ГОУ ВПО ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МИНСОЦРАЗВИТИЯ РФ Фитохимический анализ растительного сырья, содержащего флавоноиды Методическое пособие по фармакогнозии Раздел: Химический анализ лекарственных растений Иркутск 2009 УДК 615.322 Авторы учебного пособия для студентов фармацевтического факультета «Фитохимический анализ растительного сырья, содержащего флавоноиды»: зав. каф. Фармакогнозии с курсом ботаники, д.ф.н., профессор Федосеева Галина Михайловна; к.ф.н., старший преподаватель Мирович Вера Михайловна; к.ф.н., ассистент Горячкина Елена Геннадьевна, интерн Переломова Мария Викторовна. Рецензенты: доц. каф. фармацевтической и токсикологической химии, к.ф.н. Пахолков Геннадий Васильевич; доц. Каф. технологии лекарственных форм, к.ф.н. Гордеева Валентина Васильевна Утверждено на заседании ФМС фармацевтического факультета ИГМУ, протокол №______ от __________ 2 1.ХИМИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ФЛАВОНОИДОВ Флавоноиды (от лат. flavus— желтый, лат. суф. — оп-, греч. eidos - вид) фенольные соединения, содержащие в своей структуре фрагмент дифенилпропана (С6-С3-С6) и представляющие собой чаще всего производные 2фенилхромана (флаван) или 2-фенилхромона (флавон). Термин «флавоноид» был предложен в 1949 году английским ученым Гейссманом более века спустя после выделения первого флавоноида кверцетина (Quercus) не только для флавонов — веществ желтого цвета, но и для других соединений флавоноидной природы, имеющих иную окраску — белую или бесцветную (флаваноны), оранжевую (ауроны, халконы), красную, малиновую, синюю (антоцианы). Химическая классификация флавоноидов основана на трех основных признаках: • степень окисленности кольца С или пропанового фрагмента; • величина гетероцикла (С); • положение бокового фенила. Флавоноиды целесообразно разделять на следующие группы: 1.Катехины Катехин: листья чая китайского и др. Катехины (флаван-3-олы)- бесцветные соединения, которые, являясь наиболее восстановленными флавоноидами, легко поддаются окислению, в результате чего приобретают розовую или красную окраску. Характерным примером может 3 служить чай, различный цвет которого (черный, красный, желтый) обусловлен степенью окисленности катехинов. Катехин — оптически активное вещество, поэтому может существовать в виде 4 изомеров, отличающихся направлением и величиной угла вращения: Dкатехин, L-катехин, D-эпикатехин, L-эпикатехин. Изомеры отличаются друг от друга не только физическими свойствами (температура плавления, удельное вращение и др.), но и биологическим действием. Например, L-эпикатехин, содержащийся в чае, обладает большей P-витаминной активностью, чем другие изомеры катехина. 2. Лейкоантоцианидины Лейкоантоцианидин: листья чая китайского и др. Лейкоантоцианидины, или проантоцианидины (флаван-3,4-диолы), как и катехины, — бесцветные соединения. Лейкоантоцианидины при нагревании с кислотами превращаются в антоцианидины и приобретают красную окраску (цианидин). Обычно лейкоантоцианидины существуют в свободном виде. В качестве типичного примера этой группы соединений можно привести лейкоцианидин, имеющий строение 3,4,5,7,3',4'-гексагидроксифлавана. 3.Антоцианидины 4 Цианидин: плоды рябины черноплодной Особенностью строения антоцианидинов является наличие свободной валентности у кислорода в пирановом кольце. Благодаря положительному заряду антоцианидины в кислом растворе ведут себя как катионы и образуют соли с кислотами, в щелочном растворе — как анионы и образуют соли с основаниями. В зависимости от рН среды изменяется и окраска (см. физикохимические свойства). Антоцианидины обычно встречаются в природе в виде гликозидов — антоцианов, причем наиболее типичным и распространенным является цианидин (3, 5, 7, 3', 4'-пентагидроксиантоцианидин). В растениях встречаются также и другие антоцианы - дельфинидин(3, 5, 7, 3',4', 5'- гексагидроксиантоцианидин), мальвидин (3, 5, 7, 41-тетрагидрокси- 3', 5'диметоксиантоцианидин) (черника) и др. Дельфинидин Мальвидин 4.Флаваноны 5 Пиноцембрин: почки тополя Флаваноны (от лат. flavus — желтый, лат. суф. -an-, -on-) - группа флавоноидов, содержащих один ассиметрический атом углерода (при С-2), УФ спектры которых имеют один интенсивный максимум поглощения при 289 нм. Флаваноны не содержат хромофоров, поэтому, как правило, не имеют окраски. В лекарственных растениях наиболее распространены пиноцембрин, пиностробин (почки тополя), нарингенин (цветки бессмертника песчаного), эриодиктиол и гесперетин (плоды лимона). Нарингенин: R=R2=H; R1=OH Эриодиктиол: R=H; R1=R2=OH Пиноцембрин: R=H Пиностробин: R=CH3 Гесперетин: R=H; R1=OH; R2=OCH3 5.Флаванонолы Таксифолин (дигидрокверцетин): лиственница сибирская Флаванонолы (от лат.flavus— желтый) — группа флавоноидов, содержащих 6 два ассиметрических атома углерода (при С-2 и С-3), УФ спектры которых имеют один интенсивный максимум поглощения при 289 нм. Флаванонолы не содержат в себе хромофоров, поэтому, как правило, не имеют окраски. В лекарственных растениях наиболее распространены дигидрокемпферол (листья чая китайского), пинобанксин (древесины сосны обыкновенной), почки тополя), таксифолин (древесина лиственницы сибирской). Пинобанксин: R=R1=R2=H Дигидрокемпферол: R=R1=H; R1=OH Таксифоллин: R=H;R1=R2 =OH 6.Флавоны Лютеолин: цветки пижмы обыкновенной Флавоны (от лат. flavus) - широко распространенная группа флавоноидов, имеющих, как правило, светло-желтую, желтую или желто-зеленую окраску. Для УФ спектров флавонов характерны два максимума поглощения при - 270 нм (коротковолновый максимум) и при-340-350 нм (длинноволновый максимум), что успешно используется в методиках количественного определения веществ с применением спектрофотометрического метода. Наиболее распространенными агликонами флавонов являются хризин, апигенин, акацетин, лютеолин, 7 диосметин, хризоериол, диуретин и трицин. Хризин:R=R1=R2=H; Апигенин:R=R2=H; R1=OH Акацетин:R=R2=H; R1=OCH3 Лютеолин:R=H; R1=R2=OH Хризоериол:R=H; R1=OH; R2=OCH3 Диосметин:R=H; R2=OH; R1=OCH3 Трицин:R1=OH; R=R2=OCH3 7.Флавонолы Кверцетин: цветки софоры японской и др. Флавонолы (от лат. flavus—желтый) — широко распространенная группа флавоноидов, имеющих, как правило, желтую или желто-зеленую окраску. Для УФ спектров флавонолов характерны два максимума поглощения при - 260 нм (коротковолновый максимум) и при - 360-370 нм (длинноволновый максимум), 8 что успешно используется в методиках количественного определения веществ с использованием спектрофотометрического метода. Наиболее распространенными агликонами флавонолов являются галангин, кемпферол, кверцетин, изорамнетин, мирицетин, гербацетин. Галангин:R=R1=R2=R3=H Кемпферол:R=R1=R3=H; R2=OH Кверцетин:R=R1=H; R2=R3=OH Изорамнетин:R=R1=H; R2=OH; R3=OCH3 Мирицетин:R=H; R1=R2=R3=OH Гербацетин:R1=R3=H; R=R2=OH 8.Изофлавоны Формононетин: корни солодки, стальника. Изофлавоны отличаются от других групп флавоноидов положением бокового фенильного кольца, которое находится не у С-2, а у С-3. 9 9.Халконы Ликуразид:корни солодки Изосалипурпозид: цветки бессмертника песчаного Халконы — флавоноиды с раскрытым у-пироновым кольцом (С). В кислой среде халконы превращаются в соответствующие флаваноны. Типичными халконами являются ликуразид (агликон — изоликвиритигенин) и изосалипурпозид. 10.Дигидрохалконы 2',6'-дигидрокси-4'-метоксидигидрохалкон: почки тополя 10 11.Ауроны Сульфуретин: трава череды трехраздельной 12. Флаволигнаны Силибин: плоды расторопши пятнистой Флаволигнаны, флаванолигнаны, флавонолигнаны — продукты окислительного сочетания флавоноидов и фенилпропаноидов, чаще всего коричных спиртов. Силибин является первым флаволигнаном, веделенным из растений в 1964 году немецкими учеными (Wagner H., Hansel R. и др.) из плодов расторопщи пятнистой. Химическое строение силибина изучалось в течение более 20 лет, в результате чего данное соединение было отнесено к новому классу природных веществ — флавонолигнанам. Впоследствии этот класс Куркиным В.А., Запесочной Г.Г. был назван флаволигнанами. 13. Бифлавоноиды Бифлавоноиды различаются между собой различным сочетанием двух молекул агликонов, структурой сочетающихся флавоноидов и характером связи. 11 Наиболее типичными бифлавоноидами являются компоненты листьев чая (димеры катехина), гинкго двулопастного (аментофлавон, гинкгетин), травы зверобоя продырявленного (биапигенин). Катехин-6',8-димер Катехин-4,8-димер Аментофлавон: R=H Гинкгетин:R=CH3 12 Классификация гликозидов флавоноидов Многообразие флавоноидов обусловлено также особенностями строения функциональных групп и их местоположением в агликоне. Флавоноиды встречаются как в свободном виде, в том числе в виде метоксилированных производных, так и в виде гликозидов. В настоящее время все известные флавоноидные гликозиды разделяются на три группы. Первая (основная) группа представлена О - гликозидами, в которых сахара связаны с агликоном полуацетальной связью через атом кислорода. О гликозиды в зависимости от количества сахаров, положения и порядка присоединения, делятся на монозиды, биозиды, дигликозиды. Монозиды относятся к более простым соединениям; биозиды могут различаться последовательностью и порядком соединения сахаров, величиной оксидных циклов и конфигурацией гликозидных связей, усложняясь биозиды могут переходить в триозиды и олигозиды, при этом сахара в этих соединениях могут сочетаться в прямые или разветвленные цепи. Дигликозиды содержат сахара у двух атомов углерода. Вторую группу представляют С- гликозиды, или гликофлавоноиды. Они в свою очередь подразделяются на С-моногликозиды, С -О-дигликозиды, С — Обиозиды. В гликофлавоноидах углеводные заместители связаны с агликоном через углеродный атом в 6- и 8- положениях К третьей группе флавоноидов относятся комплексные соединения. Они представляют собой ацилированные гликозиды и в зависимости от положения ацильного заместителя делятся на гликозиды депсиноидного типа и гликозиды со сложноэфирной связью в сахарных заместителях. В депсиноидах агликоны обычно связаны с ароматическими кислотами (бензойной, n-оксибензойной, протокатеховой, п-оксикоричной, кофейной, феруловой и др.) 13 2.БИОСИНТЕЗ ФЛАВОНОИДОВ Образование флавоноидов происходит в хлоропластах и осуществляется с помощью двух биосинтетических путей: шикиматного (кольцо В) и ацетатного (кольцо А). Это было показано на примере кверцетина (гречиха), цианидина (проростки красной капусты), катехина (листья чайного растения) и др. Предположение о том. что первичной реакцией в биосинтезе флавоноидов должна служить конденсация активированной молекулы гидроксикоричной кислоты с тремя молекулами ацетил-КоА или малонил-КоА, приводящая к образованию соответствующего флавоноида (через халкон), высказал Г. Гризебах. Следует отметить, что образование халконов с участием фермента халконсинтазы является первым и общим для всех представителей в биосинтезе флавоноидов. В этой связи халконсинтаза является ключевым ферментом последовательности реакций, ведущих к возникновению огромного разнообразия флавоноидов. В результате халконсинтазной реакции образуется халкон, который легко изомеризуется в соответствующий флаванон, в частности, нарингенин. За внедрение ОН-группы в молекулу флавоноида отвчает микросомольная гидроксилаза. Метилирование флавоноидов осущеставляется с участием О-метилтрансферазы, гликозилирование — гликозилтрансферазы. Биосинтез фенольных соединений 1. Образование коричных кислот АТФ Шикимовая кислота 14 5-фосфошикимовая кислота ФЕП Префеновая кислота Фенилаланинаминолиаза (ФАЛ) -NH2 Фенилаланин:R=H Коричная кислота:R=H Тирозин:R=OH п-кумаровая кислота:R=OH Простые фенолы, фенилпропаноиды, дубильные вещества, кумарины, флавоноиды, хиноины 2. Ацетатно-малонатный путь Ацетил-КоА Малонил-КоА Ацето-ацетил-КоА 15 Циклизация Малонил-КоА Тетраацетилполикетид Ароматизация Хиноны, нафтохиноны, Антрахиноны Биосинтез флавоноидов 1. Образование коричной кислоты Шикимовая кислота п-кумаровая кислота п-кумароил-КоА 16 2.Образование тетраацетилполикетида (предшественник кольца А) Ацетил-КоА Малонил-КоА Тетраацетилполикетид 3. Образование флавоноида (халкон-синтазная реакция) Халконсинтаза Тетрагидроксихалкон Биосинтез флаванонов и других флавоноидов Халкон-флаванон синтаза Халконсинтаза Тетрагидроксихалкон Тетрагидроксифлаванон(Нарингенин) 17 3.ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЛАВОНОИДОВ В чистом виде флаваноиды представляют собой кристаллические соединения с определенной температурой плавления, имеющие светло-желтую, желтую или желтовато-зеленую (флавоны, флавонолы), оранжевую или оранжево-красную (ауроны), красную или синюю окраску (антоцианы). Довольно часто встречаются и бесцветные флавоноиды — изофлавоны, катехины, флаваноны, флаванонолы. Агликоны флавоноидов, как правило, растворяются в этиловом эфире, ацетоне, спиртах и практически нерастворимы в воде. Многие метоксилированные флавоноиды (например, пиностробин) растворяются в хлороформе. Гликозиды флавоноидов, содержащие в молекуле 1-2 сахара (монозиды, биозиды, дигликозиды), как правило, хорошо растворимы в этиловом и метиловом спиртах, водных спиртах (особенно в 70% этиловом спирте), nбутаноле, частично — в ацетоне, этилацетате, но не растворяются в хлороформе и диэтиловом эфире. Гликозиды флавоноидов, содержащие в молекуле 3 моносахаридных остатка и более, хорошо растворяются в воде, частично — в водных спиртах, но не растворяются в крепких спиртах, в хлороформе и диэтиловом эфире. Агликоны и гликозиды флаваноидов не имеют запаха, но некоторые из них обладают горьким вкусом. Например — горькие вещества. Считается, что их горький вкус обусловлен строением углеводного компонента неогесперидозы. Флавоноидные гликозиды обладают оптической активностью, что используется для определения показателей качества некоторых стандартных образцов (датисцин, рутин, гиперозид и др.). Одна из характерных особенностей флавоноидных гликозидов — способность к кислотному и ферментативному гидролизу. Скорость гидролиза и условия его проведения различны в зависимости от строения флавоноидов. Так, 18 флавонол-3-гликозиды легко гидролизуются при нагревании со слабыми растворами минеральных кислот (0,1-2%), а 7-О-гликозиды флавонов (цинарозид) гидролизуются в жестких условиях — при нагревании в течение 2 часов с 5-10% минеральными кислотами. Напротив, 5-О-гликозиды гидролизуются мгновенно даже слабыми кислотами, причем без нагревания (трицин-5-О-глюкозид). Флавоноиды подвержены ферментативному гидролизу, например, глюкозиды (за небольшим исключением) довольно легко расщепляются 3глюкозидазой. Особую группу составляют так называемые С-гликозиды (например, витексин), которые расщепляются только с использованием смеси Килиани (смесь ледяной уксусной кислоты, концентрированной НС1 и воды в соотношении 55:35:10) при нагревании на водяной бане в течение 2-3 часов. 4.МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ Для выделения флавоноидов проводят экстракцию растительного материала, как правило, этиловым, метиловым спиртом или водными спиртами (чаще всего, это 70% спирт как один из оптимальныхэкстрагентов). Спиртовое или водно-спиртовое извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду и после охлаждения удаляют неполярные соединения (хлорофилл, каротиноиды, эфирное масло, смолы, жиры, стерины и другие липофильные вещества) из водной фазы с помощью хлороформа или четыреххлористого углерода. Флавоноиды из водной фазы извлекают последовательно этиловым эфиром (агликоны), этилацетатом (в основном монозиды), н-бутанолом (биозиды, дигликозиды). При этом в водной фазе остаются более полярные флавоноиды (триозиды) и другие гидрофильные вещества. Для разделения суммы флавоноидов обычно используют колоночную 19 хроматографию на силикагеле, полиамидном сорбенте, сефадексе LН-20, целлюлозе. Важно подчеркнуть, что для разделения и очистки флавоноидов нельзя использовать оксид алюминия, с которым флавоноидные соединения образуют так называемые лаки — продукты необратимой реакции. Элюирование веществ проводят с помощью хлороформа, а затем смеси хлороформа с метиловым или этиловым спиртами в градиентном режиме, то есть с возрастающей полярностью элюентной смеси (обычно в диапазоне концентраций спиртов 1-30%). Для выделения индивидуальных флавоноидов используют рехроматографию, перекристаллизацию или специфические методы. Так, для выделения рутина из бутонов софоры японской экстракцию проводят горячей водой. При охлаждении водных извлечений рутин выпадает в осадок, его отфильтровывают и очищают перекристаллизацией из спирта. Получение датисцина из листьев датиски коноплевой осуществляют с использованием метанола с последующим упариванием до кубового остатка и обработкой последнего хлороформом. 5.МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФЛАВОНОИДОВ Идентификацию флавоноидов проводят основываясь на их физикохимических свойствах. Проводят определение температуры плавления, удельного вращения гликозидов, сравнение УФ-, ИК-, масс ПМР-спектров со спектрами известных образцов. 5.1.Химические реакции и хроматография. Для получения предварительной информации о структурных особенностях выделенных флавоноидных соединениях используют химические методы анализа. Флавоноиды обнаруживают по качественным реакциям. 1. Цианидиновая проба или проба Шинода (Chinoda). Флавонолы, флаваноны и флавоны при восстановлении магнием в присутствии соляной 20 кислоты (конц.) дают красное или оранжевое окрашивание, обусловленное образованием антоцианидинов: Кверцетин Цианидин хлорид 2. Цианидиновая проба по Брианту (продолжение первой реакции). При последующем разбавлении содержимого пробирки водой и добавлении октилового или бутилового спиртов малиновая окраска в случае агликоновой природы флавоноидов переходит в органическую (верхняя фаза), а при исследовании гликозидов флавоноидов остается в водной фазе (флавилевые пигменты гликозидов растворяются в воде). 3. Реакция с алюминием хлоридом. Флавоноиды с 1 - 2% спиртовым раствором алюминия хлорида образуют окрашенные соединения (желтая, зеленая окраска), имеющие желто-зеленую флуоресценцию при длине волны 366 нм (батохромный сдвиг). Следует отметить, что в образовании батохромного комплекса прежде всего принимают участие свободные 3- и 5ОН -группы флавоноидов. Данная реакция довольно специфична и часто 21 используется в методиках количественного определения. Гиперозид Батохромный комплекс гиперозида Кверцетин Батохромный комплекс кверцетина Подобные комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет, флавоноиды дают и с солями других тяжелых металлов (свинец, сурьма, бериллий и др.), но данные реакции большого практического значения с точки зрения фитохимического анализа не имеют (за исключением хлорокись циркония). 4.Реакция с хлористым цирконилом(ZnOCl2) (Реакция Хензеля-Хьерхаммера). В результате этой реакции появляется ярко-желтая окраска и желто-зеленая флуоресценция. По аналогии с реакцией Вильсона, при добавлении к содержимому пробирки нескольких кристаллов лимонной кислоты желтая окраска исчезает, если в качестве продукта реакции выступал неустойчивый 22 шестичленный комплекс. 5. Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона). 3- и 5-гидрокси флавоны и 3- и 5-гидрокси флавонолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной (или щавелевой) кислоты, образуя ярко-желтое окрашивание с желтовато-зеленой флуоресценцией (образование батохромного комплекса), в случае участия в реакции 3-ОН-группы образуется устойчивый пятичленный комплекс, который не разрушается при добавлении лимонной или щавелевой кислот. Флавоноиды, имеющие свободную 5-ОН-группу также дают положительную реакцию, но образуемый при этом шестичленный комплекс после добавления соответствующих органических кислот разрушается (окраска и флуоресценция исчезают). Гиперозид Батохромный комплекс гиперозида 23 Кверцетин Батохромный комплекс кверцетина 6. С раствором аммиака флавоны, флаваноны, флавонолы и флаванонолы дают желтое окрашивание, переходящее при нагревании в оранжевое или красное. В случае халконов и ауронов тотчас же образуется красное или пурпурное окрашивание. Чистые катехины окраски не дают, однако присутствие даже в небольшом количестве примесей (продуктов окисления) вызывает появление желтой окраски. Антоцианы при наличии аммиака или карбоната натрия дают синее или фиолетовое окрашивание. Эту реакцию можно проводить с парами аммиака при использовании хроматографии на бумаге. Темно-коричневые пятна гликозидов флавонов и флаванолов (при осмотре в УФ свете) при обработке парами аммиака приобретают желто-зеленую флуоресценцию. 7. Реакция с едкими щелочами (NaOH, KOH). При использовании слабых растворов щелочей(1-2%) реакция идет с образованием халконов (разрывается 1-2 связь производных флаванона и флавона). В случае обработки флавоноидов 30% раствором щелочи наблюдается глубокая деструкция молекулы с образованием соответствующих артефактов (из кверцетина, например, 24 образуется протокатеховая кислота и флороглюцин). 8. Флавоноиды, реагируют с содержащие диазореактивом диазобензосульфокислота в свободные ароматические (диазотированная щелочной среде) ОН-группы сульфаниловая кислота, образованием окраски с различных оттенков (лимонно- желтой, оранжевой и др.) Данная реакция иногда используется в методиках количественного определения флавоноидов. 9. Реакция с треххлорным железом. Флавоноиды с 1% спиртовым раствором FeCl3 дают коричневую (3-ОН-группа) или зеленую (5-ОН-группа) или синюю (3 4 5 OH-группы) окраски. 10. Флавоноиды с минеральными кислотами концентрированными образуют оксониевые соли (ярко-желтое или ярко-оранжевое окрашивание). 11. Катехины с 1% раствором ванилина в концентрированной HCl образуют красно-малиновое окрашивание (производные флороглюцина и резорцина). 12. Флавоноиды в зависимости от строения имеют различную флуоресценцию, чаще всего желто-зеленую (агликоны) или темнокоричневую флавоноидов, (гликозиды). для Аномально которых характерна ведут себя 5-О-гликозиды ярко-голубая флуоресценция (флавоноиды хвоща полевого). Качественные реакции в настоящее время применяют в сочетании с хроматографическими методами. Рядом зависимость исследователей между показано, химическим что существует строением определенная флавоноидов и хроматографическим поведением, Основные закономерности сводятся к следующему : 1.Величина Rf снижается с увеличением гидроксильных групп в молекуле. 25 2.Метилирование гидроксильных групп вызывает повышение величины Rf агликонов. 3.Гликозидирование обусловливает понижение величины Rf. Образование биозида приводит к меньшему снижению величины Rf, чем образование дигликозида. 4.Ацетилирование может способствовать как повышению, так и понижению Rf. 5.Орто- и вициальные положения заместителей приводят к исключению из данных правил в сторону увеличения Rf. Чаще всего при анализе флавоноидных соединений используют бумажную или тонкослойную хроматографию. Пятна флавоноидов на хроматограммах, как правило, не окрашены или имеют очень слабую окраску и поэтому недостаточно хорошо просматриваются в видимой области спектра. Для повышения чувствительности и избирательности методик хроматографического анализа применяют реактивы, способные образовывать окрашенные соединения и флуоресцировать при просматривании в УФ-свете. Тонкослойная и бумажная хроматография с использованием проявляющих реактивов позволяет ориентировочно установить структуру агликонов флавоноидов и определить расположение гидроксильных групп у С-3, С-5, С-7, С-8, а также наличие диоксигруппировки в боковом фенильном радикале. При хроматографировании в тонких слоях 3-монозиды флавоноидов могут быть отделены от 3-биозидов, а последние - от 3,7-дигликозидов. Для обнаружения гликозидов и агликонов используют спиртовый раствор алюминия хлорида, хлористый цирконил с лимонной кислотой, раствор едкого калия, раствор треххлористой сурьмы в четыреххлористом углероде, 1% ванилин в конц. соляной кислоте, раствор железоаммонийных квасцов, пары аммиака и другие. Для обнаружения сахаров применяют анилин-фталатный реактив. 26 Хроматографирование проводят в следующих системах растворителей: бутанол-уксусная кислота-вода, 15% уксусная кислота, бензол-уксусная кислота-вода, уксусная кислота-соляная кислота-вода, этилацетат-муравьиная кислота-вода и другие. Как уже отмечалось, наряду с бумажной широко применяется и тонкослойная хроматография. В качестве сорбентов используют порошок целлюлозы в смеси с гипсом, силикагель, капрон и ацетилированный полиамид, магнезол. кремневую кислоту, поливинилпирролидон, полиакрилнитрил. Для получения хроматограмм применяют следующие системы растворителей: уксусная кислота-муравьиная кислота-вода(10:2:3), бутанолуксусная кислота-вода(4:1:5), хлороформ-ацетон-метанол(36:1:1), хлороформацетон-метанол-гептан(36:1:1:1), 15% уксусная кислота, м-крезол-уксусная кислота-вода(50:2:48) и другие. Для хроматографии более гидрофобных соединений (флавонов, изофлавонов) основными компонентами смеси являются липофильные растворители: бензол, толуол, хлороформ в смеси с ацетоном, спиртами (этанол, метанол), с простыми и сложными эфирами, для гликозидов и флавонолов - этилацетат, насыщенный водой в комбинации с кислотой или спиртом. Идентификацию флавоноидов проводят по значению Rf с помощью "свидетелей". Следует обратить внимание на то, что из-за различий в бумаге, растворителях и в других условиях идентификация методами бумажной и тонкослойной хроматографии требует непосредственного сравнения с достоверными образцами на том не листе бумаги или пластины и использавания нескольких систем растворителей и реагентов для опрыскивания. Флавонолы и 7-гликозиды флавоноидов, как правило, имеют желтую окраску пятен на хроматограммах при просматривании в УФ-свете, а флавоны, флаваноны и гликозиды - бурую или коричневую окраску, ксантоны оранжевую, изофлавоноиды в данных условиях не проявляются. 27 Для отличия агликонов и гликозидов необходимо проводить параллельное хроматографирование в системе хлороформ-уксусная кислота-вода (13:6:1) и в системе 15% уксусной кислоты. 5.2. УФ-спектроскопия. Спектрофотометрическое поглощения в определение разновидности по прямой максимумам или собственного дифференциальной спектрофотометрии является одним из более распространенных методов анализа флавоноидных соединений. За последнее время накоплен большой материал по УФ-спектроскопии флавоноидных соединений, с помощью которого возможна идентификация не только основной структуры флавоноидов, но и установление количества и положения гидроксильных групп и остатков Сахаров. Спектрофотометрический метод анализа базируется на избирательном поглощении монохроматического света раствором исследуемых веществ. Поглощение обусловлено электронными переходами с орбиты донорного заместителя на вакантную орбиту бензольного кольца или акцепторного заместителя. Для флавоноидов в УФ-спектре характерны две интенсивные полосы поглощения в длинноволновой области 320-380 нм (I полоса) и в коротковолновой 240-270 нм ( I I полоса), а для флавонолов 350-390 нм и 250270 нм соответственно, дополнительный максимум при 300 нм. Расстояние между основными максимумами более или менее постоянно и для флавонолов составляет 93-125 им, что может служить отличительным признаком. Спектральные исследования спиртовых растворов флавоноидных соединений показывают, что гидроксильные группы оказывают значительное батохромное к гипсохромное влияние на максимумы поглощения в зависимости от их положений. Наибольшее влияние оказывают оксигруппы, сопряженные с карбонилом, другие группы имеют вспомогательное значение. Поэтому при снятии УФ-спектров используют различные реагенты, 28 оказывающие влияние на хромофорную систему флавоноидов, что проявляется в виде батохромных или гипсохромных сдвигов основных максимумов поглощения. Рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые, так и коротковолновые максимумы. В качестве ионизирующих и комплексообразующих добавок достаточно широко применяют этилат натрия, ацетат натрия, ацетат натрия с борной кислотой, хлористый алюминий и хлористый цирконил с лимонной кислотой. При наличии гидроксильной группы в положении С-7 наблюдается батохромный сдвиг I полосы под действием ацетата натрия. У флавонов и флавонолов свободная гидроксильная группа в 4-положении устанавливается в присутствии этилата натрия по батохромному сдвигу первой полосы на 40-64 нм без уменьшения интенсивности. Гидроксильная группа в положении С-3 у флавонолов при отсутствии гидроксила у С-4" также вызывает батохромию первой полосы на 50-60 нм, но уже с понижением интенсивности. Если присутствуют гидроксильные группы у С-3 и С-4" одновременного наблюдается гипсохромный сдвиг, что обусловлено окислением и разрушением в щелочной среде 4"-оксифлавонолов. Орто-диоксильная группировка в боковом фенильном радикале устанавливается по батохромному сдвигу первой полосы в присутствии безводного ацетата натрия с борной кислотой на 25 нм. Хлористый алюминий и соли цирконила позволяют определить свободные гидроксильные группы в положении С-3 и С-5 по батохромии 1 полосы. Если при добавлении лимонной кислоты батохромный сдвиг исчезает, то что обусловлено 5-оксигруппой. Устойчивый сдвиг к лимонной кислоте оказывает на свободную гидроксильную группу в 3 положении. Свободные гидроксилы при С-3 и С-5 вызывают удвоенный батохромный сдвиг 1 полосы под действием хлористого цирконила, достигающий 100 нм и более. Флавонолы в присутствии алюминия хлорида и соляной кислоты вызывают батохромию первой полосы на 50-60 нм, а сдвиг второй полосы на 20-26 нм. 29 5.3 ИК-спектроскопия При анализе флавоноидных соединений широко используются спектральные исследования в ИК-области для установления и подтверждения строения молекул веществ. ИК-спектроскопия позволяет также определить конфигурацию и конформацию молекул. ИК-спектры обусловлены колебанием атомов молекулы. При этом колебания имеют различную энергию и могут быть направлены вдоль валентной связи между атомами. Колебания всех атомов молекулы обуславливают полосы поглощения индивидуальные для данного вещества. В основном для целей идентификации служит область "отпечатков пальцев" (1400-650 см-1). Эта область чаще всего используется для установления подлинности путем змперического сравнения ИК-спектров исследуемого и известного соединений. Наличие функциональных групп в молекуле флавоноида устанавливают по характерному поглощению в определенной области спектра. Так, установлено, что в ИК-спектрах флавоноидов незамещенная карбонильная группа флаванона поглощает при 1660-1690 см-1. Валентные колебания С=О группы Флавонолов находятся в области 1637-1650 см-1. Наличие в 'положении С-7 гидроксильной группы понижает частоту валентных колебаний этой группы на 15-10 см-1. Образование водородной связи между группами C=О и ОН в положении С-5 объясняет снижение значения частоты С=О до 1640 см-1. Валентные колебания двойных связей проявляются в виде нескольких интенсивных полос поглощения в области 1600-1470 см-1. Колебания СНгруппы ароматических колец с двойной связью, сопряженной с С=0, проявляются в области 3130-3110 см-1. Свободные алифатические гидроксильные группы поглощают в интервале 3625-3600 см-1. А фенольные гидроксилы агликона определяются в области 30 3300-2700 см-1. 0Н-группы углеводных заместителей проявляются в области 3600-3300 см-1. С помощью ИК-спектров различают L- и В- аномеры моносахаридов и их производных. Для L-конфигурации связи C-0 характерна полоса 844 ± 8 см-1, для L-конфигурации - полоса 891±7 см-1. Сочетание ИК-спектроскопии с хроматографией в тонких слоЯХ сорбента позволяет повысить избирательность качественного обнаружения веществ в смеси. Количество исследуемого соединеНИЯ , которое может быть снято с тонкослойной хроматограммы, достаточно для снятия ИК-спектров малых образцов. Это позволяет использовать ИК-спектроскопию в анализе биологически активных веществ, содержание которых в растениях, как правило, невелико. 5.4. ЯМР-спектроскопия ЯМР-спектроскопия позволяет установить структуру молекул флавоноидов, их конформационное строение и распределение электронной плотности. В сочетании с УФ- и ИК-спектроскопией дает очень ценную информацию о структуре флавоноидов. По числу сигналов в спектре ЯМР можно определить сколько типов протонов имеется в молекуле, а по положению сигналов установить тип протонов. Вследствие низкой растворимости гликозидов в малополярных и неполярных растворителях, используемых для получения спектров, они в большинстве случаев исследуются в виде ацетильных или триметилсилиловых производных. При помощи ПМР-спектров можно не только быстро и точно установить положение заместителей в кольцах А и В флавоноида, но и расшифровать строение углеводного компонента, определить конфигурацию гликозидной связи, природу и конформацию углевода. 31 6.СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ФИТОПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФЛАВОНОИДЫ Подлинность сырья оценивают с помощью вышеперечисленных качественных реакций (чаще всего, это цианидиновая проба и реакция с А1С13) и с использованием различных хроматографических методов (ТСХ, БХ). Большинство видов ЛРС до сих пор анализируется с использованием качественных реакций (зверобой продырявленный, софора японская, бессмертник песчаный и др.). Однако в последнее время активно стали внедряться хроматографические методы. Например, подлинность травы череды трехраздельной устанавливает методом хроматографии на бумаге по характерному набору флавоноидов, а травы эрвы шерстистой — методом ТСХ. С использованием ТСХ определяют также подлинность листьев датиски коноплевой, плодов боярышника, плодов расторопши пятнистой, почек тополя, причем в этих случаях применяют соответствующие ГСО (датисцин, гиперозид, силибин, пиностробин). Методы количественного определения флавоноидов В настоящее время все большее распространение получают различные физико-химические и спектральные методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья. К таким методам спектрофотометрия, относятся ВЭЖХ, хрома-тоспектрофотометрия, фотоэлектроколориметрия, денсито-метрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком (закрепленном и незакрепленном) слое сорбента. хроматоспектрофо-тометрический метод, Если то необходимо хроматография применить (БХ, ТСХ, колоночная) используется как для очистки, так и для разделения суммы флавоноидов на отдельные компоненты. 32 Особенно ценным методом, отвечающим параметрам валидации, является ВЭЖХ. Внедрению этого метода в фармакопейный анализ во многом способствовали работы академика РАМН, профессора А.П. Арзамасцева, профессора Н.А. Тюкавкиной, профессора Г.Г. Запесочной, профессора И.А. Самылиной. 1. Спектрофотометрический метод. Основан на определении оптической плотности раствора анализируемых веществ при определенной длине волны. Например, в случае плодов расторопши пятнистой, почек тополя используется прямая спектрофотометрия, но чаще всего из-за возможного вклада других ароматических веществ в оптическую плотность анализируемых растворов приходится прибегать к очистке суммы флавоноидов (без хроматографии) или к реакции комплексообразования. Для фармакопейного анализа обычно используют раствор алюминия хлорида (трава зверобоя продырявленного и др.). Например, для флавонов и флавонолов, в частности, для рутина характерны два макисимума поглощения — коротковолновый (260 нм) и длинноволновый (362 нм), что может быть использовано не только с целью идентификации веществ, но в плане количественной оценки, особенно в условиях дифференциальной спектрофотометрии. При этом в присутствии А1С13 образуется батохромный сдвиг длинноволновой полосы с образованием максимума при длине волны 412 нм (аналитическая длина волны). Этот подход является одним из самых используемых при анализе ЛРС, содержащего флавоноиды, поскольку позволяет минимизировать вклад сопуствующих веществ в оптическую плотность исследуемых растворов (см. траву зверобоя). 2.Хроматоспектрофотометрический метод. Название метода обозначает, что в нем сочетаются два подхода — хроматографическая очистка суммы или индивидуальных флавоноидов и последующее спектрофотометрическое определение целевых веществ. Хроматоспектрофотометрический метод может осуществляться в различных 33 модификациях, но в целом их можно разделить на 2 группы: 1. Хроматографическое отделение флавоноидов от сопутствующих веществ методом ТСХ или БХ (например, определение рутина в ЛРС). Методики количественного определения рутина в траве гречихи посевной и бутонах софоры японской основаны на хроматоспектрофотометрии, причем в первом случае используется хроматография на бумаге, а во втором — ТСХ. В обоих случаях, используют прием отделения рутина от сопутствующих флавоноидов, а затем измеряют оптическую плотность элюата. В методиках используют ГСО рутина. 2. Хроматографическое отделение флавоноидов от сопутствующих веществ методом колоночной хроматографии (например, леспедеца копеечниковая). В основу разработанного метода количественного определения суммы флавоноидов в надземной части леспедецы положено выделение суммы флавоноидов и определение оптической плотности раствора в этиловом спирте при длинноволновом максимуме поглощения (353 нм) с последующим расчетом процентного содержания по удельному показателю поглощения чистого гомоориетина(лютеолин-6-С-в-0- глюкопиранозид). 3. Фототоколориметрический метод основан на реакции диазосочетания, а также на основе цветных реакций флавоноидов солями различных металлов(алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде. Методы, имеющее в большей мере теоретическое значение: 1. Полярографический метод. Он основан на способности флавоноидов, например, флавонолов и флавонов, восстанавливаться на ртутно-капльном электроде. 34 2. Метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях. Метод основан на способности флавоноидов проявлять слабо выраженных кислотные свойства (из-за наличия в молекуле фенольных гидроксилов, особенно 7-ОН-группы). Метод кислотно-основного титрования осуществляют в неводных растворителях — диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне. З.Денситометрический метод. Метод основан на цветных реакциях, причем он не требует дополнительных операций по выделению веществ с хроматограмм. 7.ЛЕКАРСТВЕННОЕ РАСТИТЕЛЬНОЕ СЫРЬЕ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАКОПЕИ, СОДЕРЖАЩЕЕ ФЛАВОНОИДЫ (КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ, КОЛИЧЕСТВЕННОЕ) HERBA POLYGONI HYDROPIPERIS ТРАВА ГОРЦА ПЕРЕЧНОГО (ВОДЯНОГО ПЕРЦА) Качественные реакции. Около 1 г измельченного сырья (см. раздел "Количественное определение") кипятят в течение 5 мин с 20мл воды и фильтруют. К 5 мл фильтрата прибавляют 3 мл 1% раствора алюминия хлорида в 95% спирте; появляется желто – зеленое окрашивание (флавоноиды). Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 90% спирта, содержащего 1% концентрированной хлористоводородной кислоты, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной 35 температуры и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют еще раз указанным выше способом, затем еще 1 раз 90% спиртом в течение 30 мин. Извлечения фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу, промывают фильтр 90% спиртом и доводят объем фильтрата 90% спиртом до метки (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 2 мл раствора А, прибавляют 1 мл 1% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 20 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 430 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2 мл раствора А, доведенного 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: D*25*100*100*100 X= 764,6*m*2*(100-W) где D - оптическая плотность исследуемого раствора; 764,6 удельный показатель поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом при 430 нм; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Числовые показатели. Цельное сырье. Суммы флавоноидов в 36 пересчете на кверцетин не менее 0,5%; HERBA POLYGONI AVICULARIS ТРАВА ГОРЦА ПТИЧЬЕГО (СПОРЫША) Качественные реакции. Около 1 г измельченного сырья (см. раздел "Количественное определение") кипятят в течение 5 мин с 20 мл 70% спирта и фильтруют через бумажный фильтр. К 5 мл фильтрата прибавляют 3 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида; появляется желто - зеленое окрашивание (флавоноиды). Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 70% спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют еще 2 раза указанным выше способом. Объединенные извлечения повторно фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу, фильтр промывают 70% спиртом и доводят объем фильтрата тем же спиртом до метки (раствор А). 4 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки; через 20 мин измеряют 37 оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют следующий раствор: 4 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 каплю разведенной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на авикулярин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: D*100*100*25 Х= 330*m*(100 - W) где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 330 - удельный показатель поглощения комплекса авикулярина с алюминия хлоридом при 410 нм; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Числовые показатели. Цельное сырье. Суммы флавоноидов в пересчете на авикулярин не менее 0,5%; HERBA HYPERICI ТРАВА ЗВЕРОБОЯ Качественные реакции. К 1 мл извлечения, полученного согласно методике, описанной в разделе "Количественное определение", прибавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и 7 мл 95% спирта; раствор окрашивается в зеленовато - желтый цвет (флавоноиды). 38 Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 50% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещают в колбу для экстрагирования и прибавляют 30 мл 50% спирта. Экстракцию повторяют еще дважды в описанных выше условиях, фильтруя извлечение в ту же мерную колбу. После охлаждения объем извлечения доводят 50% спиртом до метки и перемешивают (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно 39 сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: D*m0*100*100*100 Х= D0 *m*100*(100-W) где D - оптическая плотность испытуемого раствора; Dо - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m - масса сырья в граммах; m0 масса ГСО рутина в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Примечание. Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина: около 0,05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 град. С в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают. Числовые показатели. Цельное сырье. Суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 1,5%; FRUCTUS CRATAEGI ПЛОДЫ БОЯРЫШНИКА Боярышник кроваво-красный Crataegus sanguinea. Качественные реакции. Измельченное сырье в количестве 0,5 г (см. раздел "Количественное определение") кипятят в течение 15 мин с 5 мл 95% спирта. После охлаждения извлечение декантируют и 0,01 40 мл раствора микропипеткой наносят на пластинку "Силуфол" (15Х15 см) в виде полосы длиной 1 см, рядом наносят в виде точки - 0,005 мл 0,1% раствора Государственного стандартного образца (ГСО) гиперозида. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 5 мин, затем помещают в камеру со смесью растворителей хлороформ - метиловый спирт (8:2) и хроматографируют восходящим способом (смесь растворителей заливают в камеру непосредственно перед хроматографированием). Когда фронт растворителей дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, высушивают в вытяжном шкафу в течение 2 мин и просматривают в УФ - свете при длине волны 360 нм. На уровне пятна ГСО гиперозида должна появиться полоса темно - коричневого цвета. Затем пластинку обрабатывают 5% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревают ее в течение 2-3 мин в сушильном шкафу при температуре 100-105 град. С. При этом пятно приобретает ярко - желтую окраску в видимом и яркую желто зеленую флюоресценцию в УФ - свете (гиперозид). Примечание. Приготовление 5% спиртового раствора алюминия хлорида: 5г алюминия хлорида (ГОСТ 3759-75) растворяют в 40 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 100 мл, 41 прибавляют 50 мл 95% спирта, взвешивают с погрешностью +/-0,01 г, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы 95% спиртом. Содержимое колбы фильтруют через воронку диаметром 5 см с вложенным ватным тампоном толщиной не более 0,5 см, отбрасывая первые 15 мл фильтрата; 25 мл фильтрата переносят в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 50 мл и упаривают досуха под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток дважды обрабатывают 10 мл горячего 10% раствора натрия хлорида, каждый раз нагревая содержимое колбы на кипящей водяной бане в течение 2 мин. Раствор охлаждают, фильтруют через воронку с ватным тампоном, смоченным водой, на колонку с полиамидным сорбентом. Колонку промывают 30 мл воды, из них 10 мл используют для промывания фильтра, который после этого убирают. Когда над сорбентом останется слой жидкости толщиной 7-10 мм, водный элюат отбрасывают. Элюирование суммы флавоноидов проводят 25 мл 95% спирта, который добавляют в колонку постепенно, порциями по 5 мл. Первые порции элюата (бесцветные и прозрачные) собирают в градуированную пробирку вместимостью 10 мл, диаметром около 1 см. Когда элюат приобретет окраску и объем окрашенного элюата в пробирке достигнет 1 мл, мерную пробирку убирают (граница раздела бесцветного водного и окрашенного спиртового слоев элюата в 42 пробирке хорошо различима визуально). Элюат из пробирки отбрасывают. Последующие порции элюата собирают в мерную колбу вместимостью 25 мл. Объем элюата в колбе доводят 95% спиртом до метки и перемешивают (раствор А). В мерную колбу вместимостью 10 мл переносят 2 мл раствора А и доводят объем раствора 95% спиртом до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 365 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне раствора сравнения. Параллельно измеряют оптическую плотность элюата раствора ГСО гиперозида: 2 мл 0,1% раствора ГСО гиперозида помещают в круглодонную колбу вместимостью 50 мл со шлифом и упаривают досуха под вакуумом. Содержимое колбы дважды обрабатывают 10 мл горячего 10% раствора натрия хлорида, каждый раз нагревая содержимое колбы на водяной бане в течение 2 мин, и сливают раствор на колонку с полиамидным сорбентом через воронку с ватным тампоном, смоченным водой. Элюат для измерения оптической плотности стандартного образца гиперозида получают аналогично элюату суммы флавоноидов. Содержимое суммы флавоноидов в пересчете на гиперозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: D*m0*50*2*100*100 Х= D0*m*(100 - W)*25*50 где D - оптическая плотность элюата испытуемого раствора; D0 43 оптическая плотность элюата раствора ГСО гиперозида; m0 - масса ГСО гиперозида в граммах; m - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Примечания. 1. В ходе анализа используют 3 колонки с полиамидным сорбентом: для получения испытуемого раствора, раствора сравнения и раствора ГСО гиперозида. 2. Приготовление колонки: 1 г полиамида для колоночной хроматографии (ТУ 6-09-10-822-73) помещают в стаканчик вместимостью 50 мл, приливают 30 мл воды, перемешивают и выливают через воронку в колонку диаметром 1,5 см и высотой 25 см. В нижнюю часть колонки предварительно помещают небольшой ватный тампон, смоченный водой. Колонку заполняют при открытом кране. Элюирование проводят со скоростью 4 мл/мин, не допуская обнажения поверхности сорбента. Толщина слоя жидкости над сорбентом должна быть не менее 4-5 мм. 3. Приготовление раствора сравнения: раствор сравнения получают аналогично элюату суммы флавоноидов путем пропускания 25 мл 95% спирта через колонку в мерную колбу вместимостью 25 мл, объем раствора доводят 95% спиртом до метки и перемешивают. Числовые показатели. Гиперозида не менее 0,5%. ЛИСТЬЯ БЕРЕЗЫ FOLIA BETULAE Качественные реакции. 0,03г измельченного сырья (см. раздел «Количественное определение») помещают в пробирку, прибавляют 5 мл 95% 44 спирта и взбалтывают в течение 3 минут. Затем прибавляют 10 капель кислоты хлористоводородной концентрированной 0,015г магния металлического и нагревают на кипящей водяной бане в течение 3 минут. Через 5 минут появляется розовое окрашивание (флавоноиды). Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм. Около 1г (точная навеска) измельченною сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 200 мл, приливают 100 мл 50% спирта и взвешивают. Колбу с содержимым присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 2 часов. После охлаждения до комнатной температуры колбу взвешивают, доводят ее массу 50% спиртом до первоначальной, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем 95% спиртом до метки. Через 40 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли кислоты уксусной разведенной и доведенный 95% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Раствор выдерживают в течение 40 минут. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: X= D*m0*100*100 D 0 * m* ( 1 00 - W ) = D*m0 *10000 D 0 * m* ( 1 0 0 - W ) 45 г д е D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m - масса сырья в граммах; m0 - масса ГСО рутина в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах. Примечание. Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина. Около 0,05г (точная навеска) ГСО рутина предварительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 час, растворяют в 85 мл 95% спирта в колбе вместимостью 100 мл при нагревании па водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают. Срок годности раствора I мес. Числовые показатели. Суммы фенольных соединений в пересчете на рутин не менее 2,0%. ТРАВА ОВСА ПОСЕВНОГО HERBA AVENAE SATIVAE Качественные реакции. 2г сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл и прибавляют 20 мл 70% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей бане в течение 30 минут с момента закипания спирта в колбе. После охлаждения полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр. Далее извлечение упаривают до объема 1 мл, прибавляют 1 мл 95% спирта этилового, тщательно перемешивают и делят на две части. К 1 мл извлечения прибавляют 0,1г порошка магния или цинковой пыли и 1 мл кислоты хлористоводородной концентрированной. Наблюдается появление розового окрашивания (флавоноиды). Вторую часть извлечения в количестве 0,015 мл наносят на линию старта (2см от края) пластинки «Силуфол» размером 8x15 см в виде полоски длиной 1см. Одновременно на линию старта в 2см от последнего наносят 0,005 мл 0,1% спиртового раствора Государственного стандартного образца (ГСО) лютеолина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 5 минут, затем помещают в камеру (предварительное насыщение не менее 1 ч а с а ) со смесью растворителей хлороформ: метанол: 46 вода (52:28:7) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 14см, её вынимают из камеры, высушивают в вытяжном шкафу в течение 10 минут и просматривают в УФ-свете при длине волны 360 нм. На пластинке над местом нанесения извлечения должны появиться 3 основных темно-коричневых пятна, которые по отношению к ГСО лютеолина имеют Rс 0.44: 0,57: и 1,09. Хроматограмму проявляют 5% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С в течение 2-3 минут. При этом пятна приобретают желтую окраску в видимом свете. В УФ-свете пятна с Rс 0,44 (2»-0-арабинозид изоориентина) и Rc 0,57 (2»-0-арабинозид изовитексина) имеют ярко-желтую окраску, а верхнее пятно с Rc 1,09 (трицин) - ярко желто-зеленую. Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2мм. Около 1г (точная навеска) измельченного сырья помещают в патрон из фильтровальной бумаги и затем в экстрактор Сокслета объемом около 100 мл. В колбу-приемник заливают 150 мл хлороформа и ведут форэкстракцию на кипящей бане до получения бесцветных хлороформных сливов. Бумажный патрон вынимают, сушат при комнатной температуре 18-20°С в вытяжном шкафу до удаления запаха растворителя. Патрон надрезают, помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл, со шлифом, и прибавляют 100 мл 70% спирта этилового. Колбу закрывают пробкой, взвешивают с погрешностью ± 0,01г, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают при умеренном кипении растворителя на водяной бане 1,5 часа. Затем колбу с содержимым охлаждают до комнатой температуры, взвешивают и доводят массу до первоначальной 70% спиртом этиловым. Извлечение филируют через бумажный фильтр. 2 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 70% спиртом этиловым до метки и перемешивают. 47 Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 338 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения используют 70% этанол. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на 2-О-арабинозид изовитексина и абсолютно-сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: D*100*25*100 D*354,1 X= = 353*m*2*(100-W) m*(100-W) где D - оптическая плотность испытуемого раствора; 353 -удельный показатель поглощения 2-0-арабинозид изовитексина при 338 им; m – масса сырья в граммах; W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах; 25100 – разведения испытуемого раствора. Числовые показатели. Цельное сырье. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на 2-О-арабинозид изовитексина не менее 1,3% ПЛОДЫ РАСТОРОПШИ ПЯТНИСТОЙ FRUCTUS SILYBI MARIANI Качественные реакции. 1-2 мл раствора А (см. раздел «Количественное определение») помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1мл 3% раствора уксусной кислоты и доводят объем 95% спиртом до метки. Полученный раствор при измерении на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10мм имеет максимум поглощения при длине волны 289+2 нм (флаволигнаны). Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1мм. Около 1г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 150 48 мл, прибавляют 50 мл 95% спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем отстаивают 5-10 минут и фильтруют через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл. Извлечение повторяют еще 2 раза указанным выше способом и после охлаждения доводят объем раствора 95% спиртом до метки (раствор А). Отбирают из мерной колбы 10 мл извлечения, помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 95% спиртом до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют через 30 минут на спектрофотометре при длине волны 380 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 10 мл извлечения, 1 мл 3% раствора уксусной кислоты, доведенной 95% спиртом до 25 мл. Содержание суммы флаволигнанов в процентах (X) вычисляют по формуле: D*50000 X= , где 67,5*m*(l00-W) D-оптическая плотность испытуемого раствора, 67,5 - удельный показатель поглощения силидианина-стандарта, m- масса сырья в граммах, W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах. БУТОНЫ СОФОРЫ ЯПОНСКОЙ ALABASTRA SOPHORAE JAPONICAE Качественные реакции. 1г измельченных бутонов софоры японской заливают 10 мл 95% спирта, нагревают на водяной бане до кипения и настаивают 3-4 часа. Спиртовое извлечение фильтруют, упаривают до 2 мл, делят пополам и переносят в две пробирки. В каждую пробирку прибавляют по три капли концентрированной хлористоводородной кислоты, в одну из пробирок прибавляют 0,03-0,05г цинковой пыли и нагревают на водяной бане до кипения. При этом в пробирке с цинковой пылью жидкость окрашивается в вишнево-красный цвет (флавоноиды). Окрашивание отчетливо заметно при сравнении испытуемого раствора с контрольным, т.е. без цинковой пыли. 49 Количественное определение. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5мм. Около 2г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 750-1000 мл, затем прибавляют 5г кварцевого песка, 15 стеклянных шариков размером 5-10мм, 150 мл метилового спирта и встряхивают 6 часов на вибрационном встряхивателе с последующим настаиванием в течение 18 часов. Метанольное извлечение отфильтровывают через складчатый фильтр. На стартовую линию хроматографической бумаги (марки «С») размером 14x55 см наносят микропипеткой 0,2 мл метанольного извлечения. Хроматограмму высушивают на воздухе в течение 5 минут и проводят хроматографирование нисходящим способом в системе 15% уксусной кислоты до тех пор, пока слой растворителя на бумаге не пройдет 30см (3,5 часа). Хроматограмму подсушивают на воздухе до исчезновения запаха уксусной кислоты (3-4 часа) и просматривают в УФ-свете при 254 нм. Рутин проявляется в виде желтовато-коричневого пятна с R f около 0,70. Бумагу с пятном рутина вырезают, разрезают на мелкие кусочки, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, заливают 30 мл 60% спирта и встряхивают 4 часа на вибрационном встряхивателе. Элюат отфильтровывают и определяют его оптическую плотность на спектрофотометре при 358 нм в кювете с толщиной слоя 10мм. В качестве раствора сравнения используют элюат (60% метиловый спирт) с равной по площади бумаги, хроматографированной в тех же условиях без вещества. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца рутина. Содержание рутина в пересчете на абсолютно-сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле: X= D1*C*150*30*100*100 D0*m*0.2*(100-W) где Di - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность стандартного раствора рутина; С - навеска стандартного образца 50 рутина, в граммах; m - масса сырья, в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах. П РИМ ЕЧАНИЕ . Приготовление раствора стандартного образца рутина. 0,0500г (точная навеска) стандартного образца рутина растворяют в метиловом спирте в мерной колбе вместимостью 25 мл и доводят объем раствора метиловым спиртом до метки. 1мл этого раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора 60% метиловым спиртом до метки. 1 мл стандартного раствора содержит 0,00002г рутина. Приготовление 60% метилового спирта. Смешивают 600 мл метилового спирта и 400 мл воды. Числовые показатели. Рутина не менее 16%; 51 8.ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ Выберите один правильный ответ: 1. К флавоноидам относится соединение, изображенное на рисунке: А. Б. В. 2. Присутствие флавоноидов в растительном сырье можно доказать реакцией: А. осаждения спиртом. Б. «лактонной пробы». В. цианидиновой. Г. с тимолом и концентрированной соляной кислотой. Д. микровозгонки. 52 3. К производным изофлавона относится соединение, изображенное на рисунке: А. Б. В. 4. На рисунке изображена формула: А. лютеолина. Б. рутина. 53 В. гиперозида. Г. кверцетина. Д. кемпферола. 5. Основными действующими веществами в траве горца птичьего являются: А. хромоны. Б. флавоноиды. В. фенологликозиды. Г. кумарины. Д. лигнаны. 6. К производным флаванона относится соединение, изображенное на рисунке: А. Б. В. 7. Присутствие флавоноидов в сырье можно доказать реакцией с: 54 А. хиноином. Б. хлоридом алюминия. В. «лактонная проба». Г. фосфорномолибденовой кислотой. Д. «двойного окрашивания». 8. Траву горца птичьего стандартизуют по содержанию: А. эфирного масла. Б. экстрактивных веществ. В. дубильных веществ. Г. суммы флавоноидов. Д. суммы полисахаридов. 9. Содержание суммы флавоноидов в траве зверобоя определяют: А. перегонкой с водяным паром. Б. спектрофотометрически. В. потенциометрически. Г. весовым методом. Д. йодометрически. 10. На рисунке изображена формула: А. кверцетина. Б. кемпферола. В. гиперозида. Г. кумарина. Д. рутина. 11. К производным флавона относится соединение на рисунке: 55 А. Б. В. 12. Содержание флавоноидов в траве горца перечного по ГФ XI определяют методом: А. йодометрическим. Б. фотоэлектрокалориметрическим. В. спектрофотометрическим. Г. гравиметрическим. Д. нейтрализации. 13. На рисунке изображена формула: 56 А. рутина. Б. кверцетина. В. кемпферола. Г. гиперозида. Д. лютеолина. 14. Действующими веществами в траве зверобоя являются: А. флавоноиды. Б. хромоны. В. кумарины. Г. лигнаны. Д. фенологликозиды. 15. К производным флавонола относится соединение, изображение на рисунке: А. Б. 57 В. 16. Траву зверобоя по ГФ ХI стандартизуют по содержанию: А. рутина. Б. экстрактивных веществ, извлекаемых 70% спиртом. В. суммы флавоноидов в пересчете на рутин. Г. экстрактивных веществ, извлекаемых водой. Д. гиперецина. 17.На рисунке изображена формула: А. рутина. Б. кверцетина. В. гиперозида. Г. витексина. Д. авикулярина. Ответы на тестовые задания: 1-Б; 2-В; 3-В; 4-А; 5-Б; 6-А; 7-Б; 8-Г; 9-Б; 10-Д; 11-А; 12-В; 13-Г; 14-А; 15-В; 16-В; 17-Б. 58 Ситуационные задачи Ситуационная задача 1 Для производства лекарственных средств фармацевтическое предприятие приобрело сырье “цветки бессмертника” и проверило его доброкачественность . Опишите результаты анализа, пользуясь следующим планом: 1. Латинское и русское название сырья, производящего растения и семейства бессмертника. 2. Определения понятия цветки. 3. Запишите химический состав цветков бессмертника, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определения понятию “флавоноиды”. 5. Каким реакциям можно доказать присутствие в сырье флавоноидов? Запишите химизм реакции на примере кемпферола. 6. Перечислите числовые показатели сырья “цветки бессмертника”, укажите их регламентацию (не менее…, не более…). 7. Запишите (в виде таблицы) методику количественного определения в сырье флавоноидов, объясняя каждый ее этап. Укажите, на каких свойствах она основана. 8. Запишите правила хранения цветков бессмертников (группы и условия хранения) 9. Для производства каких лекарственных средств были приобретены цветки бессмертника? Назовите их фармакологическое действие. Ситуационная задача 2 Для производства лекарственных средств фармацевтическое предприятие приобрело сырье “трава горца перечного” и проверило его доброкачественность. Опишите результаты анализа, пользуясь следующим планом: 59 1. Латинское и русское названия сырья, производящего растения и семейства горца перечного. 2. Определения понятия “трава”. 3. Запишите химический состав травы горца перечного, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определение понятию “флавоноиды”. 5. Каким реакциям можно доказать присутствие в сырье флавоноидов? Запишите химизм реакции на примере кверцетина. 6. Запишите (в виде таблицы) методику количественного определения в сырье флавоноидов, объясняя каждый её этап. Укажите, на каких свойствах она основана. 7. Запишите правила хранения травы горца перечного (группа и условия хранения). 8. Для производства какого лекарственного средства была приобретена трава горца перечного? Укажите фармакологическое действие. Ситуационная задача 3 Фармацевтические предприятие для производства рутина прибрело сырье “бутоны софоры японской “ и проверило его доброкачественность. Опишите результаты анализа , пользуясь следующим планом: 1. Латинские и русские названия сырья, производящего растения и семейства софоры японской. 2. Определите понятие ”цветки”. 3. Запишите химический состав бутонов софоры японской, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определение понятия “флавоноиды”. 5. Как можно доказать присутствие сырья рутина? Запишите схему методики. 60 6. Запишите химизм возможных реакций рутина с хлоридом алюминия и “цианидиновой реакции”. 7. Перечислите числовые показатели сырья “бутоны софоры японской”, и укажите их регламентацию (не менее…, не более…). 8. Запишите (в виде таблицы) методику количественного определения в сырье рутина, объясняя каждый ее этап. Укажите, на каких свойствах она основана. 9. Запишите правила хранения сырья (группа и условия хранения). 10.Укажите фармакологическое действие рутина. Ситуационная задача 4 Аналитическая лаборатория фармацевтического предприятия провела анализ сырья “трава пустырника” и подтвердила его доброкачественность. Опишите результаты анализа, пользуясь следующим планом: 1. Латинские и русские названия сырья, производящих растений и семейства пустырника. 2. Определите понятие ”трава”. 3. Запишите химический состав пустырника, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определение понятию “флавоноиды”. 5. Каким реакциям можно доказать присутствие в сырье флавоноидов? Запишите химизм реакции на примере апигенина. 6. Какими реакциями можно доказать присутствие в сырье флавоноидов? Запишите химизм реакции на примере апигенина. 7. Как по НД доказывается присутствие в сырье пустырника иридоидов? 8.Перечислите числовые показатели сырья «трава пустырника», укажите их регламентацию (не менее..., не более...). 9 Что такое «экстрактивные вещества»? Запишите методику определения экстрактивных веществ. 61 10. Запишите (в виде таблицы) возможную методику количественного определения в сырье флавоноидов, объясняя каждый ее этап. Укажите, на каких свойствах она основана. 11. Запишите правила хранения травы пустырника (группа и условия хранения). 12. Для производства каких лекарственных средств была приобретена трава пустырника? Назовите их фармакологическое действие. Ситуационная задача 7 Для производства лекарственных средств фармацевтическое предприятие приобрело сырье «плоды боярышника» и проверило его доброкачественность. Опишите результаты анализа, пользуясь следующим планом: 1.Латинское и русское названия сырья, производящего растения и семейства боярышника. 2.Определение понятия «плоды». 3.Запишите химический состав плодов боярышника, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определение понятию «флавоноиды». 5. Какими реакциями можно доказать присутствие в сырье флавоноидов. Запишите химизм реакции на примере гиперозида. 6. Как по ГФ XI доказывается присутствие в сырье гиперозида? Запишите схему методики. 7. Перечислите числовые показатели сырья «плоды боярышника», укажите их регламентацию (не менее..., не более...). 8. Запишите (в виде таблицы) методику количественного определения в сырье флавоноидов, объясняя каждый ее этап. Укажите, на каких свойствах она основана. 9. Запишите правила хранения плодов боярышника (группа и условия хранения). 62 10.Для производства каких лекарственных средств были приобретены плоды боярышника? Назовите их фармакологическое действие. Ситуационная задача 8 Аналитическая лаборатория фармацевтического предприятия провела анализ сырья «трава зверобоя» и подтвердила его доброкачественность. Опишите результаты анализа, пользуясь следующим планом: 1. Латинское и русское названия сырья, производящих растений и семейства зверобоя. 2. Определение понятия «трава». 3. Запишите химический состав травы зверобоя, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определение понятию «флавоноиды». 5. Какими реакциями можно доказать присутствие в сырье флавоноидов? Запишите химизм реакции на примере рутина. 6. Перечислите числовые показатели сырья «трава зверобоя», укажите их регламентацию (не менее... не более...). 7. Запишите (в виде таблицы) методику количественного определения в сырье флавоноидов, объясняя каждый ее этап. Укажите, на каких свойствах она основана. 8. Запишите правила хранения травы зверобоя (группа и условия хранения). 9. Для производства каких лекарственных средств была приобретена трава зверобоя? Назовите их фармакологическое действие. Ситуационная задача 9 Фармацевтическое предприятие приобрело сырье «трава сушеницы» и подтвердила его доброкачественность. Опишите результаты анализа, пользуясь следующим планом: 1. Латинское и русское названия сырья, производящего растения и семейства сушеницы топяной. 63 2. Определение понятия «трава». 3.Запишите химический состав травы сушеницы, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определение понятию «флавоноиды». 5. Можно ли использовать реакцию с хлоридом алюминия для доказательства присутствия в сырье флавоноидов (на примере гнафалозида)? 6. Перечислите числовые показатели сырья «трава сушеницы», укажите их регламентацию (не менее..., не более...). 7. Запишите (в виде таблицы) методику количественного определения в сырье флавоноидов. Объясняя каждый ее этап. Укажите, на каких свойствах она основана? 8. Запишите правила хранения травы сушеницы (группа и условия хранения). 9.Укажите фармакологическую группу, к которой относится данное сырье, пути использования. Ситуационная задача 10 Фармацевтическое предприятие приобрело сырье «трава горца птичьего» и подтвердила его доброкачественность. Опишите результаты анализа, пользуясь следующим планом: 1. Латинское и русское названия сырья, производящего растения и семейства горца птичьего. 2. Определение понятия «трава». 3. Запишите химический состав травы горца птичьего, формулу основного соединения и укажите группу по классификации, к которой оно относится. 4. Дайте определение понятию «флавоноиды». 5. Какими реакциями можно доказать присутствие в сырье флавоноидов? Запишите химизм реакции на примере авикулярина. 6. Перечислите числовые показатели сырья «трава горца птичьего», укажите их регламентацию (не менее..., не более...). 64 7. Запишите (в виде таблицы) методику количественного определения в сырье флавоноидов, объясняя каждый ее этап. Укажите, на каких свойствах она основана. 8. Запишите правила хранения травы горца птичьего (группа и условия хранения). 9. Укажите фармакологическую группу, к которой относится данное сырье, пути использования, препараты. 65 Список литературы 1. Георгиевский В.П., Комисаренко Н.Ф., Дмитрук С.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений. – Новосибирск: Наука: Сибирское отделение. – 1999. – с. 333. 2. Государственная фармакопея СССР XI, вып. 1. – Москва: Медицина, 1987. – с. 336. 3. Государственная фармакопея СССР XI, вып. 2. – Москва: Медицина, 1990. – с. 400. 4. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов. – Самара: ООО «Офорт», ГОУВПО «Сам ГМУ», 2004. – 1180с. 5. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия: Учебное пособие / Я 47 Под ред. Г.П. Яковлева и К.Ф. Блиновой. – Спб.: Спец. Лит, 2004. – 765с.; ил. 6. Лекарственные растения Государственной Фармакопеи. Фармакогнозия. – Москва: АНМИИ, 1999г. – 534с. 7. Максютина Н.П., Литвиненко В.И. Методы выделения и исследования флавоноидных соединений. – М.: Фенольные соединения и их биологическая функция, 1968. – с. 81-82. 8. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии: Учебное пособие / Под ред. И.А. Самылиной, А.А. Сорокиной. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – 672с. 66 Содержание 1 Химическая классификация флавоноидов 3 2 Биосинтез флавоноидов 14 3 Физико-химические свойства флавоноидов 18 4 Методы выделения флавоноидов 19 5 Методы идентификации флавоноидов 20 5.1 Химические реакции и хроматография 5.2 УФ-спектроскопия 21 28 5.3 ИК-спектроскопия 30 5.4 ЯМР-спектроскопия 31 6 Стандартизация лекарственного растительного фитопрепаратов, содержащих флавоноиды сырья и 32 7 Лекарственное растительное сырье Государственной Фармакопеи, содержащее флавоноиды 35 8 Тестовые задания 52 9 Ситуационные задачи 59 10 Список литературы 66 11 Содержание 67 67
