Лекция №2. Антисмысловые технологии (Antisense technologies) 1. Что такое антисмысловые олигонуклеотиды 2. Мишени антисмысловых олигонуклетидов в клетке 3. Химические модификации - путь решения проблем стабильности, и эффективности действия 4. Взаимодействие с РНК мишенями - выбор последовательности антисмысловых олигонуклеотидов 5. Механизм действия 6. Разрешенные терапевтические препараты на основе антсмысловых олигонуклеотидов Что такое антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) ? Центральная догма молекулярной биологии: DNA RNA Protein database of instructions specific instructions functional product Современное определение: ASOs это одноцепочечные синтетические молекулы ДНК и РНК длиной 12 -25 звеньев, последовательность, которых полностью комплементарна их РНК мишени, что и обеспечивает специфичность их действия. Смысловая последовательность кодирует белок ASOs – осуществляют РНК направленное действие, высокая специфичность которого определяется точностью комплементарных взаимодействий. Что такое антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) ? Центральная догма молекулярной биологии: DNA RNA Protein database of instructions specific instructions functional product Современное определение: ASOs это одноцепочечные синтетические молекулы ДНК и РНК длиной 12 -25 звеньев, последовательность, которых полностью комплементарна их РНК мишени, что и обеспечивает специфичность их действия. Мишени ASOs Смысловая последовательность кодирует белок NATs (natural antisense transcripts) circRNAs (circular RNA) lncRNAs (long non-coding RNAs) lincRNAs (long intergenic non-coding RNAs) Long enhancer ncRNAs T-UCRs (Transcribed Ultraconserved Regions) мРНК, - традиционная мишень Некодирующие РНК: tRNA (transport RNA) rRNA (ribosomal RNA) miRNAs (microRNAs) (more than 2000 species) endo-siRNAs (endogenous small interfering RNAs) piRNAs (PIWI-interecting RNAs) snoRNAs (small nucleolar RNAs) sdRNAs (sno-derived RNAs) tiRNAs (transcription initiation RNAs) moRNAs (microRNA-offset-RNAs) Транскриптом клетки представлен разнообразными РНК, среди которых, в дополнение в традиционным РНК, вовлеченным в биосинтез белка (мРНК. рРНК, и тРНК), множество различных коротких некодирующих РНК <200 nt) являются участниками или регуляторами различных биологических процессов и могут служить мишенями для ASOs. Это snРНК участвующие в сплайсинге pre-мРНК, snoРНК - процессинг рРНК и модификации, и конечно же микро РНК – miРНК - регуляторы трансляции и стабильности мРНК и длинные некодирующие РНК (lncRNA), а также целый ряд других некодирующих РНК. Что такое антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) ? ASOs - мишенями которых могут служить различные РНК, должны «работать» и в ядре , и в цитоплазме клетки. Это определяет дополнительные требования к структуре ASOs и паттернам их модификации. TF к РНК-мишень выбирается на основе глубокого анализа данных о взаимном влиянии уровней экспрессии определенных РНК на физиологические и патофизиологические процессы, происходящие в клетке/организме. Что такое антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) ? Первая публикация, в которой появился термин антисмысловой олигонуклеотид Stephenson, M. L., & Zamecnik, P. C. (1978). Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. PNAS, 75(1), 285–288. https://doi.org/10.1073/PNAS.75.1.285 Zamecnik and Stephenson впервые использовали 13звенный антисмысловой ДНК-олигонуклеотид комплементарный рибосомной РНК вируса саркомы Рауса для того, чтобы ингибировать трансляцию и предотвратить онкогенную трансформацию куриных фибробластов, инфицированных этим вирусом. Мемориальная золотая доска, врученная в 2000 г. авторам статьи А.М. Беликовой, В,Ф, Зарытовой и Н.И. Гриневой за их пионерскую работу, опубликованную в 1967 г в журнале Tetrahedron, которая является первой в мире публикацией по антисенс технологии, призванной революционизировать лечение вирусных, онкологических и наследственных заболеваний. Основные проблемы, решение которых позволило получить терапевтические препараты на основе ASOs. 1. Устойчивость ASOs к действию нуклеаз, стабильность в биологических средах. 2. Неспецифическое взаимодействие с белками и другими биополимера 3. Прочное связывание с РНК-мишенью 4. Высокая биологическая активность - эффективное снижение уровня РНК-мишени, приводящее в требуемому биологическому эффекту 5. Эффективное накопление в органе/ткани/клетках мишенях Основные проблемы, решение которых позволило получить терапевтические препараты на основе ASOs. 1. Устойчивость ASOs к действию нуклеаз, стабильность в биологических средах. Решается с помощью химической модификации 2. Неспецифическое взаимодействие с белками и другими биополимерами Решается с помощью химической модификации 3. Прочное и специфическое связывание с РНК-мишенью Решается с помощью химической модификации 4. Высокая биологическая активность - эффективное снижение уровня РНКмишени, приводящее в требуемому биологическому эффекту Решается с помощью химической модификации + выбор РНК-мишени + выбор последовательности в РНК мишени 5. Эффективное накопление в органе/ткани/клетках – мишенях Решается путем создания биоконъюгатов + ситем направленной доставки Химические модификации, используемые для улучшения свойств антисмысловых олигонуклеотидов Химические модификации, используемые для улучшения свойств антисмысловых олигонуклеотидов PS модификация оказалась самой удачной и наиболее широко используемой среди модификаций первого поколения, затрагивающих несвязывающий атом кислорода межнуклеотидной связи. Эти химические модификации улучшали стабильность ASOs по отношению к нуклеазам, что являлось основной целью модификации. В случае PS ASOs время полужизни олигонуклеотида (half-life) с среде с сывороткой увеличивалось с минут до дней. Кроме того, PS олигонуклеотиды активировали РНКазу Н. Недостатком ASOs первого поколения явилась высокая токсичность вследствие неспецифического связывания с белками. Эти проблемы были решены при разработке ASO второго и следующих поколений. +- хорошо связывается с РНК-мишенью, стабилен в биологических средах, активирует Рнказу Н при связывании с РНК - - высокая цитоттоксичность, неспецифическое связывание с белками Химические модификации, используемые для улучшения свойств антисмысловых олигонуклеотидов Second Generation ASO Inotersen Второе поколение ASOs характеризуется наличием алкильных или фтор модификаций по 2’положению рибозы. Введение по этому положению кислород содержащих групп приводит к образованию 20-O-метил (20-OME) и 20-O-метоксиэтил (20-MOE) нуклеотидов. Такие ASOs оказались менее токсичными, чем PS, более эффективно связывались с РНК-мишенямиand, так как это были модификации РНК-олигонуклеотидов, они не активировали РНКазу Н и их биологическое действие проявлялось путем стерического блокирования трансляции или других функций РНК. Эти модификации представляют интерес присоздании ASOs для которых не требуется деградации РНКмишени. Химические модификации, используемые для улучшения свойств антисмысловых олигонуклеотидов Third Generation ASO Miravisen Eteplisen Третье поколение ASOs является более гетерогенным, так как включает большое число разнообразных модификаций, которые должны улучшить сродство с РНК-мишенью, устойчивость к нуклеазам, и фармакокинетику ASOs. Среди этих модификаций наиболее распространенными являются locked nucleic acids (LNAs), в которых метиленовый мостик соединяет 2’-кислород с 4’- атомом углерода рибозы; фосфорамидат морфолино олигонуклеотиды (PMOs) , в которых рибоза заменена морфолином, а фосфодиэфирная связь – фосфорамидатной и peptide nucleic acids (PNAs), в которых рибозо-фосфатный остов заменен на полиамидный, состоящий из повторов N-(2-аминоэтил)глицина, к которому и присоединены основания. PNA и PMO и не активируют РНКазу Н. Химические модификации, используемые для улучшения свойств антисмысловых олигонуклеотидов Новые модификации ASO Phosphoryl guanidine (PX) PX и µ-ASO хорошо связывается с РНК-мишенью, стабильны в биологических средах. µ-ASO активирует РНКазу Н при связывании с РНК, заряжен, хорошо растворим в воде PX ASO не заряжен, не активирует РНКазу Н. Химические модификации, используемые для улучшения свойств антисмысловых олигонуклеотидов Гапмеры (Gapmers) ASOs несущие химические модификации второго и третьего поколения не активируют Рнказу Н. Для того , чтобы ASO активировал РНКазу Inoue (Inoue et al., 1987) предложил новый дизайн ASO: в центр олигонуклеотида был вставлен короткий фрагмент РО (немодифицированные звенья) или PS звеньев, фланкированный парой фрагментов, не активирующих РНКазй Н. Эта структура получила название гапмер (“gapmer.”). 10 лет спустя такая структура ASOs стала широко применяться. Полностью модифицированные ASOs, не активирующике Рнказу Н, обычно используют для регуляции сплайсинга и трансляции. Gapmer ASOs, обычно на концах содержат 3-5 звеньев с различными 2’ модификациями. Экспериментальные данные показали, что биологическую активность гапмеров можно повысить путем включения в определенное положение гэпа 2’ОMe or MOP (methoxypropyl phosphonate) модификацию. Comparison of biological properties of PMO, PGO, μ-ASOs and PG-gapmers Inotersen Как определяется эффективность ASOs? Эффективность ASOs определяется ТОЛЬКО по их биологической активности in vitro на релевантных кдлеточных моделях заболеваний и in vivo. Факторы, которые могут влиять на биологическую активность ASOs 1) Стабильность в биологических средах 2) Выбор РНК-мишени, ее локализация, и концентрация в клетке (число копий на клетку) 3) Выбор участка РНК для связывания с ASO, структура РНК, стабильность образующегося комплекса 4) Механизм действия ASO. 5) Неспецифические взаимодействия (off-target effects, side effects) Как определяется эффективность ASOs? Эффективность ASOs определяется ТОЛЬКО по их биологической активности in vitro на релевантных клеточных моделях заболеваний и in vivo. Факторы, которые могут влиять на биологическую активность ASOs 1) Стабильность в биологических средах 2) Выбор РНК-мишени, ее локализация, и концентрация в клетке (число копий на клетку) 3) Выбор участка РНК для связывания с ASO, структура РНК, стабильность образующегося комплекса 4) Механизм действия ASO. 5) Неспецифические взаимодействия (off-target effects, side effects) Две ключевых характеристики ASOs - СРЕЦИФИЧНОСТЬ и СЕЛЕКТИВНОСТЬ Специфичность – только с выбранной последовательностью Селективность – только с выбранной РНК среди всех РНК транскриптома Элементы вторичной структуры РНК Какая длина ASO обеспечивает селективность и специфичность взаимодействия? Показаны все возможные гапмерные ASOs данной длины, комплементарные РНКмишени (мРНК PCSK9) (черный цвет). Уникальные последовательности каждой длины для мРНК PCSK9, то есть не имеющие никаких полностью комплементарных последовательностей в транскриптоме показаны серым цветом. Белым цветом показано число возможных уникальных гапмеров, не имеющих во всем транскриптоме человека частично комплементарных последовательностей с энергией связывания, отличающихся от энергии связывания полностью комплементарного комплекса менее чем на 3 kcal/mol . Принцип метода выбора эффективных по связыванию с РНК-мишенью ASOs OLIGONUCLEOTIDE WALK Пример определения специфичности взаимодействия гапмерных ASOs, содержащих на конфац фосфорилгуанидиновые модификации in vitro с помощью расщепления РНКазой Н Lanes Im and T1 – imidazole and T1 ladders; k – control RNA Lanes 1–5 (left panel), lanes 6 and 7 (right panel), complexes of RNA with ASOs: lane 1 – RNA/M2; lane 2 – RNA/M1; lane 3 – RNA/M3; lane 4 – RNA/G1; lane 5 – RNA/G2; lane 6 – RNA/G3; lane 7 – RNA/G4. MDR1 RNA (0.05 μg) was precomplexed with 10 μM ASO at 37°C for 1 h and then incubated with RNase H (1 U/mL) at 37°C for 30 min. The ASOs targeted to the 319–333 nt region of MDR1 RNA. B. Secondary structure of the 678 nt fragment of MDR1 RNA. The ASO binding site is indicated in blue. Spontaneous cleavages at CA and UA sites of MDR1 RNA are indicated by red arrows. миРНК направленные ASOs Зрелые микро РНК (miРНК) - это 21-23-звенные фрагменты РНК, находящиеся в клетке в комплексе с белками (Ago2, Exportine 5 etc) в ядре и цитоплазме в концентрации 0,1-10 микро молей. ASOs направленные к miРНК называют антагомиры. Работают как по РНКаза Н зависимому (происходит расщепление miРНК), так и по РНКаза Н независимому механизму (Блокирование функции за счет связывания с мишенью. миРНК-губки (sponge), содержащие множественные участки для связывания с миРНК, применяются для предотвращения подавления экспрессии эндогенных мРНК – мишеней миРНК Антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарно адресованные к микроРНК и выключающие их регуляторную функцию Маскирующие олигонуклеотидв комплементарные участку связывания miРНК с мРНК Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов Классической мишенью антисмысловых олигонуклеотидов является мРНК Связывание AS-ON с мРНК-мишенью ингибирует трансляцию за счет стерического блока Связывание AS-ON с мРНК-мишенью вызывает активацию РНКазы Н и расщепление мРНК AS-ON, проникая в ядро клетки, могут ингибировать различные этапы процессинга мРНК Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов Эта стратегия привела в первому ASO (fomivirsen) , разрешенному к клиническому использованию FDA 1998 г. (Ionis Pharmaceuticals (formerly Isis) and Novartis Ophthalmics зарегистрировали его под именем Vitravene). Fomivirsen это полностью PS ASO первого поколения направленный к вирусной мРНК кодирующей белок IE-2 (immediate early-2) необходимы для репликации цитомегаловируса CMV. Препарат вводится интравитрально для лечения ретинита, вызванного СМV. Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов Блокирование трансляции/ активация трансляции ASOs подавляют трансляцию за счет связывания с областью кэпа, АUG кодона, или с кодирующей областью мРНК, что приводит к no-go decay. ASOs могут усиливать экспрессию гена путем усиления трансляции за счет маскирования TIE (translation inhibitory elements), таких как uORF (upstream open reading frame) - открытая рамка считывания в 5' UTR) области мРНК и других. Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов Такие факторы как высокая активность РНКазы Н или Рнказы Н зависимый механизм действия, а также наличие двух и более сайтов связвая ASO c РНК – мишенью являются факторами повышающими биологическую активность ASOs. Факторами, снижающими биологическую активность AOOs являются структура РНК, РНК-связывающие белки или неспецифическое связывание ASOs c белками. Нейтральными факторами, влияния которых на активность ASOs не показано, являются время полужизни РНК и ее концентрация в клетке. MRE (miRNA recognition element) это сайты связывания миРНК на мРНК, полностью комплементарные seed-области миРНК. ASOs направленные к MRE могут блокировать деградацию мРНК, связанную с патологически высокой экспрессией определенных миРНК. Для этого были использованы ASOs mixmers, состоящие из LNA и названные target-site blockers (TSB). Эти олигонуклеотиды не активируют РНКазу Н, но прочно связываются с MRE и блокируют взаимодействие с миРНК. In vivo такие олигонуклеотидов действуют очень специфично, активируя экспрессию только выбранного гена. Steinert's disease, also known as type 1 myotonic dystrophy (DM1). DM1 is a triplet-repeat disease originating from progressive expansion of CTG repeats in the 30 UTR of the DMPK (DM1 protein kinase) gene. The disease displays autosomal dominant transmission, and disease severity varies with the number of CTG repeats The excess of triplet-repeats results in the formation of secondary stem-loop structures on the mRNA, which does not exit the nucleus. These toxic mRNA molecules accumulate in the nucleus and their secondary structures associate with proteins, such as MBNL1 (muscle blind-like splicing regulator 1). As MBNL1 protein is involved in the regulation of splicing, its sequestration in nuclear foci leads to multiple splicing abnormalities and spliceopathies. ASOs are being studied as inhibitors used to treat this disease.Several strategies are possible. ASOs are being studied as inhibitors used to treat this disease.Several strategies are possible. The first involves degrading the toxic mRNA to release the sequestered protein. By degrading the DMPK mRNA with an ASO displaying RNAse H activity (MOE gapmers), the sequestered MBNL1 protein is released and accurate splicing is restored. The second strategy is based on competitive binding between ASOs and the sequestered protein. Here, a CAG-repeat morpholino oligomer (without activating RNAse H) competes with MBNL binding to the CUGrepeats. This ASO was effective in triggering the release of MBNL and restoring splicing function in mice. ASOs могут быть использованы для регуляции контроля качества мРНК в процессе трансляции. Один из таких механизмов NMD (Nonsense-mediated decay) предназначен для удаления мРНК, содержащих сторкодон в неправильном месте (PTC premature termination codon) , что приводит с синтезу укороченного белка с dominant-negative activity (Такой белок взаимодействует с теми же элементами, что и правильный, но у него некоторые функции отсутствуют или блокированы) Exon junction complex, EJC Различные препараты на основе терапевтических нуклеиновых кислот в доклинических и клинических исследованиях ASOs (мРНК и миРНК) Miravirsen (SPC3649 ), Santaris Pharma Miravirsen – первый миРНК направленный ASO в клинических исследованих. Это LNA/PS ASO направленный к miR- 122 - это микро РНК специфично эфкспрессированная в печени и необходимая для репликации вируса гепатита С (HCV) . Лечение Miravirsen значительно снижаеи вирусную нагрузку (титр вируса в крови) у пациентов с НСV. MRX34 (miR-34 mimic), miRNA Therapeutics В 2013 компания microRNA Therapeutics Начала испытания miРНК мимики MRX34 для коррекции дефицита опухольсупрессирующей miR-34 в опухолевых клетках. Перспективность разработки терапевтически препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов определяется: 1) известные и хорошо изученные механизмы взаимодействия с мишенями и другими биополимерами; 2) высокая специфичность взаимодействия с молекулярными мишенями; 3) возможность в широких пределах варьировать структуру и свойства ASO путем химической модификации, получая химерные молекулы и биоконъюгаты; 4) возможность персонализации препарата; 5) биосовместимость; 6) легкость масштабирования синтеза 7) возможность применения разрабатываемой технологии для получения интеллектуальных антибактериальных, противовирусных препаратов, а также средств терапии широкого спектра заболеваний. 8) Принципиальным достоинством является то, что такие терапевтические препараты могут производиться на основе универсальных технологических платформ, специфичность действия и персонализация препаратов будет достигаться путем модулирования их структуры 9) Для повышения эффективности действия, улучшения биодоступности и длительности эффектов возможно проводить оптимизацию всей конструкции.