МЕХАНИЗМ СПЛАЙСИНГА САЙТЫ СПЛАЙСИНГА Нуриева И.Р., гр. 01-661 ПРОЦЕССИНГ (СОЗРЕВАНИЕ) РНК (посттранскрипционные модификации РНК) ― совокупность процессов в клетках эукариот, которые приводят к превращению первичного транскрипта в зрелую РНК ― в зависимости от типа РНК (матричные, рибосомные, транспортные, малые ядерные) их предшественники подвергаются разным последовательным модификациям. Например, предшественники матричных РНК подвергаются кэпированию, сплайсингу, полиаденилированию, метилированию и иногда редактированию. СПЛАЙСИНГ РНК (англ. splice — сращивать или склеивать концы чего-либо) ― процесс вырезания (удаления) из РНК-предшественника некодирующих последовательностей – интронов и соединения между собой кодирующих фрагментов зрелой мРНК – экзонов путём биохимических реакций с участием РНК и белков ― наиболее часто этот процесс встречается при созревании мРНК у эукариот ― большинство генов прокариот, кодирующих белки, не имеют интронов, поэтому у них сплайсинг пре-мРНК встречается редко ― у представителей эукариот, бактерий и архей встречается сплайсинг тРНК и др. некодирующих РНК биохимические реакции с участием РНК и белков ↓ УДАЛЕНИЕ ИНТРОНОВ + СОЕДИНЕНИЕ ЭКЗОНОВ ДРУГ С ДРУГОМ участки, кодирующие аминокислотную последовательность участки, не кодирующие белок ↓ ПРЕВРАЩЕНИЕ НЕЗРЕЛОЙ МРНК В ЗРЕЛУЮ ↓ ТРАНСЛЯЦИЯ БЕЛКА МЕХАНИЗМ СПЛАЙСИНГА ― сплайсинг ядерных про-мРНК происходит в ядре. I ЭТАП - СБОРКА КОМПЛЕКСА СПЛАЙСИНГА - комплекс, катализирующий сплайсинг и состоящий из множества субъединиц - СПЛАЙСОСОМА СПЛАЙСОСОМА ― ядерная структура, состоящая из молекул РНК и белков и осуществляющая удаление интронов из пре-мРНК ― это комплекс из 5 малых ядерных РНК (мяРНК), и каждая из них связана по меньшей мере с 7 белковыми факторами, образуя малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП) - U1, U2, U4, U5, U6 ― сплайсосома собирается на интроне перед расщеплением на 5’-сайте сплайсинга и состоит из интрона, связанного с белками и рибонуклеопротеидными комплексами. РЕГУЛЯТОРНЫЕ ОБЛАСТИ СПЛАЙСИНГА Интроны удаляются из первичных транскриптов путем расщепления в консервативных последовательностях – САЙТАХ СПЛАЙСИНГА, которые находятся на 5'- и 3'-концах интронов. ― ― 5’ чаще всего удаляемая последовательность РНК начинается с динуклеотида GU на его 5'-конце и заканчивается AG на его 3'-конце. Эти консенсусные последовательности имеют решающее значение, поскольку изменение одного из консервативных нуклеотидов приводит к ингибированию сплайсинга. Еще один важный регуляторный элемент сплайсинга - ТОЧКА ВЕТВЛЕНИЯ, которая представлена аденином, расположенным ближе к 3’-концу интрона, на расстоянии 18-37 нуклеотидов от экзона. В интронах человека этот остаток не находится в фиксированном положении и не окружен какой-то определенной последовательностью. Точка ветвления всегда содержит аденин, но в остальном сохраняется слабо. Типичная последовательность – YNYYRAY (Y - пиримидин, N - любой нуклеотид, R - любой пурин, A – аденин) *Редко обнаруживаются альтернативные последовательности сайтов сплайсинга, которые начинаются с динуклеотида AU и заканчиваются AC (соединяются аналогично) 3’ МЕХАНИЗМ СПЛАЙСИНГА ― ― ― ― ― Сплайсинг молекулы пре-мРНК происходит в несколько этапов, которые катализируются snRNP U1-рибонуклеопротеиды специфически связываются с экзонинтронными соединениями, защищая последовательность интрона примерно из 17 нуклеотидов от расщепления РНКазой, и с областью из 40 нуклеотидов, содержащей нуклеотид аденин, участвующий в образовании разветвленной петлеобразной структуры. После того, как U1 snRNP связывается с 5'-сайтом сплайсинга, 5'-конец интрона соединяется с последовательностью нижнего ответвления путем спаривания гуаниновых и адениновых нуклеотидов от 5'-конца и точки ветвления, соответственно, с образованием петлевой структуры - ЛАРИАТА snRNP U2 и U4 / U6 вносят вклад в позиционирование 5’-конца и точки ветвления в непосредственной близости. При участии U5 3'-конец интрона сближается, разрезается и присоединяется к 5'-концу. 3'-конец экзона разрезан и присоединен к сайту разветвления ОН-группой на 3'-конце экзона, которая атакует фосфодиэфирную связь в 3'-сайте сплайсинга. В результате экзоны (L1 и L2) ковалентно связываются, и лариат, содержащий интрон, высвобождается. АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ ТИПЫ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА Нуриева И.Р., гр. 01-661 Альтернативный сплайсинг - процесс, с помощью которого данный ген встраивается в молекулы мРНК более чем одного типа. Это эффективный способ продукции мРНК, кодирующих структурно родственные белки. Эти изоформы могут выполнять как одинаковые, так и разные функции. Некоторые интроны имеют несколько 5’- и 3’-сайтов сплайсинга. В этих случаях возникает явление, называемое альтернативным сплайсингом. В результате прохождения процесса сплайсинга по различным сайтам с одного первичного транскрипта образуются несколько зрелых мРНК и в результате - несколько протеиновых последовательностей с одного гена. Регуляция альтернативного сплайсинга происходит на уровне использования разных промоторов (ген легкой цепи миозина), полиаденилированием про-мРНК в различных местах и, следовательно, разницей длин 3’-последовательностей (легкая и тяжелые цепи иммуноглобулинов). Примеры: - иммуноглобулины человека представлены 2 изоформами - мембраносвязанной и секретируемой - благодаря альтернативному сплайсингу возникает тканеспецифичность различных изоформ белка: в щитовидной железе синтезируется кальцитонин, а в мозге - его изоформа. ТИПЫ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА: ― кассетный - один из экзонов может присутствовать или отсутствовать в конечном продукте; ― взаимоисключающий - в конечном продукте присутствует либо тот, либо другой экзон; ― с внутренним акцепторным сайтом внутри интрона, что приводит к образованию экзонов разной длины ― ― с использованием альтернативных промоторов; с присутствием разных сайтов полиаденилирования.
