Лекция 3.3. Микроклональное размножение растений Микроклональное размножение (или клональное микроразмножение) – это использование техники in vitro для быстрого получения неполовым путем растений, идентичных исходному. Свое название эта технология получила от термина «клон» (от греч. clon – отпрыск), который предложил Г. Веббер в 1903 году. По сути микроклональное размножение аналогично вегетативному типу размножения растений с той лишь разницей, что оно протекает «в пробирке» в условиях in vitro, где из клеток изолированных тканей в итоге можно получить достаточно большое количество растений. Асептические условия и соответствующие питательные добавки позволяют в случае необходимости уменьшить размер экспланта до нескольких миллиметров. В основе получения таких растений лежит уникальное свойство растительной клетки – тотипотентность. Тотипотентность – это способность клетки реализовывать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма. Тотипотентность присуща оплодотворенной яйцеклетке растений и животных. Что же касается дифференцированных клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. У высших животных с началом специализации клеток, т.е. уже начиная с ранних этапов эмбриогенеза, тотипотентность не реализуется. От тотипотентности зависит способность к регенерации взрослых растений из трансформированных клеток. Отдельные ткани одного и того же вида, виды и даже сорта растений могут отличаться по способности к регенерации. Тотипотентность хорошо выражена в клетках двудольных растений, таких как табак, картофель, свекла, соя, рапс, люцерна, томаты, морковь, капуста, некоторых плодовых. Напротив, получить регенерацию трансгенных растений из клеток большинства бобовых, перца, баклажана крайне тяжело. У однодольных, особенно злаков, свойство тотипотентности клеток выражено гораздо слабее, в связи с чем процесс регенерации клеток в целое растение затруднён. В настоящее время разработаны методики регенерации трансформированных клеток основных зерновых культур, таких как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. В настоящее время число видов растений, которые можно клонировать in vitro уже составляет около одной тысячи. Хотя метод микроклонального размножения растений является довольно трудоемким и затратным, в ряде случаев на его основе уже стало возможным создавать экономически рентабельные технологии. Клональное микроразмножение имеет существенные преимущества перед традиционными способами размножения: высокий коэффициент размножения (105–106 – для травянистых цветковых растений, 104–105 – для кустарниковых и древесных, 104 – для хвойных). Одно растение герберы за год при микроклональном размножении даёт до 1 млн новых растений, тогда как при обычных способах размножения только 50-100 растений. Большинство культивируемых в настоящее время сортов лилий размножается только вегетативно. Луковички возникают на материнских луковицах или на побеге в небольших количествах, также возможно размножение чешуями. Микроклональная технология позволяет получить за 6 месяцев до 105 новых растений. возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала; получение генетически однородного посадочного материала; освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; сокращение продолжительности селекционного процесса; получение растений, трудно размножаемых традиционными способами; возможность автоматизации процесса выращивания. Области применения клонального микроразмножения разнообразны и имеют тенденцию к расширению: в селекции для поддержания и размножения растений с уникальными генотипами; для быстрого размножения новых и уже существующих сортов; для массового получения оздоровленного посадочного материала у растений, подверженных вирусным заболеваниям; для быстрого размножения некоторых гетерозиготных садовых культур, обычно размножающихся семенами и расщепляющихся при скрещивании; для быстрого клонального размножения in vitro лучших экземпляров взрослых древесных растений, разведение и селекция которых осуществляется медленно вследствие длительности процесса полового размножения; для сохранения редких и исчезающих видов. Обязательное условие клонального микроразмножения – использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса (от экспланта до растений в поле). Такому требованию удовлетворяют меристематические ткани: апексы, пазушные почки стеблей, адвентивные почки корней, стеблей и листьев. Их устойчивость к генетическим изменениям, вероятно, связана с высокой активностью систем репарации ДНК, а также с негативной селекцией изменённых клеток. Типы и методы клонального микроразмножения Н. В. Катаева и Р. Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения: 1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля). 2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo. Существует много методов клонального микроразмножения. Наиболее распространенной является классификация, согласно которой микроклональное размножение может осуществляться за счет: 1) активации развития уже существующих в растении меристем – апекса стебля, пазушных и спящих почек, интеркалярных зон стебля (рис. 1, схема 1). Относится к первому типу клонального микроразмножения; Все остальные методы относятся ко второму типу клонального микроразмножения: 2) индукции адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте (рис. 1, схема 2); 3) индукции соматического эмбриогенеза в каллусе и суспензионной культуре (рис. 1, схема 3); 4) индукции адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях (рис. 1, схема 4). 5) микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доминирование; 6) стимуляция образования микроклубней и микролуковичек. Рисунок 1. Схемы клонального микроразмножения растений: 1 – активация развития меристемы; 2 – образование адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте; 3 – индукция соматического эмбриогенеза в каллусе и суспензионной культуре; 4 – образование адвентивных почек в каллусной ткани Рассмотрим эти методы подробнее. 1. Активация развития уже существующих в растении меристем Считается основным методом, использующимся при клональном микроразмножении растений. Метод состоит в снятии апикального доминирования и активизации развития меристем, существующих в растении. Наиболее распространенным вариантом этого метода является активизация пазушных меристем (рис. 2). Снятие апикального доминирования достигается или удалением апикальной меристемы побега, или благодаря действию гормонов цитокининов (цитокинины ‒ класс гормонов растений 6-аминопуринового ряда, стимулирующих деление клеток (цитокинез)), наносимых на пазушные почки. При клонировании цитокинины (6-бензиламинопурин (БАП), 6фурфуриламинопурин, зеатин) добавляют в питательную среду, что приводит к развитию многочисленных пазушных побегов. Обычно из экспланта за 4-8 недель развивается пучок (кластер) побегов. Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков. Для полноценного развития побегов их разделяют и переносят на питательную среду с новым составом. Рисунок 2. Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А. Р. Родину, Е. А. Калашниковой, 1993): 1 – путем удаления верхушечной меристемы: 2 – добавлением цитокининов в среду (б/г – среда без гормонов, Ц – цитокинин, А – ауксин) С момента введения в культуру до высадки растений в открытый грунт может проходить большое время, но этап мультиразмножения на среде с фитогормонами желательно сокращать для снижения риска возникновения аномалий развития. В наиболее критичных случаях растения теряют способность к укоренению, а иногда погибают. В опытах с размножением земляники было показано, что при микроклональном размножении необходимо чередовать 2-3 цикла получения побегов с их укоренением. В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала технических (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощных культур (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.). Для некоторых сельскохозяйственных культур, таких, как картофель, технология клонального микроразмножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих в растении меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 105 растений в год. 2. Индукция адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте Метод заключается в стимулировании развития придаточных (адвентивных) почек из растительных клеток и тканей, которые их обычно не образуют. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и, таким образом, регенерировать целые растения. Эта способность в значительной мере обусловлена тотипотентностью растительных клеток. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Процесс образования адвентивных почек вызывают внесением в питательную среду растительных гормонов: цитокининов и ауксинов с преобладанием первых. Соотношение поддерживают на уровне от 10:1 до 100:1. В качестве ауксина используют индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или нафтилуксусную кислоту (НУК). Адвентивные почки могут формироваться из предварительно полученной каллусной массы и тогда этот прием выделяют в отдельный вариант технологии (не совсем желательной из-за повышения риска генетических перестроек). Почки возникают в любом месте, кроме апикальной или пазушной меристемы. Такой путь обеспечивает более быстрое размножение, однако повышает вероятность мутаций. Этот метод широко используется для размножения следующих растений: луковичных цветочных растений (нарциссы, лилии, гиацинт, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуй, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представителей рода Brassicа (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) из сегментов гипокотиля, семядолей, листьев; лука и чеснока из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томатов из апикальных или пазушных меристем; салата цикорного из сегментов листовых пластинок; петуний из сегментов корней; глоксиний, фиалок из сегментов листовых пластинок, древесных растений из изолированных зрелых и незрелых зародышей. 3. Индукция соматического эмбриогенеза в каллусе и суспензионной культуре Образование соматических зародышей основано на соматическом эмбриогенезе – на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши. Впервые это явление было отмечено в середине 50-х годов XX века в культуре клеток моркови. В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток (рис. 3). Рисунок 3. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани Формирование эмбриоидов в культуре осуществляется в два этапа. На первом этапе соматические клетки дифференцируются в эмбриональные в присутствии ауксинов, обычно это 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4Д). На следующей стадии развиваются эмбриоиды. Процесс проходит только при значительном снижении концентрации ауксина или полном отсутствии его в питательной среде. Соматический эмбриогенез может происходить в тканях первичного экспланта, в каллусной или суспензионной культуре. Манипулируя составом среды, можно добиваться формирования придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (проводить деление первичных эмбриоидов). Поскольку соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растения, данный метод позволяет сократить затраты, связанные с подбором условий укоренения и адаптации растенийрегенерантов. Кроме того, преимущество получения соматических эмбриоидов в том, что при использовании соответствующей техники капсулирования из них можно получать искусственные семена. Это весьма перспективная технология на основе культуры ткани. Искусственные семена представляют собой соматические зародыши, инкапсулированные в подходящем материале (например, альгинате натрия) и покрытые оболочкой для защиты от высыхания. Пока система искусственного семеноводства только разрабатывается, но ожидают, что в недалеком будущем она сможет конкурировать с традиционным семеноводством для быстрого размножения элитных растений, а также размножения новых линий и сортов. Необходимость создания искусственных семян обусловлена тем, что многие формы, полученные с помощью культуры клеток, не могут быть размножены обычными семенами из-за мейотической нестабильности, которая ведет к потере искомых качеств. В настоящее время соматический эмбриогенез используется для размножения большинства растений из семейств орхидных и рутовых, некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, моркови, винограда, а также некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная) 4. Индукция адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях Образования адвентивных (добавочных) почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий). Стеблевые почки возникают de novo как в эпидермальных, так и супэпидермальных слоях экспланта (рис. 4). Рисунок 4. Регенерация саженца из молодых побегов бамбука: A ‒ каллус, полученный из побегов бамбука; Б ‒ каллус, выращенный на питательной среде; C ‒ позеленение каллуса на среде для индукции побегов; D ‒ молодые побеги бамбука на среде для индукции; E ‒ молодые побеги, растущие в пучках; F ‒ индукция корней у молодых побегов. Метод мало используется для получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на питательную среду наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками. Данный метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность между растениямирегенерантами не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести амариллис, томат, спаржу, некоторые древесные породы. 5. Микрочеренкование доминирование побега, сохраняющего апикальное Растения-регенеранты, полученные любым другим способом, можно черенковать в стерильных условиях, высаживать на свежую питательную среду, укоренять, и адаптировать к полевым условиям либо снова подвергать микрочеренкованию для того, чтобы увеличить количество посадочного материала. Клональное микроразмножение картофеля путем черенкования осуществляется следующим образом. Клубни проращивают 10-15 дней. За это время на них появляются длинные желтоватого цвета побеги с мелкими недоразвитыми листьями – этиолированные побеги. Они сохраняют ювенильные свойства. Стебли разрезают на фрагменты, содержащие одну почку, стерилизуют и помещают на питательную среду. Вскоре сегменты стебля, находящиеся в пробирках, образуют растения, которые размножают черенкованием. Для этого растения вынимают из пробирки и разрезают на сегменты с одним листом и пазушной почкой. Их переносят в пробирки с питательной средой. Из них образуются растеньица, которые можно переносить в почву, где они превращаются в нормальные растения картофеля. Данная технология позволяет выращивать большое количество растений в ограниченном пространстве: каждый лоток может содержать до 500 проростков на квадратный метр. Большинство коммерческих систем микроразмножения растений обеспечивает смешанный тип органогенеза, т. е. образование побегов, как из пазушных, так и из адвентивных почек. Для отдельных культур возможно размножение в результате соматического эмбриогенеза. При многократном пассировании тип органогенеза на той же среде может изменяться (вместо боковых образуются адвентивные почки). Многократное пассирование увеличивает вероятность эпигенетических изменений и мутаций. Возможно и снижение регенерационного потенциала после 7-10-го пассажа. Обычно продолжительность в 10-12 пассажей считают максимальной. Может возникать витрификация (стекловидность побегов), за счёт их избыточной оводненности. В таких случаях нарушается образование хлорофилла, протеинов, снижается жизнеспособность и приживаемость при пересадке; большинство растений гибнут. Один из возможных путей уменьшения оводнённости – снижение концентрации цитокининов в среде и снижение температуры культивирования. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro, а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений. В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, технических, овощных, плодовых и ягодных культур, культур промышленного цветоводства (например, гвоздики), тропических и субтропических растений. Для многих культур технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. 6. Стимуляция образования микроклубней и микролуковичек У клубнеобразующих растений, полученных путем микрочеренкования побегов, можно вызвать образование маленьких клубней (так называемых «микроклубней»). Для этого необходимо поместить пробирочные растения, полученные с помощью методики, рассмотренной выше, на среду специального состава и в особые условия культивирования (рис. 4). Рис. 4. 1 – микрорастение картофеля; 2 – размножение картофеля in vitro; 3 – микроклубни безвирусного картофеля. Этот способ ускоренного размножения картофеля позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100 000 микроклубней в год – ценного безвирусного посадочного материала. Из микроклубней выращивают безвирусный семенной картофель обычного размера, который может использоваться в сельском хозяйстве. По мере роста растениям требуется защита от насекомых-вредителей с целью предотвращения возникновения новых инфекционных заболеваний. Некоторые лилейные растения (Liliaceae s.l.), например, лилии, тюльпаны, рябчики и др. можно размножать микролуковицами. В качестве исходного материала используют части луковичных чешуй размером 5х5 мм. При культивировании на специально подобранных средах на эксплантах происходит образование меристематических очагов, из которых развиваются многочисленные адвентивные микролуковички. Затем их переносят на питательные среды с другим составом для дальнейшего размножения, а затем укореняют. Из одного экспланта можно получить несколько тысяч молодых растений. Рис. 5. Этапы процесса микроразмножения редкого растения рябчика дагана (Fritillaria dagana) из луковичных чешуй: а) исходный материал – луковицы; б) адвентивное побегообразование на части луковичной чешуи на питательной среде; в) стадия размножения адвентивных микролуковичек; г) регенерант Fritillaria dagana, укорененный на питательной среде. Этапы клонального микроразмножения растений Процесс клонального микроразмножения включает в себя следующие этапы: I. Выбор растения донора, изолирование и стерилизация экспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitrо; II. Собственно клональное микроразмножение, осушествляемое одним из перечисленных выше методов; III. Укоренение размноженных микропобегов и образование искусственных семян; IV. Перевод растений-регенерантов в тепличные условия с последующей высадкой в поле. На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. При этом, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасиге и Скуга, а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста (ауксины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объекта. Продолжительность первого этапа – от 1 до 2 месяцев. На втором этапе важно достигнуть получения максимального количества мериклонов. На нём, как и на первом этапе, используют питательную среду Мурасиге-Скуга. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов – ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л. При длительном культивировании растительных тканей в питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к формированию растений с измененной морфологией. Третий этап является наиболее трудоемким, поскольку от него во многом зависит успех клонального микроразножения. На данном этапе, как правило, меняют основной состав среды. Уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей в среде Мурасиге-Скуга, снижают концентрацию сахара до 0,5-1% и полностью исключают цитокинины, оставляя лишь ауксины. В качестве стимулятора корнеобразования используют индолилмасляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК. Укоренение микропобегов проводят двумя способами: выдерживание микропобегов в течение 2-24 часов в стерильном концентрированном растворе ауксина (20-50 мг/л) с последующим их культивированием на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка); культивирование микропобегов в течение 3–4 недель непосредственно на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1-5 мг/л). В последнее время предложен пока еще мало практикуемый метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Четвертый этап ‒ пересадка растений-регенерантов в субстрат ‒ является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений – весна или начало лета. Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90°С в течение 1-2 часов. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20-22°С), освещенностью не более 5 000 люкс и влажностью 6590%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений. Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Растения, выращенные в культуре in vitro, имеют ряд анатомических и физиологических особенностей. Во-первых, у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. В-третьих, для них характерны более мелкие и тонкие листья, слабо развитая кутикула, закрытая проводящая система из элементов ксилемы, тип питания чаще миксо- или гетеротрофный, что может вызвать гибель значительной части растений от недостатка влаги, повышенной температуры и других неблагоприятных факторов. В связи с этим главная задача этапа – акклиматизация в условия in vivo. Важно также контролировать патогены, так как in vivo микрорастения могут инфицироваться бактериями, грибами, вирусами. В качестве дополнительной задачи этого этапа может быть укоренение, если корни слабо развиты. Для успешного решения этих проблем микрорастения пересаживают в теплицы с контролируемыми условиями: высокая относительная влажность, уменьшенная интенсивность света, не слишком влажный субстрат и оптимальная температура. В теплицах для более высокой влажности над растениями помещают полиэтиленовую пленку или применяют туманообразующую установку. Такие условия поддерживают в течение 2-3 недель. Иногда проводят обработку химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания растений. В некоторых случаях целесообразно на третьем и четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими веществами, водой, биологически активными соединениями, а также в защите растений от патогенов. Упрощенный способ адаптации пробирочных растений винограда был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адаптацию проводят прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда дорастают до верха пробирки, используя для этого обеднённую среду культивирования. Возможно также охлаждение дна сосудов. Для предотвращения инфицированности микрорастений используют фунгициды и стерилизацию субстрата. Вопросы для самоконтроля: Вопросы для самоконтроля: 1. Какие способы клонального микроразмножения существуют? 2. В чём преимущества и недостатки размножения с активацией развития адвентивных почек? 3. Какими способами в культуре in vitro снимают апикальное доминирование и зачем? 4. Какой максимальный коэффициент микроклонального размножения может быть получен? 5. Какие нежелательные процессы могут протекать при клональном микроразмножении? Вопросы для самоконтроля: 1. В чём преимущества и недостатки технологии искусственных семян? Почему она до сих пор широко не внедрена? 2. Какие стадии имеет технология получения искусственных семян? 3. Какое строение имеют искусственные семена? Какое значение имеют их составные части? 1. Как пробирочные растения адаптируют к условиям низкой влажности? 2. Каким образом восстанавливают симбиотические отношения корней растений с микроорганизмами? 3. Какие условия среды оптимальны для адаптации пробирочных растений? 4. Какие требования предъявляют к теплицам для адаптации материала из культуры тканей? 5. Какие субстраты используют для пересадки пробирочных растений? Вопросы для самоконтроля: 1. Для чего нужна регенерация in vitro? 2. От каких факторов зависит регенерационная способность? Как пробирочные растения адаптируют к условиям низкой влажности? 2. Каким образом восстанавливают симбиотические отношения корней растений с микроорганизмами? 3. Какие условия среды оптимальны для адаптации пробирочных растений? 4. Какие требования предъявляют к теплицам для адаптации материала из культуры тканей? 5. Какие субстраты используют для пересадки пробирочных растений?
