ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА КЛЕТКИ ПАВЛОВА СОФЬЯ ФБЭ 3 КУРС 1 ГРУППА Виды излучений Ионизирующие излучения делят на: • Электромагнитные излучения К электромагнитным излучениям относят рентгеновское и гамма-излучения • Корпускулярные излучения Корпускулярные излучения представляют собой потоки заряженных частиц: бета-частицы (электроны и позитроны); ядра атомов водорода (протоны), дейтерия (дейтроны), гелия (альфа-частицы) и других химических элементов; ядерные частицы, не имеющие заряда, — нейтроны, а также многие нестабильные частицы. Неионизирующие излучения — более низкочастотные и, соответственно, более длинноволновые излучения. К ним относятся ультрафиолетовое, видимый свет, инфракрасное, микроволновое, радиочастотное и низкочастотные излучения. Все виды излучений способны при действии на молекулы прямо или косвенно вызывать ионизацию и образование активных радикалов, которые могут инициировать окислительные свободнорадикальные процессы в клетках. Так как энергия ионизирующих излучений всегда превышает энергию межмолекулярных и внутримолекулярных связей, в природе не существует объектов, не подверженных действию ионизирующих излучений. ОБЩИЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА КЛЕТКУ Наиболее чувствительными к облучению органеллами клеток организма млекопитающих являются ядро и митохондрии. Повреждения этих структур наступают при малых дозах и проявляются в самые ранние сроки. Изменения в структуре митохондрий обнаруживаются уже через 1 час после облучения дозой 1 Грей. Эти изменения проявляются: • набуханием митохондрий, деструкцией крист и просветлением матрикса • Повреждением мембраны митохондрий, проявляющиеся прежде всего в резком угнетении процессов окислительного фосфорилирования. • изменения физико-химических свойств нуклеопротеидных комплексов, в результате чего происходят количественные и качественные изменения ДНК, а также разобщается процесс синтеза белка. В ядрах радиочувствительных клеток почти сразу после облучения: • угнетаются энергетические процессы, ионы натрия и калия выбрасываются в цитоплазму, нарушается нормальная функция мембран • возможны разрывы хромосом, выявляемые в период клеточного деления, хромосомные аберрации и точечные мутации, в результате которых образуются белки, утратившие свою нормальную биологическую конформацию и активность. Этапы радиационного поражения клетки Первый этап: Физическая стадия лучевого воздействия на клетку Излучение воздействует на сложные макромолекулярные образования, ионизируя и возбуждая их. При поглощенной дозе фотонного излучения 10 Гр в клетке образуется до 3 х 106 ионизированных и возбужденных молекул. При этом в ядре должно возникнуть около 9х105 активных центров, в каждой митохондрии - 9 х 102 центров, в эндоплазматическом ретикулуме - 4,5 х 105 и в каждой лизосоме - около 2 х 102 активных центров. На эти процессы прямого воздействия расходуется до 80% поглощенной энергии. Кроме того, от 25 до 50% образовавшихся в результате радиолиза воды радикалов реагируют с макромолекулами клетки. Поглощенная энергия может мигрировать по макромолекулам, реализуясь в слабых местах. В белках, вероятно, это SН-группы, в ДНК - хромофорные группы тимина, в липидах - ненасыщенные связи. Этапы радиационного поражения клетки Второй этап: Химическая стадия лучевого воздействия на клетку Химические преобразования, соответствующие процессам взаимодействия радикалов белков, нуклеиновых кислот и липидов с водой, кислородом, радикалами воды и биомолекулами, а также возникновению органических перекисей, вызывающих быстро протекающие реакции окисления, которые приводят к появлению множества измененных молекул. В результате этого начальный эффект многократно усиливается. Радикалы, появляющиеся в слоях упорядоченно расположенных белковых молекул, взаимодействуют с образованием сшивок, в результате чего нарушается структура биологических мембран. Повреждение мембран приводит к высвобождению ряда ферментов. Вследствие повреждения лизосомных мембран увеличивается активность ДНКазы, РНКазы, катепсинов, фосфатазы и ряда других ферментов. Этапы радиационного поражения клетки Третий этап: Биохимическая стадия лучевого воздействия на клетку Нарушения, наступающие в результате высвобождения ферментов из клеточных органелл и изменения их активности, соответствуют биохимическому этапу лучевого поражения клетки. Высвободившиеся ферменты путем диффузии достигают любой органеллы клетки и легко проникают в нее благодаря увеличению проницаемости мембран. Под воздействием этих ферментов происходит распад высокомолекулярных компонентов клетки, в том числе нуклеиновых кислот и белков. РЕАКЦИИ КЛЕТОК НА ИОНИЗИРУЮЩЕЕ ИЗЛУЧЕНИЕ Различают два вида гибели клеток вследствие облучения: • Интерфазная гибель – это гибель клетки до вступления её в фазу митоза, в большинстве случаев в первые часы после облучения. Этот тип гибели характеризуется расстройством всей метаболической организации клетки, является или выражением высокой радиочувствительности клетки или следствием воздействия большой дозы излучения. • Митотическая гибель (репродуктивная, пролиферативная) – возникает вследствие инактивации клетки, наступающей после облучения и после первого или последующих митозов. Поэтому даже при воздействии облучения в больших дозах этот вид гибели может проявляться через отдалённый период времени (до нескольких суток). РЕАКЦИИ КЛЕТОК НА ИОНИЗИРУЮЩЕЕ ИЗЛУЧЕНИЕ В поражённых клетках выявляются физикохимические изменения: повышение проницаемости клеточных оболочек, изменение вязкости и гидрофильности цитоплазмы. Происходят и морфологически определяемые сдвиги: слипание, набухание, разрыв с последующей утратой части хромосом или неправильным воссоединением концов, изменения микросом и лизосом, увеличение ядра и изменение его формы и размеров клеток, вакуолизация цитоплазмы. РЕАКЦИИ КЛЕТОК НА ИОНИЗИРУЮЩЕЕ ИЗЛУЧЕНИЕ При облучении в дозах, принятых в лучевой терапии, не во всех клетках создаются условия, ведущие к их гибели. Наряду с клетками, находящимися в таком состоянии, что нанесённые лучевые повреждения оканчиваются их гибелью, имеются: • Облученные клетки, в которых изменения сами по себе не приведут клетку к гибели, но при повторном облучении проявятся в виде лучевого поражения клетки – сублетальные повреждения. • Лучевые изменения в клетках, при которых эффект воздействия реализуется в разной степени при определённых условиях – потенциальные повреждения. При этом клетки могут либо восстановиться, либо повреждения появятся только при определённых условиях. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ Ионизирующие излучения способны вызывать все виды наследственных перемен или мутаций. К ним относятся геномные мутации, хромосомные мутации или хромосомные аберрации – структурные и численные изменения хромосом, и генные (точковые) мутации. Спектр мутаций, индуцированных ионизирующими излучениями, не отличается от спектра спонтанных мутаций. Радиоиндуцированные хромосомные аберрации Тип хромосомных аберраций в значительной степени обусловлен фазой клеточного цикла, на котором находилась клетка в момент облучения. При облучении клеток на стадии G0 – G1 клеточного цикла наблюдают аберрации хромосомного типа. Наиболее характерными среди них являются так называемые обменные хромосомные аберрации, а именно дицентрические и кольцевые хромосомы, образующиеся в результате неправильного воссоединения двунитевых разрывов ДНК. Такие хромосомы, как правило, имеют фрагмент, не содержащий центромеры, хромосомный ацентрический фрагмент. Радиоиндуцированные хромосомные аберрации • Дицентрические хромосомы (дицентрики) – редкий тип аномальной хромосомы с потерей ацентрических фрагментов, когда два хромосомных сегмента из разных хромосом или из двух хроматид одной хромосомы (каждый с центромерой) соединяются конец в конец. Дицентрические хромосомы, несмотря на две центромеры, могут быть стабильными, если одна из двух центромер инактивирована или если центромеры в анафазе координируют свое перемещение к одному и тому же полюсу. Такие хромосомы формально называют псевдодицентрическими. Наиболее часто псевдодицентрики состоят из половых или акроцентрических хромосом. Радиоиндуцированные хромосомные аберрации • Кольцевая хромосома – замкнутая двухцепочечная молекула ДНК, естественная структура хромосом у многих прокариот, некоторых вирусов, а также молекул ДНК, входящих в состав пластид и митохондрий эукариот. Кольцевые хромосомы могут также быть результатом структурной хромосомной аберрации, появляющейся в результате мутаций. Мелкие кольцевые хромосомы могут образовываться при фрагментациях хромосом. Радиоиндуцированные хромосомные аберрации Если облучение вызвало появление двунитевого разрыва ДНК в участке хромосомы, уже прошедшем удвоение в процессе репликации в S-фазе клеточного цикла, то это может привести к образованию аберраций хроматидного типа. Наиболее типичными аберрациями хроматидного типа являются: • Тетрарадиалы – это обменные аберрации, возникающие в процессе неправильного соединения двух двунитевых разрывов ДНК, находящихся на хроматидах разных хромосом. • Хроматидные фрагменты – это нерепарированный двунитевый разрыв ДНК. Радиационно-индуцированные генные мутации Полагают, что в других случаях вызванные ионизацией менее крупные внутримолекулярные перестройки влекут за собой подлинные генные мутации – такие внутримолекулярные перестройки групп атомов, которые не вызывают изменений структуры хромосомы. Энергия излучения поглощается, по-видимому, не только в хромосомах, но и в окружающей их среде, что может вызвать химические изменения, которые в свою очередь вызывают генные мутации или фрагментацию хромосом. Генные (точковые) мутации – это изменения числа и (или) последовательности нуклеотидов в структуре ДНК в пределах отдельных генов, приводящие к изменению количества или качества соответствующих белковых продуктов. Радиационно-индуцированные генные мутации Замены оснований приводят к появлению трех типов мутантных кодонов: • С измененным смыслом (миссенс-мутации) В результате миссенс-мутации в кодируемом данным геном полипептиде одна аминокислота замещается на другую, поэтому фенотипическое проявление мутации зависит от функциональной значимости затронутого домена. Так замены аминокислот в активных центрах белков могут сопровождаться полной потерей их функциональной активности. Однако не всякая замена аминокислоты отразится на функциональной активности белка, вследствие чего прозошедшая мутация может остаться не выявленной. Кроме того, в силу вырожденности генетического кода не всякая замена основания приведет к миссенс-мутации. Радиационно-индуцированные генные мутации • С неизмененным смыслом (нейтральные мутации) Замены нуклеотидов в кодирующих областях генов, не сопровождающиеся заменами аминокислот в силу вырожденности генетического кода, приводят к нейтральным мутациям, не оказывающим заметного влияния ни на функцию соответствующего белка, ни на его структуру. • Бессмысленные (нонсенс-мутации) В результате нонсенс-мутации кодон, определяющий какую-либо аминокислоту, превращается в один из стоп-кодонов, не транслирующихся на рибосомах. Появление такого кодона не в конце структурного гена, а внутри него приводит к преждевременной терминации трансляции и обрыву полипептидной цепи. Нонсенс-мутации обладают наибольшим повреждающим действием, так как образующиеся при преждевременной терминации трансляции белки не способны к модификации, часто не защищены от действия протеолитических ферментов и быстро деградируют. Радиационно-индуцированное повреждение ДНК Радиационно-индуцированное повреждение ДНК может быть: 1. Прямое повреждение приводит к возникновению положительно-заряженного радикала, электрона и электронновозбужденной молекулы ДНК. 2. Непрямое повреждение ДНК приводит к радиолизу воды, которая, в зависимости от типа клетки и стадии ее роста и развития, может составлять до 90% массы клетки. В результате ионизации молекулы воды могут образоваться: • свободные радикалы гидроксила (НО·) • свободные радикалы водорода (Н·) • гидратированный электрон (eгидр) Радиационно-индуцированное повреждение ДНК Эти радикалы в дальнейшем могут вступить во взаимодействие с возбужденной молекулой воды и кислородом тканей, дополнительно образуя активные формы кислорода (АФК). В результате оксидативного повреждения ДНК могут образовываться: • сайты с выпавшими нуклеотидами одной из комплементарных цепей ДНК • модифицированные основания • деструкция дезоксирибозы в нуклеотидах • появление одно- и дву- нитевых разрывов ДНК • сшивки ДНК / белок, играющие существенную роль при считывании генетической информации и при редупликации ДНК повреждение выпадение однонитевой разрыв двунитевой разрыв комплексное повреждение Радиационно-индуцированное повреждение ДНК При хроническом воздействий дополнительных доз ионизирующего излучения с низкой ЛПЭ вероятность возникновения радиационноиндуцированных двухцепочечных разрывов относительно других типов изменения ДНК в 104 раз выше, чем индуцированных эндогенно. При этом плотноионизирующие излучения (например, α-частицы) вызывают более сложные и тяжелые репарируемые нарушения, чем редкоионизирующие излучения (жесткий ультрафиолет, рентгеновские и гамма-лучи). Такие локальные кластеры повреждений ДНК могут состоять из нескольких разрывов или групп модифицированных оснований, расположенных на близком расстоянии друг от друга. В этом случае ферменты репарации уже не в состоянии гарантированно справляться со своей задачей. Радиационно-индуцированное повреждение ДНК Двунитевые разрывы являются первичными молекулярными событиями, ведущими к гибели клетки, а их количество, как правило, коррелирует с выраженностью цитотоксического эффекта ионизирующего излучения. Ошибочная репарация двунитевых разрывов может привести к хромосомным обменам, в результате которых формируются нестабильные дицентрические хромосомы или ацентрические хромосомные фрагменты, ведущие преимущественно к снижению жизнеспособности клетки-носительницы, а также к формированию сбалансированных транслокаций, основная угроза которых связана с последующим возможным озлакочествлением клетки-носительницы за счет запуска онкогенного каскада генов вследствие перераспределения генетического материала. Для устранения двунитевых разрывов ДНК в клетке существуют механизмы гомологичной рекомбинации и негомологичного воссоединения разорванных концов. Выбор клеткой того или иного способа репарации зависит и от стадии клеточного цикла. Радиационно-индуцированное повреждение ДНК • Гомологичная рекомбинация происходит преимущественно на стадии G1, гомологичная рекомбинация – на стадиях S и G2. Поскольку гомологичная рекомбинация использует участки ДНК с полной гомологией на протяжении нескольких сотен нуклеотидов, ее отличительной чертой является безошибочность, т.е. восстановление первоначальной последовательности ДНК в сайте разрыва идет достаточно эффективно. • Негомологичное воссоединение, напротив, полностью игнорирует принцип гомологии и поэтому само может являться источником ошибок, что проявляется в изменениях последовательности нуклеотидов в сайте репарации и, как следствие, ведет к закреплению мутационного события в геноме, либо стимулирует экспрессию эпигеномной изменчивости. Обычно этот механизм ведет к образованию микроделеций или инсерций в сайте разрыва, реже – к крупным хромосомным перестройкам. Суммируя приведенную выше информацию, можно констатировать, что конечный продукт радиационного мутагенеза обусловлен противодействием двух процессов: повреждения и репарации ДНК. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ Облучение клеток приводит к задержке их прохождения через G1-, S- и G2-фазы клеточного цикла. Это происходит вследствие активации контрольных точек, узнающих повреждение ДНК. Контрольные точки представляют определенные моменты в клеточном цикле, активируя которые можно блокировать или замедлить вхождение клеток в следующую фазу. В ответ на облучение в различные моменты цикла процессы репарации активируют четыре контрольные точки. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ Продвижение по циклу клетки, находящейся в G1-, S-, G2- или М-фазе, происходит за счет действия циклинзависимых киназ (Cdks). Эти киназы фосфорилируют различные белки и запускают процесс, необходимый для прохождения клетки по циклу. Cdk активна только в том случае, когда она связана со своим партнером – циклином, но для активации контрольных точек комплексы циклин-Cdk должны быть заингибированы. В случае облучения это достигается двумя путями: 1. Первый путь включает активацию определенных белков, непосредственно ингибирующих комплекс циклин-Cdk. Это ингибиторы циклинзависимой киназы (CDKIs). 2. Второй путь состоит в изменении степени фосфорилирования и активности самого фермента Cdk. Активность определенных Cdk часто находится под контролем фосфорилирования, и та или иная киназа может быть активной в фосфорилированном или дефосфорилированном состоянии. G1-блок клеточного цикла Контрольная точка, расположенная между G1- и S-фазами цикла, играет существенную роль в принятии клеткой решения перейти к делению. Она зависит от присутствия ростовых факторов, источников питания и других компонентов, обеспечивающих пролиферацию. Переход от G1- к S-фазе находится под контролем фактора транскрипции. Этот фактор регулирует активность многих генов, продукты которых участвуют в инициации репликации ДНК в S-фазе, и в течение G1-периода он поддерживается в неактивном состоянии за счет связывания с белком ретинобластомы (Rb). Облучение приводит к предотвращению фосфорилирования Rb и перехода клетки в S-фазу. Контрольная точка в S-фазе В клетках, находящихся в момент облучения в S-фазе, наблюдается фосфорилирование Cdk-киназы, а так же зависимое от дозы снижение скорости синтеза ДНК, в результате которого общая продолжительность репликативного периода существенно увеличивается. неактивен активен дефосфорилирование фосфорилирование Контрольная точка в G2-фазе Контрольная точка в G2-фазе напоминает точки в S-фазе, однако она активируется большими дозами излучения и совершенно другим типом повреждений в ДНК. Эта точка не активируется двунитевыми разрывами, и функционирование ее запускается повреждениями, которые сохраняются после завершения в ДНК репаративных процессов. ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ Во множестве участков мембран излучение инициирует цепную автокаталитическую реакцию перекисного окисления липидов. В итоге при облучении в достаточно высоких дозах происходит деградация мембран и связанных с ними ферментных ансамблей, высвобождение ферментов из мест их специфической локализации со сдвигом обмена веществ в сторону катаболизма. Но главное последствие – генерация сигналов для системы проведения сигналов от рецепторов к генетическому аппарату клетки. В качестве таких сигналов могут выступать: факторы роста, воспалительные цитокины, факторы стресса: АФК-О·2, Н2О2, ОН·, NO·. ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ Облучение от естественного радиационного фона в дозе 0,1 Гр/год приводит к приросту мутаций на 7-10 на клетку в сутки. Но реализация повреждающего действия АФК, продуцируемых метаболически при нерадиационных воздействиях и возникающих в радиационно-химических реакциях, имеет определенные различия, состоящие в том, что антиокислительная защита всегда стоит барьером на пути обменных радикалов (образующихся в цитоплазме) к органоидам клетки. ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ • При нерадиационных воздействиях АФК возникают в структурах цитоплазмы и, мигрируя, оказывают повреждающее действие и на близлежащие мембранные структуры, и на органоиды в целом, а также на ядро, когда противостоящая им антиоксидантная защита оказывается неэффективной. Это приводит к локальной дезорганизации клеточного метаболизма и может вызывать повреждения в генетическом материале, деградацию мембран, аберрации хромосом и генные мутации. Однако никогда не возникает всплеска клеточной гибели путем апоптоза и следующей за ним клинической картины, характерной для лучевой болезни. • При действии ионизирующей радиации свободные радикалы, включая АФК, возникают во всем облучаемом объеме клетки – как в органоидах, так и в цитоплазме. Уже в момент облучения более половины радиационно-обусловленных АФК оказывается за антиоксидантным барьером и, находясь на более коротких расстояниях, чем метаболические АФК, от критических мишеней, взаимодействует с наиболее радиочувствительными биомолекулами, успевая реализовать повреждающее действие в органоидах еще до вступления в реакции с системой антиокислительной защиты. Поэтому даже на фоне активации сигнальных каскадов, организующих ответ клеток на повреждение, наблюдаемый радиобиологический эффект оказывается зависимым от дозы облучения. ВЕРОЯТНОСТНАЯ МОДЕЛЬ РАДИАЦИОННОГО ПОРАЖЕНИЯ КЛЕТКИ По Ю.Г. Капульцевичу процесс радиационного поражения клетки делится на три этапа: • l этап – осуществление событий попадания, в результате которых формируются первичные потенциальные повреждения • ll этап – реализация потенциальных повреждений • lll этап – различные вторичные нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, вызываемые реализацией повреждений. Повидимому, на этом этапе возможно восстановление клеток от последствий реализованных повреждений или их компенсация, поэтому вероятность проявления реализованного повреждения не равна единице. Она зависит от биологических особенностей клетки. Однако анализ реакций клеток на облучение не позволят выявить природу повреждений, лежащих в основе данных реакций. ВЫВОД Под влиянием повреждающего агента возникают однотипные изменения, включающие нарушение мембранного транспорта и соответствующих градиентов концентрации низкомолекулярных соединений, которые локально накапливаются в компартментах клеток, сорбируются на макромолекулах и изменяют их конформационную подвижность. В итоге может наступить состояние паранекроза, обратимое при умеренно повреждающих воздействиях. При этом изменяется соотношение скоростей конкурирующих между собой процессов реализации и репарации «скрытых повреждений» в уникальных структурах, ответственных за гибель клеток.
