). – P. 495–520. 210. Kojima, S. Outcome of 154 patients with severe aplastic anemia who received transplants from unrelated donors: the Japan Marrow Donor Program / S. Kojima, T. Matsuyama, S. Kato // Blood. – 2002. – Vol. 100, № 3. – P. 799–803. 211. Kojouri, K. Splenectomy for adult patients with idiopathic thrombocytopenic purpura: a systematic review to assess long-term platelet count responses, prediction of response, and surgical complications / K. Kojouri, S.K. Vesely, D.R. Terrell [et al.] // Blood. – 2004. – Vol. 104, № 9. – Р. 2623–2634. 212. Kook, H. Changes in T-cell receptor VB repertoire in aplastic anemia: effects of different immunosuppressive regimens / H. Kook, A.M. Risitano, W. Zeng [et al.] // Blood. – 2002. – Vol. 99, № 10. – Р. 3668–3675. 213. Kordasti, S. Functional characterization of CD4_ T cells in aplastic anemia / S. Kordasti, J. Marsh, S. Al-Khan [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 119, № 9. – P. 2033– 2043. 215 214. Kordasti, S. Deep phenotyping of Tregs identifies an immune signature for idiopathic aplastic anemia and predicts response to treatment / S. Kordasti, B. Costantini, T. Seidl [et al.] // Blood. – 2016. – Vol. 128, № 9 – Р. 1193–1205. 215. Kraal, G. New insights into the cell biology of the marginal zone of the spleen / G. Kraal, R. Mebius // International review of cytology. – 2006. – № 250. – P. 175–215. 216. Kraal, G. Cells in the marginal zone of the spleen / G. Kraal // International review of cytology. – 1992. – № 132. – P. 31–74. 217. Kuchar, E. A review of guidance on immunization in persons with defective or deficient splenic function / E. Kuchar, K. Miśkiewicz, M. Karlikowska // British Journal of Haematology. – 2015. – Vol. 171, № 5. – P. 683–694. 218. Kuksin, C.A. CXCR4 expression on pathogenic T cells facilitates their bone marrow infiltration in a mouse model of aplastic anemia / C.A. Kuksin, G. GonzalezPerez, L.M. Minter // Blood. – 2015. – Vol. 125, № 13. – P. 2087–2094. 219. Kumar, S. Splenectomy for immune thrombocytopenic purpura: long-term results and treatment of postsplenectomy relapses / S. Kumar, F.E. Diehn, M.A. Gertz [et al.] // Annals of Hematology. – 2002. – Vol. 81, № 6. – P. 312–319. 220. Kuter, D.J. Long-term treatment with romiplostim in patients with chronic immune thrombocytopenia: safety and efficacy / D.J. Kuter, J.B. Bussel, A. Newland [et al.] // British Journal of Haematology. – 2013. – Vol. 161, № 3. – P. 411–423. 221. Kuwana, M. Suppression of autoreactive T-cell response to glycoprotein IIb/IIIa by blockade of CD40/CD154 interaction: implications for treatment of immune thrombocytopenic purpura / M. Kuwana, Y. Kawakami, Y. Ikeda // Blood. – 2003. – Vol. 101, № 2. – P. 621–623. 222. Kuwana, M. Splenic macrophages maintain the anti-platelet autoimmune response via uptake of opsonized platelets in patients with immune thrombocytopenic purpura / M. Kuwana, Y. Okazaki, Y. Ikeda // Journal of Thrombosis and Haemostasis. – 2009. – № 7. – P. 322–329. 223. Kuwana, M. Immunodominant epitops on glycoprotein IIb-IIIa recognized by autoreactive T cells in patients with immune thrombocytopenic purpura / 216 M. Kuwana, J. Kaburaki, H. Kitasato [et al.] // Blood. – 2001. – Vol. 98, № 7. – P. 130–139. 224. Kuwana, M. Spleen is a primary site activation platelet – reactive T and B cells in patients with immune thrombocytopenic purpura / M. Kuwana, Y. Okazaki, J. Kaburaki [et al.] // The Journal of Immunology. – 2002. – № 168. – P. 3657–3682. 225. Laan, A.M. Monocyte subset accumulation in the human heart following acute myocardial infarction and the spleen as monocyte reservoir / A.M. van der Laan, E.N. ter Horst, R. Delewi [et al.] // European Heart Journal. – 2014. – Vol. 35. – P. 376–385. 226. Latour, R.P. Th17 immune responses contribute to the pathophysiology of aplastic anemia / R.P. Latour, V.Visconte, T. Takaku [et al.] // Blood. – 2010. – Vol. 116, № 20. – P. 4175–4184. 227. Lambert, M.P. Clinical updates in adult immune thrombocytopenia / M.P. Lambert, T.B. Gemsheimer // Blood. – 2017. – Vol. 129, № 21. – P. 2829–2835. 228. Lee, J.W. Iron chelation therapy with deferasirox in patients with aplastic anemia: a subgroup analysis of 116 patients from the EPIC trial / J.W. Lee, S. Yoon, Z.X. Shen [et al.] // Blood. – 2010. – Vol. 116, № 14. – P. 2448–2454. 229. Van Leeuwen, E.F. Specificity of autoantibodies in autoimmune thrombocytopenia / E.F. van Leeuwen, J.T. van der Ven, C.P. Engelfriet [et al.] // Blood. – 1982. –Vol. 59, № 1. – P. 23–26. 230. Leo, C.A. Postsplenectomy recurrence of idiopathic thrombocitopenic purpura: role of laparoscopic splenectomy in the treatment of accessory spleen / C.A. Leo, R. Pravisani, S. Bidinost [et al.] // Giornale di Chirurgia. – 2015. – Vol. 36 (4). – P. 153–157. 231. Li, J.P. Abnormal immunity and stem/progenitor cells in acquired aplastic anemia / J.P. Li, C.L. Zheng, Z.C. Han // Critical Reviews in Oncology/Hematology. – 2010. – Vol. 75 (2). – P. 79–93. 232. Li, X. Defective regulatory B-cell compartment in patients with immune thrombocytopenia / Х. Li, H. Zhong, W. Bao [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 120, № 8. – Р. 3318–3325. 217 233. Li, Y. Regulation of leukocyte recruitment to the spleen and peritoneal cavity during pristane-induced inflammation / Y. Li, J. Wu, Q. Wu [et al.] // Journal of Immunology Research. – 2017; 2017:9891348. 234. Li, Y. Repetitive restraint stress changes spleen immune cell subsets through glucocorticoid receptor or β-adrenergic receptor in a stage dependent manner / Y. Li, W. Jiang, Z.Z. Li [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2018. – Vol. 495 (1). – P. 1108–1114. 235. Li, Z.F. Changes in count and function of splenic lymphocytes from patients with portal hypertension / Z.F. Li, S. Zhang, G.B. Lu [et al.] // World Journal of Gastroenterology. – 2008. – Vol. 14, № 15. – P. 2377–2382. 236. Libregts, S.F. Chronic IFN-γ production in mice induces anemia by reducing erythrocyte life span and inhibiting erythropoiesis through an IRF-1/PU.1 axis / S.F. Libregts, L. Gutierrez, A.M. de Bruin [et al.] // Blood. – 2011. – Vol. 118, № 9. – Р. 2578–2588. 237. Lin, F. IFN-γ causes aplastic anemia by altering hematopoietic stem/progenitor cell composition and disrupting lineage differentiation / F. Lin, M. Karwan, B. Saleh [et al.] // Blood. – 2014. – Vol. 124, № 25. – P. 3699–3708. 238. Liu, B. Abnomality of CD4+ CD25+ regulatory T cells in idiopathic thrombocytopenic purpura / B. Liu, H. Zhao, M.C. Poon [et al.] // European Journal of Haematology. – 2007. – Vol. 78, № 2. – P. 139–143. 239. Liu, W. The effect of danazol in primary immune thrombocytopenia: an analysis of a large cohort from a single center in China / W. Liu, X. Gu, R. Fu [et al.] // Clinical and applied thrombosis/hemostasis. – 2016. – Vol. 22, № 8. – P. 727–733. 240. Lopes-Carvalho, T. Marginal zone B cells in lymphocyte activation and regulation / T. Lopes-Carvalho, J. Foote, J.F. Kearney // Current Opinion in Immunology. – 2005. – Vol. 17 № 3. – P. 244–250. 241. Luoto, T.T. Long-term outcomes after pediatric splenectomy / T.T. Luoto, M.P. Pakarinen, A. Koivusalo // Surgery. – 2016. – Vol. 159, № 6. – P. 1583–1590. 242. Magri, G. Innate lymphoid cells integrate stromal and immunological signals 218 to enhance antibody production by splenic marginal zone B cells / G. Magri, M. Miyajima, S. Bascones [et al.] // Nature Immunology. – 2014. – Vol. 15, № 4. – P. 354–364. 243. Marsh, J.C. Prospective study of rabbit antithymocyte globulin and cyclosporine for aplastic anemia from the EBMT Severe Aplastic Anaemia Working Party / J.C. Marsh, A. Bacigalupo, H. Schrezenmeier [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 119, № 23. – P. 5391–5396. 244. Marsh, J.C.W. Management of the refractory aplastic anemia patient: what are the options? / J. C. W. Marsh, A.G. Kulasekararaj // Blood. – 2013. – Vol. 122, № 22. – Р. 3561–3567. 245. Matter, M. S. Destruction of lymphoid organ architecture and hepatitis caused by CD4+ T cells / M.S. Matter, T. Hilmenyuk, C. Claus [et al.] // PLoS ONE. – 2011. – Vol. 6, № 9. – Available at: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024772/ – (Accessed 28 April 2017). 246. Matsuno, K. The microstructure of secondary lymphoid organs that support immune cell trafficking / K. Matsuno, H. Ueta, Z. Shu [et al.] // Archives of Histology and Cytology. – 2010. – Vol. 73, № 1. – P. 1–21.243. 247. McKenzie, C.V. Splenomegaly: Pathophysiological bases and therapeutic options / C.V. McKenzie, C.K. Colonne, J.H. Yeo [et al.] // International Journal of Biochemistry and Cell Biology. – 2018. – Vol.94. – P. 40–43. 248. McMillan, R. Suppression of in vitro megakaryocyte production by antiplatelet autoantibodies from adult patients with chronic ITP / R. McMillan, L. Wang, A. Tomer [et al.] // Blood. – 2004. – Vol. 103, № 4. – P. 1364–1369. 249. Mebius, R.E. Structure and function of the spleen / R.E. Mebius, G. Kraal // Nature Reviews Immunology. – 2005. – Vol. 5. – P. 606–616. 250. Meinderts, S.M. Human and murine splenic neutrophils are potent phagocytes of IgG-opsonized red blood cells / S.M. Meinderts, P.A. Oldenborg, B.M. Beuger [et al.] // Blood Adv. – 2017. – Vol. 1, № 14. – P. 875–886. 251. Melikyan, A.L. Incidence of Primary Immune Thrombocytopenia (ITP) in adults in one region of Russia / A.L. Melikyan, E.L. Pustovaya, E.M. Volodicheva 219 [et al.] // Blood. – 2016. – Vol. 128 (22). – Abstr. 4941. – 11. – P. 841. 252. Meng, W. An atlas of B-cell clonal distribution in the human body / W. Meng, B. Zhang, G.W. Schwartz [et al.] // Nature Biotechnology. – 2017. – Vol. 35 (9). – P. 879–884. 253. Minges Wols, H.A. Migration of immature and mature B cells in the aged microenvironment / H.A. Minges Wols, K.M. Johnson, J.A. Ippolito [et al.] // Immunology. – 2009. – Vol. 129. – C. 278–290. 254. Monteiro, J.P. Normal hematopoiesis is maintained by activated bone marrow CD4+ T cells / J.P. Monteiro, A. Benjamin, E.S. Costa [et al.] // Blood. – 2005. – Vol. 105, № 4. – P. 1484–1491. 255. Mountz, J.D. Cytokine regulation of B-cell migratory behavior favors formation of germinal centers in autoimmune disease / J.D. Mountz, J.H. Wang, S. Xie [et al.] // Discovery medicine. – 2011. – Vol. 11 (56). – P. 76–85. 256. Neunert, C. The American Society of Hematology 2011 evidence-based practice guideline for immune thrombocytopenia / C. Neunert, W. Lim, M. Crowther [et al.] // Blood. – 2011. – Vol. 117, № 16. – Р. 4190–4207. 257. Nolte, M.A. B cells are crucial for both development and maintenance of the splenic marginal zone / M.A. Nolte, R. Arens, M. Kraus [et al.] // The Journal of Immunology. – 2004. – Vol. 172, № 6. – Р. 3620–3627. 258. Nolte, M.A. A conduit system distributes chemokines and small blood-borne molecules through the splenic white pulp / M.A. Nolte, J.A. Beliën, I. SchadeeEestermans [et al.] // Journal of Experimental Medicine. – 2003. – Vol. 198, № 3. – P. 505–512. 259. Nolte, M.A. Maintenance of memory CD8 T cells: Divided over division / M.A. Nolte, M. Goedhart, J. Geginat J // European Journal of Immunology. – 2017. – Vol. 47, № 11. – P. 1875–1879. 260. Ogawa, S. Clonal hematopoiesis in acquired aplastic anemia / S. Ogawa // Blood. – 2016. – Vol. 128, № 3. – P. 337–347. 261. Olsson, B. Increased number of B-cells in the red pulp of the spleen in ITP / B. Olsson, B. Ridell, M. Jernas, H. Wadenvik // Annals of Hematology. – 2012. – 220 Vol. 91. – P. 271–277. 262. Olsson, B. Recruitment of T cells into bone marrow of ITP patients possibly due to elevated expression of VLA-4 and CX3CR1 / B. Olsson, B. Ridell, L. Carlsson [et al.] // Blood. – 2008. – Vol. 112, № 11. – P. 1078–1084. 263. Palandri, F. Have splenectomy rate and main outcomes of ITP changed after the introduction of new treatments? A monocentric study in the outpatient setting during 35 years / F. Palandri, N. Polverelli, D. Sollazzo [et al.] // American Journal of Hematology. – 2016. – Vol. 91, № 4. – P. 267–272. 264. Panitsas, F.P. Adult chronic idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) is the manifestation of a type-1 polarized immune response / F.P. Panitsas, M. Teodoropoulou, A. Kauraklis [et al.] // Blood. – 2004. – Vol. 103, № 7. – P. 2645– 2647. 265. Park, Y.H. Clinical outcome and predictive factors in the response to splenectomy in elderly patients with primary immune thrombocytopenia: a multicenter retrospective study / Y.H. Park, H.G. Yi, C.S. Kim [et al.] // Acta Haematol. – 2016. – Vol. 135, № 3. – P. 162–171. 266. Passweg, J.R. Aplastic anemia: first-line treatment by immunosuppression and sibling marrow transplantation / J.R. Passweg, J.C. Marsh // American Society of Hematology. – 2010. – Vol. 2010, № 1. – P. 36–42. 267. Passweg, J.R. Treatment and hematopoietic SCT in aplastic anemia / J.R. Passweg, M. Aljurf // Bone Marrow Transplantation. – 2013. – Vol. 48. – P. 161. 268. Patel, V.L. Outcomes 5 years after response to rituximab therapy in children and adults with immune thrombocytopenia / V.L. Patel, M. Mahevas, S.Y. Lee [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 119, № 25. – P. 5989–5995. 269. Peng, J. Effects of B7-blocking agent and/or CsA on induction of plateletspecific T-cell anergy in chronic autoimmune thrombocytopenic purpura / J. Peng, C. Liu, C. Ren [et al.] // Blood. – 2003. – Vol. 101, № 7. – P. 2721–2726. 270. Pizzi, M. A Lucky Mistake: The Splenic Glands of Marcello Malpighi / M. Pizzi, F. Chaviano, M. Rugge [et al.] // Human Pathology. – 2018. – Vol. 72. – P. 191–195. 221 271. Provan, D. International consensus report on the investigation and management of primary immune thrombocytopenia / D. Provan, R. Stasi, A. Newland [et al.] // Blood. – 2010. – Vol. 115, № 2. – P. 168–186. 272. Puga, I. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen / I. Puga, M. Cols, C.M. Barra [et al.] // Nature Immunology. – 2012. – Vol. 13. – P. 170–80. 273. Quarm, B. Functional characterization of CD4+ T cells in aplastic anemia / B. Quarm, T. Seidl, S.A. Mian [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 119, № 9. – P. 2033– 2043. 274. Rao, V.K. ITP: hematology’s Cosette from Les Miserables / V.K. Rao // Blood. – 2013. – Vol. 121, № 11. – P. 1928–1930. 275. Ren, J. Elevated expression of CX3C chemokine receptor 1 mediates recruitment of T cells into bone marrow of patients with acquired aplastic anaemia / J. Ren, X.Y. Hou, S.H. Ma [et al.] // Journal of Internal Medicine. – 2014. – Vol. 276 (5). – P. 512–524. 276. Roark, J.H. Genetic analysis of autoantibodies in idiopathic thrombocytopenic purpura reveals evidence of clonal expansion and somatic mutation / J.H. Roark, J.B. Bussel, D.B. Cines [et al.] // Blood. – 2002. – Vol. 100, № 4. – P. 1388–1398. 277. Rodeghiero, F. Standardization of terminology, definition and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children: report from an international working group / F. Rodeghiero, R. Stasi, T. Gernsheimer [et al.] // Blood. – 2009. –Vol. 113, № 11. – Р. 2386–2393. 278. Rodeghiero, F. Standardization of bleeding assessment in immune thrombocytopenia: report from the International Working Group / F. Rodeghiero, M. Michel, T. Gernsheimer [et al.] // Blood. – 2013. – Vol. 121, № 14. – P. 2596–2626. 279. Roderick, J.E. Therapeutic targeting of NOTCH signaling ameliorates immune-mediated bone marrow failure of aplastic anemia / J.E. Roderick, G. GonzalezPerez, C.A. Kuksin [et al.] // Journal of Experimental Medicine. – 2013. – Vol. 210 (7). – P. 1311–1329. 222 280. Rodero, M.R. Immunization for Patients with asplenia: importence and recommendations / M.R. Rodero, C.S.F. Martins, A. Zuliani [et al.] // Journal of Blood & Lymph. – 2016. – Vol. 6 (149). – P. 2–5. 281. Rogausch, H. Local and systemic autonomic nervous effects on cell migration to the spleen / H. Rogausch, D. Zwingmann, M. Trudewind [et al.] // Journal of Applied Physiology. – 2003. – Vol. 94. – P. 469–475. 282. Roman, S. The role of spleen in the pathogeny of aplastic anemia related to increased number of CD3+CD8+FcR+cells / S. Roman, G. Grigoriu, T. Puscariu [et al.] // Rom. J. Intern. Med. – 1994. – Vol. 32 (4). – P. 275 – 282. 283. Saleh, M.N. Safety and efficacy of eltrombopag for treatment of chronic immune thrombocytopenia: results of the long-term, open-label extend study / M.N. Saleh, J.B. Bussel, G.Cheng [et al.] // Blood. – 2013. – Vol. 121, № 3. – P. 537–545. 284. Saltzstein, S.L. Phospholipid accumulation in histiocytes of splenic pulp associated with thrombocytopenic purpura / S.L. Saltzstein // Blood. – 1961. – Vol. 18, № 2. – P. 73–88. 285. Scheinberg, P. Activity of alemtuzumab monotherapy in treatment-naive, relapsed, and refractory severe acquired aplastic anemia / P. Scheinberg, O. Nunez, B. Weinstein // Blood. – 2012. – Vol. 119, № 2. – P. 345–354. 286. Scheinberg, P. Aplastic anemia: what have we learned from animal models and from the clinic / P. Scheinberg, J. Chen // Seminars in hematology. – 2013. – Vol. 50, № 2. – P. 156–164. 287. Scheinberg, P. How I treat acquired aplastic anemia / P. Scheinberg, N.S. Young // Blood. – 2012. – Vol. 120, № 6. – P. 1185–1196. 288. Scheinberg, P. Moderate-dose cyclophosphamide for severe aplastic anemia has significant toxicity and does not prevent relapse and clonal evolution / P. Scheinberg, D. Townsley, B. Dumitriu [et al.] // Blood. – 2014. – Vol. 124, № 18. – P. 2820–2823. 289. Schmidt, E.E. Changes in splenic microcirculatory pathways in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura / E.E. Schmidt, I.C. MacDonald, A.C. Groom // 223 Blood. – 1991. – Vol. 78, № 6. – P. 1458–1489. 290. Semple, J.W. Differences in serum cytokine levels in acute and chronic autoimmune thrombocytopenic purpura: relationship to platelet phenotype and antiplatelet T-cell reactivity / J.W. Semple, Y. Milev, D. Cosgrave [et al.] // Blood. – 1996. – Vol. 87, № 10. – P. 4245–4254. 291. Semple, J.W. Platelets and the immune continuum / J.W. Semple, J.E. Italiano, J. Freedman // Nature Reviews Immunology. – 2011. – Vol. 11. – P. 264–274. 292. Semple, J.W. ITP three R’s: regulation, routing, rituximab / J.W. Semple // Blood. – 2008. – Vol. 112, № 4. – P. 927–928. 293. Seymour, R. Abnormal lymphoid organ development in immunodeficient mutant mice / R. Seymour, J.P. Sundberg, H. Hogenesch // Veterinary Pathology. – 2006. – Vol. 43. – P. 401–423. 294. Smirnova, S.J. Expansion of CD8+ cells in autoimmune hemolytic anemia / Smirnova S.J., Sidorova J.V., Tsvetaeva N.V. [et al.] // Autoimmunity. – 2016. – Vol. 49, № 3. – P. 147–154. 295. Shi, J. Intrinsic impairment of CD4+CD25+ regulatory T cells in acquired aplastic anemia / J. Shi, M. Ge, S. Lu [et al.] // Blood. – 2012. – Vol. 120, № 8. – P. 1624–1632. 296. Shimanovsky, A. Refractory immune thrombocytopenic purpura and cytomegalovirus infection: a call for a change in the current guidelines / A. Shimanovsky, D. Patel, J. Wasser // Mediterr J Hematol Infect Dis. – 2016. – № 8.– Available at: http://www.mjhid.org/index.php/mjhid/article/view/2016.010/pdf_65. – (Accessed 28 April 2011). 297. Shulman, N.R. Similarities between known antiplatelet antibodies and the factor responsible for thrombocytopenia in idiopathic purpura / N.R. Shulman, V.J. Marder, R.S. Weinrach // Physiologic, serologic and isotopic studies. Ann N Y Acad Sci. – 1965. – Vol. 124, № 2. – P. 499–542. 298. Silva, J.S. Low CXCL13 expression, splenic lymphoid tissue atrophy and germinal center disruption in severe canine visceral / J.S. Silva, A.C. Andrade, 224 C.C. Santana [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7, № 1. 299. Sloand, E. Intracellular interferon-γ in circulating and marrow T cells detected by flow cytometry and the response to immunosuppressive therapy in patients with aplastic anemia / E. Sloand, S. Kim, J.P. Maciejewski [et al.] // Blood. – 2002. – Vol. 100, № 4. – P. 1185–1191. 300. Socie, G. Granulocyte-stimulating factor and severe aplastic anemia: a survey by the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) / G. Socie, J.Y. Mary, H. Schrezenmeier [et al.] // Blood. – 2007. – Vol. 109, № 7. – P. 2794–2796. 301. Solomou, E.E. T-bet, a Th1 transcription factor, is up-regulated in T cells from patients with aplastic anemia / E.E. Solomou, K. Keyvanfar, N.S. Young // Blood. – 2006. – Vol. 107, № 10. – P. 3983–3991. 302. Solomou, E.E. Deficient CD4+ CD25+ FOXP3+ T regulatory cells in acquired aplastic anemia / E.E. Solomou, K. Rezvani, S. Mielke [et al.] // Blood. – 2007. – Vol. 110, № 5. – P. 1603–1606. 303. Somasundaram, S.K. Laparoscopic splenectomy is emerging «gold standard» treatment even for massive spleens / S.K. Somasundaram, L. Massey, D. Gooch [et al.] // The Royal College of Surgeons of England. – 2015. – Vol. 9. – P. 1-4. 304. Speck, B. Splenectomy as an adjuvant measure in the treatment of severe aplastic anaemia / B. Speck, A. Tichelli, E. Widmer [et al.] // Br. J. Haematol. – 1996. – Vol. 92 (4). – P. 818–824. 305. Stasi, R. Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura / R. Stasi, A. Pagano, E. Stipa [et al.] // Blood. – 2001. – Vol. 98, № 4. – P. 952–957. 306. Stasi, R. Response to B-cell-depleting therapy with rituximab reverts the abnormalities of T-cell subsets in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura / R. Stasi, G. Poeta, E. Stipa [et al.] // Blood. – 2007. – Vol. 110, № 8. – P. 2924–2930. 307. Stasi R. Analysis of regulatory T-cell changes in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura receiving B cell-depleting therapy with rituximab / R. Stasi, 225 N. Cooper, G. Poeta [et al.] // Blood. – 2008. – Vol. 112, № 4. – P. 1147–1150. 308. Steiniger, B. The species-specific structure of microanatomical compartments in the human spleen: strongly sialoadhesin-positive macrophages occur in the perifollicular zone, but not in the marginal zone / B. Steiniger, P. Barth, B. Herbst [et al.] // Immunology. – 1997. – Vol. 92. – P. 307 – 316. 309. Steiniger, B. Microanatomy and function of the spleen / B. Steiniger, P. Barth // Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. – 2000. – Vol. 151. – P. 1–100. 310. Steiniger, B. The three-dimensional structure of human splenic white pulp compartments / B. Steiniger, L. Rüttinger, P.J. Barth // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. – 2003. – Vol. 51, № 5. – P. 655–663. 311. Steiniger, B. CD27+ B cells in human lymphatic organs: re-evaluating the splenic marginal zone / B. Steiniger, E.M. Timphus, R. Jacob [et al.] // Immunology. – 2005. – Vol. 116, № 4. – P. 429–442. 312. Steiniger, B. Spleen / B. Steiniger // Encyclopedia of life sciences. – John Wiley & Sons, Ltd, 2005. – P. 1–9. 313. Steiniger, B. Phenotypic differences between red pulp capillary and sinusoidal endothelia help localizing the open splenic circulation in humans / B. Steiniger, V. Stachniss, H. Schwarzbach [et al.] // Histochemistry and Cell Biology. – 2007. – Vol. 128, № 5. – P. 391–398. 314. Steiniger, B. The follicular dendritic cell network in secondary follicles of human palatine tonsils and spleens / B. Steiniger, M. Trabandt, P.J. Barth // Histochemistry and Cell Biology. – 2011. – Vol. 135, № 4. – P. 327–336. 315. Steiniger, B. The open microcirculation in human spleens: a threedimensional approach / B. Steiniger, M. Bette, H.J. Schwarzbach // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. – 2011. – Vol. 59. – P. 639–648. 316. Steiniger, B.S. B lymphocyte compartments in the human splenic red pulp: capillary sheaths and periarteriolar regions / B.S. Steiniger, A. Seiler, K. Lampp [et al.] // Histochemistry and Cell Biology. – 2014. – Vol. 141, № 5. – P. 507–518. 317. Steiniger, B.S. Heterogeneity of stromal cells in the human splenic white 226 pulp. Fibroblastic reticulum cells, follicular dendritic cells and a third superficial stromal cell type / B.S. Steiniger, V. Wilhelmi, A. Seiler [et al.] // Immunology. – 2014. – Vol. 143, № 3. – P. 462–477. 318. Steiniger, B.S. Human spleen microanatomy: why mice do not suffice / B.S. Steiniger // Immunology. – 2015. – Vol. 145, № 3. – P. 334–346. 319. Solanilla, A. Platelet-associated CD154 in immune thrombocytopenic purpura / A. Solanilla, J.M. Pasquet, J.F. Viallard [et al.] // Blood. – 2005. – Vol. 105, № 1. – P. 215–218. 320. Swirski, F.K. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites / F.K. Swirski, M. Nahrendorf, M. Etzrodt [et al.] // Science. – 2009. – Vol. 325. – P. 612–616. 321. Tarantino, G. Spleen: A new role for an old player? / G. Tarantino, S. Savastano, D. Capone [et al.] // World Journal of Gastroenterology. – 2011. – Vol. 17, № 33. – P. 3776–3784. 322. Tavassoli, M. Structure of the spleen in idiopathic thrombocytopenic purpura / M. Tavassoli, R. McMillan // American Journal of Clinical Pathology. – 1975. – Vol. 64, № 2. – P. 180–191. 323. Taylor, S.M. Trombosis and shock induced by activating antiplatelet antibodies in human FcγRIIA transgenic mice: the interplay among antibody, spleen, and Fc receptor / S.M. Taylor, M.P. Reilly, A.D. Schreiber [et al.] // Blood. – 2000. – Vol. 96, № 13. – P. 4254–4260. 324. Theilacker, C. Overwhelming postsplenectomy infection: a prospective multicenter cohort study / C. Theilacker, K. Ludewig, A. Serr [et al.] // Clinical Infectious Diseases. – 2016. – Vol. 62, № 7. – P. 871–878 325. Tichelli, A. A randomized controlled study in patients with newly diagnosed severe aplastic anemia receiving antithymocyte globulin (ATG), cyclosporine, with or without G-CSF: a study of the SAAWorking Party of the European Group for Blood and Marrow Transplantation / A. Tichelli, H. Schrezenmeier, G. Socie [et al.] // Blood. – 2011. – Vol. 117, № 17. – P. 4434–4441. 326. Toltl, L.J. Pathophysiology and management of chronic immune 227 thrombocytopenia: focusing on what matters / L.J. Toltl, D.M. Arnold // British Journal of Haematology. – 2010. – Vol. 152. – P. 52–60. 327. Toltl, L.J. Piecing together the humoral and cellular mechanisms of immune thrombocytopenia / L.J. Toltl, I. Nazi, R. Jafari [et al.] // Seminars in Thrombosis and Hemostasis. – 2011. – Vol. 37, № 6. – P. 631–639. 328. Usui, K. Isolation and characterization of naive follicular dendritic cells / Kenta Usui, Shin-ichiro Honda, Yuichi Yoshizawa [et al.] // Molecular Immunology. – 2012. – Vol. 50, № 3. – P. 172–176. 329. Vasco, P.G. Immunohistochemical organization patterns of the follicular dendritic cells, myofibroblasts and macrophages in the human spleen-new considerations on the pathological diagnosis of splenectomy pieces / P.G. Vasco, J.L. Villar Rodríguez, J.I. Martínez [et al.] // International Journal of Clinical and Experimental Pathology. – 2010. – Vol. 3, № 2. – P. 189–202. 330. Vianelli, N. Efficacy and safety of splenectomy in immune thrombocytopenic purpura: long-term results of 402 cases / N. Vianelli, M. Galli, A. de Vivo [et al.] // Haematologica. – 2005. – V. 90, № 1. – P. 72–77. 331. Vondenhoff, M.F.R. Separation of splenic red and white pulp occurs before birth in a LTαβ-independent manner / M.F.R. Vondenhoff, G.E. Desanti, T. Cupedo [et al.] // Journal of Leukocyte Biology. – 2008. – Vol. 84. – P. 152–161. 332. Wang, D. Increased immunohistochemical expression of YKL-40 in the spleen of patients with portal hypertension / Dong Wang, Jian-Guo Lu, Qing Wang [et al.] // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. – 2012. – Vol. 45, № 3. – P. 264–272. 333. Wang, T. Type 1 and type 2 T-cell profiles in idiopathic thrombocytopenic purpura / T. Wang, H. Zhao, H. Ren [et al.] // Haematologica. – 2005. – Vol. 90, № 7. – P. 914–923. 334. Ward, J.M. Immunohistochemistry and morphology of reactive lesions in lymph nodes and spleen from rats and mice / J.M. Ward, H. Uno, C.H. Frith // Toxicologic pathology. – 1993. – Vol. 21, № 2. – P. 199–205. 335. Webert, K.E. A retrospective 11-year analysis of obstetric patients with 228 idiopathic thrombocytopenic purpura / K.E. Webert, R. Mittal, C. Sigouin [et al.] // Blood. – 2003. – Vol. 102, № 13. – P. 4306–4311. 336. Weill, J.-C. Human Marginal Zone B Cells / J.-C. Weill, S. Weller, С.А. Reynaud // Annual Review of Immunology. – 2009. – Vol. 27. – P. 267–285. 337. Weiss, L. A scanning electron microscopic study of the spleen / L. Weiss // Blood. – 1974. – Vol. 43. – P. 665–691. 338. Wen, L. Evidence of marginal-zone B cell-positive selection in spleen / L. Wen, J. Brill-Dashoff, S.A. Shinton [et al.] // Immunity. – 2005. – Vol. 23, № 3. – P. 297–308. 339. Whipple, A. Splenectomy as a therapeutic measure in thrombocytopenic purpura haemorrhagica / A. Whipple // Surgery, Gynecology & Obstetrics. – 1926. – Vol. 42. – P. 329–341. 340. Williams, D.A. Diagnosis and treatment of pediatric acquired aplastic anemia (AAA): an initial survey of the North American Pediatric Aplastic Anemia Consortium (NAPAAC) / D.A. Williams, C. Bennett, A. Bertuch [et al.] // Pediatric Blood & Cancer. – 2014. – Vol. 61 (5). – P. 869–874. 341. Winde, G. Results and prognostic factors of splenectomy in idiopathic thrombocytopenic purpura / G. Winde, K.W. Schmid, N. Lugering [et al.] // The American College of Surgeons. – 1999. – Vol. 183, № 6. – P. 565–574. 342. Witte, T. Heterogeneity of human natural killer cells in the spleen / T. Witte, K. Wordelmann, R.E., Schmidt // Immunology. – 1989. – Vol. 69. – P. 166–170. 343. Wlodarski, M.W. Molecular strategies for detection and quantitation of clonal cytotoxic T-cell responses in aplastic anemia and myelodysplastic syndrome / M.W. Wlodarski, L.P. Gondek, Z.P. Nearman [et al.] // Blood. – 2006. – Vol. 108, № 8. – Р. 2632–2641. 344. Wolf, T. First case of successful allogeneic stem transplantation in an HIVpatient who acquired severe aplastic anemia / T. Wolf, V. Rickerts, S. Staszewski [et al.] // Haematologica. – 2007. – Vol. 92, № 4. – P. 56–58. 345. Yeramilli, V.A. Development of CD27+ marginal zone B cells requires GALT / V.A. Yeramilli, K.L. Knight // European Journal of Immunology. – 2013. – 229 Vol. 43. – P. 1484–1488. 346. Yoshida, N. First-line treatment for severe aplastic anemia in children: bone marrow transplantation from a matched family donor versus immunosuppressive therapy / N. Yoshida, R. Kobayashi, H. Yabe [et al.] // Haematologica. – 2014. – Vol. 99, № 12. – P. 1784–1791. 347. Young, N.S. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia / N.S. Young, R.T. Calado, P. Scheinberg // Blood. – 2006. – Vol. 108, № 8. – P. 2509–2519. 348. Young, N.S Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia / N.S. Young // N.S ASH Education Book. – 2013. – Vol. 2013, № 1. – P. 76–81. 349. Young, N.S. Aplastic anemia: pathophysiology and treatment / N.S. Young, A. Bacigalupo, JCW Marsh // Biology of Blood and Marrow Transplantation. – 2010. – Vol. 16, № 1. – Р. 1–12. 350. Youngblood, B. Effector CD8 T cells dedifferentiate into long-lived memory cells / B. Youngblood, J.S. Hale, H.T. Kissick, E. Ahn [et al.] // Nature. – 2017. – Vol. 552 (7685). – P. 404–409. 351. Yu, J. Defective circulating CD25 regulatory T cells in patients with chronic immune thrombocytopenic purpura / J. Yu, S. Heck, V. Patel [et al.] // Blood. – 2008. – Vol. 112, № 4. – P. 1325–1328. 352. Zeng, W. Gene expression profiling in CD34 cells to identify differences between aplastic anemia patients and healthy volunteers / W. Zeng, G. Chen, S. Kajigaya [et al.] // Blood. – 2004. – Vol. 103. – P. 325-332. 353. Zhang, F. Cell-mediated lysis of autologus platelets in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura / F. Zhang, X. Chu, L. Wang [et al.] // European Journal of Haematology. – 2006. – Vol. 76, № 5. – P. 427–431. 354. Zhang, F. High-dose cyclophosphamide compared with antithymocyte globulin for treatment of acquired severe aplastic anemia / F. Zhang, L. Zhang, L. Jing [et al.] // Experimental Hematology. – 2013. – Vol. 41, № 4. – P. 328–334. 355. Zhang, Q. Increased percentages of T cells producing interleukin-21 in 230 patients with immune thrombocytopenic purpura / Q. Zhang, H. Bai, W. Wang // Cell Biology International. – 2014. – Vol. 38, № 4. – P. 520–525. 356. Zheng, Y. B-cell tolerance regulates production of antibodies causing heparin-induced thrombocytopenia / Y. Zheng, A.W. Wang, M. Yu [et al.] // Blood. – 2014. – Vol. 123, № 6. – P. 931–934. 357. Zhou, H. Interleukin 27 inhibits cytotoxic T-lymphocyte-mediated platelet destruction in primary immune thrombocytopenia / H. Zhou, J. Qiu, T. Wang [et al.] // Blood. – 2014. – Vol. 124, № 22. – P. 3316–3319. 358. Zhou, Z.H. Distribution and activation of dendritic cells in immune thrombocytopenia patients / Z.H. Zhou, X.Y. Li, Q.Y. Pan [et al.] // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi = Journal of experimental hematology. – 2013. – Vol. 21 (6). – P. 1513–1516. 359. Zindll, C.L. The lymphotoxin LTα(1)β(2) controls postnatal and adult spleen marginal sinus vascular structure and function / C.L. Zindl, T.H. Kim, M. Zeng [et al.] // Immunity. – 2009. – Vol. 30, № 3. – P. 408–420. 360. Zong-fang, LI. Morphological changes of blood spleen barrier in portal hypertensive spleen / LI Zong-fang, Zhang Shy, Huang Ying [et al.] // Chinese Medical Journal. – 2008. – Vol. 121, № 6. – P. 561–565. 361. Zufferey, A. Pathogenesis and therapeutic mechanisms in immune thrombocytopenia (ITP) / A. Zufferey, R. Kapur, J.W. Semple // Journal of Clinical Medicine Research. – 2017. – Vol. 6 (2). 362. Авiлова, О.В. Морфо-функциiональна органiзацiя селезiнки лабораторних тварин (огляд лiтератури) [Текст] / О.В. Авiлова, О.О. Приходько, О.О. Трач [и др.] // Свiт медицини та бiологii. – 2017. – № 1, 59. – C. 175–179. 231 ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное) Патенты на изобретение Рисунок А.1 – Патент на изобретение № 2535059 от 08.10.2014 «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.) 232 Рисунок А.2 – Патент на изобретение № 2555355 от 04.06.2015 «Способ морфометрической оценки прогноза течения апластической анемии после спленэктомии» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Паньков В.Н.) 233 Рисунок А.3 – Патент на изобретение № 2563284 от 21.08.2015 «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.) 234 Рисунок А.4 – Патент на изобретение № 2594119 от 19 июля 2016 «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н.) 235 Рисунок А.5 – Патент на изобретение № 2599021 от 08 сентября 2016 «Способ прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по массе CD4+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А, Федоровская Н.А., Паньков В.Н., Ванеева Е.В.) 236 Рисунок А.6 – Патент на изобретение № 2621627 от 06 июня 2017 «Способ морфометрической оценки прогноза течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии по индексу соотношения масс CD4+/CD8+ Т-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А., Федоровская Н.А., Ванеева Е.В.) 237 Рисунок А.7 – Патент на изобретение № 2625036 от 11 июля 2017 «Способ прогнозирования течения апластической анемии после спленэктомии по массе CD4+ T-лимфоцитов селезенки» (авторы: Федоровская Н.С., Дьяконов Д.А.) 238 ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочное) Показатели массы функциональных зон селезенки в группе сравнения в зависимости от этапов иммунного ответа Таблица Б.1 – Показатели массы функциональных зон селезенки в группе сравнения в зависимости от этапов иммунного ответа Масса Масса Масса Масса Масса Масса Масса Этап селе№ БП МЗ ЛУ ГЦ ПАЛМ КП иммун. образца зенки (г) (г) (г) (г) (г) (г) ответа (г) 1 85,0 10,6 0,9 5,1 0,0 4,3 63,3 0-1 2 90,0 13,2 0,8 7,8 0,9 4,5 65,1 2 3 115,0 11,3 1,4 7,8 0,0 2,5 88,8 1 4 120,0 12,2 0,8 6,8 0,0 5,6 92,2 1-2 5 157,0 13,5 1,6 7,2 1,6 4,7 123,0 2-3 6 161,0 12,2 1,0 6,4 0,0 5,2 127,8 3 7 135,0 15,1 3,3 7,7 1,6 4,5 102,3 1-2 8 140,0 13,2 1,3 8,4 0,7 3,4 108,6 2-3 9 150,0 16,7 3,1 9,0 0,0 4,7 113,8 3 10 115,0 11,9 2,4 4,7 2,3 2,6 88,2 1-2 11 125,0 19,0 1,5 10,3 0,0 7,8 89,8 1-2 12 100,0 10,0 1,3 5,3 0,0 4.3 77,0 0-1 13 120,0 10,3 0,7 5,5 0,0 5,0 94,0 0-1 14 150,0 15,9 1,5 7,8 0,0 6,2 114,6 3 15 140,0 12,3 1,7 9,1 0,0 0,7 109,5 3 16 130,0 13,8 0,7 7,2 0,0 5,2 99,3 0-1 17 120,0 13,0 4,0 4,3 1,0 4,0 91,3 1-2 18 95,0 11,9 2,0 5,5 0,7 2,9 70,8 1-2 19 115,0 14,1 1,4 12,1 0,0 0,6 85,9 0-1 20 145,0 29,4 2,8 17,8 1,2 7,0 96,7 1-2 25-й 115,0 11,9 0,9 5,5 0,0 3,0 86,5 процентиль Меди122,5 13,1 1,5 7,5 0,0 4,6 93,1 ана 75-й 143,8 14,9 2,3 8,9 1,0 5,2 109,3 процентиль
