uchebnoe_posobie_citologiya_1
реклама
ВВЕДЕНИЕ 1. ПРЕДМЕТ ЦИТОЛОГИИ. ИСТОРИЧЕСКОЕ РАЗВИТИЕ ЦИТОЛОГИИ. В процессе изучения человека его структуры подразделяют на клетки, ткани, морфо-функциональные единицы органов, органы, системы и аппараты органов, которые и формируют организм. Однако организм един, он может существовать как таковой лишь благодаря своей целостности. Организм целостен, но организован, как и многие сложные системы, по иерархическому принципу. Изучение каждого из уровней организации живого требует своих подходов и методов. Первый уровень организации живого – клетки – изучает ветвь биологических наук, именуемая цитологией. Развитие цитологии связано с созданием и усовершенствованием оптических устройств, позволяющих рассмотреть и изучить клетки. В 16091610 гг Галилео Галилей сконструировал первый микроскоп, однако лишь в 1624 г. он его усовершенствовал так, что им можно было пользоваться. Этот микроскоп увеличивал в 35-40 раз. Через год И. Фабер дал прибору название «микроскоп». В 1665 г. Роберт Гук впервые увидел в пробке ячейки, которым дал название «cell» - «клетка». В 70-х гг XVII в Марчелло Мальпиги описал микроскопическое строение некоторых органов растений. Благодаря усовершенствованию микроскопа Антоном ван Левенгуком, появилась возможность изучать клетки и детальное строение органов и тканей. В 1696 г. была опубликована его книга «Тайны природы, открытые с помощью совершеннейших микроскопов». Левенгук впервые рассмотрел и описал эритроциты, сперматозоиды, открыл дотоле неведомый и таинственный мир микроорганизмов, которые он назвал инфузориями. Левенгук по праву считается основоположником научной микроскопии. В 1715 г. X. Г. Гертель впервые использовал зеркало для освещения микроскопических объектов, однако лишь через полтора столетия Э. Аббе создал систему осветительных линз для микроскопа. В 1781 г. Ф. Фонтана первый увидел и зарисовал животные клетки с их ядрами. В первой половине XIX в Ян Пуркинье усовершенствовал микроскопическую технику, что позволило ему описать клеточное ядро («зародышевый пузырек») и клетки в различных органах животных. Ян Пуркинье впервые употребил термин «протоплазма». Р. Браун описал ядро как постоянную структуру и предложил термин «nucleus» - «ядро». В 1838 г. М. Шлейден создал теорию цитогенеза (клеткообразования). Его основная заслуга – постановка вопроса о возникновении клеток в организме. Основываясь на работах Шлейдена, Теодор Шванн создал клеточную теорию. В 1839 г. была опубликована его бессмертная книга «Микроскопические исследования о соответствии в структуре и росте животных и растений». Основными исходными положениями клеточной теории были следующие: - все ткани состоят из клеток; - клетки растений и животных имеют общие принципы строения, так как возникают одинаковыми путями; - каждая отдельная клетка самостоятельна, а деятельность организма представляет собой сумму жизнедеятельности отдельных клеток. Большое влияние на дальнейшее развитие клеточной теории оказал Рудольф Вирхов. Он не только свел воедино все многочисленные разрозненные факты, но и убедительно показал, что клетки являются постоянной структурой и возникают только путем размножения себе подобных – «каждая клетка из клетки» («omnia cellula e cellulae»). Во второй половине XIX в. возникло представление о клетке как элементарном организме (Э. Брюкке, 1861). В 1874 г Ж. Карнуа ввел понятие «Биология клетки», тем самым, положив начало цитологии как науке о строении, функции и происхождении клеток. В 1879-1882 гг. В. Флемминг описал митоз, в 1883 г. В. Вальдейер ввел понятие «хромосомы», через год О. Гертвиг и Э. Страсбургер одновременно и независимо друг от друга высказали гипотезу о том, что наследственные признаки заключены в ядре. Конец XIX в. ознаменовался открытием фагоцитоза Ильей Мечниковым (1892). В начале XX в Р. Гаррисон и А. Каррель разработали методы культивирования клеток в пробирке наподобие одноклеточных организмов. В 1928-1931 гг Е. Руска, М. Кнолль и Б. Боррие сконструировали электронный микроскоп, благодаря которому было описано подлинное строение клетки и открыты многие ранее неизвестные структуры. А. Клод в 1929-1949 гг впервые использовал для изучения клеток электронный микроскоп и разработал методы фракционирования клеток с помощью ультрацентрифугирования. Все это позволило по-новому увидеть клетку и интерпретировать собранные сведения. Клетка является элементарной единицей всего живого, потому что ей присущи все свойства живых организмов: высокоупорядоченное строение, получение энергии извне и ее использование для выполнения работы и поддержания упорядоченности (преодоление энтропии), обмен веществ, активная реакция на раздражения, рост, развитие, размножение, удвоение и передача биологической информации потомкам, регенерация, адаптация к окружающей среде. Клеточная теория в современной интерпретации включает следующие главные положения: - клетка является универсальной элементарной единицей живого; - клетки всех организмов принципиально сходны по своему строению, функции и химическому составу; - клетки размножаются только путем деления исходной клетки; - клетки хранят, перерабатывают и реализуют генетическую информацию; - многоклеточные организмы являются сложными клеточными ансамблями, образующими целостные системы. - именно благодаря деятельности клеток в сложных организмах осуществляются рост, развитие, обмен веществ и энергии. В XX веке за открытия в области цитологии и смежных наук были присуждены Нобелевские премии. Среди лауреатов были: в 1906 г Камилло Гольджи и Сантьяго Рамон-и-Кахаль за открытия в области структуры нейронов; в 1908 г Илья Мечников и Пауль Эрлих за открытия фагоцитоза (Мечников) и антител (Эрлих); в 1930 г Карл Ландштейнер за открытие групп крови; в 1931 г Отто Варбург за открытие природы и механизмов действия дыхательных ферментов цитохромоксидаз; в 1946 г Герман Меллер за открытие мутаций; в 1953 г Ханс Кребс за открытие цикла лимонной кислоты; в 1959 г Артур Корнберг и Северо Очоа за открытие механизмов синтеза ДНК и РНК; в 1962 г Френсис Крик, Морис Уилкинсон и Джеймс Уотсон за открытие молекулярной структуры нуклеиновых кислот и их значения для передачи информации в живых системах; в 1963 г Франсуа Жакоб, Андре Львов и Жак Моно за открытие механизма синтеза белка; в 1968 г Хар Гобинд Корана, Маршалл Ниренберг и Роберт Холли за расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белка; в 1970 г Джулиус Аксельрод, Бернард Кац и Ульф фон Эйлер за открытие гуморальных медиаторов нервных окончаний и механизма их хранения, выделения и инактивации; в 1971 г Эрл Сазерленд за открытие вторичного посредника цАМФ и его роли в механизме действия гормонов; в 1974 г Кристиан де Дюв, Альберт Клод и Джордж Паладе за открытия, касающиеся структурной и функциональной организации клетки (ультраструктура и функция лизосом, комплекса Гольджи, эндоплазматического ретикулума). 2. ЭВОЛЮЦИЯ КЛЕТКИ. ПРОКАРИОТЫ И ЭУКАРИОТЫ. Все живые существа состоят из клеток – маленьких, окруженных мембраной полостей, заполненных концентрированным водным раствором химических веществ. Простейшие формы жизни – это одиночные клетки, размножающиеся делением. Более высокоразвитые организмы, такие как мы сами, можно сравнить с клеточными городами, в которых специализированные функции осуществляют группы клеток, в свою очередь связанные между собой сложными системами коммуникаций. В известном смысле клетки находятся на полпути между молекулами и человеком. Мы изучаем клетки, чтобы понять, каково их молекулярное строение, с одной стороны, и чтобы выяснить, как они взаимодействуют для образования столь сложного организма, как человек – с другой. Считается, что все организмы и все составляющие их клетки произошли эволюционным путем от общей преДНКовой клетки. Два основных процесса эволюции - это: 1. Случайные изменения генетической информации, передаваемой от организма к его потомкам. 2. Отбор генетической информации, способствующей выживанию и размножению своих носителей. Эволюционная теория является центральным принципом биологии, позволяющим нам осмыслить ошеломляющее разнообразие живого мира. Естественно, в эволюционном подходе есть свои опасности: большие пробелы в наших знаниях мы заполняем рассуждениями, детали которых могут быть ошибочными, не в наших силах вернуться в прошлое и стать свидетелями уникальных молекулярных событий, происходивших миллиарды лет назад. Однако эти древние события оставили много следов, которые мы можем анализировать. ПреДНКовые растения, животные и даже бактерии сохранились как ископаемые. Но, что еще более важно, каждый современный организм содержит информацию о признаках живых организмов в прошлом. В частности, существующие ныне биологические молекулы, позволяют судить об эволюционном пути, демонстрируя фундаментальное сходство между наиболее далекими живыми организмами и выявляя некоторые различия между ними. Условия, существовавшие на Земле в первый миллиард лет ее истории, все еще являются предметом спора. Мы не знаем, была ли поверхность нашей планеты вначале расплавленной? Содержала атмосфера аммиак или же метан? Можно только предполагать, что Земля была весьма неспокойным местом – с постоянными вулканическими извержениями, неистовыми ливнями и сверкающими молниями. Не было совсем или было очень мало кислорода, и отсутствовал озоновый слой, поглощающий жесткое ультрафиолетовое излучение Солнца. В таких условиях, очевидно, возникали простые органические (т.е. содержащие углерод) молекулы. Лучшее тому доказательство лабораторные эксперименты. Если через нагретую смесь воды и газов, таких, как углекислый газ, аммиак, метан и водород, пропускать электрический разряд или ультрафиолетовое излучение, они реагируют с образованием малых органических молекул. Обычно набор таких молекул невелик, но каждая образуется в сравнительно больших количествах. Среди продуктов есть ряд соединений, таких, как цианистый водород (HCN) и формальдегид, которые легко вступают в последующие реакции в водном растворе. Наиболее важно, что в эксперименте удается получить четыре основных класса внутриклеточных малых молекул: аминокислоты, нуклеотиды, сахара и жирные кислоты. Хотя в таких опытах нельзя точно воспроизвести условия, существовавшие ранее на Земле, они показывают, что органические молекулы образуются на удивление легко. Кроме того, наша формирующаяся планета имела огромные преимущества перед любым экспериментатором: она была очень велика и обеспечивала широкий спектр условий. Но важнее всего то, что в распоряжении Земли были сотни миллионов лет. В таких условиях кажется вполне вероятным, что в какой-то момент, в каком-нибудь месте сконцентрировались многие из простых органических молекул, входящих в состав современных клеток. Простые органические молекулы, такие, как аминокислоты или нуклеотиды, могут ассоциировать с образованием больших полимеров. Две аминокислоты могут соединиться с помощью пептидной связи, а два нуклеотида могут быть соединены фосфодиэфирной связью. Последовательное повторение этих реакций ведет к образованию линейных полимеров, называемых соответственно полипептидами и полинуклеотидами. У современных организмов полипептиды, называемые белками, и полинуклеотиды в форме рибонуклеиновой кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) обычно считаются наиболее важными компонентами. Универсальные «кирпичики», из которых состоят белки – это всего лишь 20 аминокислот, а молекулы ДНК и РНК построены только из четырех типов нуклеотидов. Остается лишь гадать, почему именно эти наборы мономеров, а не другие со схожими химическими свойствами были отобраны для биосинтеза. Специфическое спаривание комплементарных нуклеотидов сыграло, видимо, решающую роль в возникновении жизни. Рассмотрим, например, полинуклеотид, подобный РНК и содержащий основания урацил (U), аденин (А), цитозин (С) и гуанин (G). Благодаря комплементарному спариванию оснований – А с U и G с С – при добавлении РНК к смеси активированных нуклеотидов в условиях, благоприятствующих полимеризации, синтезируется новая молекула РНК, последовательность нуклеотидов которой комплементарна последовательности нуклеотидов в исходной РНК. Таким образом, новые молекулы представляют собой как бы слепок исходной молекулы, каждому А которой соответствует U в копии и т.д. На первой стадии информация, содержащаяся в последовательности исходной цепи РНК, сохраняется в новообразующихся комплементарных цепях. На второй стадии копирование с использованием комплементарной цепи в качестве матрицы восстанавливает исходную последовательность. Механизмы комплементарного матричного копирования изящны и просты, они занимают центральное место в процессах переноса информации в биологических системах. Генетическая информация каждой клетки закодирована в последовательности оснований ее полинуклеотидов, и эта информация передается из поколения в поколение благодаря комплементарному спариванию оснований. Для быстрого образования полинуклеотидов в пробирке обязательно должны присутствовать специфические белковые катализаторы-ферменты, которых не могло быть в «пребиотическом бульоне». Там, однако, были, очевидно, минералы и ионы металлов, способные служить менее эффективными катализаторами. Кроме того, катализаторы лишь ускоряют реакции, которые происходили бы и без них, но за достаточно долгое время. Поскольку и время, и химически активные предшественники нуклеотидов имелись в изобилии, то вполне возможно, что в пребиотических условиях на Земле стало возможным возникновение медленно реплицирующихся систем полинуклеотидов. Как только эволюция нуклеиновых кислот продвинулась до кодирования ферментов, обеспечивающих их собственное воспроизведение, распространение репликативной системы должно было резко ускориться. Взрывной характер такого автокаталитического процесса можно видеть на примере жизненного цикла некоторых современных вирусов бактерии: проникнув в бактерию, эти вирусы направляют синтез белков, избирательно катализирующих их собственную репликацию и в короткое время оккупируют всю клетку. Одним из решающих событий, приведших к формированию первой клетки, очевидно, было формирование внешней мембраны. В самом деле: белки, синтезируемые под контролем определенного типа РНК не могли бы облегчить репродукцию именно этих молекул РНК, если бы не удерживались поблизости от них. Более того, до тех пор, пока белки свободно диффундировали в популяции реплицирующихся молекул РНК, они в равной степени способствовали размножению любого из конкурирующих видов РНК. Если возникала РНК, производящая улучшенный тип фермента, новый фермент не способен был направленно обеспечить выживание именно этой измененной РНК. Отбор молекул РНК по качеству кодируемых ими белков не мог начаться раньше, чем появился некий замкнутый объем (компартмент), заключающий в себя белки, произведенные молекулой РНК. Следовательно, эти белки становятся доступными только для РНК, порождающей их. Важнейшая роль в эволюции клеточных мембран, по-видимому, принадлежит классу амфипатических молекул, которые обладают простым физико-химическим свойством: одна их часть гидрофобна (нерастворима в воде), а другая - гидрофильна (растворима в воде). Когда такие молекулы попадают в воду, они располагаются так, что их гидрофобные части и приходят в тесный контакт друг с другом, а гидрофильные части – в контакт с водой. Амфипатические молекулы способны спонтанно агрегировать, образуя двухслойные структуры в виде маленьких замкнутых пузырьков, изолирующих водное содержимое от внешней среды. Этот феномен может быть продемонстрирован в пробирке путем простого смешивания фосфолипидов и воды: при подходящих условиях действительно образуются маленькие пузырьки. Все ныне существующие клетки окружены плазматической мембраной, состоящей из амфипатических молекул, главным образом фосфолипидов, такой структуры. В клеточных мембранах в состав липидного бислоя входят также амфипатичские белки. В электронном микроскопе такие мембраны имеют вид листков толщиной около 5 нм с выраженной трехмерной структурой (следствие плотной укладки фосфолипидных молекул хвост к хвосту). Не совсем ясно, в какой момент эволюции биологического катализа были сформированы первые клетки. Они могли появиться, когда молекулы фосфолипидов пребиотического бульона случайно собрались в мембранную структуру, заключившую в себя самореплицирующуюся смесь каталитических молекул РНК. Однако принято считать, что синтез белков осуществлялся до появления клеток. В любом случае, как только они оказались заключенными в замкнутую мембрану, молекулы РНК начали эволюционировать не только на основе их собственной структуры, но также в зависимости от их воздействия на другие молекулы в том же компартменте: нуклеотидные последовательности РНК могли теперь влиять на признаки целой клетки. Таким образом, живые клетки, скорее всего, появились на Земле приблизительно 3,5 млрд. лет назад в результате спонтанной агрегации молекул. Изучение современных организмов и содержащихся в них молекул позволяет предполагать, что развитие автокаталитических механизмов, присущих живым системам, началось с эволюции группы молекул. Со временем одна из этих групп согласованно катализирующих РНК приобрела способность к прямому синтезу полипептидов. Первые клетки, по-видимому, широко использовали каталитические функции и РНК, и белков, а в качестве вещества наследственности содержали только РНК. После того как накопление дополнительных каталитических белков сделало возможным развитие более эффективных и сложных клеток, двухцепочечная ДНК заменила РНК в роли хранителя генетической информации. Существует предположение, что все ныне живущие организмы произошли из единственной, возникшей несколько миллиардов лет назад «первобытной» клетки. Пережив своих конкурентов, эта клетка положила начало процессу клеточного деления и эволюции, который, в конце концов, создал зеленый покров Земли, изменил состав ее атмосферы и сделал ее родиной разумной жизни. Видимо, только так можно объяснить «фамильное сходство» между всеми организмами. На эволюционном пути имеется важная веха. Приблизительно 1,5 млрд. лет назад произошел переход от маленьких клеток со сравнительно простой внутренней структурой к большим по размеру и значительно более сложно устроенным клеткам. В настоящее время различают прокариотические и эукариотические организмы. К первым принадлежат сине-зеленые водоросли, актиномицеты, бактерии, спирохеты, микоплазмы, риккетсии и хламидии, ко вторым – большинство водорослей, грибы и лишайники, растения и животные. В отличие от прокариотической, ограниченное оболочкой эукариотическая из двух мембран, и клетка большое имеет ядро, количество мембранных органелл. Более детальные различия представлены в таблице 1. Таблица 1. Признаки прокариотов и эукариотов (по E.A. Martin, 1976) Признаки Размер клеток Вид метаболизма ДНК Прокариоты 1-10 мкм Анаэробный или Аэробный Кольцевая в цитоплазме Синтез РНК и И то, и другое – в белка Цитоплазме Эукариоты 10-100 мкм Аэробный Не кольцевая, очень длинная, окружена ядерной оболочкой Синтез и процессинг РНК – в ядре, белка – в цитоплазме Органеллы Нет или мало. Ни одна из них не имеет оболочки (двойной мембраны). Многочисленны и разнообразны. Некоторые органеллы окружены двойной мембраной, остальные – одинарной мембраной Есть Цитоскелет Нет Эндо- и экзоцитоз Митохондрии Нет Есть Нет Есть Эндоплазматиче ская сеть Комплекс Гольджи Рибосомы Нет Есть Нет Есть Лизосомы Внутриклеточно е переваривание Деление клеток Нет Нет Есть: 70 S Есть: 70 S в митохондриях, 80 S в цитоплазме Есть Есть Бинарное Митоз (у половых клеток – мейоз) 3. БАКТЕРИИ Бактерии – это мельчайшие одноклеточные организмы. Диаметр бактериальной клетки в среднем составляет 1 мкм. Размеры клеток варьируют в пределах от 0,1 до 10 мкм. Бактерии освоили самые разнообразные среды обитания: они живут в почве, пыли, воде, воздухе, на внешних покровах животных и растений и внутри организма. Их можно обнаружить даже в горячих источниках, где они живут при температуре около 60 °С или выше. Численность бактерий трудно оценить: в 1 г плодородной почвы может находиться до 100 млн., а в 1 см3 парного молока – свыше 3000 млн. бактерий. Жизнедеятельность микроорганизмов имеет важное значение для всех остальных живых существ, так как бактерии и грибы разрушают органическое вещество и участвуют в круговороте веществ в природе. К тому же бактерии приобретают все большее значение в жизни людей, и не потому, что они вызывают различные заболевания, а потому, что их можно использовать для получения многих необходимых продуктов. При неблагоприятных условиях бактерии способны образовывать споры. Некоторые бактерии (в основном принадлежащие к роду Clostridium или Bacillus) образуют эндоспоры, т. е. споры, находящиеся внутри клетки. Эндоспоры - толстостенные долгоживущие образования, крайне устойчивые к нагреванию и коротковолновому излучению. Они по-разному располагаются внутри клетки, что служит очень важным признаком для идентификации и систематики таких бактерий. Если покоящаяся, устойчивая структура образуется из целой клетки, то она называется цистой. Цисты образуют некоторые виды Azotobacter. Одним из важнейших систематических признаков является форма бактериальной клетки. Kокки (сферические): стафилококки (напоминают виноградную гроздь). Пример – Staphylococcus aureus, живущий в носоглотке; разные штаммы стафилококков вызывают фурункулез, воспаление легких, пищевые отравления и другие заболевания; стрептококки (образуют цепочки клеток). Пример – многие виды Streptococcus; некоторые вызывают инфекционные заболевания верхних дыхательных путей; например, S. Pyogenes – вызывает ангину и скарлатину; S. thermophilus придает йогурту его пикантный вкус; диплококки (две клетки в одной капсуле) – к этому роду относится единственный вид Diplococcus pneumoniae (пневмококк), возбудитель пневмонии, который многочисленные вызывает тяжелые острые крупозное пиогенные воспаление инфекции: легких и менингит, септицемию, эмфизему и перитонит. Спириллы (спиралевидные): Спиральная палочка с одним жгутиком Пример – Spirillum. Сюда же относятся спирохеты. Форма клеток у спирохет очень схожа, но есть различия по способу передвижения, например Treponema pallidum – возбудитель сифилиса. Бациллы (палочковидные): одиночные палочки, например, Escherichia coli (обычный кишечный симбионт), Lactobacillus, Salmonella typhi – возбудитель брюшного тифа; палочки, образующие цепочки клеток, например Azotobacter – азотфиксирующая бактерия; Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы. Некоторые бациллы образуют эндоспоры, которые находятся в разном положении, имеют разные размеры и форму: овальная спора находится в центре и не вызывает набухания клетки, например у Bacillus anthracis; сферическая спора находится на конце материнской клетки, придает ей характерную форму барабанной палочки, например, Clostridium tetani- возбудитель столбняка; спора находится в субтерминальном положении, вызывая набухание клетки, например у Clostridium botulinum (споры могут занимать и центральное положение) – возбудитель смертельного пищевого отравления – ботулизма. Вибрионы – короткие палочки, всегда изогнутые в виде запятой, например, Vibrio cholerae - возбудитель холеры, имеет один жгутик. Бактерии способны образовывать капсулы и слизистые слои. Капсулы и слизистые слои – это слизистые или клейкие выделения некоторых бактерий, такие выделения хорошо видны после негативного контрастирования (когда окрашивают не препарат, а фон). Капсула представляет собой относительно толстое и компактное образование, а слизистый слой намного рыхлее. В некоторых случаях слизь служит для формирования колоний из отдельных клеток. И капсула, и слизистые слои служат дополнительной защитой для клеток. Так, например, инкапсулированные штаммы пневмококков свободно размножаются в организме человека и вызывают воспаление легких, а некапсулированные штаммы легко атакуются и уничтожаются фагоцитами и поэтому совершенно безвредны. Бактериальная клетка устроена достаточно просто, особенно если сравнить ее с клетками эукариот. Клеточная стенка придает бактериальной клетке определенную форму и жесткость и препятствует осмотическому набуханию и разрыву клеток, когда они, как это часто случается, попадают в гипотоническую среду. Вода, другие малые молекулы и разные ионы легко проникают через крошечные поры в клеточной стенке, но через них не проходят крупные молекулы белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, клеточная стенка обладает антигенными свойствами, которые ей придают содержащиеся в ней белки и полисахариды. По строению клеточной стенки бактерий можно разделить на две группы. Одни окрашиваются по Граму, поэтому их называют грамположительными, а другие обесцвечиваются при отмывке красителя, и поэтому их называют грамотрицательными. В клеточной стенке и тех и других есть особая жесткая решетка, состоящая из муреина. Молекула муреина представляет собой правильную сеть из параллельно расположенных полисахаридных цепей, сшитых друг с другом короткими цепями пептидов. Таким образом, каждая клетка окружена сетевидным мешком, составленным всего из одной молекулы. У грамположительных бактерий, например у Lactobacillus, в муреиновую сетку встроены другие вещества, главным образом полисахариды и белки. Так вокруг клетки создается сравнительно толстая и жесткая упаковка. У грамотрицательных бактерий, например, у Escherichia coli или у Azotobacter, клеточная стенка гораздо тоньше, но устроена она сложнее. Муреиновый слой у этих бактерий снаружи покрыт мягким и гладким слоем липидов. Это защищает их от лизоцима содержащегося в биологических жидкостях. Он катализирует гидролиз определенных связей между остатками углеводов и таким образом расщепляет полисахаридную основу муреина. Клеточная стенка разрывается, и, если клетка находится в гипотоническом растворе, происходит ее лизис (клетка осмотически набухает и лопается). Липидный слой придает клетке устойчивость и к пенициллину. Этот антибиотик препятствует образованию сшивок в клеточной стенке грамположительных бактерий, что делает растущие клетки более чувствительными к осмотическому шоку. Многие бактерии подвижны, и эта подвижность обусловлена наличием у них одного или нескольких жгутиков. Жгутики у бактерий устроены гораздо проще, чем у эукариот, и по своей структуре напоминают одну из микротрубочек эукариотического жгутика. Жгутики состоят из одинаковых сферических субъединиц белка флагеллина (похожего на мышечный актин), которые расположены по спирали и образуют полый цилиндр диаметром около 10-20 нм. Несмотря на волнистую форму жгутиков, они довольно жестки. Жгутики приводятся в движение посредством уникального механизма. Основание жгутика вращается так, что жгутик как бы ввинчивается в среду, не совершая беспорядочных биений, и таким образом продвигает клетку вперед. Это, очевидно, единственная известная в природе структура, где используется принцип колеса. Другая интересная особенность жгутиков – это способность отдельных субъединиц флагеллина спонтанно собираться в растворе в спиральные нити. Спонтанная самосборка – очень важное свойство многих сложных биологических структур. В данном случае самосборка целиком обусловлена аминокислотной последовательностью (первичной структурой) флагеллина. Подвижные бактерии могут передвигаться в ответ на определенные раздражители, т. е. они способны к таксису. Так, аэробные бактерии обладают положительным аэротаксисом (движутся туда, где среда богаче кислородом), а подвижные фотосинтезирующие бактерии – положительным фототаксисом (движутся к свету). На клеточной стенке некоторых грамотрицательных бактерий видны тонкие выросты (палочковидные белковые выступы), которые называются пили или фимбрии. Они короче и тоньше жгутиков и служат для прикрепления клеток друг к другу или к какой-нибудь поверхности, придавая специфическую «липкость» тем штаммам, которые ими обладают. Пили бывают разного типа. Наиболее интересны так называемые F-пили, которые кодируются специальной плазмидой и связаны с размножением бактерий. Плазмиды придают своим клеткам-хозяевам целый ряд особых свойств. Некоторые плазмиды являются «факторами резистентности» (R-плазмиды, или R-факторы), т. е. факторами, придающими устойчивость к антибиотикам. Примером может служить пенициллиназная плазмида стафилококков, которая трансдуцируется различными бактериофагами. В этой плазмиде содержится ген, кодирующий фермент пенициллиназу, которая разрушает пенициллин и, таким образом, придает устойчивость к пенициллину. Другие плазмидные гены определяют устойчивость к дезинфицирующим средствам; способствуют таким заболеваниям, как стафилококковая импетиго; помогают молочнокислым бактериям превращать молоко в сыр, придают способность усваивать такие сложные вещества, как углеводороды, что можно использовать для борьбы с загрязнениями океана или для получения кормового белка из нефти. Как у всех клеток, протоплазма бактерий окружена полупроницаемой мембраной. По структуре и функциям плазматические мембраны бактерий не отличаются от мембран эукариотических клеток. У некоторых бактерий плазматическая мембрана впячивается внутрь клетки и образует мезосомы и (или) фотосинтетические мембраны. Мезосомы – складчатые мембранные структуры, на поверхности которых находятся ферменты, участвующие в процессе дыхания. Следовательно, мезосомы можно назвать примитивными органеллами. Во время клеточного деления мезосомы связываются с ДНК, что, по-видимому, облегчает разделение двух дочерних молекул ДНК после репликации и способствует образованию перегородки между дочерними клетками. У фотосинтезирующих бактерий в мешковидных, трубчатых или пластинчатых впячиваниях плазматической мембраны находятся фотосинтетические пигменты (в том числе бактериохлорофилл). Сходные мембранные образования участвуют и в фиксации азота. ДНК бактерий представлена одиночными кольцевыми молекулами длиной около 1 мм. Каждая такая молекула состоит примерно из 5х106 пар нуклеотидов. Суммарное содержание ДНК (геном) в бактериальной клетке намного меньше, чем в эукариотической, а, следовательно, меньше и объем закодированной в ней информации. В среднем такая ДНК содержит несколько тысяч генов, что примерно в 500 раз меньше, чем в клетке человека. Индивидуальный рост и бесполое размножение бактерий. Отношение поверхность/объем у бактериальных клеток очень велико. Это способствует быстрому поглощению питательных веществ из окружающей среды за счет диффузии и активного транспорта. В благоприятных условиях бактерии растут очень быстро. Рост, прежде всего, зависит от температуры и рН среды, доступности питательных веществ и концентрации ионов. Облигатным аэробам обязательно нужен еще и кислород, а облигатным анаэробам, наоборот, нужно, чтобы его совсем не было. Достигнув определенных размеров, бактерии переходят к бесполому размножению (бинарному делению), т. е. начинают делиться с образованием двух дочерних клеток. Переход к делению диктуется отношением объема ядра к объему цитоплазмы. Перед клеточным делением происходит репликация ДНК, во время которой мезосомы удерживают геном в определенном положении. Мезосомы могут прикрепляться и к новым перегородкам между дочерними клетками и каким-то образом участвовать в синтезе веществ клеточной стенки. У самых быстрорастущих бактерий деление происходит через каждые 20 мин; интервал между делениями называется временем генерации. Половое размножение, или генетическая рекомбинация. У бактерий наблюдается и половое размножение, но в самой примитивной форме. Половое размножение бактерий отличается от полового размножения эукариот тем, что у бактерий не образуются гаметы и не происходит слияния клеток. Однако главнейшее событие полового размножения, а именно обмен генетическим материалом, происходит и в этом случае. Этот процесс называется генетической комбинацией. Часть ДНК (очень редко вся ДНК) клетки-донора переносится в клетку-реципиент, ДНК которой генетически отличается от ДНК донора. При этом перенесенная ДНК замещает часть ДНК реципиента. В процессе замещения ДНК участвуют ферменты, расщепляющие и вновь соединяющие цепи ДНК. При этом образуется ДНК, которая содержит гены обеих родительских клеток. Такую ДНК называют рекомбинантной. У потомства, или рекомбинантов, наблюдается заметное разнообразие признаков, вызванное смешением генов. Такое разнообразие признаков очень важно для эволюции и является главным преимуществом полового размножения. Известны три способа получения рекомбинантов. Это трансформация, конъюгация и трансдукция. При трансформации клетки донора и реципиента не контактируют друг с другом. Этот процесс открыл Гриффит в 1928 г, работая с пневмококками. У пневмококков имеются колонии двух типов, которые различаются по внешнему виду. Одни колонии – шероховатые – R-штаммы (R – от англ. rough - шероховатый), другие – гладкие – S-штаммы (S – от англ. Smooth – гладкий, ровный). R-штаммы не патогенны и не образуют капсулы; S-штаммы патогенны, и у них имеются толстые капсулы. Гриффит обнаружил, что если мышам ввести живые R-клетки и мертвые (убитые нагреванием) S-клетки, то мыши погибают через несколько дней, а в крови у них можно обнаружить живые S-клетки. На этом основании Гриффит сделал вывод, что из мертвых S-клеток высвобождается какой-то фактор, который придает R-клеткам способность образовывать капсулу и предохраняет их от разрушения в организме животного-хозяина. Оказалось, что такая «трансформация» наследуется. В настоящее время известно, что при трансформации из клетки-донора выходит небольшой фрагмент ДНК, который активно поглощается клеткой-реципиентом и включается в состав ее ДНК, замещая в ней похожий, хотя и не обязательно идентичный фрагмент. Трансформация наблюдается лишь у немногих бактерий, в том числе и у некоторых так называемых «компетентных» штаммов пневмококков, у которых ДНК может проникать в клетку-реципиента. При трансдукции небольшой двухцепочечный фрагмент ДНК попадает из клетки-донора в клетку-реципиент вместе с бактериофагом. Некоторые вирусы способны встраивать свою ДНК в ДНК бактерий; такая встроенная ДНК реплицируется одновременно с ДНК хозяина и передается от одного поколения бактерий к другому. Время от времени такая ДНК активируется и начинает кодировать образование новых вирусов. ДНК хозяина (бактерии) разрывается, а высвобожденные фрагменты иногда захватываются внутрь новых вирусных частиц, порой даже вытесняя ДНК самого вируса. Такие новые «вирусы», или трансдуцирующие частицы, затем переносят ДНК в клетки других бактерий. Питание бактерий. В соответствии с типом питания самой важной является группа хемогетеротрофных бактерий. По способу добывания пищи эти бактерии можно разделить на три группы: сапрофиты, симбионты и паразиты. Сапрофиты - это организмы, которые извлекают питательные вещества из мертвого и разлагающегося органического материала. Сапрофиты секретируют ферменты в органическое вещество, так что переваривание происходит вне организма. Образующиеся при этом растворимые продукты всасываются и усваиваются (ассимилируются) уже внутри тела сапрофита. Сапрофитные бактерии составляют группу редуцентов. Они необходимы для разложения веществ и круговорота элементов в природе. Редуценты образуют гумус из останков животных и растений, но они могут разрушать и другие вещества, в том числе нужные человеку, например портить пищевые продукты. Примерами симбионтов могут служить Rhizobium - бактериясимбионт, способная фиксировать азот и живущая в корневых клубеньках бобовых растений, или Escherichia coli, обитающая в кишечнике и участвующая в образовании витаминов группы В и К. Бактерии-паразиты, вызывающие различные заболевания, называют патогенами. Паразит-это организм, живущий внутри другого организма (хозяина) или на нем. Организм-хозяин обеспечивает паразита пищей и убежищем. Хозяином может быть любой организм, причем паразит, как правило, наносит вред своему хозяину. Одни паразиты могут жить и расти только в живых клетках и поэтому называются облигатными паразитами. Другие заражают хозяина, вызывают его гибель и затем питаются сапрофитно его остатками; такие паразиты называются факультативными. Один из признаков паразита - чрезвычайная взыскательность к составу пищи. Все паразиты нуждаются в «дополнительных ростовых веществах», которые они не могут сами синтезировать и находят их только в других живых клетках. Значение бактерий. Микроорганизмы имеют большое значение они играют важную роль в биосфере, их преднамеренно можно использовать в нужных целях для человека и при этом самыми разными способами. Бактерии играют важную роль в плодородии почвы, в частности сапрофитные бактерии участвуют в образовании гумуса из лесной подстилки и лежащих на ней гниющих растительных и животных. При разложении органических остатков образуются двуокись углерода, аммиак, минеральные соли (например, фосфаты и сульфаты) и вода, которые снова вступают в круговорот веществ. Азотфиксирующие бактерии, такие, как свободно живущие сапрофиты, например Azotobacter, или симбионты, например Rhizobium участвуют в кругообороте азота, серы и фосфора; нитрифицирующие бактерии, например Nitrosomonas и Nitrobacter, превращают азот, связанный в органических соединениях (например, в белках), в нитраты; денитрифицирующие бактерии, например Thiobacillus, превращают нитрат в свободный азот. Кроме того, в очистных сооружениях бактерии играют почти такую же роль, как в почве. И в том и в другом случае они расщепляют органические вещества, превращая их в безвредные растворимые неорганические соединения. Бытовые сточные воды предварительно разделяют в специальных отстойниках на жидкую часть и илистый осадок, которые затем перерабатывают в несколько этапов, используя аэробные и анаэробные бактерии. Метан, образуемый анаэробными бактериями, иногда используют как топливо для рабочих механизмов очистных сооружений. После очистки получают очищенную жидкость, которую обычно спускают в реки, и ил, состоящий из безвредных органических и неорганических веществ и микроорганизмов (в основном бактерий и простейших), который можно затем высушить и, если он не загрязнен тяжелыми металлами, использовать вместо удобрения. Важную роль играют бактерии и в организме животных. Так, млекопитающие и другие животные не могут переваривать целлюлозу, так как у них нет фермента целлюлазы. Основную же массу пищи, поедаемой травоядными животными, составляет клетчатка. Однако у них в кишечнике живут симбиотические бактерии и простейшие, переваривающие клетчатку. У кроликов такие бактерии живут в слепой кишке и червеобразном отростке, а у коров и овец – в рубце. Косвенным образом эти бактерии служат и человеку, поскольку он использует мясо домашних животных в пищу. Более непосредственное отношение к человеку имеет «микрофлора» его собственного кишечника. В кишечнике живут многие бактерии, при этом некоторые из них, например Escherichia coli, синтезируют витамины группы В и витамин К. Некоторые бактерии, живущие на коже человека, предохраняют его от заражения патогенными организмами. Следует отметить важную роль бактерий в промышленных процессах брожения. Многие полезные органические продукты получаются в результате брожения, и человек использует их уже несколько тысяч лет. Продукты брожения становятся все более важными как новый источник пищи и топлива. Этими вопросами занимаются многие ученые и технологи. При производстве сыра молочный сахар лактоза сбраживается до молочной кислоты, а кислота заставляет свертываться белок молока казеин. Твердые сгустки, состоящие из белка и жиров, отделяют от жидкой сыворотки и затем инокулируют бактерии. Для получения разных сортов сыра используют разные микроорганизмы, так, например, чеддер получают с помощью различных видов Lactobacillus. Молочнокислые стрептококки сквашивают сливки и придают сливочному маслу характерный вкус и аромат. Молочнокислые бактерии из рода Lactobacillus применяют также для квашения капусты, приготовления различных солений и маринадов, для получения силоса. С 30-х годов прошлого столетия многие исследователи начали заниматься выделением из бактерий и грибов природных веществ, обладающих антибиотическими свойствами, т. е. способных либо подавлять рост, либо совсем убивать других микробов. Эти исследования продолжаются по сей день. Антибиотики находят применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, промышленности и чисто научных исследованиях. Самый богатый источник антибиотиков – организмы, живущие в почве. В почвенных микроэкосистемах чрезвычайно развита конкуренция между отдельными обитателями, а антибиотики входят в тот природный «арсенал», который нужен для захвата экологической ниши. Образцы почв из всех районов мира постоянно анализируют в поисках новых сильнодействующих источников антибиотиков. антибиотиков служит Одним род из самых Streptomyces. продуктивных К этому роду принадлежат многие виды актиномицетов, у которых обнаружено и идентифицировано свыше 500 антибиотиков. Свыше 50 таких антибиотиков широко применяется в практике; к их числу относятся стрептомицин, хлорамфеникол и различные антибиотики тетрациклинового ряда. 4. СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ Эукариотическая клетка в сравнении с прокариотической представляет собой более сложное образование. Важнейшим отличием эукариот является организация внутреннего объема клетки, уже не представляющего собой единое пространство, но разделенного внутренними мембранами на множество различных отсеков – компартментов (органелл). Добавить из Дерябина – отсканировать с 155 -162 4.1. Цитоплазматическая мембрана Мембраны играют ключевую роль как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток – прокариотических и эукариотических, растительных и животных. Мембраны формируют внутриклеточные компартменты (отсеки), с их помощью происходит разделение содержимого компартментов и окружающей их среды. Мембраны не только разделяют клетку на отдельные компартменты, но и участвуют в регуляции всех связей и взаимодействий, которые осуществляются между наружной и внутренней сторонами этих компартментов. Это может проявляться в виде физического переноса ионов или молекул через мембрану (внутрь компартмента или из него) или в форме передачи информации при помощи конформационных изменений, индуцируемых в мембранных компонентах. Кроме того, с мембранами связаны многие клеточные ферменты. Некоторые из них катализируют трансмембранные реакции, когда реагенты находятся по разные стороны мембраны или когда каталитический акт сопровождается транспортом молекул. Другие ферменты образуют своеобразные комплексы, которые осуществляют цепь последовательных превращений, причем благодаря тому, что эти ферменты располагаются в плоскости мембраны, повышается эффективность всего процесса. Имеются ферменты, которые, действуя на мембраносвязанные субстраты, участвуют тем самым в биосинтезе мембран. С участием мембран в той или иной степени осуществляется большинство жизненно важных клеточных функций, например, протекают такие разные процессы, как репликация прокариотической ДНК, биосинтез белков и их секреция, биоэнергетические процессы и функционирование систем гормонального ответа. Данные, полученные при изучении клеток млекопитающих методом электронной микроскопии, свидетельствуют о наличии широко развитой сети внутриклеточных мембранных образований, которая занимает значительную часть внутреннего объема клетки. Сейчас уже не вызывает сомнений, что основные принципы структурной организации всех этих мембран по сути одинаковы. Более того, эти принципы соблюдаются также и в случае мембран растительных и бактериальных клеток. Основные закономерности, установленные Робертсоном в конце 1950-х гг, позволяют нам переносить результаты, полученные при исследовании одной мембранной системы (например, мембраны эритроцитов), на другие системы (конечно, со всеми необходимыми предосторожностями). Естественно, учет специфики здесь необходим, поскольку, как это ни парадоксально звучит, одной из самых характерных особенностей мембран является их чрезвычайное разнообразие. Такое разнообразие обусловлено, прежде всего, разнообразием белков, присутствующих в каждой мембране, и способов их взаимодействия друг с другом и с компонентами цитоплазмы. Эти взаимодействия, в конечном счете, проявляются в специфической морфологии мембранных образований (таких, как микроворсинки кишечного эпителия или тубулярный эндоплазматический ретикулум) и могут быть связаны с латеральной гетерогенностью той или иной мембраны. Плазматическая мембрана образует границу, на которой осуществляется контакт клетки с ее окружением. Она содержит специализированные компоненты, участвующие в межклеточных контактах и взаимодействиях, в системах гормонального ответа и транспорта как малых, так и больших молекул из клетки и внутрь ее. Однако и сама плазматическая мембрана состоит из специализированных участков, которые имеют различное окружение – это апикальный и базолатеральный участки. Апикальная мембрана контактирует с какой-либо внутриклеточной средой. Так, у гепатоцитов она обращена в просвет желчных канальцев, а у эпителиальных клеток кишечника – в просвет желудочно-кишечного тракта. Она может иметь специализированные структуры, например микроворсинки. Последние в некоторых всасывающих клетках образуют щеточную каемку. Микроворсинки значительно увеличивают площадь поверхности мембраны, в результате чего повышается эффективность мембранного транспорта. Базолатеральная мембрана находится в контакте с другими клетками (в этом случае она называется латеральной или контактной) или обращена в просвет кровеносных сосудов (и называется синусоидной мембраной). Латеральная и синусоидная мембраны гепатоцитов различаются как по своей морфологии, так и биохимически. Базолатеральная мембрана, например, гепатоцитов, имеет также специализированные структуры, ответственные за межклеточную адгезию и транспорт. Тот факт, что плазматическая мембрана, окружающая клетки, представляет собой вполне определенную структуру, был осознан в середине XIX столетия. На исходе этого столетия Овертон обратил внимание на корреляцию между скоростью, с которой небольшие молекулы проникают в растительные клетки, и их коэффициентом распределения между маслом и водой. Это привело его к мысли о липидной природе мембран. В 1925 г. Гортер и Грендел предположили, что липиды в мембране эритроцитов образуют биомолекулярный слой (липидный бислой). Эта идея возникла на основе результатов элегантного и простого эксперимента. Липиды эритроцитов экстрагировали ацетоном и затем в кювете Лэнгмюра получали из них тонкую пленку на поверхности воды. С помощью поплавка сжимали слой липидных молекул на границе раздела вода-воздух до тех пор, пока этот слой не начинал оказывать сопротивление дальнейшему сжатию. Это явление было объяснено образованием плотноупакованной мономолекулярной липидной пленки. Измерение площади, занимаемой липидами, и сравнение ее с площадью поверхности эритроцитов, из которых эти липиды были экстрагированы, дали соотношение 2:1. Отсюда был сделан вывод, что мембрана эритроцитов состоит из липидных молекул, расположенных в два слоя. По-видимому, этот вывод Гортера и Грендела оказался правильным только благодаря взаимной компенсации ошибок, однако в историческом плане эта работа имела большое значение, поскольку с тех пор концепция липидного бислоя как структурной основы биологических мембран стала доминирующей и на самом деле оказалась верной. Концепция бимолекулярной липидной мембраны получила дальнейшее развитие в предложенной в 1935 г. модели Дэвсона-Даниелли, или модели «сэндвича», в которой предполагалось, что белки покрывают поверхность липидного бислоя. Это была необыкновенно удачная модель, и в течение последующих 30 лет многочисленные экспериментальные данные, особенно полученные с помощью дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии, полностью подтвердили ее адекватность. Однако тогда же обнаружилось, что мембраны выполняют огромное множество функций, и чтобы объяснить этот феномен, исходная модель Дэвсона-Даниелли неоднократно подвергалась модификациям. Быстрый прогресс в мембранологии, в результате которого сформировались современные представления, был достигнут в значительной мере благодаря успехам в изучении свойств мембранных белков. Электронно-микроскопические исследования с применением метода замораживания-скалывания показали, что в мембраны встроены глобулярные частицы. В этих случаях препараты быстро замораживают, не подвергая их при этом каким-либо повреждающим воздействиям, как при получении тонких срезов. Процесс подготовки препарата включает следующие операции: 1. После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток или мембран, скалывают с помощью ножа при низкой температуре (– 100 °С) в глубоком вакууме. Возникающие при скалывании усилия приводят к образованию среза, проходящего через образец. Оказалось, что, когда плоскость среза проходит через мембрану, последняя раскалывается преимущественно по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны. 2. При необходимости образец подвергают травлению – проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран. 3. После этого получают так называемую реплику с обнаженной поверхности. Именно эту реплику и изучают под электронным микроскопом. Для получения реплики сначала напыляют на образец платину под углом около 45°, чтобы выявить топологические характеристики препарата. Затем платиновой реплике придают механическую прочность, нанеся на нее слой углерода. После этого препарат оттаивают, реплика всплывает, и ее вылавливают с помощью специальной сеточки. Наиболее характерные структуры, наблюдаемые при изучении мембран методом замораживания-скалывания – это многочисленные внутримембранные частицы диаметром от 80 до 100 А, лежащие в плоскости мембранных сколов. Обычно они расположены хаотично, но иногда образуют группы. Многочисленные исследования показали, что эти частицы, возможно, являются мембранными белками. Любопытно, что при электронной микроскопии тонких срезов подобные структуры не обнаруживаются. Реплики, полученные от двух половинок расщепленной мембраны, не всегда бывают топологически комплементарными. Это означает, что некоторые частицы связаны только с одной из половин мембраны. Данные, полученные методом замораживания-скалывания, широко использовались Сингером и Николсоном при создании жидкостномозаичной модели мембран, поскольку они убедительно показывали, что глобулярные белки находятся не только на поверхности мембраны, но и внутри бислоя. Тем временем биохимикам удалось диссоциировать мембраны до состояния функционально активных «частиц». Данные спектральных исследований указывали, что для мембранных белков характерно высокое содержание α-спиралей и что они, вероятно, образуют глобулы, а не распределены в виде монослоя на поверхности липидного бислоя. Неполярные свойства мембранных белков наводили на мысль о наличии гидрофобных контактов между белками и внутренней неполярной областью липидного бислоя. Тогда же были разработаны методы, позволившие выявить текучесть липидного бислоя. Сингер и Николсон свели воедино все эти идеи, создав жидкостно-мозаичную модель. В рамках этой модели мембрана представляется как текучий фосфолипидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие белки. Прежняя модель ДэвсонаДаниелли была статичной и успешно объясняла имевшиеся в то время стркутурные данные, полученные с довольно низким разрешением. В то же время, начиная с 1970 г. большое внимание стало уделяться изучению динамических свойств и их взаимосвязи с мембранными функциями. В последние годы жидкостно-мозаичная модель тоже подверглась модификации, и этот процесс будет продолжаться. В частности, теперь стало ясно, что не все мембранные белки свободно диффундируют в жидком липидном бислое. Имеются данные о существовании латеральных доменов в самой мембране. 4.2. Состав мембран Основными компонентами мембран являются белки и липиды. На долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав гликолипидов или гликопротеинов. Соотношение между белками и липидами в мембранах значиПлотность мембран прямо пропорциональна содержанию в них белка. Судя по данным изопикнического центрифугирования, чем выше содержание белка в мембране, тем больше ее плотность. Белковый состав мембраны зависит в какой-то степени от метода ее выделения. Некоторые белки непрочно связаны с мембраной и легко удаляются при промывании ее растворами с высокой или, напротив, с низкой ионной силой, щелочными растворами или растворами, содержащими хелатирующие агенты типа ЭДТА. При этом трудно сказать, является ли белок мембранным или цитоплазматическим, случайно связавшимся с мембраной в ходе ее выделения. 4.2.1. Мембранные липиды Следует отметить в мембранных липидах их огромное разнообразие. Причины этого пока не ясны, хотя становится все более очевидно, что, повидимому, связано это с тем разнообразием функций, которые липиды выполняют в мембранах. Но, конечно, главная функция мембранных липидов состоит в том, что они формируют бислойный матрикс, с которым взаимодействуют белки. Различают следующие основные классы липидов. Глицерофосфолипиды – это наиболее распространенные липиды. Одна из гидроксильных групп глицерола связана с полярной группировкой, содержащей фосфат, а две другие – с гидрофобными остатками. Среди глицерофосфолипидов выделяют: 1. 1,2-диацилфосфоглицериды или фосфолипиды. Эти липиды, являющиеся сложными эфирами жирных кислот и глицерола, широко представлены во многих мембранах эукариотических и прокариотических клеток, за исключением архебактерий. В частности, фосфатидилхолин является основным компонентом мембран животных клеток, а фосфатидилэтаноламин – это нередко основной липид бактериальных мембран. 2. Кардиолипины или дифосфатидилглицеролы – это димерные формы фосфолипидов. Они содержатся в большом количестве во внутренней мембране митохондрий, в мембране хлоропластов и в некоторых бактериальных мембранах, но редко встречаются в других мембранах. 4. Плазмалогены – это фосфоглицеролипиды, у которых одна из углеводородных цепей представляет собой простой виниловый эфир Этаноламиновые плазмалогены широко представлены в миелине и в саркоплазматическом ретикулуме сердца. Фосфосфинголипиды – эти липиды имеют такие же полярные головки (например, фосфорилхолин), как и глицерофосфолипиды, но их гидрофобная часть представлена церамидом. В плазматических мембранах животных клеток широко распространен сфингомиелин (церамид-1-фосфорил-холин). В мембранах растительных и бактериальных клеток фосфосфинголипиды встречаются редко. Кроме сфингомиелина известны и другие фосфосфинголипиды, например церамид-1-фосфорилэтаноламин, церамид-1фосфорилинози-тол и церамид-1-фосфорилглицерол. Гликоглицеролипиды – это полярные липиды, у которых в 3положении глицерола находится углевод, присоединенный с помощью гликозидной связи, например галактоза. Гликоглицеролипиды широко представлены в мембранах хлоропластов, они обнаружены также в заметных количествах в сине-зеленых водорослях и бактериях. Моногалактозилдиацилглицерол был назван «наиболее распространенным в природе полярным липидом», поскольку на его долю приходится половина всех липидов тилакоидной мембраны хлоропластов. Для мембран грамположительных бактерий характерны гликоглицеролипиды с большим разнообразием сахаров. Архебактерии также содержат такие липиды, но, как и в случае глицерофосфолипидов, их стереохимическая конфигурация является обращенной. В мембранах животных клеток гликоглицеролипиды встречаются редко. Гликосфинголипиды – эти липиды содержат углеводы, присоединенные с помощью гликозидной связи к концевой гидроксильной группе церамида. Их классифицируют в соответствии с размером углеводной части, которая может быть представлена всего лишь одним моносахаридным остатком, с одной стороны, и очень сложным углеводным полимером – с другой. Моногликозилцерамиды обычно называют цереброзидами. Ганглиозиды представляют собой класс анионных гликосфинголипидов, которые содержат один или несколько остатков сиаловой кислоты (Nацетилнейраминовой кислоты, NeuNAc), связанных с сахарными остатками церамидолигосахарида. Нейтральные гликосфинголипиды, которые не содержат остатков отрицательно заряженной сиаловой кислоты называют глобозидами. Гликосфинголипиды находятся на наружной поверхности плазматических мембран животных клеток. Обычно они являются минорными компонентами, но иногда содержатся в значительных количествах (например, в плазматических мембранах эпителиальных клеток. Моногалактозилцерамид – это один из основных компонентов миелиновой оболочки нервного волокна. В некоторых случаях гликосфинголипиды локализуются не в плазматической мембране, а во внутриклеточных мембранах. Гликосфинголипиды мембран эритроцитов несут антигены группы крови. В клетках аденокарциномы человека накапливаются необычные фукозилированные гликосфинголипиды, которые можно использовать для обнаружения этих клеток и контроля за развитием опухоли. Стеролы. Эти липиды присутствуют во многих мембранах растений, животных и микробов. Самым распространенным из стеролов является холестерол. Его молекула состоит из компактного, жесткого гидрофобного ядра, а полярной головкой является гидроксильная группа. Холестерол содержится в плазматических мембранах животных клеток, в лизосомах, эндосомах и в мембранах аппарата Гольджи. Он составляет около 30% всей массы мембранных липидов во многих плазматических мембранах животных клеток. В высших растениях обнаружены другие стеролы, чаще всего ситостерол и стигмастерол. Растительные стеролы (фитостеролы) часто имеют еще одну боковую цепь в положении С-24 и двойную связь в положении С-22. В мембранах дрожжей и других эукариотических микроорганизмов часто содержится эргостерол. К классу стеролоподобных липидов относят также гопаноиды, которые найдены в бактериях и некоторых растениях. Минорные компоненты. В мембранах присутствуют также и другие липиды, которые можно отнести к разряду минорных компонентов вследствие их малого содержания в мембранах. Так, в мембранах обычно обнаруживаются, хотя и в очень малых количествах, свободные жирные кислоты и лизофосфолипиды. Пожалуй, исключением из этого правила являются мембраны хромаффинных гранул, которые, как известно, содержат необычно много свободных жирных кислот. Минорными компонентами мембран являются также моноацил- и диацилглицеролы. Диацилглицеролы выполняют важную функцию вторых посредников в передаче сигнала при активации клеток рядом биологически активных веществ. В мембранах обычно присутствуют и полиизопреноидные липиды. К ним относятся убихиноны и менахиноны – компоненты цепи электронного транспорта в мембранах. Можно отметить также ундекапренол и долихол, которые являются липидными переносчиками промежуточных продуктов соответственно при биосинтезе клеточной стенки у прокариот и при биосинтезе гликопротеинов в аппарате Гольджи у эукариот. Длина молекул этих липидов в вытянутом состоянии значительно превышает толщину бислоя, поэтому неизвестно, как эти молекулы в нем расположены. Неясно также, почему липидными переносчиками служат именно полиизопреноидные структуры. Таким образом, совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, однако удовлетворительного объяснения этому феномену не найдено. Любая конкретная мембрана может содержать более ста разных типов липидных молекул. Почему их так много и почему каждая мембрана имеет уникальный липидный состав? Становится все более очевидным, что липиды активно участвуют в процессах, протекающих в мембранах, однако причины их разнообразия также неясны. Рассмотрим некоторые факторы, возможно, определяющие липидный состав мембраны. 1. Смесь липидов обязательно должна быть способна образовать стабильный бислой, в котором могли бы функционировать белки. 2. Некоторые липиды способствуют стабилизации сильно искривленных участков мембраны, образованию контакта между мембранами или связыванию определенных белков, поскольку форма этих молекул благоприятствует нужной упаковке бислоя на соответствующих участках мембраны. 3. Некоторые липиды являются важными биорегуляторами. Наиболее изучена в этом отношении регуляторная роль производных фосфатидилинозитола в плазматических мембранах клеток эукариот (см. разд. 9.7.3). 4. Некоторые липиды участвуют в реакциях биосинтеза. Например, в клетках Е. coli фосфатидилглицерол поставляет глицерофосфатный фрагмент при биосинтезе периплазматических олигосахаридов. 5. Отдельные липиды необходимы для поддержания оптимальной активности ряда ферментов. Этот вопрос рассматривается в гл. 6. 6. Ганглиозиды, как полагают, играют важную роль в регуляции роста клеток, являются специфическими рецепторами в плазматической мембране и ответственны за клеточную адгезию. 7. Специфические функции могут выполнять и полиизопреноиды (например, долихол, убихиноны, менахиноны и каротиноиды), а также фактор активации тромбоцитов. Как было показано экспериментально, организмы часто могут выдерживать, причем без всяких последствий, существенные изменения липидного состава мембран. Например, с помощью генетической трансформации можно получить штаммы Е. coli, в мембранах которых содержится 34% фосфатидной кислоты, обычно отсутствующей в штаммах дикого типа. Очевидно, тот липидный состав, который характерен для штаммов дикого типа, не является обязательным для выживания клеток, по крайней мере, в условиях их выращивания в лаборатории. 1.5.3. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ Мембраны содержат от 20 до 80% (по весу) белка. Как правило, именно белки ответственны за функциональную активность мембран. К ним относятся разнообразные ферменты, транспортные белки, рецепторы, каналы, поры и т. д., которые обеспечивают уникальность функций каждой мембраны. Первые успехи в изучении мембранных белков были достигнуты тогда, когда биохимики научились использовать детергенты для выделения мембранных белков в функционально активной форме. Это были работы по изучению ферментных комплексов внутренней мембраны митохондрий. Мембранные белки могут глубоко проникать в липидный бислой или даже пронизывать его, и их стабилизация осуществляется за счет гидрофобных взаимодействий. Эти термодинамические представления существенно обогатили принцип «гидрофобных сил», предложенный для объяснения структуры белков и предполагавший существование неполярной, гидрофобной области внутри белковой глобулы и полярных, гидрофильных участков, контактирующих с водной средой. По мере совершенствования методов очистки удавалось получать в изолированном виде все большее число мембранных белков. Определение первичной структуры большинства из них было затруднено из-за плохой растворимости в воде как самих белков, так и получаемых из них гидрофобных пептидов. В середине 1970-х гг. эта проблема была решена для двух мембранных белков – гликофорина и цитохрома, что позволило установить основной принцип структурной организации интегральных белков. В аминокислотной последовательности гликофорина – сиалогликопротеина из мембраны эритроцитов – был обнаружен короткий участок, состоящий из 23 неполярных аминокислот и расположенный примерно в середине цепи. Данные топологических и других исследований показали, что молекула гликофорина полностью пронизывает мембрану, причем погруженный в мембрану гидрофобный участок имеет α-спиральную конфигурацию. Так вошла в жизнь новая, теперь уже общепризнанная концепция о наличии в мембранных белках α-спиральных доменов, пронизывающих мембрану. Эта концепция была полностью подтверждена при изучении трансмембранных белков с помощью методов, которые позволяют получить максимально возможное в наше время разрешение. Судя по результатам реконструкции электронно-микроскопических изображений препаратов бактериородопсина из пурпурной мембраны Halobacterium halobium и по данным рентгеноструктурного исследования фотосинтетических реакционных центров бактерий, эти белки содержат несколько α-спиральных участков, последовательно пересекающих бислой. Другой вариант расположения полипептидной цепи в мембране был обнаружен при изучении аминокислотной последовательности интактной формы микросомного цитохрома. Было показано, что этот белок содержит относительно короткий участок вблизи карбоксильного конца, состоящий из гидрофобных аминокислот. Этот «гидрофобный якорь» можно было удалить с помощью протеолиза, причем гемсвязывающий домен высвобождался в водорастворимой форме. Локализованный в мембране гидрофобный домен, или «якорь», стал еще одним характерным элементом структуры мембранных белков. В основе современных представлений о структуре мембранных белков лежит идея о том, что их полипептидная цепь уложена так, чтобы образовалась неполярная, гидрофобная поверхность, контактирующая с неполярной областью липидного бислоя. Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут вазимодействовать с полярными головками липидов на поверхности бислоя. Многие мембранные белки являются трансмембранными и пронизывают бислой. Некоторые белки, по-видимому, связаны с мембраной лишь за счет их взаимодействия с другими белками. Мембранные белки обычно связываются с мембраной с помощью нековалентных взаимодействий – гидрофобных или электростатических сил. Однако есть мембранные белки, которые связаны с липидами ковалентно. Такие примеры пока немногочисленны, но их появляется все больше. Многие белки плазматических мембран растительных и животных клеток (например, гликофорин) относятся к классу гликопротеинов. Углеводные остатки этих белков всегда находятся с наружной стороны плазматической мембраны. Обычно мембранные белки подразделяют на наружные (периферические) и внутренние (интегральные). При этом критерием служит степень жесткости обработки, необходимой для извлечения этих белков из мембраны. Периферические белки высвобождаются при промывании мембран буферными растворами с низкой ионной силой, буферными растворами с низким или, наоборот, высоким значением рН и в присутствии хелатирующих агентов (например, ЭДТА), связывающих двухвалентные катионы. Как полагают, такие белки связаны с поверхностью мембраны за счет слабых электростатических взаимодействий с полярными головками липидных молекул либо с молекулами других белков. Часто бывает нелегко отличить периферические мембранные белки от белков, связавшихся с мембраной в процессе ее выделения. При обработке мембранного препарата буфером с низкой ионной силой в раствор переходит около 30% белков, связанных с мембраной эритроцитов. При несколько более жесткой обработке высвобождаются периферические белки. В ряде случаев эти агенты оказывают влияние достаточно сильное, чтобы разрушить белокбелковые взаимодействия, хотя денатурации белков при этом не происходит. Для высвобождения интегральных мембранных белков необходимо использовать детергенты или даже органические растворители. Детергенты разрушают липидный бислой и, как полагают, связываются с гидрофобными участками мембранных белков, контактирующими с гидрофобной областью бислоя. Для того чтобы сохранить интегральные мембранные белки в растворенном монодисперсном состоянии, в растворе постоянно должны присутствовать детергенты. При удалении детергентов неизбежно происходят агрегация белков и их последующее осаждение. Исходя из их функции выделяют следующие основные виды мембранных белков: 1. Структурные белки. Белки этой группы а) придают клетке и органеллам определенную форму; б) придают мембране (например, плазмолемме) те или иные механические свойства (эластичность и т. п.); в) обеспечивают связь мембраны с цитоскелетом или (в случае ядерной мембраны) с хромосомами. 2. Транспортные белки. Проницаемость мембран определяется их липидным бислоем. Последний же проницаем лишь для ограниченного круга веществ – не очень больших гидрофобных молекул (например, жирных кислот) и совсем мелких молекул (газов, воды и т. д.). Все прочие вещества могут перемещаться через мембрану только при наличии в ней соответствующих белковых транспортных систем. Причем одни из этих систем обеспечивают двусторонний перенос своих лигандов, а другие – только односторонний. В итоге деятельность этих систем дает два основных результата: а) создаются устойчивые транспортные потоки определенных веществ через мембраны (например, в проксимальных канальцах почек – поток глюкозы из первичной мочи в кровь через последовательно расположенную серию мембран); б) кроме того, транспорт ионов приводит к возникновению трансмембранного потенциала во всех клетках, а также к его изменениям в нервных и мышечных клетках и волокнах. Последнее же лежит в основе таких важнейших явлений, как возбудимость и проводимость. 3. Белки, обеспечивающие непосредственное межклеточное взаимодействие. Многочисленные белки этой группы можно поделить прежде всего на две совокупности: а) Т. н. адгезивные белки необходимы для связывания клеток друг с другом или неклеточными структурами (базальной мембраной, волокнами). б) Другие белки участвуют в образовании специализированных межклеточных контактов (десмосом и др.). В свою очередь, в каждой из этих совокупностей можно произвести дальнейшее деление белков, о чем будет речь позднее. 4. Последняя большая группа мембранных белков участвующие в передаче сигналов от одних клеток к другим. – белки, Такая передача осуществляется в очень многих случаях и самыми разными способами. Например, в нервных и нервно-мышечных синапсах с т. н. ионотропными рецепторами сигнальной молекулой (внеклеточным медиатором) является определенное низкомолекулярное вещество, а плазмолемма воспринимающей клетки содержит: а) рецепторные белки, б) белки эффекторного устройства – ионные каналы, изменяющие свою функцию при связывании лиганда с рецепторами, в) фермент инактивации медиатора. Как видно, участвующие в этом ионные каналы попадают сразу в две функциональные группы: кроме данной, еще и в группу транспортных белков. Помимо того, обычно эти ионные каналы сами же осуществляют и рецепторную функцию (за счет дополнительных субъединиц). Так обстоит, например, дело в случае т. н. н-холинорецепторов – они одновременно являются ионными каналами для катионов. Все это иллюстрирует сложность классификации мембранных белков, о чем уже говорилось выше. Есть синапсы и с т. н. метаботропными (медленными) рецепторами. Здесь используется иной способ передачи сигнала от клетки к клетке – такой, какой применяется и в случае гормонов нестероидной природы. Имеются в виду гормоны-белки, пептиды и производные аминокислот. Практически все они неспособны проникать через плазмолемму клеткимишени. Однако и в этих случаях мембранные белки, участвующие в процессе, обычно можно разделить на три функциональные вида: а) рецепторные белки, б) белки трансмиттерного устройства (передающего сигнал через мембрану), в) ферменты, одни из которых на внешней поверхности инактивируют сигнальное вещество, а другие на внутренней поверхности реагируют на сигнал образованием внутриклеточного медиатора. Как видно, это близко к тому, что было сказано для синапсов с ионотропными рецепторами. Таким образом, данную триаду можно распространить на большинство случаев передачи сигнала. Итак, мы перечислили четыре основные функциональные группы мембранных белков, каждая из которых обычно подразделяется далее и объединяет большое количество конкретных белков. Наличие углеводного компонента характерно практически для всех мембран клетки, но особенно для мембран вакуолярной системы и плазматической мембраны. Углеводный компонент мембран представлен главным образом гликопротеинами – молекулами белков, ковалентно (в отличие от нуклеопротеидов) связанных с цепочками углеводов – гликокаликс. Как правило, цепочки углеводов расположены в наружных слоях мембран (для цитоплазматических вакуолей наружными считают слои, обращенные не к матриксу цитоплазмы, а в полость везикул или вакуолей). Они имеют ковалентные связи с интегральными белками, образуя гликопротеиды, или с липидами (гликолипиды). Углеводы мембран представляют собой короткие линейные или разветвленные цепочки, в состав которых входят галактоза, манноза, фруктоза, сахароза, N- ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, пентозы (арабиноза и ксилоза), а также нейраминовая (сиаловая) кислота. Значение этого компонента очень велико для функционирования плазматической мембраны и обеспечения ее механической устойчивости. Как показали электронно-микроскопические исследования, особенно контрастирования с применением полисахаридов, гликокаликс специальных имеет вид методов рыхлого волокнистого слоя толщиной 3–4 нм, покрывающего всю поверхность клетки. Особенно хорошо гликокаликс выражен в щеточной каемке клеток всасывающего эпителия кишечника (энтероциты), однако он обнаружен практически у всех животных клеток, но степень его выраженности различна. Механическая устойчивость плазматической мембраны, кроме того, обеспечивается структурой примыкающего к ней со стороны цитоплазмы кортикального слоя и внутриклеточных фибриллярных структур. Кортикальный (от слова cortex – кора, кожица) слой цитоплазмы, тесно контактирующий с липопротеидной наружной мембраной, имеет ряд особенностей. Здесь в толщине 0,1–0,5 мкм отсутствуют рибосомы и мембранные пузырьки, но в большом количестве встречаются фибриллярные элементы цитоплазмы – микрофиламенты и часто микротрубочки. Основным фибриллярным компонентом кортикального слоя является сеть актиновых микрофибрилл. Здесь же располагается ряд вспомогательных белков, необходимых для движения участков цитоплазмы. Роль этих связанных с актином белков очень важна, так как она объясняет их участие в связи, в «заякоривании» интегральных белков плазматической мембраны. Так, для того чтобы проколоть ее с помощью микроигл или микропипеток, требуется довольно большое усилие. При давлении на нее микроиглы она сначала сильно прогибается, а лишь затем прорываемся. Искусственные липидные мембраны менее устойчивы. Эта механическая устойчивость плазматической мембраны может определяться дополнительными компонентами, такими как гликокаликс и кортикальный слой цитоплазмы. ОТСЮДА И ДАЛЕЕ Перенос веществ через мембраны Плазматическая мембрана, или плазмалемма, среди различных клеточных мембран периферическая занимает структура, особое место. ограничивающая Это клетку поверхностная снаружи, что обусловливает ее непосредственную связь с внеклеточной средой, а, следовательно, со всеми веществами и стимулами, воздействующими на клетку. Поэтому плазматическая мембрана играет роль барьера, преграды между сложно организованным внутриклеточным содержимым и внешней средой. В этом случае плазмалемма выполняет не только роль механического барьера, но, главное, ограничивает свободный поток низко- и высокомолекулярных веществ в обе стороны через мембрану. Более того, плазмалемма выступает как структура, «узнающая», рецептирующая, различные химические вещества и регулирующая избирательно транспорт этих веществ в клетку и из нее. Другими словами, плазматическая мембрана осуществляет функции, связанные с регулируемым избирательным трансмембранным транспортом веществ, и исполняет роль первичного клеточного анализатора. Барьерная роль плазмалеммы заключается также в ограничении свободной диффузии веществ. Модельные опыты на искусственных липидных мембранах показали, что они проницаемы для воды, газов, малых неполярных молекул жирорастворимых веществ, но совершенно не проницаемы для заряженных молекул (ионы) и для крупных незаряженных (сахара) (рис. 1). Естественные мембраны также ограничивают скорость проникновения низкомолекулярных соединений в клетку. Рис. 1. Проницаемость искусственного билипидного слоя для различных молекул (из Ченцова….). Перенос низкомолекулярных веществ через мембрану Простая диффузия Простая диффузия характерна для небольших нейтральных молекул (H2O, CO2, O2), а также гидрофобных низкомолекулярных органических веществ жирные кислоты, мочевина). Эти молекулы могут проходить без какого-либо взаимодействия с мембранными белками через поры или каналы мембраны до тех пор, пока будет сохраняться градиент концентрации. При увеличении разности концентраций между отсеками, разделенными мембраной, прямо пропорционально будет расти и скорость диффузии. При выравнивании концентраций диффузия прекращается, а если соотношение концентраций меняется на противоположное, то меняется и направление диффузии. Это имеет место, в частности, в случае прохождения СО2 через мембрану эритроцитов: в капиллярах тканей СО2 диффундирует из плазмы в эритроциты, а в капиллярах легких – наоборот, из эритроцитов в плазму. Все определяется соотношением концентраций СО2 в этих компартментах. Облегченная диффузия При данном способе переноса вещество проходит через мембрану тоже по направлению градиента своей концентрации (т.е. в компартмент с меньшей концентрацией), но не самостоятельно, а с помощью специального транспортного белка – транслоказы. Транслоказы – интегральные белки, обладающие большей или меньшей специфичностью в отношении переносимых веществ. Примеры – анионные каналы в плазмолемме эритроцитов, К+-каналы в плазмолемме возбудимых клеток, Са+-каналы в мембранах саркоплазматического ретикулума и т. д. Практически всегда с помощью транслоказы переносится такое вещество, которое не способно к простой диффузии через мембрану. Но есть и исключение – перенос воды через мембраны почечных канальцев и секреторных эпителиальных клеток. Вода способна самостоятельно пересекать липидный бислой. Однако для интенсификации ее диффузии в указанных мембранах есть специальная транслоказа – аква-порин. Механизм действия транслоказ заключается в следующем. Как правило, транслоказы состоят из нескольких субъединиц. С учетом этого возможно несколько вариантов. 1. Между субъединицами имеется всегда открытый гидрофильный канал, доступный лишь для веществ определенного размера и заряда. 2. Канал открывается только при связывании с одной из его сторон специфического лиганда. 3. Канала как такового не образуется вовсе, а перенос осуществляется путем поворота транслоказы (вместе со связанным лигандом) в плоскости мембраны на 180°. В результате лиганд, связавшийся на одной стороне мембраны, высвобождается с другой стороны. Независимо от механизма, направление и скорость переноса вещества транслоказой определяются разностью концентраций этого вещества по обе стороны мембраны. Молекулы лиганда могут связываться с транслоказой как с одной, так и с другой стороны и, соответственно, переноситься в обоих направлениях. Но там, где концентрация выше, связывание и перенос будут происходить чаще, что и определит общий результат диффузии. При изменении градиента концентрации возможно изменение направления облегченной диффузии. Например, в капиллярах тканей и легких перенос бикарбонат-ионов через анионные каналы плазмолеммы эритроцитов происходит в противоположных направлениях. Вместе с тем, возможен феномен, отсутствующий при простой диффузии – так называемое явление насыщения. Это значит, что при неуклонном повышении концентрации лиганда с одной стороны мембраны скорость переноса может расти не беспредельно, а лишь до некоторого предела. При этой максимальной скорости каждая транслоказа функционирует без периодов «простоя»: после высвобождения молекулы лиганда с одной стороны тут же следует связывание очередной молекулы с другой стороны. Дальнейшая же интенсификация деятельности транслоказы уже невозможна. Аналогичный феномен, как известно, присущ и ферментам. В связи с этим транслоказы можно рассматривать как «ферменты», катализирующие перемещение веществ через мембраны. Активный транспорт Активный транспорт имеет место в том случае, когда вещество проходит через мембрану с помощью специального транспортного белка (транслоказы), но против градиента своей концентрации, т.е. из компартмента с меньшей концентрацией в компартмент с большей концентрацией. Такое перемещение требует затрат энергии клеткой. Следовательно, транспортная система должна осуществлять и энергетическое обеспечение переноса. Данная проблема решается разными способами. 1. Сопряжение переноса вещества с энергодающей реакцией (как правило, такой реакцией служит гидролиз АТФ). В простейшем варианте сама транслоказа обладает АТФазной активностью (как показано на рис. 4.9,в). Таков, в частности, Са2+-насос, закачивающий ионы Са2+ в цистерны саркоплазматического ретикулума. В других случаях к гидролизу АТФ приводит более сложная совокупность реакций, сопряженных с переносом вещества. Например, транспорт аминокислот в эпителиальные клетки кишечника в процессе всасывания. Здесь аминокислота, прошедшая с помощью транслоказы через мембрану, сразу же реагирует с трипептидом глутатионом – так, что образуются два дипептида. Тем самым снижается концентрация данной аминокислоты в примембранном пространстве клетки, что облегчает диффузию через мембрану новых порций аминокислоты. Затем происходит серия реакций, идущих с выделением энергии: - распад обоих дипептидов и - ресинтез глутатиона с затратой трех молекул АТФ. В итоге получается, что для всасывания 1-й молекулы аминокислоты расходуется энергия 3-х молекул АТФ (-150 кДж/моль аминокислоты). Это более чем достаточно для преодоления концентрационного барьера. Кроме гидролиза АТФ, непосредственным источником энергии для активного транспорта может быть окислительно-восстановительный процесс. Так, в частности, обстоит дело в митохондриях. В ходе перемещения электронов по дыхательной цепи выделяется энергия, которая служит для откачки протонов из матрикса в межмембранное пространство (через внутреннюю митохондриальную мембрану). Тем самым создается протонный градиент, энергия которого затем используется для синтеза АТФ (в ходе обратного перемещения протонов в матрикс по градиенту концентрации через другую транспортную систему – АТФазу). 2. Сопряжение переноса вещества (против X градиента концентрации) с пассивным переносом другого вещества Y (по градиенту его концентрации). В данном случае выделяют два варианта трансмембранного переноса веществ: симпорт и антипорт. В случае симпорта оба вещества переносятся транслоказой в одну сторону, т.. молекулы Y, диффундируя по градиенту своей концентрации, как бы тянут вместе с собой соединение X. Таков, в частности, механизм реабсорбции глюкозы в канальцах почек: она проникает в эпителиальную клетку путем симпорта с ионами Na+. Если оба вещества, участвующие в симпорте, являются ионами, то они имеют разноименные заряды. При антипорте, вещества переносятся транслоказой во взаимно противоположных направлениях. Т.е. молекулы Y как бы обмениваются на молекулы X. Но у эукариот антипорт весьма редко используется как средство энергообеспечения распространена трансмембранного система, где путем переноса. антипорта Гораздо сразу оба более вещества перемещаются против градиента своей концентрации, при этом источником энергии служит АТФ. Например, Na+,K+-нacoc или Na+,К+-зависимая ATФаза, присутствующая в плазмолемме почти всех клеток, при антипорте этих ионов последние имеют одноименные заряды. После этих общих сведений рассмотрим подробней некоторые из упомянутых выше транспортных систем. Системы переноса низкомолекулярных веществ Натрий-калиевый насос Na+,K+-нacoc этот белок включает две а- и две Р-субъединицы. Используя энергию АТФ, он переносит ионы Na+ и К+ против градиента их концентрации: ионы Na+ – из клетки, а ионы К+ – в клетку. Именно благодаря деятельности этого насоса создается резко асимметричное распределение данных ионов между клеточной и внутриклеточной средой. Концентрация ионов Na+ значительно выше вне клеток, а ионов К+ – внутри клеток. Важная особенность деятельности насоса – характерная стехиометрия: за счет распада 1-й молекулы АТФ происходит выкачивание 3-х ионов Na+ и одновременно закачивание в клетку 2-х ионов К+. Расчеты показывают, что при этом рассеивается только 10 % энергии АТФ; остальные 90 % преобразуются в энергию концентрационных градиентов. Такая эффективность преобразования энергии, очевидно, является очень высокой. Насос имеет некую полость. В начале очередного цикла она открыта с внутренней стороны мембраны, где ее заполняют 3 иона Na+. Для преодоления электрического отталкивания между ионами требуется энергия. Связывание ионов Na+ инициирует гидролиз молекулы АТФ. Однако этот гидролиз не только энергетически обеспечивает первую стадию цикла, но и, в свою очередь, инициирует следующую стадию. Так, фосфатная группа переносится от АТФ на белок, что изменяет его конформацию. В результате полость с ионами Na+ открывается с другой стороны мембраны – наружной. Сила электрического отталкивания между ионами заставляет последних высвобождаться во внеклеточную среду, несмотря на высокую их концентрацию здесь. Вместо ионов Na+ полость заполняют 2 иона К+. Не исключено, что меньшее количество этих ионов обусловлено просто тем, что они крупнее. Правда, в водном растворе ионы Na+ эффективней притягивают воду и за счет гидратной оболочки оказываются больше. Другое объяснение может состоять в том, что для двух ионов гораздо меньше сила электрического отталкивания. И, наконец, по третьей точке зрения, дело вовсе не в размерах полости и ионов, а «просто» в числе связывающих центров у насоса: для Na+ их – 3, а для К+ – 2. Как бы то дефосфорилирование ни было, связывание транслоказы. Это, с ионов одной К+ инициирует стороны, видимо, высвобождает остатки энергии АТФ, сохранявшиеся в связи фосфатной группы. А, с другой стороны, дефосфорилирование возвращает конформацию транслоказы в исходное состояние: ее полость вновь открывается с внутренней стороны мембраны, отчего здесь высвобождаются ионы К+. Так завершается цикл работы насоса. Имеется важная группа лекарственных средств, которые тормозят действие Na+,K+-нacoca. Это сердечные гликозиды (алкалоиды наперстянки). Они конкурируют с ионами К+ за связывание с транслоказой с ее наружной стороны. Более всего действие данных средств проявляется в отношении сердечной мышцы. Поэтому в саркоплазме кардиомиоцитов возрастает концентрация Na+. Это снижает возбудимость миокарда. Одновременно увеличивается концентрация ионов Са2+ (видимо, из-за того, что их транспорт из клетки происходит в обмен на внеклеточные ионы Na+, так что при большей внутриклеточной концентрации Na+ обмен происходит слабее). Ионы же Са2+ повышают сократимость миокарда. В итоге сокращения сердца становятся более редкими и более сильными. При передозировке сердечных гликозидов их действие можно ослабить путем введения больному препаратов К+. Тогда ионы К+ вытесняют гликозиды из связи с Na+,K+-нacocoм. Перенос через мембраны частиц и высокомолекулярных соединений Переход частиц через плазмолемму происходит в составе мембранного пузырька.При этом по направлению транспорта и по характеру переносимых веществ различают следующие процессы. 1. Эндоцитоз – перенос частиц в клетку. Его разновидности: а) пиноцитоз – захват и поглощение клеткой растворимых макромолекулярных соединений; б) фагоцитоз – то же самое, но в отношении твердых частиц; в) эндоцитоз, опосредованный рецепторами, – поглощаемый субстрат предварительно поверхностными специфически рецепторами связывается плазмолеммы. с Это очень частый вариант фаго- и пиноцитоза, особенно в иммунных процессах. Во всех перечисленных случаях в месте проникновения субстрата вначале происходит впячивание плазмолеммы в цитоплазму. Затем оно все углубляется, пока не превращается в мембранный пузырек, содержащий субстрат и полностью находящийся в цитоплазме. 2. Экзоцитоз – перенос частиц и крупных соединений из клетки. Наиболее распространенный способ экзоцитоза – секреция. Это такое выведение из клетки растворимых соединений, которое является одной из функций данной клетки. Из приведенного определения следует, что секреция может быть проявлением не только экзоцитоза, но и экспорта низкомолекулярных соединений. Действительно, под секрецией понимают выделение из клетки веществ разного размера: высокомолекулярных (например, белковых гормонов в передней доле гипофиза), низкомолекулярных (ионов Н+ в желудке и почках, биологически активных аминов в соединительной ткани, медиаторов в пресинаптических окончаниях и т. д.). В одних случаях накопление веществ в клетке происходит в виде секреторных пузырьков. Затем мембрана пузырьков сливается с плазмолеммой (с соблюдением полярности мембран) – так, что содержимое пузырьков оказывается вне клетки. Так могут секретироваться как высоко-, так и низкомолекулярные соединения. Пример: секреция гормонов и медиаторов. Реже секреция совершается по типу облегченной диффузии или активного транспорта. Очевидно, такой механизм может относиться лишь к низкомолекулярным веществам. Пример: секреция ионов Н+ в желудке и почках. Заметим, что в понятие секреции обычно не включают выведение из клетки обычных продуктов ее обмена, а также выведение из нее таких ионов (например, Na+), которые остаются в окружающей клетку среде. Если из клетки удаляются твердые частицы, то такую разновидность экзоцитоза называют экскрецией. Примером экскреции может служить происходящее в конце эритропоэза удаление из ретикулоцитов сетчатой субстанции (агрегированных остатков органелл). Видимо, механизм экскреции вновь состоит в том, что вначале выделяемые частицы оказываются в цитоплазматическом пузырьке, который затем сливается с плазмолеммой. Наконец, существует еще одно понятие – рекреция. Это перенос твердых веществ через клетку; фактически здесь сочетаются фагоцитоз и экскреция. Видимо, о данном феномене можно говорить применительно к тем специализированным макрофагам (М-клеткам, дендритным клеткам, клеткам Лангерганса), которые постоянно локализованы в эпителии слизистых оболочек и кожи. Поглощая с одной своей стороны бактериальные частицы и выделяя их «обломки» с другой стороны («представляя» таким образом антигены подлежащим лимфоцитам), эти клетки осуществляют, по существу, рекрецию. Межклеточное узнавание У многоклеточных организмов за счет межклеточных взаимодействий образуются сложные клеточные ансамбли, поддержание которых может осуществляться разными путями. В зародышевых, эмбриональных тканях, особенно на ранних стадиях развития, клетки остаются в связи друг с другом из-за способности их поверхностей слипаться. Это свойство адгезии (соединения, сцепления) клеток может определяться свойствами их поверхности, которые специфически взаимодействуют друг с другом. Механизм этих связей достаточно хорошо изучен, он обеспечивается взаимодействием между гликопротеидами плазматических мембран. При таком межклеточном взаимодействии клеток между плазматическими мембранами всегда остается щель шириной около 20 нм, заполненная гликокаликсом. Обработка ткани ферментами, нарушающими целостность гликокаликса (муказами, действующими гидролитически на муцины, мукополисахариды) или повреждающими плазматическую мембрану (протеазами), приводит к обособлению клеток друг от друга, к их диссоциации. Однако если удалить фактор диссоциации, то клетки могут снова собираться, реагрегировать. Так можно диссоциировать клетки разных по окраске губок, оранжевых и желтых. Оказалось, что в смеси этих клеток образуются два типа агрегатов: одни состоят только из желтых, другие – только из оранжевых клеток. При этом смешанные клеточные суспензии самоорганизуются, восстанавливая исходную многоклеточную структуру. Сходные результаты были получены с суспензиями разделенных клеток эмбрионов амфибий; в этом случае происходит избирательное пространственное обособление клеток эктодермы от энтодермы и от мезенхимы. Более того, если для реагрегации используются ткани поздних стадий развития зародышей, то в пробирке самостоятельно собираются различные клеточные ансамбли, обладающие тканевой и органной специфичностью, образуются эпителиальные агрегаты, сходные с почечными канальцами, и т. д. За агрегацию однородных клеток отвечают трансмембранные гликопротеиды. Непосредственно за соединение – адгезию, клеток отвечают молекулы так называемых САМ-белков (cell adhesion molecules). Некоторые из них связывают клетки друг с другом за счет межмолекулярных взаимодействий, другие образуют специальные межклеточные соединения, или контакты. Взаимодействия между адгезивными белками могут быть гомофильными, когда соседние клетки связываются друг с другом с помощью однородных молекул, и гетерофильными, когда в адгезии участвуют разного рода САМ на соседних клетках. Встречается межклеточное связывание через дополнительные линкерные молекулы. Имеется несколько классов САМ-белков: кадгерины, иммуноглобулиноподобные N-CAM (молекулы адгезии нервных клеток), селектины, интегрины. Кадгерины представляют собой интегральные фибриллярные мембранные белки, которые образуют параллельные гомодимеры. Отдельные домены этих белков связаны с ионами Са2+, что придает им определенную жесткость. Насчитывают более 40 видов кадгеринов. Так, Е-кадгерин характерен для клеток преимплантированных эмбрионов и для эпителиальных клеток взрослых организмов, Р-кадгерин – для клеток трофобласта, плаценты и эпидермиса, N-кадгерин располагается на поверхности нервных клеток, клеток хрусталика, на сердечных и скелетных мышцах. Молекулы адгезии нервных клеток (N-CAM) принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов, они образуют связи между нервными клетками. Некоторые из N-CAM участвуют в соединении синапсов, а также при адгезии клеток иммунной системы. Селектины – интегральные белки плазматической мембраны, участвуют в адгезии эндотелиальных клеток, в связывании кровяных пластинок, лейкоцитов. Интегрины представляют собой гетеродимеры, с - и -цепями. Интегрины в первую очередь осуществляют связь клеток с внеклеточными субстратами, но могут участвовать и в адгезии клеток друг с другом. Как уже указывалось, на попавшие в организм чужеродные макромолекулы (антигены) развивается сложная комплексная реакция – иммунная реакция. Суть ее заключается в том, что часть лимфоцитов вырабатывает специальные белки-антитела, которые специфически связываются с антигенами. Так, макрофаги своими поверхностными рецепторами узнают комплексы антиген-антитело и поглощают их (например, поглощение бактерий при фагоцитозе). В организме всех позвоночных, кроме того, существует система рецепции чужеродных клеток или же своих, но с измененными белками плазматической мембраны, например при вирусных инфекциях или при мутациях, часто связанных с опухолевым перерождением клеток. На поверхности всех клеток позвоночных располагаются белки так называемого главного комплекса гистосовместимости (МНС – histocompatibility complex). Это интегральные белки major гликопротеины, гетеродимеры. Очень важно запомнить, что каждый индивидуум имеет свой набор таких белков МНС. Это связано с тем, что они очень полиморфны, так как в каждом индивидуме имеется большое число альтернативных форм одного и того же гена (более 100); кроме того, имеется 7-8 локусов, кодирующих молекулы МНС. Это приводит к тому, что каждая клетка данного организма, имея набор белков МНС, будет отличаться от клеток индивидуума этого же вида. Специальная форма лимфоцитов – Т- лимфоциты, узнают МНС своего организма, но малейшие изменения в структуре МНС (например, связь с вирусом или результат мутации в отдельных клетках) приводят к тому, что Т-лимфоциты узнают такие изменившиеся клетки и уничтожают их, но не путем фагоцитоза. Они выделяют из секреторных вакуолей специфические белки-перфорины, которые встраиваются в цитоплазматическую мембрану измененной клетки, образуют в ней трансмембранные каналы, делая плазматическую мембрану проницаемой, что и приводит к гибели измененной клетки (рис. 143 и 144). Специальные межклеточные соединения (контакты) Кроме таких сравнительно простых адгезивных (но специфических) связей (рис. 145) существует целый ряд специальных межклеточных структур – контактов, или соединений, которые выполняют определенные функции. Это запирающие, заякоривающие и коммуникационные соединения (рис. 146). Запирающее, или плотное, соединение характерно для однослойных эпителиев. Это зона, где внешние слои двух плазматических мембран максимально сближены. Часто видна трехслойность мембраны в этом контакте: два внешних осмофильных слоя обеих мембран как бы сливаются в один общий слой толщиной 2– 3 нм. Слияние мембран происходит не по всей площади плотного контакта, а представляет собой ряд точечных сближений мембран (рис. 147, а и 148). На плоскостных препаратах разломов плазматической мембраны в зоне плотного контакта с помощью метода замораживания и скалывания было обнаружено, что точки соприкосновения мембран представляют собой ряды глобул. Это белки окклудин и клаудин – специальные интегральные белки плазматической мембраны, встроенные рядами. Такие ряды глобул, или полоски, могут пересекаться так, что образуют на поверхности скола как бы решетку, или сеть. Очень характерна эта структура для эпителиев, особенно железистых и кишечных. В последнем случае плотный контакт образует сплошную зону слияния плазматических мембран, опоясывающую клетку в апикальной (верхней, смотрящей в просвет кишечника) ее части (см. рис. 148). Таким образом, каждая клетка пласта как бы обведена лентой этого контакта. Такие структуры при специальных окрасках можно видеть и в световом микроскопе. Они получили у морфологов название замыкающих пластинок. Оказалось, что в данном случае роль замыкающего плотного контакта заключается не только в механическом соединении клеток друг с другом. Эта область контакта плохо проницаема для макромолекул и ионов, и тем самым она запирает, перегораживает межклеточные полости, изолируя их (и вместе с ними собственно внутреннюю среду организма) от внешней среды (в данном случае – просвет кишечника). Это можно контрастеры, продемонстрировать, например раствор используя гидроокиси электронно-плотные лантана. Если просвет кишечника или протока какой-нибудь железы наполнить раствором гидроокиси лантана, то на срезах под электронным микроскопом зоны, где располагается это вещество, обладают высокой электронной плотностью и будут темными. Оказалось, что ни зона плотного контакта, ни межклеточные пространства, лежащие ниже его, не темнеют. Если же повредить плотные контакты (легкой ферментативной обработкой или удалением ионов Са2+), то лантан проникает и в межклеточные участки. Точно так же была доказана непроницаемость плотных контактов для гемоглобина и ферритина в канальцах почек. Таким образом, плотные контакты являются барьерами не только для макромолекул, они непроницаемы для жидкостей и ионов. Замыкающий, или плотный, контакт встречается между всеми типами однослойного эпителия (эндотелий, мезотелий, эпендима). Заякоривающие, или сцепляющие, соединения, или контакты, так называются потому, что они соединяют не только плазматические мембраны соседних клеток, но и связываются с фибриллярными элементами цитоскелета (рис. 149). Для этого рода соединений характерным является наличие двух типов белков. Первый тип представлен трансмембранными линкерными (связующими) белками, которые участвуют или в собственно межклеточном соединении или в соединении плазмалеммы с компонентами внеклеточного матрикса (базальная мембрана эпителиев, внеклеточные структурные белки соединительной ткани). Ко второму типу относятся внутриклеточные белки, соединяющие, или заякоривающие, мембранные элементы такого контакта с цитоплазматическими фибриллами цитоскелета. К заякоривающим соединениям относятся межклеточные сцепляющие точечные контакты, сцепляющие ленты, фокальные контакты, или бляшки сцепления; все эти контакты связываются внутри клеток с актиновыми микрофиламентами. Другую группу заякоривающих межклеточных соединений составляют десмосомы и полудесмосомы; они связываются с другими элементами цитоскелета – промежуточными филаментами. Межклеточные точечные сцепляющие соединения обнаружены у многих неэпителиальных тканей, но более отчетливо описана структура сцепляющих (адгезивных) лент в однослойных эпителиях (рис. 150). Эта структура опоясывает весь периметр эпителиальной клетки, подобно тому, как это происходит в случае плотного соединения. Чаще всего такой поясок, или лента, лежит ниже плотного соединения (см. рис. 146). В этом месте плазматические мембраны не сближены, а даже несколько раздвинуты на расстояние 25-30 нм, и между ними видна зона повышенной плотности. Это не что иное, как места взаимодействия трансмембранных гликопротеинов, которые специфически сцепляются друг с другом и обеспечивают механическое соединение мембран двух соседних клеток. Эти линкерные белки относятся к Е-кадгеринам – белкам, обеспечивающим специфическое узнавание клетками однородных мембран. Разрушение этого слоя гликопротеидов приводит к обособлению отдельных клеток и к разрушению эпителиального пласта. С цитоплазматической стороны около мембраны видно скопление какого-то плотного вещества, к которому примыкает слой тонких (6-7 нм) филаментов, лежащих вдоль плазматической мембраны в виде пучка, идущего по всему периметру клетки. Тонкие филаменты относятся к актиновым фибриллам, они связываются с плазматической мембраной посредством белков катенина, винкулина и осактинина, образующих плотный околомембранный слой. Функциональное значение такого ленточного соединения заключается не только в механическом сцеплении клеток друг с другом: при сокращении актиновых филаментов в ленте может изменяться форма клетки. Считается, что кооперативное сокращение актиновых фибрилл во всех клетках эпителиального пласта может вызвать изменение его геометрии, например сворачивание в трубку, подобно тому, что происходит при образовании нервной трубки у эмбрионов позвоночных. Фокальные контакты, или бляшки сцепления, встречаются у многих клеток и особенно хорошо изучены у фибробластов. Они построены по общему плану со сцепляющими лентами, но выражены в виде небольших участков – бляшек – на плазмалемме. В этом случае трансмембранные линкерные белки-интегрины специфически связываются с белками внеклеточного матрикса (например, с фибронектином) (рис. 151). Со стороны цитоплазмы эти же гликопротеиды связаны с примембранными белками, куда входит и винкулин, который в свою очередь связан с пучком актиновых филаментов. Функциональное значение фокальных контактов заключается как в закреплении клетки на внеклеточных структурах, так и в создании механизма, позволяющего клеткам перемещаться. Десмосомы – структуры в виде бляшек или кнопок, также соединяют клетки друг с другом (рис. 152 и 153, а). В межклеточном пространстве здесь также виден плотный слой, представленный взаимодействующими интегральными мембранными кадгеринами – десмоглеинами, которые сцепляют клетки друг с другом. С цитоплазматической стороны к плазмалемме прилежит слой белка-десмоплакина, с которым связаны промежуточные филаменты цитоскелета. Десмосомы встречаются чаще всего в эпителиях, в этом случае промежуточные филаменты содержат кератины. Клетки сердечной мышцы – кардиомиоциты, содержат десминовые фибриллы в составе десмосом. В эндотелии сосудов в состав десмосом входят виментиновые промежуточные филаменты. Полудесмосомы в принципе сходны по строению с десмосомой, но представляют собой соединение клеток с межклеточными структурами. Так, в эпителиях линкерные гликопротеиды (интегрины) десмосомы взаимодействуют с белками так называемой базальной мембраны, куда входят коллаген, ламинин, протеогликаны и др. Функциональная роль десмосом и полудесмосом сугубо механическая: они сцепляют клетки друг с другом и с подлежащим внеклеточным матриксом прочно, что позволяет эпителиальным пластам выдерживать большие механические нагрузки. Подобно этому десмосомы прочно связывают друг с другом клетки сердечной мышцы, что позволяет им выполнять огромную механическую нагрузку, оставаясь связанными в единую сокращающуюся структуру. В отличие от плотного контакта все типы сцепляющих контактов проницаемы для водных растворов и не играют никакой роли в ограничении диффузии. Щелевые контакты считаются коммуникационными соединениями клеток. Эти структуры участвуют в прямой передаче химических веществ из клетки в клетку, что может не только играть большую физиологическую роль при функционировании специализированных клеток, но и обеспечивать межклеточные взаимодействия при развитии организма, при дифференцировке его клеток. Характерным для этого типа контактов является сближение плазматических мембран двух соседних клеток на расстояние 2–3 нм (см. рис. 147, б и 153, б). Именно это обстоятельство долгое время не позволяло на ультратонких срезах отличить данный вид контакта от плотного разделительного (замыкающего) контакта. При использовании гидроокиси лантана было замечено, что некоторые плотные контакты пропускают контрастер. В этом случае лантан заполнял тонкую щель шириной около 3 нм между сближенными плазматическими мембранами соседних клеток. Это и послужило появлению термина щелевой контакт. Дальнейший прогресс в расшифровке его строения был достигнут при использовании метода замораживания-скалывания. Оказалось, что на сколах мембран зоны щелевых контактов (размером от 0,5 до 5 мкм) усеяны гексагонально расположенными (с периодом 8-10 нм) частицами 7-8 нм в диаметре, имеющими в центре канал около 2 нм шириной. Эти частицы получили название коннексонов (рис. 154). В зонах щелевого контакта может быть от 10-20 до нескольких тысяч коннексонов в зависимости от функциональных особенностей клеток. Коннексоны были выделены препаративно, они состоят из шести субъединиц коннектина – белка с молекулярной массой около 30 тыс. Объединяясь друг с другом, коннектины образуют цилиндрический агрегат – коннексон, в центре которого располагается канал. Отдельные коннексоны встроены в плазматическую мембрану так, что прободают ее насквозь. Одному коннексону на плазматической мембране клетки точно противостоит коннексон на плазматической мембране соседней клетки, так что каналы двух коннексонов образуют единое целое. Коннексоны играют роль прямых межклеточных каналов, по которым ионы и низкомолекулярные вещества могут диффундировать из клетки в клетку. Коннексоны могут закрываться, изменяя диаметр внутреннего канала, и тем участвовать в регуляции транспорта молекул между клетками. При изучении гигантских клеток слюнных желез двукрылых выяснилось, какое функциональное значение имеют щелевые контакты. В такие клетки благодаря их величине легко можно вводить микроэлектроды для того, чтобы изучать электропроводимость их мембран. Оказалось, что если ввести электроды в две соседние клетки, то их плазматические мембраны проявляют низкое электрическое сопротивление, т. е. между клетками идет ток. Более того, выявлено, что при инъекции в одну клетку флуоресцирующего красителя метка быстро обнаруживается в соседних клетках. Используя разные флуорохромы на клетках культуры ткани млекопитающих, обнаружили, что через щелевые контакты могут транспортироваться вещества с молекулярной массой не более 1-1,5 тыс. и размером не более 1,5 нм (у насекомых через щелевой контакт могут проходить вещества с молекулярной массой до 2 тыс.). Среди этих веществ были разные ионы, аминокислоты, нуклеотиды, сахара, витамины, стероиды, гормоны, цАМФ. Ни белки, ни нуклеиновые кислоты через щелевые контакты проходить не могут. Такая способность щелевых контактов служить местом транспорта низкомолекулярных соединений используется в тех клеточных системах, где нужна быстрая передача электрического импульса (волны возбуждения) от клетки к клетке без участия нервного медиатора. Так, все мышечные клетки миокарда сердца связаны с помощью щелевых контактов (кроме того, клетки там связаны и адгезивными контактами) (см. рис. 147, б). Это создает условие для синхронного сокращения огромного количества клеток. При росте культуры эмбриональных сердечных мышечных клеток (миокардиоцитов) некоторые клетки в пласте начинают независимо друг от друга спонтанно сокращаться с разной частотой, и лишь после образования между ними щелевых контактов они начинают биться синхронно, как единый сокращающийся пласт клеток. Таким же способом обеспечивается совместное сокращение гладкомышечных клеток в стенке матки. Щелевые контакты могут служить целям метаболической кооперации между клетками, обмениваясь различными молекулами, гормонами, цАМФ или метаболитами. Примером может служить совместное культивирование мутантных по тимидинкиназе клеток с нормальными: при возникновении щелевых контактов между этими типами клеток мутантные клетки через щелевые контакты получали от нормальных клеток тимидинтрифосфат и могли участвовать в синтезе ДНК. У ранних эмбрионов позвоночных, начиная с восьмиклеточной стадии, большинство клеток связано друг с другом щелевыми контактами. По мере дифференцировки эмбриона щелевые контакты между всеми клетками исчезают и остаются только между группами специализирующихся клеток. Например, при образовании нервной трубки связь клеток этой структуры с остальным эпидермисом прерывается и они разобщаются. Целостность и функционирование щелевых контактов сильно зависят от уровня ионов Са2+ внутри клетки. В норме концентрация кальция в цитоплазме очень низка. Если Са2+ инъецировать в одну из клеток пласта культуры тканей, то в соседних клетках увеличения уровня Са2+ в цитоплазме не происходит; клетки как бы разобщаются с соседями, перестают проводить электрический ток и красители. Через некоторое время, после того как введенный кальций будет аккумулирован митохондриями, структура и функции щелевых контактов восстанавливаются. Такое свойство очень важно для поддержания целостности и работы всего слоя клеток, так как повреждение одной из них не передается на соседний через щелевые контакты, которые перестают работать как межклеточные диффузионные каналы. Синаптический контакт (синапсы). Этот тип контактов характерен для нервной ткани и встречается как между двумя нейронами, так и между нейроном и каким-либо иным элементом – рецептором или эффектором (например, нервно-мышечное окончание). Синапсы – участки контактов двух клеток, специализированных для односторонней передачи возбуждения или торможения от одного элемента к другому (рис. 155). В принципе подобного рода функциональная нагрузка, передача импульса, может осуществляться и другими типами контактов (например, щелевым контактом в сердечной мышце), однако в синаптической связи достигается высокая эффективность в реализации нервного импульса. Синапсы образуются на отростках нервных клеток – это терминальные участки дендритов и аксонов. Межнейронные синапсы обычно имеют вид грушевидных расширений – бляшек на конце отростка нервной клетки. Такое терминальное расширение отростка одной из нервных клеток может контактировать и образовывать синаптическую связь как с телом другой нервной клетки, так и с ее отростками. Периферические отростки нервных клеток (аксоны) образуют специфические контакты с клетками-эффекторами или клетками- рецепторами. Следовательно, синапс – это структура, образующаяся между участками двух клеток (так же как и десмосома). Мембраны этих клеток разделены межклеточным пространством – синаптической щелью шириной около 20-30 нм. Часто в просвете этой щели виден тонковолокнистый, перпендикулярно расположенный по отношению к мембранам материал. Мембрана в области синаптического контакта одной клетки называется пресинаптической, мембрана другой клетки, воспринимающей импульс, – постсинаптической. В электронном микроскопе обе мембраны выглядят плотными, толстыми. Около пресинаптической мембраны выявляется огромное количество мелких вакуолей – синаптических пузырьков, заполненных медиаторами. Синаптические пузырьки в момент прохождения нервного импульса выбрасывают свое содержимое в синаптическую щель. Постсинаптическая мембрана часто выглядит толще обычных мембран из-за скопления около нее со стороны цитоплазмы множества тонких фибрилл. Плазмодесмы. Этот тип межклеточных связей встречается у растений. Плазмодесмы представляют собой тонкие трубчатые цитоплазматические каналы, соединяющие две соседние клетки. Диаметр этих каналов обычно составляет 20-40 нм. Ограничивающая эти каналы мембрана непосредственно переходит в плазматические мембраны соседствующих клеток. Плазмодесмы проходят сквозь клеточную стенку, разделяющую клетки (рис. 156 и 157). Таким образом, у некоторых растительных клеток плазмодесмы соединяют гиалоплазму соседних клеток, поэтому формально здесь нет полного разграничения, отделения тела одной клетки от другой, это скорее представляет собой синцитий: объединение многих клеточных территорий с помощью цитоплазматических мостиков. Внутрь плазмодесм могут проникать мембранные трубчатые элементы, соединяющие цистерны эндоплазматического ретикулума соседних клеток. Образуются плазмодесмы во время деления клетки, когда строится первичная клеточная оболочка. У только что разделившихся клеток число плазмодесм может быть очень велико (до 1000 на клетку), при старении клеток их число падает за счет разрывов при увеличении толщины клеточной стенки. Функциональная роль плазмодесм очень велика: с их помощью обеспечивается межклеточная циркуляция растворов, содержащих питательные вещества, ионы и другие соединения. По плазмодесмам могут перемещаться липидные капли. Через плазмодесмы происходит заражение клеток растительными вирусами. Цитоплазма Цитоплазма, отделенная от окружающей среды плазмолеммой, включает в себя гиалоплазму, находящиеся в ней обязательные клеточные компоненты – органеллы, а также различные непостоянные структуры – включения. Гиалоплазма Гиалоплазма – основная плазма, или матрикс цитоплазмы, представляет собой очень важную часть клетки, ее истинную внутреннюю среду. В электронном микроскопе гомогенного или тонкозернистого плотностью. Гиалоплазма является матрикс цитоплазмы вещества сложной с низкой имеет вид электронной коллоидной системой включающей в себя различные биополимеры: белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и др. Эта система спосо6на переходить из золеобразного (жидкого) состояния в гелеобразное и обратно. В организованной, упорядоченной многокомпонентной системе гиалоплазмы отдельные зоны могут менять свое агрегатное состояние в зависимости от условий или от функциональной задачи; в бесструктурной на взгляд гиалоплазме могут возникать и распадаться различные фибриллярные, нитчатые комплексы белковых молекул. В состав гиалоплазмы входят главным образом различные глобулярные белки. Они составляют 20-25% общего содержания белков в эукариотической клетке. К важнейшим ферментам гиалоплазмы относится ферменты метаболизма сахаров, азотистых оснований, аминокислот, липидов и других важных соединений. В гиалоплазме располагаются ферменты активации аминокислот при синтезе белков, транспортные (трансфертные) РНК (тРНК). В гиалоплазме при участии рибосом и полирибосом (полисом) происходит синтез белков, необходимых для собственно клеточных нужд, для поддержания и обеспечения жизни данной клетки. Клеточные мембраны. Структурно-химическая характеристика мембран клеток Общей чертой всех мембран клетки является то, что они представляют собой тонкие (6-10 нм) пласты липопротеидной природы (липиды в комплексе с белками). Основными химическими компонентами клеточных мембран являются липиды (~40%) и белки (~60%); кроме того, во многих мембранах обнаружены углеводы (5-10%). К липидам обладающих относится плохой большая группа растворимостью в органических воде веществ, (гидрофобность) и растворимостью в органических растворителях и жирах (липофильность). Состав липидов очень разнообразен. Характерными представителями липидов, встречающихся в клеточных мембранах, являются фосфолипиды (глицерофосфатиды), сфингомиелины и из стероидных липидов – холестерин. Особенностью липидов мембран является разделение их молекул на две функционально различные части: гидрофобные неполярные, не несущие зарядов “хвосты”, состоящие из жирных кислот, и гидрофильные, заряженные полярные “головки”. Это определяет способность липидов самопроизвольно образовывать двухслойные (билипидные) мембранные структуры толщиной 5-7 нм. Различные клеточные мембраны могут значительно отличаться друг от друга по липидному составу. Они различаются и набором белковых молекул. Многие мембранные белки состоят из двух частей, из участков, богатых полярными (несущими заряд) аминокислотами, и участков, обогащенных неполярными аминокислотами: глицином, аланином, валином, лейцином. Такие белки в липидных слоях мембран располагаются так, что их неполярные участки как бы погружены в “жирную” часть мембраны, где находятся гидрофобные участки липидов. Полярная (гидрофильная) же часть этих белков взаимодействует с головками липидов и обращена в сторону водной фазы. Кроме таких интегральных белков, существуют белки, частично встроенные в мембрану – полуинтегральные и примембранные, не встроенные в билипидный слой. По биологической роли белки мембран можно разделить на белки-ферменты, белки-переносчики, рецепторные и структурные белки. Углеводы мембран входят в состав не в свободном состоянии, они связаны с молекулами липидов или белков. Такие вещества называются соответственно гликолипидами и гликопротеинами. Количество их в мембранах обычно невелико. Как бы ни было велико различие между мембранами по количеству и составу их липидов, белков и углеводов, мембраны обладают рядом общих свойств, определяемых их основной структурой. Все мембраны являются барьерными структурами, резко ограничивающими свободную диффузию веществ между цитоплазмой и средой, с одной стороны, и между гиалоплазмой и содержимым мембранных органелл – с другой. Особенность же специфических функциональных нагрузок каждой мембраны определяется свойствами и особенностями белковых компонентов, большая часть из которых представляет собой ферменты или ферментные системы. Значительную роль в функционировании мембран играют гликолипиды и гликопротеиды. Плазмолемма. Барьерно-рецепторная и транспортная система клетки Плазмолемма, или внешняя клеточная мембрана, среди различных клеточных мембран занимает особое место. Это поверхностная периферическая структура, не только ограничивающая клетку снаружи, но и обеспечивающая ее непосредственную связь с внеклеточной средой, а, следовательно, и со всеми веществами и стимулами, воздействующими на клетку. Химический состав плазмолеммы. Основу плазмолеммы составляет липопротеиновый комплекс. Она имеет толщину около 10 нм и, таким образом, является самой толстой из клеточных мембран. Снаружи от плазмолеммы располагается надмембранный слой – гликокаликс. Толщина этого слоя около 3-4 нм, он обнаружен практически у всех животных клеток, но степень его выраженности различна. Гликокаликс представляет собой ассоциированный с плазмолеммой гликопротеиновый комплекс, в состав которого входят различные углеводы. Углеводы образуют длинные, ветвящиеся цепочки полисахаридов, связанные с белками и липидами входящими в состав плазмолеммы. При использовании специальных методов выявления полисахаридов (краситель рутениевый красный) видно, что они образуют как бы чехол поверх плазматической мембраны. В гликокаликсе могут располагаться белки, не связанные непосредственно с билипидным слоем. Как правило, это белки-ферменты, участвующие во внеклеточном расщеплении различных веществ, таких как углеводы, белки, жиры и др. Функции плазмолеммы. Эта мембрана выполняет ряд важнейших клеточных функций, ведущими из которых являются функция разграничения цитоплазмы с внешней средой, функции рецепции и транспорта различных веществ как внутрь клетки, так и из нее. Рецепторные функции связаны с локализацией на плазмолемме специальных структур, участвующих в специфическом “узнавании” химических и физических факторов. Клеточная поверхность обладает большим набором компонентов – рецепторов, определяющих возможность специфических реакций с различными агентами. Рецепторами на поверхности клетки могут служить гликопротеиды и гликолипиды мембран. Считается, что такие чувствительные к отдельным веществам участки могут быть разбросаны по всей поверхности клетки или собраны в небольшие зоны. Существуют рецепторы к биологически активным веществам – гормонам, медиаторам, к специфическим антигенам разных клеток или к определенным белкам. С плазмолеммой связана локализация специфических рецепторов, отвечающих за такие важные процессы, как взаимное распознавание клеток, развитие иммунитета, рецепторов, реагирующих на физические факторы. Так, в плазмолемме светочувствительных клеток животных расположена специальная система фоторецепторных белков (родопсин), с помощью которых световой сигнал превращается в химический, что в свою очередь приводит к генерации электрического импульса. Выполняя транспортную функцию, плазмолемма обеспечивает пассивный перенос ряда веществ, например воды, ионов, некоторых низкомолекулярных соединений. Другие вещества проникают через мембрану путем активного переноса против градиента концентрации с затратой энергии за счет расщепления АТФ. Так транспортируются многие органические молекулы (сахара, аминокислоты и др.). Эти процессы могут быть сопряжены с транспортом ионов, в них принимают участие специальные белки-переносчики. Крупные молекулы биополимеров практически не проникают сквозь плазмолемму. В ряде случаев макромолекулы и даже их агрегаты, а часто и крупные частицы попадают внутрь клетки в результате процессов эндоцитоза. Эндоцитоз формально разделяют на фагоцитоз (захват и поглощение клеткой крупных частиц, например бактерий или даже фрагментов других клеток), и пиноцитоз (захват макромолекулярных соединений). ??Уже было?? Эндоцитоз начинается с сорбции на поверхности плазмолеммы поглощаемых веществ. Связывание их с плазмолеммой определяется наличием на ее поверхности рецепторных молекул. После сорбции веществ на поверхности плазмолемма начинает образовывать сначала небольшие впячивания внутрь клетки. Эти впячивания могут иметь вид еще незамкнутых округлых пузырьков или представлять собой глубокие инвагинации, впячивания внутрь клетки. Затем такие локальные впячивания отшнуровываются от плазмолеммы и в виде пузырьков свободно располагаются под ней. В дальнейшем эндоцитозные пузырьки могут сливаться друг с другом, расти и в их внутренней полости, кроме поглощенных веществ, начинают обнаруживаться гидролитические ферменты (гидролазы), поступающие сюда из лизосом (см. ниже). Эти ферменты расщепляют биополимеры до мономеров, которые в результате активного транспорта через мембрану пузырька переходят в гиалоплазму. Таким образом, поглощенные молекулы внутри мембранных вакуолей, образовавшихся из элементов плазмолеммы, подвергаются внутриклеточному пищеварению. Плазмолемма принимает участие в выведении веществ из клетки (экзоцитоз). В этом случае внутриклеточные продукты (белки, мукополисахариды, жировые капли и др.), заключенные в вакуоли или пузырьки и отграниченные от гиалоплазмы мембраной, подходят к плазмолемме. В местах контактов плазмолемма и мембрана вакуоли сливаются и содержимое вакуоли поступает в окружающую среду. Процесс эндоцитоза и экзоцитоза осуществляется при участии связанной с плазмолеммой системы фибриллярных компонентов цитоплазмы – таких, как микротрубочки и сократимые микрофиламенты. Последние, соединяясь с определенными участками плазмолеммы, могут, изменяя свою длину, втягивать мембрану внутрь клетки, что приводит к отделению от плазмолеммы эндоцитозных вакуолей. Часто, непосредственно примыкая к ней, микрофиламенты образуют сплошной, так называемый кортикальный слой. Плазмолемма многих клеток животных может образовывать выросты различной структуры. У ряда клеток такие выросты включают в свой состав специальные компоненты цитоплазмы (микротрубочки, фибриллы), что приводит к развитию специальных структур – ресничек, жгутиков и др. Наиболее часто встречаются на поверхности многих животных клеток микроворсинки. Эти выросты цитоплазмы, ограниченные плазмолеммой, имеющие форму цилиндра с закругленной вершиной. Микроворсинки характерны для клеток эпителиев, но обнаруживаются и у клеток других тканей. Диаметр микроворсинок около 100 нм. Число и длина их различны у разных типов клеток. Возрастание числа микроворсинок приводит к резкому увеличению площади клеточной поверхности. Это особенно важно для клеток, участвующих во всасывании. Так, в кишечном эпителии на 1 мм2 поверхности насчитывается до 2х108 микроворсинок. Межклеточные соединения (контакты) Плазмолемма многоклеточных животных организмов принимает активное участие в образовании специальных структур – межклеточных соединений, обеспечивающих межклеточные взаимодействия. Различают несколько типов таких структур. Простое межклеточное соединение – сближение плазмолемм соседних клеток на расстояние 15-20 нм. При этом происходит взаимодействие слоев гликокаликса соседних клеток. Плотное соединение (запирающая зона) – зона, где слои двух плазмолемм максимально сближены, здесь происходит как бы слияние участков плазмолемм двух соседних клеток. Роль плотного замыкающего соединения заключается в механическом соединении клеток друг с другом. Эта область непроницаема для макромолекул и ионов и, следовательно, она запирает, отграничивает межклеточные щели (и вместе с ними собственно внутреннюю среду организма) от внешней среды. Часто встречается, особенно в эпителии, особый тип соединения – пятно сцепления, или десмосома. Эта структура представляет собой небольшую площадку, иногда имеющую слоистый вид, диаметром до 0,5 мкм, где между мембранами располагается зона с высокой электронной плотностью. К плазмолемме в зоне десмосомы со стороны цитоплазмы прилегает участок электронно-плотного вещества, так что внутренний слой мембраны кажется утолщенным. Под этим утолщением находится область тонких фибрилл, которые могут быть погружены в относительно плотный матрикс. Функциональная роль десмосом заключается главным образом в механической связи между клетками. Щелевидное соединение, или нексус, представляет собой область протяженностью 0,5-3 мкм, где плазмолеммы разделены промежутком в 2-3 нм. Со стороны цитоплазмы никаких специальных примембранных структур в данной области не обнаруживается, но в структуре плазмолемм соседних клеток друг против друга располагаются специальные белковые комплексы (коннексоны), которые образуют как бы каналы из одной клетки в другую. Этот тип соединения встречается во всех группах тканей. Функциональная роль щелевидного соединения заключается, по-видимому, в переносе ионов и мелких молекул (молекулярная масса 2х103) от клетки к клетке. Так, в сердечной мышце возбуждение, в основе которого лежит процесс изменения ионной проницаемости, передается от клетки к клетке через нексус. Синаптические соединения, или синапсы. Этот тип соединений характерен для нервной ткани и встречается в специализированных участках контакта как между двумя нейронами, так и между нейроном и каким-либо иным элементом, входящим в состав рецептора или эффектора (например, нервно-мышечные, нервно-эпителиальные синапсы). Синапсы – участки контактов двух клеток, специализированных для односторонней передачи возбуждения или торможения от одного элемента к другому. Органеллы цитоплазмы Органеллы – постоянно присутствующие и обязательные для всех клеток микроструктуры, выполняющие жизненно важные функции. Классификация органелл. Различают мембранные органеллы – митохондрии, эндоплазматическую сеть, аппарат Гольджи, лизосомы, гладкую эндоплазматическую сеть (к категории мембранных органелл относится и плазмолемма); немембранные органеллы: свободные рибосомы и полисомы, микротрубочки, центриоли и филаменты (микрофиламенты, промежуточные филаменты). Во многих клетках органеллы могут принимать участие в образовании особых структур, характерных для специализированных клеток. Так, реснички и жгутики образуются за счет центриолей и плазматической мембраны, микроворсинки – это выросты плазматической мембраны с гиалоплазмой и микрофиламентами, акросома спермиев – это производное элементов аппарата Гольджи, “эллипсоид” зрительных клеток – скопления митохондрии и пр. Мембранные органеллы Мембранные органеллы представляют собой одиночные или связанные друг с другом отсеки цитоплазмы отграниченные мембраной от окружающей их гиалоплазмы, имеющие свое собственное содержимое, отличное по составу, свойствам и функциям от других частей клетки, т. е. это замкнутые, закрытые объемные зоны – компартменты. В гиалоплазме мембранные органеллы распределены закономерно. Эндоплазматическая сеть, различные вакуоли, возникающие из нее, составляют вакуолярную систему цитоплазмы, систему синтеза и внутриклеточного транспорта веществ. Кроме того, в ее состав входят комплекс Гольджи, лизосомы, аутолизосомы и пероксисомы. Для всех элементов вакуолярной системы характерно наличие одной ограничивающей мембраны. Митохондрии отделены от гиалоплазмы двумя мембранами (двухмембранные органеллы). Эндоплазматическая сеть Эндоплазаматическая сеть (эндоплазматический ретикулум) была открыта К.Р. Портером в 1945 г. Этот компонент цитоплазмы расположен близко к ядру и представляет собой совокупность вакуолей, плоских мембранных мешков, или трубчатых образований, создающих как бы мембранную сеть внутри цитоплазмы. Эндоплазматическая сеть (ЭПС) делится на две функционально различные структуры: гладкая (агранулярная) эндоплазматическая сеть и шероховатая (гранулярная) эндоплазматическая сеть. Гранулярная эндоплазматическая сеть на ультратонких срезах представлена замкнутыми мембранами, которые образуют на сечениях уплощенные мешки, цистерны, трубочки. Ширина полостей цистерн значительно варьирует в зависимости от функциональной активности клетки. Наименьшая ширина их – около 20 нм, но они могут достигать диаметра в несколько микрометров. Отличительной чертой этих мембран является то, что они со стороны гиалоплазмы покрыты рибосомами (полисомами). Гранулярная эндоплазматическая сеть бывает представлена редкими разрозненными цистернами или их локальными скоплениями. Первый тип гранулярной эндоплазматической сети характерен для малоспециализированных клеток или для клеток с низкой метаболической активностью. Скопления ЭПС являются принадлежностью клеток, активно синтезирующих секреторные белки. Так, в клетках печени и некоторых нервных клетках гранулярная эндоплазматическая сеть собрана в отдельные зоны. В клетках поджелудочной железы гранулярная эндоплазматическая сеть в виде плотно упакованных друг около друга мембранных цистерн занимает базальную и околоядерную зоны клетки. Рибосомы, связанные с мембранами ЭПС, участвуют в синтезе белков, выводимых из данной клетки (“экспортируемые” белки). Белки, накапливающиеся в полостях ЭПС, могут, минуя гиалоплазму, транспортироваться в вакуоли комплекса Гольджи, где они часто модифицируются и входят в состав либо лизосом, либо секреторных гранул, содержимое которых остается изолированным от гиалоплазмы мембраной. В ряде случаев внутри самих канальцев или вакуолей гранулярной модификация эндоплазматической белков, (глюкозилирование), например или связывание конденсация образованием крупных агрегатов – сети может их происходить с синтезированных сахарами белков с секреторных гранул. В гранулярной эндоплазматической сети происходит синтез мембранных интегральных белков, которые встраиваются в толщу мембраны. Итак, роль гранулярной эндоплазматической сети заключается в синтезе на ее полисомах экспортируемых белков, в их изоляции от содержимого гиалоплазмы внутри мембранных полостей, в транспорте этих белков в другие участки клетки, в химической модификации таких белков и в их локальной конденсации, а также в синтезе структурных компонентов клеточных мембран. Агранулярная (гладкая) эндоплазматическая сеть также представлена мембранами, образующими мелкие вакуоли и трубки, канальцы, которые могут ветвиться, сливаться друг с другом. В отличие от гранулярной эндоплазматической сети на мембранах гладкой эндоплазматической сети нет рибосом. Диаметр вакуолей и канальцев гладкой эндоплазматической сети обычно около 50-100 нм. Гладкая эндоплазматическая сеть возникает и развивается за счет гранулярной эндоплазматической сети. Деятельность гладкой эндоплазматической сети связана с метаболизмом липидов и некоторых внутриклеточных полисахаридов. Гладкая эндоплазматическая сеть участвует в заключительных этапах синтеза липидов. Она сильно развита в клетках, секретирующих такие категории липидов, как стероиды, например, в клетках коркового вещества надпочечников, в сустентоцитах семенников. Тесная топографическая связь гладкой эндоплазматической сети с отложениями гликогена (запасной внутриклеточный полисахарид животных) в гиалоплазме различных клеток (клетки печени, мышечные волокна) указывает на ее возможное участие в метаболизме углеводов. В поперечно-полосатых эндоплазматическая сеть мышечных способна волокнах депонировать гладкая ионы кальция, необходимые для функции мышечной ткани. Таким образом, гладкая ЭПС – это главная клеточная органелла, где происходит биосинтез липидов и накопление кальция. В гладкой эндоплазматической сети также образуются детоксицирующие ферменты семейства Р450. Синтез и разрушение этих ферментов происходят быстро и зависят от внешних сигналов. Очень важна роль гладкой эндоплазматической сети в дезактивации различных вредных для организма веществ за счет их окисления с помощью ряда специальных ферментов. Особенно четко она проявляется в клетках печени. Так, при ряде отравлений в клетках печени появляются ацидофильные зоны (не содержащие РНК), сплошь занятые гладким эндоплазматическим ретикулумом. Полость эндоплазматической сети Физико-химическая среда В полости ЭПС поддерживается среда, в которой проходит посттрансляционная модификация белка, в частности, гликозилирование, формирование дисульфидных мостиков, сворачивание полипептида и сборка субъединиц. При нарушении этих процессов белок не выходит из полости эндоплазматической сети. Для формирования дисульфидных мостиков белки должны находиться в окислительной среде. Окислительно-восстановительный или редокспотенциал, измеренный в полости ЭПС, сдвинут в кислую сторону. Например, отношение глутатиона (GSH) к окисленному глутатиону (GSSG) – около 1-3 : 1, в то время как в цитозоле это соотношение приближается к 30100 : 1. Таким образом, полость обеспечивает среду, способствующую образованию дисульфидных мостиков. Компоненты, необходимые для правильной укладки белка, определяли с использованием изолированных пузырьков ЭПС. Исследования показали, что для формирования функциональных молекул в пузырьках ЭПС необходима энергия АТР. Существует несколько этапов этого процесса, на которых могут происходить энергетические затраты. Например, АТР требуется для высвобождения шаперона hsp60 в матриксе митохондрии. Так что вполне вероятно, что для высвобождения шаперонов в ЭПС также необходима энергия (табл. 3-9 и 3-10). Компоненты полости ЭПС В полости ЭПС содержатся следующие компоненты. 1. Протеиндисульфидизомераза (PDI). Этот белок содержит два тиоредоксиновых восстанавливающих серу домена. Его концентрация наиболее высока в полости ЭПС тех клеток, которые продуцируют секреторные или мембранные белки с дисульфидными связями. Поскольку синтезирующаяся белковая цепь проходит через мембрану ЭПС и входит в ее полость, где созданы условия, благоприятные для образования дисульфидных мостиков, любые два цистеиновых остатка могут образовать дисульфидиую связь. Эти связи не всегда приводят к образованию правильной трехмерной структуры белка. Предполагается, что PDI связывается с удлиняющимся полипептидом и препятствует образованию неправильных дисульфидных связей. Точно не известно, каким образом PDI обеспечивает правильное формирование дисульфидных мостиков. Предполагается, что PDI образует дисульфидную связь с цистеином синтезирующегося белка, но эта связь менее стабильна, чем связь, формируемая двумя цистеиновыми остатками белка. Таким образом, дисульфидизомераза временно связывается с новым полипептидом, который сворачивается под действием других сил (гидрофобные взаимодействия, водородные связи, ионные взаимодействия с водным растворителем в ЭПС). При достижении правильной трехмерной структуры два цистеиновых остатка белка сближаются (вследствие других взаимодействий), а связывание дисульфидизомеразы с белком ослабляется, что приводит к формированию правильной дисульфидной связи. 2. Кальций. Концентрация Са2+ в полости ЭР относительно высока (около 5 ммоль). ЭР является важнейшим Са2+ депо клетки. Дисульфидизомераза и другие виутриполостиые ферменты связывают кальций с высоким сродством и в больших количествах. 3. Шапероны ЭПС. К шапероиам относятся белки семейств hsp70 и hsp90, связывающий белок (BiP), Grp-94 и пептидилиропилизомераза. Есть доказательства того, что шапероны предотвращают случайное свертывание и агрегацию промежуточных продуктов, обеспечивая тем самым более эффективный процесс формирования белка. Белки, которые не свертываются должным образом или приобретают иативную структуру с задержкой, остаются связанными с шаперонами в течение длительного времени. Предполагается, что подобное пролонгированное присутствие белков в полости ЭПС является важным сигналом для их последующего разрушения с помощью имеющихся в этой органелле протеаз. 4. Кальнексин. Кальнексин – это белок с молекулярной массой 88 кДа, находящийся в ЭПС. Этот белок не относится ни к hsp60, ни к hsp70, ни к hsp90 семействам. В отличие от других компонентов ЭПС, кальнексин является интегральным ЭПС-белком, каталитический домен которого обращен в полость эндоплазматической сети. Одна из его функций состоит в связывании неправильно свернутых белков и сохранении их в ЭПС. Таким образом, кальнексин функционирует как контролер качества, который предотвращает высвобождение неправильно свернутых белков. 5. Кальретикулин. Эта молекула, массой 46 кДа, была впервые идентифицирована как Са2+-связывающий белок в саркоплазматическом ретикулуме мышечных клеток. Кальретикулин, присутствующий в полости ЭПС повсеместно, содержит два Са2+-связывающих домена. Высокоаффинный домен кальретикулина может связывать кальций даже при очень низких концентрациях. Домен с высокой емкостью, связывающий несколько молекул кальция одновременно. Кальретикулин содержит сигналы задержки в ЭПС, что еще раз подтверждает ключевую метаболическую роль этого белка в данном клеточном компартменте. Было также показано, что кальретикулин содержит ядерную сигнальную последовательность и регулирует связывание стероидного рецептора с участком ДНК. Это наблюдение указывает на то, что кальретикулин должен выходить из ЭПС в цитоплазму. Как именно это происходит, неизвестно. Интересен тот факт, что кальретикулин выполняет много других функций. Например, оказалось, что он действует как интегринсвязывающий белок, плазматический антикоагулянт, как молекула памяти (молекула, участвующая в долговременном потенциировании) у морских улиток Aplysia. Вполне вероятно, что будут открыты и другие функции кальретикулина по мере дальнейшего изучения биологической активности этого белка. Задержка белков в ЭПС Выход веществ из эндоплазматической сети происходит путем формирования транспортных пузырьков, которые обладают специфической протеиновой оболочкой. Таким образом, растворимые белки, поступающие в полость ЭПС, доставляются к другим клеточным органеллам с помощью пузырьков, которые отпочковываются от мембраны ЭПС. Некоторые белки, необходимые для конформации белка и ядерного гликозилирования, остаются в ЭПС. Задержка белков в эндоплазматической сети осуществляется различными механизмами (рис. 3-12). Оказалось, что определенные белки удаляются из транспортных пузырьков, поскольку имеют характерную форму или неправильно свертываются и остаются связанными с белками ЭПС, такими как BiP или шапероны. Позже такие белки разрушаются в полости эндоплазматической сети. Кроме того, белки, которые остаются в мембране ЭПС, содержат специфические аминокислотные последовательности, называемые последовательностями задержки. Несовершенство системы задержки в ЭПС приводит к тому, что некоторые важные внутриполостные белки случайно переносятся из нее в следующий компартмент, комплекс Гольджи. Важные для ЭПС белки содержат последовательность возврата-задержки, которая состоит из четырех аминокислот (KDEL), локализованных вблизи С-конца. Белки, содержащие последовательность KDEL, медленнее двигаются к транспортным пузырькам, из чего можно предположить, что в задержке белков участвует механизм исключения из пузырьков. Данные экспериментов in vitro свидетельствуют, что связывание KDEL лиганда с возвращающими рецепторами зависит от рН среды. Максимум связывания наблюдается между рН 5 и рН 6; такой интервал рН и существует в комплексе Гольджи (рис. 3-12). Белки ЭПС, которые содержат KDEL и случайно транспортируются в комплекс Гольджи, связываются там с возвращающим рецептором, расположенным в месте поглощения пузырьков, и затем перемещаются обратно в эндоплазматическую сеть. Такие пузырьки называются ретроградными. В ЭПС рН близок к нейтральному, и белки с KDEL быстро отщепляются от рецептора при возвращении в среду эндоплазматической сети. Важно подчеркнуть, что ретроградные пузырьки могут формироваться в любом отделе комплекса Гольджи, а не только в тех стопках Гольджи, которые расположены ближе к мембране ЭПС. Комплекс Гольджи (внутренний сетчатый аппарат) В 1898 г. К. Гольджи, используя свойства связывания тяжелых металлов (осмия или серебра) с клеточными структурами, выявил в нервных клетках сетчатые образования, которые он назвал внутренним сетчатым аппаратом, который позднее стали называть комплексом Гольджи. Подобные структуры затем описаны во всех клетках эукариот. При рассмотрении в электронном микроскопе комплекс Гольджи представлен мембранными структурами, собранными вместе в небольшой зоне. Отдельная зона скопления этих мембран называется диктиосомой. Таких зон в клетке может быть несколько. В диктиосоме плотно друг к другу (на расстоянии 20-5 нм) расположены 5-10 плоских цистерн, между которыми располагаются тонкие прослойки гиалоплазмы. Каждая цистерна имеет переменную толщину: в центре ее мембраны могут быть сближены (до 25 нм), а на периферии иметь расширения, ампулы, ширина которых непостоянна. Кроме плотно расположенных плоских цистерн, в зоне комплекса Гольджи наблюдается множество мелких пузырьков (везикул), которые встречаются главным образом в его периферических участках. Иногда видно, как они отшнуровываются от ампулярных расширений на краях плоских цистерн. Принято различать в зоне диктиосомы проксимальный и дистальный участки. В секретирующих клетках обычно комплекс Гольджи поляризован: его проксимальная часть обращена к ядру, в то время как дистальная – к поверхности клетки. В клетках отдельные диктиосомы могут быть связаны друг с другом системой везикул и цистерн, примыкающих к проксимальному концу скопления плоских мешков так, что образуется рыхлая трехмерная сеть, выявляемая в световом микроскопе. Комплекс Гольджи участвует в сегрегации и накоплении продуктов, синтезированных в цитоплазматической сети, в их химических перестройках, созревании; в полисахаридов, цистернах их комплекса комплексирование Гольджи с белками, происходит что синтез приводит к образованию мукопротеидов, и, главное, с помощью элементов аппарата Гольджи происходит процесс выведения готовых секретов за пределы клетки. Кроме того, комплекс Гольджи обеспечивает формирование клеточных лизосом. Секреторная функция комплекса Гольджи заключается в том, что синтезированный на рибосомах экспортируемый белок отделяется и накапливается внутри цистерн эндоплазматической сети, по которым он транспортируется к зоне мембран пластинчатого комплекса. Затем накопленный белок может конденсироваться, образуя секреторные белковые гранулы (как это наблюдается в поджелудочной, молочной и других железах), или оставаться в растворенном виде (как иммуноглобулины в плазматических клетках). В дальнейшем от ампулярных расширений цистерн комплекса Гольджи отщепляются пузырьки, содержащие эти белки. Такие везикулы также могут сливаться друг с другом и увеличиваться в размерах, образуя секреторные гранулы. После этого секреторные гранулы начинают двигаться к поверхности клетки, соприкасаются с плазмолеммой, с которой сливаются их собственные мембраны, и таким образом содержимое гранул оказывается за пределами клетки. Морфологически этот процесс называется экструзией (выбрасывание, экзоцитоз), напоминает пиноцитоз только с обратной последовательностью стадий. Нужно отметить, что с самого момента образования до выведения из клеток секретируемые продукты отделены мембраной от гиалоплазмы. Следовательно, мембраны комплекса Гольджи выполняют сегрегирующую роль при образовании клеточных секретов. В зоне комплекса Гольджи могут происходить многие метаболические процессы. Здесь большинство белков подвергается модификации, некоторые их аминокислоты фосфорилируются, ацетилируются или глюкозилируются. Во многие секреторные продукты входят сложные белки – гликопротеиды и мукопротеиды (муцины) – белки, связанные в единую цепь с сахарами и полисахаридами разной природы. Синтез этих полисахаридов идет в комплексе Гольджи. В пузырьках комплекса Гольджи иногда происходит накопление ресинтезированных молекул липидов и образование сложных белков липопротеидов, которые могут транспортироваться пузырьками за пределы клетки. Мембраны комплекса Гольджи образуются при участии гранулярной эндоплазматической сети. Комплекс Гольджи присутствует и выполняет ряд важных функций во всех клетках, однако его строение зависит от типа клеток. Например, в секреторных клетках, таких как гепатоциты или клетки поджелудочной железы, комплекс Гольджи имеет множество слоев, известных как плоские цистерны или мешочки. В фибробластах, напротив, комплекс Гольджи состоит всего из нескольких мешочков. Проходящие через комплекс Гольджи молекулы подвергаются биохимической обработке, большую часть которой составляет прикрепление углеводных комплексов к белкам и липидам. Комплекс Гольджи иногда называют углеводной фабрикой клетки (рис. 4-7). Полярность комплекса Гольджи Цис-, промежуточные и транс-стопки Гольджи Морфологическая и функциональная полярность комплекса Гольджи находит свое отражение в терминологии: сторона мембраны, с которой сливаются пузырьки, называется цис-полюсом, а сторона, от которой пузырьки отпочковываются, называется транс-полюсом. Стопка Гольджи, расположенная ближе к ЭПС, называется цис-сетью Гольджи; стопки мембран, расположенных где-то в середине, называются промежуточной сетью Гольджи; наиболее удаленная от ЭПС стопка называется транс-сетью Гольджи. Отдельная уплощенная мембрана называется цистерной; каждая такая цистерна имеет цис- и транс-поверхности. На концах стопки находятся группы трубчатых структур, которые могут быть либо связаны, либо не связаны с цистернами. Пузырьки и трубчатые структуры составляют сеть Гольджи, цис – ближе к ЭПС и транс – дистальнее от нее. Гликопротеины проходят один за другим все отделы, в которых идут последовательные серии биохимических реакций. Вновь синтезированные мембранные и секреторные белки, а также мембранные липиды, гликозилироваиные в ЭПС, попадают в комплекс Гольджи через цис-полюс. Они перемещаются через стопки Гольджи и покидают комплекс через трансполюс, где пузырьки и трубочки образуют транс-сеть Гольджи. При прохождении белков или липидов через стопки Гольджи, они претерпевают серию посттрансляционных модификаций, включающих изменение N-связанных олигосахаридов. При прохождении белка через стопки Гольджи, эти модификации происходят последовательно: • цис-Гольджи: длинные маннозные цепи подравниваются до М-5 с помощью маннозидазы I; • промежуточный Гольджи: N-ацетилглюкозамин переносится с помощью N-ацетилглюко-заминтрансферазы I; • транс-Гольджи: добавляются концевые сахара (остатки галактозы) и сиаловая кислота. Биохимические процессы в комплексе Гольджи Ниже перечислены биохимические процессы, протекающие в комплексе Гольджи. Прекращение или нарушение этих важных процессов приводит к клиническим последствиям. Гликозилирование белков и липидов. В этом участвуют гликозидазы, группа ферментов, удаляющих остатки сахаров, и гликозилтрансферазы, прикрепляющие сахара обратно на главную углеводную цепь. Гликозилирование и сборка протеогликанов в комплексе Гольджи. Большинство сахаров, добавляемых к белковой сердцевине протеогликана, сульфатируются. Этот ферментативный процесс также происходит в комплексе Гольджи. Добавление маннозо-6-фосфата (М-6-Ф). М-6-Ф добавляется как направляющий сигнал к ферментам, предназначенным для лизосом. Сортировка для транспорта. Сортировка веществ для дальнейшего транспорта к органеллам, плазматической мембране, эндосомам, секреторным пузырькам происходит в транс-комплексе Гольджи (рис. 4-4). Процессы гликозилирования в комплексе Гольджи Напомним, что комплекс Гольджи является «углеводной фабрикой» клетки. В ЭПС долихолфосфат добавляет большой углеводный комплекс 2GlcNAc-9-маннозо-3-глюкозы к соответствующему остатку аспарагина на растущей полипептидной цепи. Как только комплекс завершен, начинается пошаговое подравнивание углеводов (см. рис. 3-16). Терминальная глюкоза отщепляется в два этапа. Сначала терминальный остаток глюкозы отщепляется с помощью глюкозидазы-I, после чего глюкозидаза-II удаляет еще два остатка глюкозы. Затем отщепляется одна манноза. На этом начальный этап процессинга углеводов в ЭПС завершается, и белки, несущие олигосахаридный комплекс, по- ступают в комплекс Гольджи. В первых цистернах Гольджи от стержневого комплекса удаляются еще три остатка маннозы. На этой стадии стержневой комплекс имеет пять маннозных остатков. N-ацетилглюкозаминтрансфераза I добавляет один остаток N- ацетилглюкозамина (GlcNAc). От образовавшегося комплекса отщепляются еще три остатка маннозы. Этот комплекс, состоящий теперь из двух молекул GlcNAc-3-маннозо-1-GlcNAc, является стержневой структурой, к которой с помощью специализированных гликозилтрансфераз добавляются другие углеводы. Каждая гликозилтрансфераза распознает развивающуюся углеводную структуру и добавляет к цепи свой собственный сахарид. Сборка сложных остатков сахаров на белках и липидах существенно отличается от сборки остатков ДНК, РНК и белка. В этом случае углеводный комплекс, сформированный на каждом этапе, служит местом связывания для следующего гликозилирующего фермента, который помещает свой субстрат на структуру полисахарида. Таким образом, образец формируется в процессе биосинтеза. ДНК, РНК и белки пользуются заранее заготовленными образцами для определения их последовательности. В состав протеогликанов входят сложные сахара, прикрепленные к стержневому полипептиду путем ОН-связывания серина или треонина с ксилозным углеводным остатком. Многие стержневые пептиды протеогликанов содержат повторяющиеся последовательности остатков серина или треонина, к которым прикрепляются углеводные остатки. Углеводы выступают из стержневого белка, как щетинки щетки. Направленный транспорт веществ из комплекса Гольджи Комплекс Гольджи – это основная органелла клетки, где осуществляется биохимическая модификация веществ. Поэтому все белки, липиды и мембранные компоненты, направляющиеся к лизосомам, пероксисомам, плазматической мембране или секреторным пузырькам, должны проходить через этот комплекс. Когда белки, предназначенные для различных органелл, отпочковываются достигают транс-сети специализированные пузырьки, Гольджи, от нее переносящие свое содержимое к необходимым органеллам с помощью белков SNAP (см. выше). Интересно, что некоторые пузырьки транспортируются к месту назначения по таким компонентам цитоскелета, как микротрубочки, которые используются как направляющие рельсы. Лизосомы Лизосомы – это разнообразный класс шаровидных структур размером 0,2-0,4 мкм, ограниченных одиночной мембраной. Характерным признаком лизосом является наличие в них гидролитических ферментов – гидролаз (протеиназы, нуклеазы, глюкозидазы, фосфатазы, липазы), расщепляющих различные биополимеры. Лизосомы были открыты в 1949 г. де Дювом. Лизосомы (рис. 4-8) – это главные пищеварительные органеллы клетки. Они участвуют в разрушении комплексов лигаид-рецептор, в метаболизме холестерола с помощью рецепторов к ЛНП и в круговороте органелл. В них содержится большое число специфических ферментов (гидролаз), участвующих в разрушении белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот. Мембрана этих органелл представляет собой единичный бислой и обладает уникальными свойствами. Одна из отличительных особенностей лизосом – низкий рН. Это свойство обеспечивается мембраносвязанной АТР- зависимой протонной помпой, которая обменивает Na+ на Н+. Для того чтобы ферменты, находящиеся в лизосоме, выполняли свои гидролитические функции, необходима кислая среда. Оптимум рН для большинства этих гидролаз – около 5, поэтому их активность совершенно ограничена при повреждении лизосом и выходе ферментов в цитозоль, где рН составляет 7,27,3. Таким образом, наличие специализированного компартмента для пищеварения веществ обеспечивает оптимальные гидролитические условия. Аминокислоты, полученные при гидролизе белка, используются в процессах биосинтеза, так же как и другие вещества, например, нуклеотиды (таблица 44). Среди лизосом можно выделить по крайней мере 3 типа: первичные лизосомы, вторичные лизосомы (фаголизосомы и аутофагосомы) и остаточные тельца. Разнообразие морфологии лизосом объясняется тем, что эти частицы участвуют в процессах внутриклеточного переваривания, образуя сложные пищеварительные вакуоли как экзогенного (внеклеточного), так и эндогенного (внутриклеточного) происхождения. Первичные лизосомы представляют собой мелкие мембранные пузырьки размером около 0,2-0,5 мкм, заполненные бесструктурным веществом, содержащим гидролазы, в том числе активную кислую фосфатазу, которая является маркерным для лизосом ферментом. Эти мелкие пузырьки практически очень трудно отличить от мелких везикул на периферии зоны комплекса Гольджи, которые также содержат кислую фосфатазу. Местом ее синтеза является гранулярная эндоплазматическая сеть, затем этот фермент появляется в проксимальных участках диктиосом, а затем в мелких везикулах по периферии диктиосом и, наконец, в первичных лизосомах. Таким образом, весь путь образования первичных лизосом очень сходен с образованием секреторных (зимогенных) гранул в клетках поджелудочной железы, за исключением последнего этапа – выбрасывания из клетки. Вторичные лизосомы, или внутриклеточные пищеварительные вакуоли, формируются при слиянии первичных лизосом с фагоцитарными вакуолями (фагосомами) или пиноцитозными вакуолями, образуя фаголизосомы, или гетерофагосомы, а также с измененными органеллами самой клетки, подвергающимися перевариванию (аутофагосомы). При этом ферменты первичной лизосомы получают доступ к субстратам, которые они и начинают расщеплять. Вещества, попавшие в состав вторичной лизосомы, расщепляются гидролазами до мономеров, которые транспортируются через мембрану лизосомы в гиалоплазму, где они реутилизируются, т. е. включаются в различные обменные процессы. Однако расщепление, переваривание биогенных макромолекул внутри лизосом может идти в ряде клеток не до конца. В этом случае в полостях лизосом накапливаются непереваренные продукты. Такая лизосома носит название “телолизосома”, или остаточное тельце. Остаточные тельца содержат меньше гидролитических ферментов, в них происходит уплотнение содержимого, его перестройка. Часто в остаточных тельцах наблюдается вторичная структуризация неперевариваемых липидов, которые образуют слоистые структуры. Там же происходит отложение пигментных веществ. Так, у человека при старении организма в клетках мозга, печени и в мышечных волокнах в телолизосомах происходит отложение “пигмента старения” – липофусцина. При участии лизосом в переваривании внутриклеточных элементов (аутолизосомы) они могут обеспечивать модификацию продуктов, приготавливаемых самой клеткой, например, с помощью гидролаз лизосом. В клетках щитовидной железы гидролизуется тироглобулин, что приводит к образованию гормона тироксина, который затем выводится в кровеносное русло. В аутофагосомах обнаруживаются фрагменты или даже целые цитоплазматические структуры, например митохондрии, элементы цитоплазматической сети, рибосомы, гранулы гликогена и др., что является доказательством их определяющей роли в процессах дегратации. Функциональное значение аутофагоцитоза еще не ясно. Есть предположение, что этот процесс связан с отбором и уничтожением измененных, поврежденных клеточных компонентов. В этом случае лизосомы выполняют роль внутриклеточных “чистильщиков”, убирающих дефектные структуры. Интересно, что в нормальных условиях число аутофагосом увеличивается при метаболических стрессах, например при гормональной индукции активности клеток печени. Значительно возрастает число аутофагосом при различных повреждениях клеток; в этом случае аутофагоцитозу могут подвергаться целые зоны внутри клеток. Увеличение числа аутолизосом в клетках при патологических процессах – обычное явление. Уникальность лизосомных мембран Несмотря на то, что в полости лизосомы происходит переваривание белков, мембрана самой лизосомы не разрушается. Рис. 4-8. Лизосомы. На электронной микрофотографии макрофага видны многочисленные первичные лизосомы. Характерные особенности лизосом – это гомогенное содержимое и четко определяемая граница мембраны. Функционально каждая лизосома представляет собой органеллу, заполненную гидролитическими ферментами, х 45 000. (Воспроизведено с изменениями с разрешения авторов из Junqueira LC et al: Basic Histology, 8th cd. Appleton & Lange, 1995, p. 37.) Эта устойчивость к гидролитическому расщеплению стала предметом детальных исследований молекул, входящих в состав мембраны. Используя различные методики (лизосомная изоляция, мембранная изоляция, антитела к различным компонентам), исследователи показали, что среди множества мембранных компонентов (размер которых колеблется от 20 до более чем 150 кДа) преобладают две группы белков размером 100-120 кДа. Эти белки были названы lgp А и lgp В. Изучение структуры и строения этих белков показало, что они являются монотопными интегральными белками, причем большая часть их структуры направлена в полость. Более того, они сильно гликозилированы. Гликозилирование само по себе не является защитным свойством, однако показано, что при возрастании степени гликозилирования разрушение белка уменьшается. (транспорте недавно переваренных молекул из лизосомы), сильно гликозилированы. Белки лизосомных мембран синтезируются в ЭПС и транспортируются в комплекс Гольджи для гликозилирования (рис. 4-9). Эти белки также должны быть нацелены на лизосому, но еще неясно, как это происходит. У них нет особого лизосомного направляющего сигнала. Предполагается, что лизосомные мембранные белки группируются в TGN и формируют специфические транспортные пузырьки (сортирующие эндосомы), которые сливаются вместе и образуют лизосому. Пути переноса веществ в лизосому Перенос веществ в лизосому может быть условно разделен на два типа. Биосинтетический механизм включает доставку растворимых гидролитических ферментов и специализированных белков для лизосомных мембран. Вещества начинают свой путь в ЭПС, проходят через сеть Гольджи и выходят из транс-сети Гольджи. Эндоцитозный механизм связан с гидролитической функцией лизосом и обеспечивает импорт веществ для последующего переваривания. Существует четыре разновидности эндоцитоза. 1. Образование эндоцитозных пузырьков, включая покрытые клатрином ямки и пузырьки, а также эндосомы, сформированные без клатриновой оболочки. Это основной способ импорта веществ в лизосомы. 2. Аутофагия включает поглощение и переваривание других внутриклеточных органелл, например дисфункциональных митохондрий. Как именно происходит такое поглощение, неясно. Предполагается, что мембраны ЭПС окружают органеллу, предназначенную для переваривания, и затем сливаются с лизосомой. Эта структура до слияния с лизосомой называется аутофагосома. 3. Фагоцитоз – поглощение крупных частиц, таких как бактерия или осколки других клеток (рис. 4-10). Этот процесс похож на эндоцитоз, однако в него вовлекаются большие внеклеточные частицы. Почти все клетки могут осуществлять фагоцитоз, но существует два типа клеток, специально предназначенных для этой цели, они называются профессиональными фагоцитами. Среди них наиболее известны нейтрофилы, моноциты и макрофаги. 4. Некоторые цитозольные белки, несущие лизосомный направляющий сигнал (KFERQ, Lys-Phe-Glu-Arg-Gln), доставляются в лизосому. Болезни синтеза и накопления лизосомных ферментов Болезни накопления мукополисахаридов Описано множество генетических заболеваний, связанных с лизосомными гидролазами. Часть из них, обобщенно называемая болезнями накопления мукополисахаридов, обусловлена недостаточностью особых лизосомных ферментов, участвующих в разрушении дерматансульфата, гепарансульфата или обоих веществ. Эти вещества относятся к группе гликозаминогликанов, называемых также мукополисахаридами. Неполностью разрушенные мукополисахариды накапливаются в тканях и выделяются с мочой. Не все гликозаминогликаны могут быть удалены; таким образом, они начинают накапливаться в клетках и окружающем межклеточном пространстве. Эти заболевания вызывают прогрессирующую деградацию и приводят к смерти обычно до 10-летнего возраста. Показана недостаточность 10 специфических лизосомных ферментов. Каждый из этих ферментов катализирует полисахарида. Разрушение отщепление в специфическом мукополисахаридиой цени участке происходит последовательно, и дефект одной связи предупреждает расщепление последующих связей, даже если есть ферменты, катализирующие этот процесс. Таким образом, минимальное на первый взгляд изменение одной из гидролаз может иметь очень тяжелые последствия (табл. 4-5). Пероксисомы Пероксисомы – небольшие (размером 0,3-1,5 мкм) овальной формы тельца, ограниченные мембраной, содержащие гранулярный матрикс, в центре которого часто видны кристаллоподобные структуры, состоящие из фибрилл и трубок (сердцевина). Пероксисомы, вероятно, образуются на расширенных сторонах цистерн эндоплазматической сети. Они особенно характерны для клеток печени, почек. Название пероксисомы появилось изза высокого содержания в этих органеллах оксидаз, которые производят токсичный пероксид водорода (Н2О2) в реакции: RH2 + О2 → R + Н2О2, где R – органический субстрат. Функция пероксисом: корреляция с клиникой Во фракции пероксисом обнаруживаются ферменты окисления аминокислот, при работе которых образуется перекись водорода, а также выявляется фермент каталаза, разрушающая ее. Каталаза пероксисом играет важную защитную роль, так как Н2О2 является токсическим веществом для клетки. Этот тип окислительных реакций особенно важен для клеток печени и почек, в которых происходит огромное число реакций детоксикации. Например, пероксисомы в гепатоцитах обезвреживают поглощенный алкоголь, превращая его в уксусный альдегид. Пероксисомы также участвуют в ?? β-окислении ??. Это окисление приводит к расщеплению жирных кислот на два углеводородных фрагмента, которые превращаются в ацетил-кофермеитА (СоА), выходят из пероксисомы и используются в качестве строительного материала для других отделов клетки. Пероксисомы содержат приблизительно 50 ферментов, которые участвуют в различных путях метаболизма. Пероксисома содержит первые два фермента, участвующие в реакциях синтеза плазмалогенов, которые составляют приблизительно 19% от общего содержания фосфолипидов организма. Плазмалогены в высоких концентрациях находятся в головном мозге и сердце. Таким образом, мембранные органеллы клетки, составляющие вакуолярную систему, обеспечивают синтез и транспорт внутриклеточных биополимеров, продуктов секреции, выводимых из клетки, что сопровождается биосинтезом всех мембран этой вакуолярной системы. Производные вакуолярной системы – лизосомы и пероксисомы – участвуют в деградации экзогенных и эндогенных субстратов клетки. Биогенез пероксисом Размножение пероксисом, по-видимому, адаптивный ответ клеток на такие воздействия внешней среды, при которых для роста и выживания требуются ферменты пероксисом. Индукция состоит из двух фаз. 1. Пролиферация органелл путем отпочковывания от существующих пероксисом. 2. Рост оргаиеллы за счет импорта белков пероксисомного матрикса. Пролиферация начинается в ответ на стимулы окружающей среды или на сигналы при развитии. В клетках млекопитающих многие гиполипидемические лекарственные средства могут вызывать размножение пероксисом, хотя точный механизм этого процесса еще до конца не понят. Эти лекарственные цитоплазматическим латентные вещества, фактором факторы вероятно, или сходны факторами, транскрипции, с неизвестным которые называемые регулируют рецепторами, активируемыми пероксисомным пролифератором (PPARs). При активации эти рецепторы перемещаются в ядро и связываются с промоторами генов, кодирующих цитоплазматические рецепторы стероидных гормонов щитовидной железы и ретиноевой кислоты. гормонов, Эти рецепторы связываются с особыми элементами ДНК в промоторах генов, кодирующих многие пероксисомные ферменты, что приводит к увеличению синтеза этих белков. Вновь синтезированные белки целенаправленно переносятся в существующие пероксисомы. Увеличение количества белков в органелле, вероятно, инициирует ее почкование, что, в конце концов, приводит к формированию новых пероксисом. Почкование считают основным механизмом размножения пероксисом; однако также существуют небольшие пероксисомные лакуны-предшественники. Оказалось, что эти лакуны содержат больше вновь синтезированных пероксисомных матриксных белков, чем зрелые пероксисомы. Эти предшественники могут быть другим местом происхождения пероксисом, способствуя, таким образом, увеличению количества органелл. Импорт белков в пероксисомы Существует два типа сигнальных последовательностей, необходимых для импорта белков в пероксисомы. Чаще всего в белках присутствует Сконцевой трипептид Ser-Lys-Leu-COOH (S-K-L-). С-концевые трипептиды различных белков могут отличаться но одному из остатков, но обычно встречается именно этот набор аминокислотных остатков. Наиболее важное значение имеет локализация пероксисомного направляющего сигнала (peroxisomal targeting signal, PTS). Остатки, входящие в состав PTS, должны располагаться на С-конце белка. У большинства ферментов, находящихся в пероксисомах, сигнальный пептид локализуется на С-конце. Однако у некоторых пероксисомных ферментов сигнальная последовательность расположена ближе к N-концу. Важное значение этих направляющих сигналов подтверждает тот факт, что различные нарушения метаболизма человека связаны с неспособностью клетки импортировать белки в пероксисомы или с ошибочным попаданием пероксисомных ферментов в другой клеточный компартмент. Различные нарушения функционирования пероксисом представлены в таблице 3-7, важные характеристики некоторых из этих нарушений даны в таблице 3-8. Другие Повышенное содержание пипеколиновой Нарушение окисления фитановой кислоты Нарушение синтеза желчных кислот Нарушение синтеза плазмалогена Повышено содержание ЖКОДЦ Дефицит или биохимически й дефект фермента Таблица 3-8. Характеристики пероксисомных болезней Группа I: Генерализованные пероксисомные нарушения вследствие нарушения биосинтеза пероксисом Синдром Цельвегера Неонатальная АЛД Детская болезнь Рефсума Гиперпипеколовая ацидемия Множественные Множественные + + + + + + +/+/- + + - Множественные + + + + + - Множественные + + + +/- + - Группа II: Дефект более одного пероксисомного фермента, интактные пероксисомы Цельвегероподобный синдром Множественные Ризомелическая точечная хондродисплазия Ацил-СоА: DHAPAT, аокисление фитановой кислоты + + + - + - - - - - - - - - - - - - - +/- - + -- + - + + Группа III: Дефект одного пероксисомного фермента, интактные пероксисомы АЛД/АМН Лигноцерил-СоАлигаза Ацил-СоАоксидаза Бифункциональный фермент Псевдонеонатальная АЛД Недостаток бифункционального фермента Синдром псевдоЦельвегера 3-оксоацил-СоАтиолаза Гипероксалурия I типа Аланин: глиоксилатаминотрансфераза Каталаза Глутарил-СоАоксидаза Акаталаземия Недостаток глутарилСоА-оксидазы + - + - + - + + - + - - - - - - - - Воспроизведено с разрешения из Seashore MR, Wappner RS: Genetics in Primary Care & Clinical Medicine, Appleton &Lange, 1996, p. 218. АЛД – адренолейкодистрофия; АМН – адреномиелонейропатия; СоА – кофермент A; DHAPAT – дигидрокси-ацетонфосфатацилтрансфераза; ЖКОДЦ – жирные кислоты с очень длинными боковыми цепями; + – нарушения; – норма. Основные пероксисомные болезни человека Некоторые наследственные заболевания связаны с нарушением функции пероксисом. Например, синдром Цельвегера (СЦ) обусловлен почти полной потерей пероксисомной функции и классифицируется как заболевание I группы, наиболее тяжелой в этом типе наследственных патологий. При синдроме Цельвегера в пероксисоме отсутствует большое число важных ферментов. Пациенты с заболеваниями I группы умирают в детском возрасте. Ко II группе относятся менее тяжелые пероксисомные заболевания, например цельвегероподобные синдромы, для которых характерно большее содержание пероксисомных ферментов. Заболевания III группы, например адренолейкодистрофия, характеризуются нарушением функционирования одного пероксисомного фермента. Это наименее тяжелая форма пероксисомных заболеваний. Митохондрии Митохондрии – органеллы синтеза АТФ. Их основная функция связана с окислением органических соединений и использованием освобождающейся при распаде этих соединений энергии для синтеза молекул АТФ. Исходя из этого, митохондрии часто называют энергетическими станциями клетки, или органеллами клеточного дыхания. Термин “митохондрия” был введен Бенда в 1897 г. для обозначения зернистых и нитчатых структур в цитоплазме разных клеток. Митохондрии можно наблюдать в живых клетках, так как они обладают достаточно высокой плотностью. В живых клетках митохондрии могут перемещаться, сливаться друг с другом, делиться. Форма и размеры митохондрий животных клеток разнообразны, но в среднем толщина их около 0,5 мкм, а длина – от 1 до 10 мкм. Подсчеты показывают, что количество их в клетках сильно варьирует – от единичных элементов до сотен. Так, в клетке печени они составляют более 20% общего объема цитоплазмы и содержат около 30-35% общего количества белка в клетке. Площадь поверхности всех митохондрий печеночной клетки в 4-5 раз больше поверхности ее плазматической мембраны. Обычно митохондрии скапливаются вблизи тех участков цитоплазмы, где возникает потребность в АТФ. Так, в сердечной мышце митохондрии находятся вблизи миофибрилл. В сперматозоидах митохондрии образуют спиральный футляр вокруг оси жгутика и т.д. Митохондрии в клетках могут увеличиваться в размерах и числе. В последнем случае происходит деление перетяжкой или фрагментация (почкование) исходных крупных митохондрий на более мелкие, которые в свою очередь могут расти и снова делиться. Митохондриальные мембраны Митохондрии ограничены двумя мембранами толщиной около 7 нм. Наружная митохондриальная мембрана отделяет их от гиалоплазмы. Обычно она имеет ровные контуры и замкнута, так что представляет собой мембранный мешок. Внешнюю мембрану от внутренней отделяет межмембранное пространство шириной около 10-20 нм. Наружная мембрана содержит значительное количество белка, порина. Этот белок формирует поры с диаметром, позволяющим молекулам размером до 5000 дальтон свободно проходить в первую полость. Таким образом, ионы, аминокислоты, сахара и другие цитозольные компоненты беспрепятственно проходят в первое, межмембранное пространство. Группа ферментов, локализованная в этом пространстве, фосфорилирует иуклеотиды и сахара нуклеотидов. Внутренняя митохондриальная мембрана ограничивает собственно внутреннее содержимое митохондрии, ее матрикс. Она формирует гораздо более плотный барьер, она значительно больше наружной мембраны и образует множество смежных складок – крист. Эти складки значительно увеличивают площадь поверхности митохондрий. Многие ферментативные реакции происходят более эффективно, если ферменты связаны митохондриальной поверхностью, что и обеспечивают кристы (см. рис. 5-1). с В мембранах крист митохондрии располагаются системы дальнейшего переноса электронов и сопряженного с ним фосфорилирования АДФ (окислительное фосфорилирование). При этом происходит перенос электронов от одного белка-акцептора электронов к другому и, наконец, связывание их с кислородом, вследствие чего образуется вода. Одновременно с этим часть энергии, выделяемой при таком окислении в цепи переноса электронов, запасается в виде макроэргической связи при фосфорилировании АДФ, что приводит к образованию большого числа молекул АТФ – основного внутриклеточного энергетического эквивалента. Именно на мембранах крист митохондрии происходит процесс окислительного фосфорилирования с помощью здесь расположенных белков цепи окисления и ферментов фосфорилирования АДФ, АТФ-синтетазы. Митохондриальный матрикс Матрикс митохондрий имеет тонкозернистое строение в нем иногда выявляются тонкие нити (толщиной около 2-3 нм) и гранулы размером около 15-20 нм. Нити матрикса митохондрий представляют собой молекулы ДНК, а мелкие гранулы – митохондриальные рибосомы. Основной функцией митохондрий является синтез АТФ, происходящий в результате процессов окисления органических субстратов и фосфорилирования АДФ. Начальные этапы этих сложных процессов совершаются в гиалоплазме. Здесь происходит первичное окисление субстратов (например, сахаров) до пировиноградной кислоты (пирувата) с одновременным синтезом небольшого количества АТФ. Эти процессы совершаются в отсутствие кислорода (анаэробное окисление, гликолиз). Все последующие этапы выработки энергии (дыхания) – аэробное окисление и синтез основной массы АТФ – осуществляются с потреблением кислорода и локализуются внутри митохондрий. При этом происходит дальнейшее окисление пирувата и других субстратов энергетического обмена с выделением СО2 и переносом протонов на их акцепторы. Эти реакции осуществляются с помощью ряда ферментов так называемого цикла трикарбоновых кислот, которые локализованы в матриксе митохондрии. Митохондриальная ДНК Выявлено, что в матриксе митохондрии локализуется автономная система митохондриального белкового синтеза. Она представлена молекулами ДНК, свободными от гистонов, что сближает их с ДНК бактериальных клеток. На этих ДНК происходит синтез молекул РНК разных типов: информационных, трансферных (транспортных) и рибосомных. В матриксе митохондрий наблюдается образование рибосом, отличных от рибосом цитоплазмы. Эти рибосомы участвуют в синтезе ряда митохондриальных белков, не кодируемых ядром. Однако такая система белкового синтеза не обеспечивает всех функций митохондрий, поэтому автономию митохондрий можно считать ограниченной, относительной. Малые размеры молекул митохондриальных ДНК не могут определить синтез всех белков митохондрий. Показано, что большинство белков митохондрий находится под генетическим контролем со стороны клеточного ядра и синтезируется в цитоплазме. Наиболее вероятно, что митохондриальная ДНК кодирует лишь немногие митохондриальные белки, которые локализованы в мембранах и представляют собой структурные белки, ответственные за правильную интеграцию в митохондриальных мембранах отдельных функциональных белковых комплексов. Свойства митохондриальной ДНК: небольшая и содержит около 16,5 кб, то есть приблизительно в 105 раз меньше, чем ДНК, локализованная в ядре; кольцевая и кодирует 2 рибосомные РНК, 22 транспортных РНК (тРНК) и 13 белков. Генетический аминокислоты, код немного митохондрий, отличается определяющий от кода отдельные ядерной ДНК. Митохоидриальный код, например, обладает измененными стоп-кодонами. Эта органелла обладает функционирующими рибосомами, которые синтезируют белки, используемые в органелле и кодируемые митохондриальной ДНК. Количество транслируемого с митохондриальной мРНК белка ограничено и формирует субъединицы более крупных ферментных комплексов. Митохондрии могут принимать различную форму. Обычно митохондрия делится, по крайней мере, один раз в течение клеточного цикла после репликации ее ДНК, которая происходит во время интерфазы. Эта репликация не связана с S-фазой клетки. Деление митохондрии происходит посредством перетяжки на две, которая начинается с образования кольцевой бороздки на внутренней митохондриальной мембране. Общая структура и функции митохондрий Убрать?? Митохондрии – это окруженные двойной мембраной органеллы, которые выполняют функцию метаболического центра клетки. Митохондрии являются местом синтеза аденозинтрифосфата (АТФ). Этот процесс требует участия многих ферментов, большинство из которых поступает из цитозоля (рис. 3-8). Процесс импорта ферментов очень сложен и включает несколько этапов, описанных ниже. Предполагается, что митохондрии – результат эволюции организмов, которые внедрились в примитивную прокариотическую клетку и сформировали симбиотические отношения с хозяином. Основные признаки митохондрий перечислены в таблице 3-3. Таблица 3-3. Основные принципы устройства и работы митохондрий Признаки Происхождение Значение Считается, что митохондрии произошли в результате эволюции от организмов, которые внедрились в примитивную прокариотическую клетку и стали симбиотами с ней Форма Эти органеллы могут принимать различные морфологические формы. Некоторые из них имеют сферическую форму, другие лентовидную Митохондриальная ДНК Митохондриальная ДНК реплицируется в интерфазе, и этот процесс не синхронизирован с репликацией ДНК в ядре. Митохондриальная ДНК отличается от ядерной ДНК и кодирует особые митохондриальные гены Синтез белка Количество транслируемых с митохондриальной мРНК белков ограничено; они формируют субъединицы крупных ферментных комплексов. Митохондрии имеют функционирующие рибосомы, переводящие информацию митохондриальной ДНК в белки, используемые в органелле Клеточное деление Во время клеточного цикла митохондрии один раз делятся надвое, образуя при этом перетяжку. Перетяжка деления развивается, начиная с внутренней митохондриальной мембраны Механизм транспорта митохондриальных белков Митохондрии служат метаболическим центром клетки; эти органеллы – место синтеза АТФ, процесса, требующего участия многочисленных ферментов, большинство из которых поступает из цитозоля (рис. 3-8). Почти все белки, предназначенные для транспорта в митохондрии, синтезируются па полирибосомах, локализованных в цитозоле. Белки, предназначенные для транспорта в митохондрии, имеют сигнальный пептид, локализованный на N-конце. Сигнальные пептиды варьируют в размере от 12 до 80 остатков. Этот участок белка также формирует амфифильный завиток: заряженные остатки сгруппированы на одной стороне альфа-спирали, а неполярпые остатки локализованы па другой стороне. Амфифильиый завиток соединяется с участком связывания митохондриального распознающего рецептора, локализованного на наружной мембране. Процесс транспорта достаточно сложен и включает несколько элементов (табл. 3-4). Таблица 3-4. Основные элементы системы транспорта белка в митохондрию Элементы Роль Рибосомы Почти все импортируемые белки производятся на полирибосомах в цитозоле Сигнальный пептид Белки, предназначенные для митохондрий, имеют сигнальные пептиды, локализованные на N-конце Амфифильный завиток Сигнальные пептиды формируют амфифильный завиток. Заряженные остатки сгруппированы на одной стороне завитка, а неполярные остатки локализованы на другой стороне Митохондриальный распознающий рецептор Амфифильный модействует со завиток взаи- связывающим доменом митохондриального рецептора распознавания, локализованного на наружной мембране Шапероны Вновь митохондрий синтезированные белковые цепи для связаны с шаперонными белками, которые способствуют определению правильной укладки и функционирования импортированных белков Митохондриальные шапероны Вновь синтезированные белки, предназначенные для митохондрий, при подготовке к импорту связываются с другим классом цитозольиых белков. Существует несколько типов этих белков, называемых шаперонами. Они обнаруживаются почти во всех клеточных органеллах и в цитоплазме. Кроме других функций, шапероны обеспечивают правильное сворачивание (фолдинг) и окончательную конформацию других белков, и поэтому необходимы для здоровья клетки и организма. Шапероны найдены во всех организмах – от бактерий до млекопитающих. В некоторых случаях эти белки имеют другое название. Одно из семейств шаперонов называется белками теплового шока (hsp) (рис. 3-9). Их обнаружили случайно: исследователи открыли, что определенные белки синтезируются в клетках плодовой мушки при увеличении температуры всего па несколько градусов. Белки теплового шока имеют большую внутривидовую устойчивость и интенсивно экспрессируются во всех клетках даже в нормальных для роста условиях. Их транскрипция и трансляция значительно возрастают при чрезвычайных условиях внешней среды. Предполагают, что шапероны необходимы для правильного сворачивания белков в условиях теплового стресса. Укладка полипептидной цепи: шапероны hsp60 и hsp70 Белки семейств hsp60 (также известного как GroEL) и hsp70 (или DnaK) участвуют в сворачивании, переносе и формировании более высокой структурной организации белка. Во внутреннем митохондриальном пространстве hsp60 и hsp70 связываются с развернутым белком и помогают формированию точной конформационной организации. Этот этап укладки является энергозависимым и требует расщепления АТФ. Наконец, семейство шаперонов hsp90 принимает участие в регуляции активности некоторых факторов транскрипции и различных белковых киназ. При относительно низкой концентрации белка он легко сворачивается должным образом из-за малой вероятности взаимодействия реактивных групп белка с активными группами других белков. Однако при большой концентрации белка вероятность того, что он сложится должным образом, значительно снижается. Обычно концентрация белка в органеллах эукариотических клеток высока. Работа шаперонов Как утверждалось ранее, шапероны находятся почти во всех органеллах и в цитоплазме. Белки-шапероны действуют в основном путем связывания с активной поверхностью полипептидов, например, с гидрофильной поверхностью. Таким образом, шапероны блокируют эти активные поверхности и эффективно предотвращают агрегацию, облегчая правильную укладку полипептидной цепи. Шапероны не связываются со своим полипептидным субстратом ковалентно. Часто белки должны быть импортированы в несложенном виде и затем вновь уложены после своего прохождения через мембрану органеллы, что также осуществляется частично благодаря шаперонам. Например, белки теплового шока связываются с растущим полипептидом как только он освобождается от рибосомы. Эти шапероны удерживают рождающуюся молекулу в конформации, предотвращающей преждевременную случайную укладку и способствующей переносу полипептида в митохондриальное пространство. Транспорт белков в митохондрии и высвобождение упакованного белка – АТР-зависимые процессы (табл. 3-5 и 3-6). Таблица 3-5. Некоторые характеристики шаперонов Ниже информация из таблицы?? Присутствуют во многих организмах: от бактерий до человека Многие называются также белками теплового шока (hsp) Некоторые стимулируются при условиях, вызывающих денатурацию вновь синтезированных белков (например, повышение температуры и различные химические вещества) Они связываются с развернутым и свернутым белком Большинство шаперонов обладает АТРазной активностью с вовлечением АТР или ADP во взаимодействие белок – шаперон Найдены в различных отделах клетки, таких как цитозоль, митохондрия, полость эндоплазматического ретикулума. Воспроизведено с разрешения авторов из Murray RK et al: Harper's Biochemistry, 24th ed., Appleton & Lange, 1996, p. 497. Таблица 3-6. Некоторые шапероны и ферменты, участвующие в процессе сворачивания белка в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме • BiP (белок связывания тяжелой цепи иммуноглобулина) • GRP94 (белок, регулируемый глюкозой) • Кальнексин • PDI (дисульфидизомераза) • PPI (пептидил-пролил-цис-транс-изомераза)______ Воспроизведено с разрешения из Murray RK et al: Harper's Biochemistry, 24th ed., Appleton & Lange, 1996, p. 497. Немембранные органеллы Опорно-двигательные структуры клетки. Цитоскелет. Микротрубочки В цитоплазме клеток, кроме мембранных структур и органелл, встречается большое количество различных фибриллярных образований, выполняющих разнообразные функции. К таким фибриллярным компонентам относятся микротрубочки белковой природы. В цитоплазме они могут образовывать временные сложные образования, например веретено клеточного деления. Микротрубочки входят в состав сложноорганизованных специальных органелл, таких как центриоли и базальные тельца, а также являются основными структурными элементами ресничек и жгутиков. Микротрубочки представляют собой прямые, неветвящиеся длинные полые цилиндры. Их внешний диаметр составляет около 24 нм, внутренний просвет имеет ширину 15 нм, а толщина стенки – 5 нм. Стенка микротрубочек построена за счет плотно уложенных округлых субъединиц величиной около 5 нм. В электронном микроскопе на поперечных сечениях микротрубочек видны большей частью 13 субъединиц, выстроенных в виде однослойного кольца. Микротрубочки, выделенные из разных источников (реснички простейших, клетки нервной ткани, веретено деления), имеют сходный состав и содержат белки – тубулины. Очищенные тубулины способны при определенных условиях собираться в микротрубочки с такими же параметрами, какие характерны для микротрубочек внутри клеток. Добавление алкалоида колхицина предотвращает самосборку микротрубочек или приводит к разборке уже существующих. Деполимеризация тубулинов или торможение их полимеризации также вызывается понижением температуры, но после повышения температуры до 37°С снова происходит самосборка микротрубочек. Деполимеризация тубулинов и исчезновение микротрубочек происходит и при действии на живую клетку колхицина или охлаждения. Полагают, что в клетке тубулины существуют в двух формах – свободной и связанной. Сдвиг равновесия между этими формами может привести или к диссоциации микротрубочек, или к их росту. Ни тубулины в чистом виде, ни построенные из них микротрубочки не способны к сокращению, они не обладают АТФ-азной активностью. Скорее всего они выполняют роль каркасных структур. В клетках микротрубочки принимают участие в создании ряда временных (цитоскелет интерфазных клеток, веретено деления) или постоянных структур (центриоли, реснички, жгутики). Микротрубочки интерфазных клеток Практически во всех эукариотических клетках в гиалоплазме можно видеть длинные неветвящиеся микротрубочки. В больших количествах они обнаруживаются в цитоплазматических отростках нервных клеток, фибробластов и других изменяющих свою форму клеток. Они могут быть выделены сами или можно выделить образующие их белки: это те же тубулины со всеми их свойствами. Главное функциональное значение таких микротрубочек цитоплазмы заключается в создании эластичного, но одновременно устойчивого внутриклеточного каркаса (цитоскелета), нео6ходимого для поддержания формы клетки. Действие колхицина, вызывающего деполимеризацию тубулинов, сильно меняет форму клеток. Так, если отростчатую и плоскую клетку в культуре фибробластов обработать колхицином, то она теряет полярность и сжимается. Точно так же ведут себя другие клетки: колхицин прекращает рост клеток хрусталика, отростков нервных клеток, образование мышечных трубок и др. Так как при этом не исчезают элементарные формы движения, присущего клеткам, в частности пиноцитоз, ундулирующие движения мембран, образование мелких псевдоподий, вероятнее всего, роль микротрубочек заключается в образовании каркаса для поддержания формы клеточного тела, для стабилизации и укрепления клеточных выростов. Создавая факторами внутриклеточный ориентированного скелет, движения микротрубочки клетки в могут целом быть и ее внутриклеточных компонентов, задавать своим расположением векторы для направленных потоков разных веществ и для перемещения крупных структур. Разрушение микротрубочек колхицином нарушает транспорт веществ в аксонах нервных клеток, приводит к блокаде секреции и т. д. С цитоплазматическими участвующие в микротрубочками механическом связаны переносе специальные отдельных белки, внутриклеточных компонентов: микровакуолей, рибосом, митохондрий и др. В неделящейся (интерфазной) клетке система микротрубочек развивается в связи с особой клеточной органеллой – центриолью, которая является местом, где происходит начальная полимеризация тубулинов и рост микротрубочек цитоскелета. Рибосомы Рибосомы – элементарные аппараты синтеза белковых, полипептидных молекул – обнаруживаются во всех клетках. Рибосомы – это сложные рибонуклеопротеиды, в состав которых входят белки и молекулы РНК примерно в равных весовых отношениях. Размер функционирующей рибосомы эукариотических клеток 25х20х20 нм. Такая рибосома состоит из большой и малой субъединиц. Каждая из субъединиц построена из рибонуклеопротеидного тяжа, где рРНК взаимодействует с разными белками и образует тело рибосомы. Различают единичные рибосомы и комплексные рибосомы (полисомы). Рибосомы могут располагаться свободно в гиалоплазме или быть связанными с мембранами эндоплазматической сети. В малоспециализированных и быстрорастущих клетках в основном обнаруживаются свободные рибосомы. В специализированных гранулярной клетках эндоплазматической рибосомы сети. располагаются Степень в составе интенсивности синтетической деятельности свободных рибосом меньше, а образуемые белки используются в основном на собственные нужды клетки. Связанные рибосомы обеспечивают синтез белков “на экспорт”, т. е., на обеспечение нужд организма. Содержание РНК и соответственно степень белковых синтезов коррелируют с интенсивностью базофилии цитоплазмы. Центриоли Этот термин был предложен Т. Бовери в 1895 г. для обозначения очень мелких телец, размер которых находится на границе разрешающей способности светового микроскопа. В некоторых объектах удавалось видеть, что мелкие плотные тельца – центриоли, обычно расположенные в паре – диплосома, окружены зоной более светлой цитоплазмы, от которой отходят радиально тонкие фибриллы (центросфера). Совокупность центриолей и центросферы называют клеточным центром. Эти органеллы в делящихся клетках принимают участие в формировании веретена деления и располагаются на его полюсах. В неделящихся клетках центриоли часто определяют полярность клеток эпителия и располагаются вблизи комплекса Гольджи. Тонкое строение центриолей удалось изучить только с помощью электронного микроскопа. Основой строения центриолей являются расположенные по окружности 9 триплетов микротрубочек, образующих таким образом полый цилиндр. Его ширина около 0,2 мкм, а длина – 0,3-0,5 мкм (хотя встречаются центриоли, достигающие в длину нескольких микрометров) (рис. 14). Кроме микротрубочек в состав центриоли входят дополнительные структуры – “ручки”, соединяющие триплеты. Системы микротрубочек центриоли можно описать формулой (9х3)+0, подчеркивая отсутствие микротрубочек в ее центральной части. Обычно в интерфазных клетках всегда присутствуют две центриоли, располагающиеся рядом друг с другом, образуя диплосому. В диплосоме центриоли располагаются под прямым – углом по отношению друг к другу. Из двух центриолей различают материнскую и дочернюю. Обе центриоли сближены и расположены так, что конец дочерней центриоли направлен к поверхности материнской центриоли. Вокруг каждой тонковолокнистый, центриоли матрикс. расположен Часто можно бесструктурный, обнаружить или несколько дополнительных структур, связанных с центриолями: спутники (сателлиты), фокусы схождения микротрубочек, дополнительные микротрубочки, образующие особую зону, центросферу вокруг центриоли. При подготовке клеток к митотическому делению происходит удвоение центриолей. Этот процесс у различных объектов происходит в разное время – в течение синтеза ядерной ДНК или после него. Он заключается в том, что две центриоли в диплосоме расходятся и около каждой из них возникает заново по одной новой дочерней, так что в клетке перед делением обнаруживаются две диплосомы, т. е. четыре попарно связанные центриоли. Этот способ увеличения числа центриолей был назван – дупликацией. Важно отметить, что увеличение числа центриолей не связано с их делением, почкованием или фрагментацией, а происходит путем образования зачатка, процентриоли, вблизи и перпендикулярно к исходной центриоли. Полагают, что центриоли участвуют в индукции полимеризации тубулином при образовании микротрубочек. Так, в интерфазе именно в связи с центриолью происходит рост микротрубочек клеточного каркаса. Перед митозом центриоль является одним из центров полимеризации микротрубочек веретена клеточного деления. Центриоль – центр роста микротрубочек аксонемы ресничек или жгутиков. Наконец, она сама индуцирует полимеризацию тубулинов новой процентриоли, возникающей при ее дупликации. Реснички и жгутики Это специальные органеллы движения, встречающиеся в некоторых клетках различных организмов. В световом микроскопе и эти структуры выглядят как тонкие выросты клетки. В основании ресничек и жгутика в цитоплазме видны хорошо красящиеся мелкие гранулы – базальные тельца. Длина ресничек 5-10 мкм, а длина жгутиков может достигать 150 мкм. Ресничка представляет собой тонкий цилиндрический вырост цитоплазмы с постоянным диаметром 200 нм. Этот вырост от основания до самой его верхушки покрыт плазматической мембраной. Внутри выроста расположена аксонема (“осевая нить”) – сложная структура, состоящая в основном из микротрубочек. Проксимальная часть реснички (базальное тело) погружена в цитоплазму. Диаметры аксонемы и базального тельца одинаковы (около 150 нм). Базальное тельце по своей структуре очень сходно с центриолью. Оно также состоит из 9 триплетов микротрубочек, имеет “ручки”. Часто в основании реснички лежит пара базальных телец, располагающихся под прямым углом друг к другу подобно диплосоме – центриоли. Аксонема в своем составе имеет в отличие от базального тельца или центриоли 9 дублетов микротрубочек с "ручками", образующих стенку цилиндра аксонемы. Кроме периферических дублетов микротрубочек, в центре аксонемы располагается пара центральных микротрубочек. В целом систему микротрубочек реснички описывают как (9х2)+2 в отличие от (9х3)+0 системы центриолей и базальных телец. Базальное тельце и аксонема структурно связаны друг с другом и составляют единое целое: две микротрубочки триплетов базального тельца являются микротрубочками дублетов аксонемы. Свободные клетки, имеющие реснички и жгутики, обладают способностью двигаться, а неподвижные клетки движением ресничек могут перемещать жидкость и корпускулярные частицы. При движении ресничек и жгутиков длина их не уменьшается, поэтому неправильно называть это движение сокращением. Траектория движения ресничек очень разнообразна. В различных клетках это движение может быть маятникообразным, крючкообразным, воронкообразным или волнообразным. Основной белок ресничек – тубулин – не способен к сокращению, укорочению. Вероятным кандидатом на роль сократимого белка считается белок “ручек” – динеин, так как он обладает АТФ-азной активностью. В последние годы для объяснения способа движения ресничек и жгутиков используется гипотеза “скользящих нитей”. Известно, что сокращение мышечных волокон происходит за счет встречного скольжения фибрилл двух мышечных белков: миозина и актина; при этом также не происходит собственно укорачивания или сокращения отдельных мышечных белковых фибрилл. Предполагается, что незначительные смещения дублетов микротрубочек друг относительно друга могут вызвать изгиб всей реснички, а если такое локальное смещение будет происходить вдоль жгутика, то может возникнуть волнообразное его движение. Другие фибриллярные структуры цитоплазмы Кроме микротрубочек, к фибриллярным компонентам цитоплазмы эукариотических клеток относятся микрофиламенты толщиной 5-7 нм и так называемые промежуточные филаменты, или микрофибриллы, толщиной около 10 нм. Микрофиламенты встречаются практически во всех типах клеток. По строению и функциям они бывают разные, однако отличить их морфологически друг от друга трудно. Располагаются микрофиламенты в кортикальном слое цитоплазмы, непосредственно под плазмолеммой, пучками или слоями. Их можно видеть в псевдоподиях амеб или в движущихся отростках фибробластов, в микроворсинках кишечного эпителия. Микрофиламенты часто образуют пучки, направляющиеся в клеточные отростки. Сеть микрофиламентов выявлена в большинстве клеток. Они отличаются по химическому составу. В зависимости от их химического состава они могут выполнять функции цитоскелета и участвовать в обеспечении движения. Эта сеть – иммунофлюоресцентных методов часть цитоскелета. С помощью четко показано, что в состав микрофиламентов кортикального слоя и пучков входят сократительные белки: актин, миозин, тропомиозин, альфа-актинин. Следовательно, микрофиламенты не что иное, как внутриклеточный сократительный аппарат, обеспечивающий не только подвижность клеток при активном амебоидном их перемещении, но, вероятно, и большинство внутриклеточных движений, таких как токи цитоплазмы, движение вакуолей, митохондрий, деление клетки. Промежуточные филаменты, или микрофибриллы, тоже белковые структуры. Это тонкие (10 нм) неветвящиеся, часто располагающиеся пучками нити. Характерно, что их белковый состав различен в разных тканях. В эпителии в состав промежуточных филаментов входит кератин. Пучки кератиновых промежуточных филаментов в эпителиальных клетках образуют так называемые тонофибриллы, которые подходят к десмосомам. В состав промежуточных филаментов клеток мезенхимальных тканей (например, фибробластов) входит другой белок – виментин, в мышечные клетки – десмин, в нервных клетках в состав их нейрофиламентов также входит особый белок. Роль промежуточных микрофиламентов скорее всего опорно- каркасная, однако эти фибриллярные структуры не так лабильны, как микротрубочки. В последнее время с помощью иммуноморфологических методов стало возможным определить тканевое происхождение тех или иных опухолей именно по белкам их промежуточных филаментов, что очень важно для правильного выбора типа химиотерапевтических противоопухолевых препаратов. Включения Включения цитоплазмы – необязательные компоненты клетки, возникающие и исчезающие в зависимости от метаболического состояния клеток. Различают включения трофические, секреторные, экскреторные и пигментные. К трофическим включениям относятся капельки нейтральных жиров, которые могут накапливаться в гиалоплазме. В случае недостатка субстратов для жизнедеятельности клетки эти капельки могут резорбироваться. Другим видом включений резервного характера является гликоген – полисахарид, откладывающийся также в гиалоплазме. Отложение запасных белковых гранул обычно происходит в связи с активностью эндоплазматической сети. Так, запасы белка вителлина в яйцеклетках амфибии накапливаются в вакуолях эндоплазматической сети. Секреторные включения – обычно округлые образования различных размеров, содержащие биологически активные вещества, образующиеся в клетках в процессе жизнедеятельности. Экскреторные включения не содержат каких-либо ферментов или других активных веществ. Обычно это продукты метаболизма, подлежащие удалению из клетки. Пигментные включения могут быть экзогенные (каротин, пылевые частицы, красители и др.) и эндогенные (гемоглобин, гемосидерин, билирубин, меланин, липофусцин). Наличие их в цитоплазме может изменять цвет ткани, органа временно или постоянно. Нередко пигментация ткани служит диагностическим признаком. Структура и химический состав клеточного ядра Ядро клетки – система генетической детерминации и регуляции белкового синтеза. Ядро неделящейся, интерфазной клетки обычно одно на клетку (хотя встречаются и многоядерные клетки). Ядро состоит из хроматина, ядрышка, кариоплазмы (нуклеоплазмы) и ядерной оболочки, отделяющей его от цитоплазмы. Роль ядерных структур в жизнедеятельности клеток Ядро обеспечивает две группы общих функций: одну, связанную собственно с хранением и передачей генетической информации, другую – с ее реализацией, с обеспечением синтеза белка. Хранение и поддержание наследственной информации в виде неизменной структуры репарационных ДНК ферментов, связаны с наличием ликвидирующих так называемых спонтанные повреждения молекул ДНК. В ядре происходит воспроизведение или редупликация молекул ДНК, что дает возможность при митозе двум дочерним клеткам получить совершенно одинаковые в качественном и количественном отношении объемы генетической информации. Другой группой клеточных процессов, обеспечиваемых активностью ядра, является создание собственно аппарата белкового синтеза. Это не только синтез, транскрипция на молекулах ДНК разных информационных РНК, но и транскрипция всех видов транспортных и рибосомных РНК. В ядре происходит также образование субъединиц рибосом путем комплексирования синтезированных в ядрышке рибосомных РНК с рибосомными белками, которые синтезируются в цитоплазме и переносятся в ядро. Таким образом, ядро является не только вместилищем генетического материала, но и местом, где этот материал функционирует и воспроизводится. Вот почему выпадание или нарушение любой из перечисленных выше функций гибельно для клетки в целом. Все это указывает на ведущее значение ядерных структур в процессах синтеза нуклеиновых кислот и белков. Хроматин Ядерный материал, определяемый как хроматин, состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), гистонов и различных ядерных белков, участвующих в следующих процессах. Формирование поддерживающего комплекса для ДНК. Связывание со специфическими последовательностями ДНК и участие в транскрипции ДНК. Репликация ДНК. В неделящихся (интерфазных) клетках хроматин, выявляемый в световом микроскопе, может более или менее равномерно заполнять объем ядра или же располагаться отдельными глыбками. Хроматин интерфазных ядер представляет собой хромосомы, которые, однако, теряют в это время свою компактную форму, разрыхляются, деконденсируются. Степень такой деконденсации хромосом может быть различной. Зоны полной деконденсации и их участков морфологи называют эухроматином. При неполном разрыхлении хромосом в интерфазном ядре видны участки конденсированного хроматина, иногда называемого гетерохроматином. Степень деконденсации хромосомного материала – хроматина в интерфазе может отражать функциональную нагрузку этой структуры. Чем “диффузнее” распределен хроматин в интерфазном ядре, тем интенсивнее в нем синтетические процессы. Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде плотных хромосом. В этот период хромосомы не выполняют никаких синтетических функций, в них не происходит включения предшественников ДНК и РНК. Таким образом, хромосомы клеток могут находиться в двух структурно-функциональных состояниях: в активном, рабочем, частично или полностью деконденсированном, когда с их участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и редупликации, и в неактивном, в состоянии метаболического покоя при максимальной их конденсированности, когда они выполняют функцию распределения и переноса генетического материала в дочерние клетки. В составе хроматина обнаруживается также РНК. Количественные отношения ДНК, белка и РНК составляют 1:1,3:0,2. Обнаружено, что длина индивидуальных линейных молекул ДНК может достигнуть сотен микрометров и даже сантиметров. Среди хромосом человека самая большая первая хромосома содержит ДНК с общей длиной до 7 см. Суммарная длина молекул ДНК во всех хромосомах одной клетки человека составляет около 170 см, что соответствует 6∙10-12 г. В ядрах, кроме хроматиновых. участков и матрикса, встречаются перихроматиновые фибриллы, перихроматиновые и интерхроматиновые гранулы. Они содержат РНК и встречаются практически во всех активных ядрах, представляют собой информационные РНК, связанные с белками, – рибонуклеопротеиды (информосомы). Матрицами для синтеза этих РНК являются разные гены, разбросанные по деконденсированным участкам хромосомных (хроматиновых) фибрилл. В хромосомах существует множество мест независимой репликации ДНК – репликонов. ДНК эукариотических хромосом представляют собой линейные молекулы, состоящие из тандемно (друг за другом) расположенных репликонов разного размера. Средний размер репликона около 30 мкм. В составе генома человека должно встречаться более 50 000 репликонов, участков ДНК, которые синтезируются как независимые единицы. Синтез ДНК как на участках отдельной хромосомы, так и среди разных хромосом идет неодновременно, асинхронно. Так, например, в некоторых хромосомах человека (1, 3, 16) репликация наиболее интенсивно начинается на концах хромосом и заканчивается (при высокой интенсивности включения метки) в центромерном районе. Наиболее поздно репликация заканчивается в хромосомах или в их участках, находящихся в компактном, конденсированном состоянии. Таким примером может являться поздняя репликация генетически инактивированной Х-хромосомы у женщин, формирующей в клеточном ядре компактное тельце полового хроматина. Белки хроматина составляют 60-70% от его сухой массы. К ним относятся так называемые гистоны и негистоновые белки. Негистоновые белки составляют 20% от количества гистонов. Гистоны – щелочные белки, обогащенные основными аминокислотами (главным образом лизином и аргинином). Очевидна структурная роль гистонов, которые не только обеспечивают специфическую укладку хромосомной ДНК, но и имеют значение в регуляции транскрипции. Гистоны расположены по длине молекулы ДНК не равномерно, а в виде блоков. В один такой блок входят 8 молекул гистонов, образуя так называемую нуклеосому. Размер нуклеосомы около 10 нм. При образовании нуклеосом происходит компактизация, сверхспирализация ДНК, что приводит к укорачиванию длины хромосомной фибриллы примерно в 5 раз. Сама же хромосомная фибрилла имеет вид нитки бус или четок, где каждая бусина – нуклеосома. Такие фибриллы толщиной 10 нм дополнительно продольно конденсируются и образуют основную элементарную фибриллу хроматина толщиной 25 нм. Негистоновые белки интерфазных ядер образуют внутри ядра структурную сеть, которая носит название ядерный белковый матрикс, представляющий собой основу, определяющую морфологию и метаболизм ядра. Ядрышко Практически во всех живых клетках эукариотических организмов в ядре видно одно или несколько обычно округлой формы телец величиной 1-5 мкм, сильно преломляющих свет – это ядрышко, или нуклеола. К общим свойствам ядрышка различными относится красителями, способность особенно хорошо основными. окрашиваться Такая базофилия определяется тем, что ядрышки богаты РНК. Ядрышко – самая плотная структура ядра – является производным хромосомы, одним из ее локусов с наиболее высокой концентрацией и активностью синтеза РНК в интерфазе. Оно не является самостоятельной структурой или органеллой. В ядрышке находятся хромосомы, содержащие петли ДНК и большие скопления генов рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК). Каждое такое скопление генов называется ядрышковым оргнанизатором. В ядрышках происходят следующие процессы. 1. Транскрипция рибосомной ДНК РНК-полимеразой I. 2. Упаковка рРНК в рибонуклеопротеидные комплексы, которые в дальнейшем становятся двумя главными субъедииицами рибосомы (40S и 60S субъединицами). Образование ядрышек и их число связаны с активностью ядрышковых организаторов, которые расположены большей частью в зонах вторичных перетяжек; количество ядрышек в клетках данного типа может изменяться за счет слияния ядрышек или за счет изменения числа хромосом с ядрышковыми организаторами. При исследовании фиксированных клеток вокруг ядрышка всегда выявляется зона конденсированного хроматина, часто отождествляемая околоядрышковый с хроматином хроматин, по ядрышкового данным организатора. электронной Этот микроскопии, представляет собой интегральную часть сложной структуры ядрышка. ДНК ядрышкового организатора представлена множественными (несколько сотен) копиями генов рРНК: на каждом из этих генов синтезируется высокомолекулярный предшественник РНК, который превращается в более короткие молекулы РНК, входящие в состав субъединиц рибосомы. Схему участия ядрышек в синтезе цитоплазматических белков можно представить следующим образом: на ДНК ядрышкового организатора образуется предшественник рРНК, который в зоне ядрышка одевается белком, здесь происходит сборка рибонуклеопротеидных частиц – субъединиц рибосом; субъединицы, выходя из ядрышка в цитоплазму, участвуют в процессе синтеза белка. Ядрышко неоднородно по своему строению: в световом микроскопе можно видеть микроскопе его тонковолокнистую выявляются два основных организацию. компонента: В электронном гранулярный и фибриллярный. Диаметр гранул около 15-20 нм, толщина фибрилл – 6-8 нм. Фибриллярный компонент может быть сосредоточен в виде центральной части ядрышка, а гранулярный – по периферии. Часто гранулярный компонент образует нитчатые структуры – нуклеолонемы толщиной около 0,2 мкм. Фибриллярный компонент ядрышек представляет собой рибонуклеопротеидные тяжи предшественников рибосом, а гранулы – созревающие субъединицы рибосом. В зоне фибрилл можно выявить участки ДНК ядрышковых организаторов. Ультраструктура ядрышек зависит от активности синтеза РНК: при высоком уровне синтеза рРНК в ядрышке выявляется большое число гранул, при прекращении синтеза количество гранул снижается, ядрышки превращаются в плотные фибриллярные тельца базофильной природы. Действие многих веществ (актиномицин, митомицин, ряд канцерогенных углеводородов, циклогексимид, гидрооксимочевина и др.) вызывает в клетках падение интенсивности ряда синтезов и в первую очередь активности ядрышек. При этом возникают изменения в структуре ядрышек: их сжатие, обособление фибриллярных и гранулярных зон, потеря гранулярного компонента, распад всей структуры. Эти изменения отражают степень повреждения ядрышковых структур, связанных главным образом с подавлением синтеза рРНК Синтез рибосом в ядрышке Ядрышко не окружено мембраной; это, скорее, скопление рибосомных частиц, образующееся в процессе сборки. Синтез рибосом – основной процесс, происходящий в ядре. Самые активные эукариотические клетки используют около 10 миллионов рибосом в течение одного клеточного цикла. Как часть структуры рибосомы, вокруг каждой рРНК субъединицы находится ряд высокоспециализироваииых белков. В состав малой субъедииицы – 40S частицы – входят 30 уникальных белков, собранных вокруг молекулы 18S РНК. Большая субъединица – 60S частица – имеет 51 белок, связанный со своей главной молекулой 28S РНК. В комплекс большей субъединицы входит также 5,8S РНК. Более подробно механизмы синтеза белка рассматриваются ниже в этой главе ?? (откуда глава?) (рис. 3-4). Ядерная оболочка Ядерная оболочка – двойная мембранная структура, которая окружает хроматин и переходит в ЭПС. Внешняя ядерная мембрана и внутренняя мембрана цистерной оболочки ядерной разделены оболочки. перинуклеарным Мембраны пространством, ядерной или оболочки в морфологическом отношении не отличаются от остальных внутриклеточных мембран. В общем виде ядерная оболочка может быть представлена как полый двухслойный мешок, отделяющий содержимое ядра от цитоплазмы. Внутренняя мембрана по составу белков отличается от наружной мембраны. Внутренний слой мембраны имеет волокнистую сеть белков, называемых ламинами, которые играют ключевую роль в поддержании структурной целостности мембраны. Наружная мембрана ядра переходит в мембрану ЭПС и содержит белки, необходимые для связывания рибосом (рис. 3-5). Ядерная оболочка содержит ядерные поры. Внешняя мембрана контактирующая с ядерной цитоплазмой оболочки, клетки, имеет непосредственно ряд структурных особенностей, позволяющих отнести ее к собственно мембранной системе эндоплазматической сети: на ней со стороны гиалоплазмы расположены многочисленные полирибосомы, а сама внешняя ядерная мембрана может прямо переходить в мембраны эндоплазматической сети. Внутренняя мембрана связана с хромосомным материалом ядра. Ядерная пора и ядерный поровый комплекс Наиболее характерными структурами ядерной оболочки являются ядерные поры. Они образуются за счет слияния двух ядерных мембран. Ядерные поры – гигантские макромолекуляриые комплексы, которые обеспечивают активный обмен белков и рибонуклеоиротеидов между ядром и цитоплазмой. Округлые сквозные отверстия поры имеют диаметр около 80-90 нм. Эти отверстия в ядерной оболочке заполнены сложноорганизованными глобулярными и фибриллярными структурами Совокупность мембранных перфораций и этих структур называют ядерным комплексом поры (ЯПК).. ЯПК формирует цилиндр, приблизительно 1200 Å в диаметре и 500 Å толщиной и имеет восьмиугольную симметрию. ЯПК состоит из 100-200 белков; он имеет массу 124x106 дальтон, что примерно в 30 раз больше массы рибосомы. По границе округлого отверстия в ядерной оболочке располагается три ряда гранул по 8 в каждом: один ряд лежит со стороны ядра, другой – со стороны цитоплазмы, третий расположен в центральной части поры. Размер гранул около 25 нм. От этих гранул отходят фибриллярные отростки. Фибриллы, отходящие от периферических гранул, могут сходиться в центре и создавать как бы перегородку, диафрагму поперек поры. Этот комплекс – основные ворота для веществ, которые постоянно перемещаются внутрь ядра и из него. Например, матричная РНК (мРНК), субъединицы рибосом, гистоны, рибосомпые белки, факторы транскрипции, ионы и мелкие молекулы быстро обмениваются между ядром и полостью эндоплазматического ретикулума или цитозолем (рис. 3-6).. Число ядерных пор зависит от метаболической активности клеток: чем интенсивнее синтетические процессы в клетках, тем больше пор на единицу поверхности клеточного ядра. Так, у эритробластов (клеток- предшественников ядерных эритроцитов) низших позвоночных животных во время интенсивного синтеза и накопления гемоглобина обнаруживается в ядре около 30 ядерных пор на 1 мкм2. После того как эти процессы заканчиваются, в ядрах зрелых клеток – эритроцитов прекращается синтез ДНК и РНК и количество пор снижается до 5 на 1 мкм2. В ядерных оболочках полностью зрелых сперматозоидов поры не обнаруживаются. Из многочисленных свойств и функциональных нагрузок ядерной оболочки следует подчеркнуть ее роль как барьера, отделяющего содержимое ядра от цитоплазмы, ограничивающего свободный доступ в ядро крупных агрегатов биополимеров, регулирующего транспорт макромолекул между ядром и цитоплазмой. Одной из важных функций ядерной оболочки следует считать ее участие в создании внутриядерного порядка – в фиксации хромосомного материала в трехмерном пространстве ядра. В интерфазе часть хроматина структурно связана с внутренней ядерной мембраной. Описаны случаи примембранной локализации центромерных и теломерных участков интерфазных хромосом. Механизм ядерного импорта и экспорта Основные этапы активного ядерного импорта состоят в следующем. 1. Растворенный в цитозоле рецептор узнает импортируемую молекулу; рецептор и молекула связываются в комплекс. 2. Рецепторный комплекс связывается с цитопазматической поверхностью ЯПК. 3. Комплекс центральному рецептор-лиганд каналу ЯПК. Гидролиз перемещается ближе к ГТФ молекулами гуанозинтрифосфатаз (ГТФаз) дает энергию для активации воротного механизма центральной поры, что ведет к транслокации комплекса в нуклеоплазму. Как только транслокационный комплекс переходит в ядро, он диссоциирует, и транспортные факторы, включая растворимый рецептор, вновь возвращаются в цитоплазму (рис. 3-7). Перемещение молекул из ядра и в него происходит путем активного транспорта, пассивной диффузии или путем специальной ядерной локализации, которая идет посредством сигнальной последовательности определенных белков. Пассивная диффузия и активный транспорт происходят через ядерный поровый комплекс. Мелкие молекулы и ионы (< 9 кДа) диффундируют через водный канал ЯПК, около 10 нм в диаметре. Более крупные молекулы (> 9 кДа) перемещаются путем активного транспорта с вовлечением ядерного сигнала (главы 9 и 10), а также по энергозависимому механизму. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ КЛЕТОК Клеточный цикл Один из постулатов клеточной теории гласит, что увеличение числа клеток, их размножение происходят путем деления исходной клетки. Обычно делению клеток предшествует редупликация их хромосомного аппарата, синтез ДНК. Это правило является общим для прокариотических и эукариотических клеток. Время существования клетки как таковой, от деления до деления или от деления до смерти, обычно называют клеточным циклом. Во взрослом организме высших позвоночных клетки различных тканей и органов имеют неодинаковую способность к делению. Встречаются популяции клеток, полностью потерявшие свойство делиться. Это большей частью специализированные, дифференцированные клетки (например, зернистые лейкоциты крови). В организме есть постоянно обновляющиеся ткани – различные эпителии, кроветворные ткани. В таких тканях существует часть клеток, которые постоянно делятся, заменяя отработавшие или погибающие клеточные типы (например, клетки базального слоя покровного эпителия, клетки крипт кишечника, кроветворные клетки костного мозга). Многие клетки, не размножающиеся в обычных условиях, приобретают вновь это свойство при процессах репаративной регенерации органов и тканей. Размножающиеся клетки обладают разным количеством ДНК в зависимости от стадии клеточного цикла. Это наблюдается при размножении как соматических, так и половых клеток. Как известно, половые мужские и женские клетки несут единичный (гаплоидный) набор хромосом и, следовательно, содержат в 2 раза меньше ДНК, чем все остальные клетки организма. Такие половые клетки (сперматозоиды и овоциты) с единичным набором хромосом называют гаплоидными. Плоидность обозначают буквой n. Так, клетки с 1n гаплоидны, с 2n диплоидны, с 3n триплоидны и т. д. Соответственно количество ДНК на клетку (с) зависит от ее плоидности: клетки с 2n числом хромосом содержат 2с количества ДНК. При оплодотворении происходит слияние двух клеток, каждая из которых несет 1n набор хромосом, поэтому образуется исходная диплоидная (2n, 2с) клетка-зитота. В дальнейшем в результате деления диплоидной зиготы и последующего деления диплоидных клеток разовьется организм, клетки которого (кроме зрелых половых) будут диплоидными. При изучении клеточного цикла диплоидных клеток в их популяции встречаются как диплоидные (2с), так и тетраплоидные (4с) и интерфазные клетки с промежуточным количеством ДНК. Такая гетерогенность определяется тем, что удвоение ДНК происходит в строго определенный период интерфазы, а собственно к делению клетки приступают только после этого процесса. Весь клеточный цикл состоит из 4 отрезков времени: собственно митоза (М), пресинтетического (G1), синтетического (S) и постсинтетического (G2) периодов интерфазы. В G1-периоде, наступающем сразу после деления, клетки имеют диплоидное содержание ДНК на одно ядро (2 с). После деления в период G1 в дочерних клетках общее содержание белков и РНК вдвое меньше, чем в исходной родительской клетке. В период G1 начинается рост клеток главным образом за счет накопления клеточных белков, что определяется увеличением количества РНК на клетку. В этот период начинается подготовка клетки к синтезу ДНК (S-период). Обнаружено, что подавление синтеза белка или иРНК в G1-периоде предотвращает наступление S-периода, так как в течение G -периода происходят синтезы ферментов, необходимых для образования предшественников ДНК (например, нуклеотид-фосфокиназ), ферментов метаболизма РНК и белка. Это совпадает с увеличением синтеза РНК и белка. При этом резко повышается активность ферментов, участвующих в энергетическом обмене. В следующем, S-периоде происходит удвоение количества ДНК на ядро и соответственно удваивается число хромосом. В разных клетках, находящихся в S-периоде, можно обнаружить разные количества ДНК – от 2 до 4с. Это связано с тем, что исследованию подвергаются клетки на разных этапах синтеза ДНК (только приступившие к синтезу и уже завершившие его). S-период является узловым в клеточном цикле. Без прохождения синтеза ДНК неизвестно ни одного случая вступления клеток в митотическое деление. Единственным исключением является второе деление созревания половых клеток в мейозе, когда между двумя делениями нет синтеза ДНК. В S-периоде уровень синтеза РНК возрастает соответственно увеличению количества ДНК, достигая своего максимума в G2-периоде. Постсинтетическая (G2) фаза еще называется премитотической. Последним термином подчеркивается ее большое значение для прохождения следующей стадии – стадии митотического деления. Выданной фазе происходит синтез иРНК, необходимый для прохождения митоза. Несколько ранее этого синтезируется рРНК рибосом, определяющих деление клетки. Среди синтезирующихся в это время белков особое место занимают тубулины – белки митотического веретена. В конце G2-периода или в митозе по мере конденсации митотических хромосом синтез РНК резко падает и полностью прекращается во время митоза. Синтез белка во время митоза понижается до 25% от исходного уровня и затем в последующих периодах достигает своего максимума в G2периоде, в общем повторяя характер синтеза РНК. В растущих тканях растений и животных всегда есть клетки, которые находятся как бы вне цикла. Такие клетки принято называть клетками G0периода. Именно эти клетки представляют собой так называемые покоящиеся, временно или окончательно переставшие размножаться клетки. В некоторых тканях такие клетки могут находиться длительное время, не изменяя особенно своих морфологических свойств: они сохраняют в принципе способность к делению, превращаясь в камбиальные, стволовые клетки(например, в кроветворной ткани). Чаще потеря (хотя бы и временная) способности делиться сопровождается появлением способности к специализации, дифференцировке. Такие дифференцирующиеся клетки выходят из цикла, но в особых условиях могут снова входить цикл. Например, большинство клеток печени находится в G0-периоде; они не участвуют в синтезе ДНК и не делятся. Однако при удалении части печени у экспериментальных животных, многие клетки начинают подготовку к митозу (G1-период), переходят к синтезу ДНК и могут митотически делиться. В других случаях, например в эпидермисе кожи, после выхода из цикла размножения и дифференцировки клетки некоторое время функционируют, а затем погибают (ороговевшие клетки покровного эпителия). Деление клеток Митоз Митоз, кариокинез, или непрямое деление,– универсальный, широко распространенный способ деления клеток. При этом конденсированные и уже редуплицированные хромосомы переходят в компактную форму митотических хромосом, образуется веретено деления, участвующее в сегрегации и переносе хромосом (ахроматиновый митотический аппарат), происходит расхождение хромосом к противоположным полюсам клетки и деление тела клетки (цитокинез, цитотомия). Процесс непрямого деления клеток принято подразделять на несколько основных фаз: профаза, метафаза, анафаза, телофаза. Профаза. После окончания S-периода количество ДНК в интерфазном ядре равно 4с, так как произошло удвоение хромосомного материала. Однако морфологически регистрировать удвоение числа хромосом в этой стадии не всегда удается. Собственно хромосомы как нитевидные плотные тела начинают обнаруживаться микроскопически в начале процесса деления клетки, а именно в профазе митотического деления клетки. Если попытаться подсчитать число хромосом в профазе, то их количество будет равно 2n. Но это ложное впечатление, потому что в профазе каждая из хромосом двойная, что является результатом их редупликации в интерфазе. В профазе эти сестринские хромосомы тесно соприкасаются друг с другом, взаимно спирализуясь одна относительно другой, поэтому трудно увидеть двойственность всей структуры в целом. Позднее хромосомы в каждой такой паре начинают обособляться, раскручиваться. Двойственность хромосом в митозе наблюдается у живых клеток в конце профазы, когда видно, что общее их число в начинающей делиться клетке равно 4n. Следовательно, уже в начале профазы хромосомы состояли из двух сестринских хромосом, или, как их еще называют, хроматид. Число их (4n) в профазе точно соответствует количеству ДНК (4с). Параллельно конденсации хромосом в профазе происходят исчезновение, дезинтеграция ядрышек в результате инактивации рибосомных генов в зоне ядрышковых организаторов. Одновременно с этим в середине профазы начинается разрушение ядерной оболочки, исчезают ядерные поры, оболочка распадается сначала на фрагменты, а затем на мелкие мембранные пузырьки. Меняются в это время и структуры, связанные с синтезом белка. Происходит уменьшение количества гранулярного эндоплазматического ретикулума, он распадается на короткие цистерны и вакуоли, количество рибосом на его мембранах резко падает. Значительно (до 25%) редуцируется число полисом как на мембранах, так и в гиалоплазме, что является признаком общего падения уровня синтеза белка в делящихся клетках. Второе важнейшее событие при митозе тоже происходит во время профазы – это образование веретена деления. В профазе уже репродуцировавшиеся в S-периоде центриоли начинают расходиться к противоположным концам клетки, где будут позднее формироваться полюса веретена. К каждому полюсу отходит по двойной центриоли, диплосоме. По мере расхождения диплосом начинают формироваться микротрубочки, отходящие от периферических участков одной из центриолей каждой диплосомы. Сформированный аппарат деления в животных клетках имеет веретеновидную форму и состоит из нескольких зон: двух зон центросфер с центриолями внутри них и промежуточной между ними зоны волокон веретена. Во всех этих зонах имеется большое число микротрубочек. Микротрубочки в центральной части этого аппарата, в собственном веретене деления, так же как микротрубочки центросфер, возникают в результате специальных полимеризации структур – тубулинов в кинетохоров, зоне центриолей расположенных и в около области центромерных перетяжек хромосом. В веретене деления принято различать два типа волокон: идущие от полюса к центру веретена и хромосомные, соединяющие хромосомы с одним из полюсов. В индукции роста микротрубочек веретена в зоне полюса деления принимает участие одна из центриолей диплосомы, а именно материнская. Такое новообразование и рост нитей (пучков микротрубочек) веретена происходят в профазе митоза. В то же время видны появляющиеся на хромосомах в местах первичных перетяжек пластинчатые кинетохоры, около которых позднее также появляются микротрубочки, идущие в направлении полюсов деления. Таким образом, у животных клеток центриоли и хромосомные кинетохоры являются центрами организации микротрубочек веретена деления. Метафаза занимает около трети времени всего митоза. Во время метафазы заканчивается образование веретена деления, а хромосомы выстраиваются в экваториальной плоскости веретена, образуя так называемую метафазную пластинку хромосом, или материнскую звезду. К концу метафазы завершается процесс обособления друг от друга сестринских хроматид. Их плечи лежат параллельно друг другу, между ними хорошо видна разделяющая их щель. Последним местом, где контакт между хроматидами сохраняется, является центромера. Анафаза. Хромосомы все одновременно теряют связь друг с другом в области центромер и синхронно начинают удаляться друг от друга по направлению к противоположным полюсам клетки. Скорость движения хромосом равномерная, она может достигать 0,2-0,5 мкм/мин. Анафаза – самая короткая стадия митоза (несколько процентов от всего времени), но за это время происходит ряд событий. Главным из них является обособление двух идентичных наборов хромосом и перемещение их в противоположные концы клетки. Движение хромосом складывается из двух процессов, расхождения их по направлению к полюсам и дополнительного расхождения самих полюсов. Предположения о сокращении микротрубочек как о механизме расхождения хромосом в митозе не подтвердились, поэтому многие исследователи поддерживают гипотезу “скользящих нитей”, согласно которой соседние микротрубочки, взаимодействуя друг с другом (например, хромосомные и полюсные) и с сократительными белками, тянут хромосомы к полюсам. Телофаза начинается с остановки разошедшихся диплоидных (2n) наборов хромосом (ранняя телофаза) и кончается началом реконструкции нового интерфазного ядра (поздняя телофаза, ранний G1-период) и разделением исходной клетки на две дочерние (цитокинез, цитотомия). В ранней телофазе хромосомы, не меняя своей ориентации (центромерные участки – к полюсу, теломерные – к центру веретена), начинают деконденсироваться и увеличиваться в объеме. В местах их контактов с мембранными пузырьками цитоплазмы образуется новая ядерная оболочка. После замыкания ядерной оболочки начинается формирование новых ядрышек. Клетка переходит в новый G1-период. Важное событие телофазы – разделение клеточного тела, цитотомия, или цитокинез, который происходит у клеток животных путем образования перетяжки в результате впячивания плазматической мембраны внутрь клетки. При этом в кортикальном, подмембранном слое цитоплазмы располагаются ориентированные сократимые элементы циркулярно в зоне типа актиновых экватора клетки. фибрилл, Сокращение такого/кольца приведет к впячиванию плазматической мембраны в области этого кольца, что завершается разделением клетки перетяжкой на две. При повреждении митотического аппарата (действие холода или агентов, вызывающих деполимеризацию тубулинов) может произойти или задержка митоза в метафазе, или рассеивание хромосом. При нарушениях репродукции центриолей могут возникать многополюсные и асимметричные митозы и т. д. Нарушения цитотомии приводят к появлению гигантских ядер или многоядерных клеток. Морфология митотических хромосом Как интерфазные, так митотические хромосомы состоят из элементарных хромосомных фибрилл – молекул ДНП. В последнее время принято считать, что на каждую хромосому приходится одна гигантская фибрилла ДНП, сложно уложенная в относительно короткое тельце – собственно митотическую хромосому. Установлено, что в митотической хромосоме существуют боковые дезоксирибонуклеопротеида. петли Боковые этой петли гигантской хромосом в молекулы вытянутом состоянии могут достигать 30 мкм. При их компактизации (спирализации) образуются структуры промежуточного характера – так называемые хромонемные фибриллы. Взаимодействие этих компонентов хромосом друг с другом и их взаимная агрегация приводят к конечной компактизации хроматина в виде митотической хромосомы. Морфологию митотических хромосом лучше всего изучать в момент их наибольшей конденсации, в метафазе и в начале анафазы. Хромосомы в этом состоянии представляют собой палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной. У большинства хромосом удается легко найти зону первичной перетяжки (центромеры), которая делит хромосому на два плеча. Хромосомы с равными или почти равными плечами называют метацентрическими, с плечами неодинаковой длины – субметацентрическими. Палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом называют акроцентрическими. В области первичной перетяжки расположен кинетохор. От этой зоны во время митоза отходят микротрубочки клеточного веретена, связанные с перемещением хромосом при делении клетки. Некоторые хромосомы имеют, кроме того, вторичные перетяжки, располагающиеся вблизи одного из концов хромосомы и отделяющие маленький участок – спутник хромосомы. Вторичные перетяжки называют, кроме того, ядрышковыми организаторами, так как именно на этих участках хромосом в интерфазе происходит образование ядрышка. В этих местах локализована ДНК, ответственная за синтез рибосомных РНК. Плечи хромосом оканчиваются теломерами – конечными участками. Размеры хромосом, как и их число, у разных организмов варьируют в широких пределах. Совокупность числа, размеров и особенностей строения хромосом называется кариотипом данного вида. При специальных методах окраски хромосомы неравномерно воспринимают красители: вдоль их длины наблюдается чередование окрашенных и неокрашенных участков – дифференциальная неоднородность хромосомы. Важно то, что каждая хромосома имеет свой, неповторимый рисунок такой дифференциальной окраски. Применение методов дифференциальной окраски позволило детально изучить строение хромосом. Хромосомы человека принято подразделять по их размерам на 7 групп (А, В, С, D, Е, F, G). Если при этом легко отличить крупные (1, 2) хромосомы от мелких (19, 20), метацентрические от акроцентрических (13), то внутри групп трудно различить одну хромосому от другой. Так в группе С6 и С7 хромосомы схожи между собой, так же как и с Х-хромосомой. Дифференциальное окрашивание позволяет четко отличить эти хромосомы друг от друга. Эндорепродукция Эндорепродукция – образование клеток с увеличенным содержанием ДНК. Появление таких клеток происходит в результате полного отсутствия или незавершенности отдельных этапов митоза. Существует несколько моментов в процессе митоза, блокада которых приводит к его остановке и появлению полиплоидных клеток, т. е. клеток с увеличенным числом хромосомных наборов. Блокада может наступить при переходе от G2периода к собственно митозу, остановка может произойти в профазе и метафазе, в последнем случае часто нарушается функция и целость веретена деления. Наконец, следствием нарушения цитотомии также может явиться появление полиплоидных клеток – одноядерных и двуядерных. При блокаде митоза в самом его начале, при переходе его от G 2 к профазе, клетки приступают к следующему циклу репликации, приводящему к прогрессивному увеличению количества ДНК в ядре. При этом не наблюдается никаких морфологических особенностей таких ядер, кроме увеличения их объема. Появление полиплоидных соматических клеток может происходить в результате блокады деления клеточного тела. В печени взрослых млекопитающих встречаются, кроме диплоидных, тетра- и октаплоидные (8n) клетки, а также двуядерные клетки разной степени плоидности. Процесс полиплоидизации этих клеток происходит следующим образом. После S- периода клетки, обладающие 4с количеством ДНК, вступают в митотическое деление, проходят все его стадии, включая телофазу, но не приступают к цитотомии. Таким образом, образуется двуядерная клетка (2х2n). Если она снова проходит 5-период, то оба ядра в такой клетке будут содержать по 4с ДНК и 4n хромосом. Такая двуядерная клетка входит в митоз, на стадии метафазы происходит объединение хромосомных наборов (общее число хромосом равно 8n), а затем – нормальное деление, в результате которого образуются две тетраплоидные клетки. Этот процесс попеременного появления двуядерных и одноядерных клеток приводит к появлению ядер с 8n, 16n и даже 32n количеством хромосом. Подобным способом образуются полиплоидные клетки в печени, в эпителии мочевого пузыря, в пигментном эпителии сетчатки, в ацинарных отделах слюнных и поджелудочной желез, мегакариоциты красного костного мозга. Необходимо отметить, что полиплоидизация соматических клеток встречается на терминальных периодах развития клеток, тканей и органов. Она большей частью характерна для специализированных, дифференцированных клеток и не встречается при генеративных процессах, таких как эмбриогенез (исключая провизорные органы) и образование половых клеток; нет полиплоидии среди стволовых клеток. РЕАКЦИЯ КЛЕТОК НА ВНЕШНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ Организм и его клетки постоянно подвергаются воздействию самых разнообразных химических, физических или биогенных факторов. Эти факторы могут вызывать первичное нарушение одной или нескольких клеточных структур, что в свою очередь приводит к функциональным нарушениям. В зависимости от интенсивности поражения, его длительности и характера судьба клетки может быть различна. Измененные в результате повреждения клетки могут адаптироваться, приспособиться к повреждающему фактору, репарировать повреждения, реактивироваться после снятия повреждающего воздействия или измениться необратимо и погибнуть. Исходя из этого, функциональные и морфологические картины клеток в этих состояниях очень разнообразны. На различные факторы при обратимом повреждении клетки отвечают рядом изменений. Проявлением общеклеточной реакции на повреждение является изменение способности клетки связывать различные красители. Так, нормальные клетки, поглощая из внеклеточной среды растворенные в ней красители, откладывают их в виде гранул. Такое гранулообразование происходит в цитоплазме, ядро при этом остается бесцветным. При повреждении клеток многими физическими (нагревание, давление) или химическими факторами (изменение рН среды, добавление спирта или какого-либо иного денатурирующего агента) гранулообразование прекращается, цитоплазма и ядро диффузно окрашиваются проникшим в клетку красителем. Если действие фактора обратимо и при устранении его клетка возвращается к норме, то снова восстанавливается ее способность к гранулообразованию. При различных повреждениях клеток значительно падает окислительное фосфорилирование: прекращается синтез АТФ и растет потребление кислорода. Для поврежденных клеток характерно усиление гликолитических процессов, падение количества АТФ, активация протеолиза. Совокупность неспецифических обратимых изменений цитоплазмы, возникающих под воздействием различных агентов, была обозначена термином “паранекроз” [Насонов Д. Н., Александров В. Я., 1940]. При различных воздействиях на клетку наиболее частым изменением структуры ядра является конденсация хроматина, что может отражать падение ядерных синтетических процессов. При гибели клетки происходят коагуляция хроматина, собирание его в грубые агрегаты внутри ядра (пикноз), что часто завершается распадом на части (кариорексис) и растворением ядра (кариолизис). Ядрышки при подавлении синтеза рРНК уменьшаются в размерах, теряют гранулы, фрагментируются. К наиболее часто встречающимся изменениям ядерной оболочки относятся расширение (отечность) перинуклеарного пространства, извитость контура ядерной оболочки, что нередко сочетается с пикнозом ядра. На ранних этапах повреждения клетки часто приобретают шаровидную форму и теряют многочисленные клеточные выросты и микроворсинки. В дальнейшем, наоборот, изменения плазмолеммы сводятся к появлению на поверхности клеток различных выростов или мелких пузырей. На начальных стадиях нарушения окислительного фосфорилирования происходит сжатие митохондриального матрикса и некоторое расширение межмембранного пространства. В дальнейшем этот тип реакции митохондрий может смениться их набуханием, что особенно часто встречается при самых различных патологических изменениях клеток. Митохондрии при этом принимают сферическую форму и увеличиваются в размерах, происходит обводнение матрикса, он становится светлым. Набухание митохондрий, как правило, сопровождается редукцией числа и размера крист. При необратимом повреждении митохондрий происходит разрыв их мембран, матрикс смешивается с гиалоплазмой. Система эндоплазматического ретикулума чаще всего подвергается вакуолизации и распаду на мелкие пузырьки. При этом на мембранах гранулярного ретикулума уменьшается число рибосом, что однозначно указывает на падение белкового синтеза. Цистерны комплекса Гольджи также могут увеличиваться в объеме или распадаться на мелкие вакуоли. В поврежденных клетках происходит активация их лизосом, увеличивается число аутофагосом. При тяжелых клеточных повреждениях мембраны лизосом разрываются и лизосомные гидролазы начинают разрушать сами клетки – происходит лизис клеток. Поврежденные клетки резко снижают митотическую активность, часто задерживаются на разных стадиях митоза главным образом из-за нарушения митотического аппарата, очень чувствительного к изменениям внутриклеточной среды. Развитие процесса повреждения клеток останавливается после неблагоприятного воздействия. Если изменения в клетке не зашли слишком далеко, происходит репарация клеточных повреждений, возврат клетки к нормальному функциональному уровню. Так, в ряде случаев повреждения клеток, связанные с набуханием митохондрий и с фрагментацией эндоплазматического ретикулума, оказываются обратимыми. Процессы восстановления внутриклеточных структур называют внутриклеточной регенерацией. Репарация клеток бывает полной, когда восстанавливаются все свойства данных клеток, или неполной. В последнем случае после снятия действия повреждающего фактора нормализуется ряд функций клеток, но через некоторое время они уже без всякого воздействия погибают. Особенно часто это наблюдается при поражениях клеточного ядра. Повреждение клеток внешними и внутриорганизменными факторами может привести к нарушениям регуляции их метаболизма. При этом происходит интенсивное отложение или же, наоборот, резорбция ряда клеточных включений. Кроме того, наблюдается нарушение регуляции проницаемости клеточных мембран, что приводит к вакуолизации мембранных органелл. В патологической анатомии такие изменения в структуре клеток называют дистрофиями. При жировой дистрофии в клетках накапливаются жировые включения. Жировая инфильтрация, когда клетка, поглощая жиры, неспособна к их утилизации, приводит к накоплению жировых капель в цитоплазме. Часто в цитоплазме измененных клеток обнаруживаются скопления липопротеидных комплексов, имеющих вид многослойных мембранных пластов. Нарушение регуляторных процессов метаболизма сахаров приводит к патологическому отложению и накоплению гликогена, что, вероятно, связано с недостаточностью фермента, расщепляющего гликоген (глюкозо-6-фосфатазы). Часто в измененных клетках животных происходит отложение различных пигментов, белковых гранул и др. Особой формой патологического нарушения регуляторных процессов могут быть нарушения специализации, одним из которых является злокачественный опухолевый рост. Опухолевые клетки характеризуются безудержностью, неограниченностью размножения, нарушением уровня специализации, автономностью изменениями от строения регуляторных влияний клеток, со относительной стороны организма, способностью к метастазированию. Все эти свойства опухолевые клетки сохраняют от поколения к поколению, т. е. свойства злокачественности являются наследственной особенностью таких клеток. Вот почему считается, что раковые клетки являются мутантами, обладающими измененной генетической структурой; именно изменением генотипа клетки можно объяснить непрерывную передачу дочерним клетками дефектной (в отношении регуляции) информации. При необратимом повреждении клетки гибнут. Дать определение момента клеточной смерти очень трудно (так же, как и при смерти целого организма), так как умирание – это не одномоментное явление, а процесс. При необратимом повреждении разворачивается ряд последовательных событий, приводящих к разрушению клеток. В самом начале изменения клеток имеют характер обратимых, паранекротических. Отличие состоит в том, что после снятия воздействия они не исчезают, а прогрессируют. Явным признаком гибели клетки является активация внутриклеточных гидролитических ферментов. Они активируются в гиалоплазме и начинают расщепление белков, липидов и др., при этом разрушаются внутриклеточные мембраны, в том числе и мембраны лизосом. Все это приводит к лизису, разрушению клеток, но это уже относится к посмертным изменениям.