ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кафедра биологии с курсом медицинской генетики Тема: «МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ ЧЕЛОВЕКА (ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЙ, БИОХИМИЧЕСКИЙ, ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ, БЛИЗНЕЦОВЫЙ, МОЛЕКУЛЯРНЫЙ)» Краснодар, 2020 Преподаватель: Почешхова Э.А. ПЛАН ЛЕКЦИИ Гибридологический метод Популяционностатистический метод Генеалогический метод Биохимический метод 05 Молекулярногенетический метод 06 Цитогенетический метод 03 07 Метод дерматоглифики 04 Близнецовый 08 метод 01 02 ЦЕЛЬ: знакомство с новейшими достижениями генетики в области диагностики наследственных болезней в отдельных семьях и в популяции в целом. ЗАДАЧИ: 1. Разобрать сущность и возможности современных генетических методов (цитогенетической, биохимической и молекулярно-генетической диагностики), показания для их применения; 2. Изучить клинико-генеалогический анализ: сбор генеалогических сведений, составление родословной и формирование предварительного заключения о типе наследования патологии в конкретной семье; 3. Разобрать методы исследования генетики человека (близнецовый и популяционностатистический): определение, сущность, понятия, применение; 4. Получение представления о возможностях и значении современных методов генетики человека в диагностике и профилактике наследственной патологии человека. ВОПРОС 1. ГИБРИДОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД Основан на анализе наследования признаков при скрещивании родительских особей с известными генотипами (фенотипами). Метод преимущественно применяется в сельском хозяйстве (растениеводство и животноводство). В генетике человека гибридологический метод не используется. Однако, при определении вероятности наследования какого-то признака у потомков применяются методики гибридологического анализа. Пример. У фенотипически здоровых родителей родился ребенок с ахондроплазией – резкое укорочение костей нижних и верхних конечностей. Необходимо определить вероятность повторения данной патологии при следующей беременности. ФЕНОТИПЫ БОЛЬНЫХ АХОНДРОПЛАЗИЕЙ ГИБРИДОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД o Доминантный мутантный ген, локализованный в 4р16.3. o У обоих фенотипически здоровых родителей гены ответственные за рост трубчатых костей конечностей нормальные – рецессивные, и их генотипы гомозиготные по рецессивным генам (аа). o У больного ребенка в генотипе обязательно присутствует доминантный ген (А), который появился в результате новой мутации (de novo). o Обозначив генотипы родителей аа и аа и их гаметы с генами а, можно видеть, что вероятность передачи доминантного гена отсутствует, т.е. равна нулю %. o Такие расчеты возможны при медико-генетическом проспективном консультировании, когда известен тип наследования анализируемого признака (моногенное, с полным доминированием). ВОПРОС 2. ПОПУЛЯЦИОННОСТАТИСТИЧЕСКИЙ МЕТОД Этим методом можно рассчитать частоту встречаемости в популяции различных аллелей гена и разных генотипов по этим аллелям, выяснить распространение в ней различных наследственных признаков, в том числе заболеваний. СТАТИСТИЧЕСКИЙ (МАТЕМАТИЧЕСКИЙ) МЕТОД В работе Г.Менделя этот метод впервые был применен для количественной оценки наследуемости отдельных признаков у анализируемых растений (горох), что позволило установить закономерности наследования при моно- и дигибридном скрещивании. В настоящее время метод чаще используется в медико-генетических исследованиях для определения вероятности рождения детей (больных или здоровых) в семьях с отягощенной наследственностью. Вероятность выражается в процентах. Метод широко применяется при проведении популяционных исследований - популяционно-статистический анализ. ВОПРОС 3. ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД Основан на сборе анамнестических данных, получаемых от пробанда, его родителей или родственников. o Метод позволяет установить тип наследования патологии : АД, АР, Х-сц, Y- cц. o При сборе генеалогической информации необходимо соблюдать достоверность и объективность сведений о всех членах анализируемой семьи. o Конфиденциально полученная информация об исследуемой семье должна использоваться только в интересах медико-генетического анализа и не может быть использована для других целей. ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ВОПРОС 4. БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД Позволяет диагностировать наследственные болезни обмена (НБО), которые развиваются под контролем мутантных генов. Известно более 3000 НБО, которые клинически проявляются различными признаками в результате нарушения белкового, углеводного, липидного , ионов металлов и др. видов обмена органических и неорганических веществ. БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД Для биохимического анализа могут быть использованы: кровь, моча, пот, слюна, мышцы и др. ткани и секреты человека. При биохимическом анализе возможны качественные, количественные и полуколичественные методы исследования. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, не дают ложноотрицательных результатов, что позволяет заподозрить НБО. Эти тесты бывают универсальные (на группу НБО). Качественные реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации субстратов блокированной ферментной реакции или их производных, которые накапливаются при НБО. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, не дают ложноотрицательных результатов, что позволяет заподозрить НБО. Например: качественный тест Бенедикта при исследовании мочи позволяет заподозрить у больного несколько НБО (алкаптонурию, галактоземию, врожденную непереносимость фруктозы, лактазную недостаточность, диабет, синдром Фанкони). Алкаптонурия БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД Специфические тесты - на конкретную патологию (тест на гомогентизиновую кислоту – только на алкаптонурию). Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочой (гомоцистинурия, мукополисахаридозы и др.), так и с кровью (газы крови, глюкоза, ионы аммония, холестерин, молочная кислота и др.). Для этих целей используются высокоточные количественные методы: флуориметрические, хроматомассспектрометрия, спектрофотометрия, хроматография и электрофорез, аминокислотные анализаторы. ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА С ПОМОЩЬЮ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА МЕТОДИКИ БИОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА НБО o o Газовая хроматография (ГХ) – для определения концентрации лактата, пирувата, кетоновых тел, ионов аммония, кислотно-щелочного равновесия в крови и др. Тонкослойная (ТСХ) и колоночная хроматография для выявления дефектов обмена пуринов и пиримидинов, углеводов, аминокислот, олигосахаридов , как правило на ранних этапах скрининга. o Ионообменная жидкостная хроматография с использованием аминокислотного анализатора o Высоковольтный электрофорез с последующей нисходящей хроматографией аминокислот на бумаге Колоночная хроматография Газовая хроматография Ионообменная жидкостная хроматография МЕТОДИКИ БИОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА НБО o o o Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Хроматомасс-спектрометрия (ХМС) – для количественного и качественного анализа (определение вещества, его количества, с какой молекулярной массой присутствует в анализируемой пробе Тандемная масс-спектрометрия (ТМС) – позволяет количественный анализ одновременно более 3000 метаболических маркеров разных групп НБО и охарактеризовать классы веществ и их молекулярную массу Хроматомасс-спектрометрия Жидкостная хроматография Тандемная масс-спектрометрия БЛАНКИ С ОБРАЗЦАМИ КРОВИ НОВОРОЖДЕННОГО ВОПРОС 5. ДНК-ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Прямой анализ Непрямой анализ Требования Ген должен быть клонирован; мутации охарактеризованы. Точная клиническая диагностика; ген локализован; есть тесно сцепленные маркеры; доступна ДНК от членов семьи. Преимущества 100% точность; быстрота; не обязательна ДНК от всех членов семьи. Доступен для очень большого числа наследственных болезней. Недостатки Ген должен быть хорошо охарактеризован. Точность <100%. Методы Блот по Саузерну (делеции, дупликации, расширение повторов); ПЦР (точковые мутации, делеции, расширение повторов). Блот по Саузерну (ПДРФ); ПЦР (микросателлиты ПДРФ). МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) ГЕННЫЕ БОЛЕЗНИ Нарушенный вид обмена Пример НБО Аминокислот • альбинизм (АР); • фенилкетонурия (АР); Углеводов • галактоземия; • непереносимость фруткозы; Липидов • гиперхолиестеринемия (АД); • болезнь Нимана-Пика; Пуринов и пиримидинов • подагра Биосинтез кортикостироидов • адреногенитальный синдром; Металлов • семейный периодический паралич; • болезнь Вильсона-Коновалова Соединительной ткани • синдрмо Морфана (АД); • синдром Элерса-Данло (АД и АР); Транспортных систем • муковисцидоз Эритрона • анемия Фанкони • гемолитические анемии Транспорта систем почек • витами D резистентный рахит (Х-рецесс) Порфиринового и билирубинового обмена • синдром Жильбера; • порфирии. ВОПРОС 6. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД В 1956 г. шведские ученые Дж. Тио и А. Леван установили, что у человека в соматических клетках находится 46 хромосом. В течение последующих 3-х лет активные исследования хромосом у больных с определенными клиническими проявлениями учеными разных стран позволили установить хромосомную природу болезни Дауна (Lejeune), синдромов Шерешевского-Тернера (Ford), Клайнфельтера (Jacobs, Strong), трисомии Х (Jacobs). В 1960 г. Мурхедом с соавторстве был предложен метод культуры лимфоцитов периферической крови человека, что позволило проводить цитогенетические исследования при медикогенетическом консультировании больных с наследственной патологией. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД В 1960 г. для идентификации хромосом в кариотипе человека принята международная Денверовская классификация. o o o o o o o o Группа А (хромосомы 1-3) - большие метацентрические хромосомы. Группа В (хромосомы 4 и 5) - включает большие субметацентрические хромосомы. Группа С (хромосомы 6-12) - среднего размера субметацентрические хромосомы. Группа D (хромосомы 13-15) - большие акроцентрические хромосомы. Группа Е (хромосомы 16-18) - включает короткие субметацентрические хромосомы. Группа F - (хромосомы 19 и 20) - маленькие метацентрические хромосомы. Группа G - (хромосомы 21 и 22) - включает малые акроцентрические хромосомы. Половая Х-хромосома по длине и центромерному индексу (соотношению между длиной короткого и длинного плечей хромосомы) близка к хромосомам группы С, а Y-хромосома по величине и морфологии (при обычной окраске) близка к хромосомам группы G. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД В 1970 г. принята Парижская классификация, основанная на дифференциальной окраске хромосом, дающая чередование поперечных темных и светлых полос. o Короткое плечо обозначают p, длинное – q. Плечи разделены на районы, нумеруемые по порядку от центромеры к теломере. Внутри районов нумеруют полосы. o Если локализация гена известна, для обозначения гена используют индекс полосы. o Например, локализация гена, колирующего эстеразу, обозначается 13 p 14. 4 – это полоса первого района короткого плеча 13 хромосомы. МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ОКРАСКЕ o o Рутинная окраска красителем Гимзы Сплошная или рутинная окраска красителем Гимзы (для определения количества хромосом и выявления геномных мутаций – анеуплоидий). G – метод дифференциальной окраски (культура клеток предварительно обрабатывается раствором трипсина с последующим окрашиванием красителем Гимзы, что приводит к специфичной для каждой пары хромосом поперечной исчерченности). G – метод дифференциальной окраски МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ОКРАСКЕ o o o R – метод дифференциальной окраски R – метод – дифференциальной окраски с сегментацией хромосом противоположное окраске G-методом. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми - гетерохроматиновые. С – метод – дифференциальной окраски позволяет анализировать только участки хромосом с гетерохроматином, локализованным в околоцентромерных областях длинных плеч хромосом 1,9 и 16 и Y, а также в коротких плечах акроцентрических хромосом. Q – метод - дифференциальная окраска с использованием флуорохромов (акрихин, акрихиниприт, квинакрин и др.). При этом каждая пара гомологов имеет особое свечение. C – метод дифференциальной окраски Q – метод дифференциальной окраски ПОЛОВОЙ ХРОМАТИН Половой хроматин — участок ядра соматической клетки, находящейся в интерфазе, представляющий собой конденсированную половую хромосому; в результате конденсации Xхромосомы образуется X-хроматин, а конденсации Y-хромосомы — Y-хроматин. ВОПРОС 7. ДЕРМАТОГЛИФИЧЕСКИЙ МЕТОД Метод изучения кожных покровов и рельефа ладони, ориентировочный метод диагностики хромосомной патологии. На концевых фалангах пальцев определяется вид папиллярных образований : круг или завиток - W , петля – L (ульнарная – Lu или радиальная- Lr), дуга - A. Определяются трирадиусы – участки, где папиллярные линии не пересекаются, подсчитывается количество гребней от центра узора до трирадиуса на каждом пальце и определяется гребневой счётчисло гребешков. Определяется величина угла atd на обеих ладонях. ХРОМОСОМНЫЕ БОЛЕЗНИ. ВОПРОС 8. БЛИЗНЕЦОВЫЙ МЕТОД Близнецовость – результат многоплодной беременности. Популяционная частота двойней в среднем 1:100. Близнецы бывают: o монозиготные (Mz) o дизиготные (Dz) Mz – развиваются из одной зиготы-оплодотворенной яйцеклетки и последующего её дробления . Dz – образуются из нескольких зигот (двух и более оплодотворенных яйцеклеток). o Идентификация близнецов – определение их зиготности o Конкордантность близнецов – степень их сходства в % o Дискордантность близнецов – степень их различия в % КОНКОРДАНТНОСТЬ МОНОЗИГОТНЫХ И ДИЗИГОТНЫХ БЛИЗНЕЦОВ Признак Монозиготные близнецы Дизиготные близнецы Количество обследованных пар С, % Количество обследованных пар С, % Косолапость 35 22,9 135 2,3 Врожденный вывих бедра 29 41,4 109 2,8 Расщелины губы и нёба 125 29,6 236 4,7 Рак 196 17,4 546 10,8 Ишемическая болезнь сердца 21 19 47 8,5 Диабет 181 55,8 394 11,4 Атопии 12 50 23 4,4 Желчнокаменная болезнь 49 26,6 62 6,5 Псориаз 31 61 46 13 Туберкулез 381 51,6 843 22,2 Саркоидоз 4 50 11 8,5 Корь 1629 97,4 2016 94,3 Скарлатина 321 54,6 381 47,1 БЛИЗНЕЦОВЫЙ МЕТОД Метод позволяет определить роль генетических (наследственных) или средовых факторов приведших к развитию врожденной патологии у плода в эмбриональном периоде. Для определения коэффициента наследуемости (Н) используется формула Хольцингера: H = (CMz - CDz) / (100 – CDz) При Н > 0,5 основным фактором считается генетический, а при Н < 0,5 – средовой. Пример: по признаку врожденная расщелина верхней губы и нёба конкордантность монозиготных близнецов (СMz) составила 30%, а дизиготных (СDz) – 5%. Необходимо определить какой фактор (генетический или средовый) оказался доминирующим в развитии данной патологии. Подставляя данные конкордантности (С) монозиготных (Mz) и дизиготных (Dz) близнецов в уравнение Хольцингера определяем Н : 30 – 5 / 100 – 5 = 25 / 95 = 0,26 Следовательно Н < 0,5, а это означает, что основным фактором является в данном случае внешне средовой фактор. БЛИЗНЕЦОВЫЙ МЕТОД Низкая конкордантность Высокая конкордантность Монозиготные близнецы Сходство показателя конкордантности Достоверно различающиеся, но достаточно низкие показатели конкордантности Дизиготные близнецы ЗАКЛЮЧЕНИЕ Развитие современной медицины характеризуется неуклонно возрастающим применением генетических методов. С помощью современных методов генетики, производят широкие исследования генетических причин различного рода заболеваний. Приобретение знаний о методах изучения наследственности человека способствует формированию чётких ориентиров в восприятии новых медикобиологических открытий, что для врачебной профессии необходимо в полной мере, поскольку прогресс науки быстро и глубоко изменяет клиническую практику. Эффективное внедрение научных достижений медицинской генетики в практическое здравоохранение может осуществляться только на основе подготовки квалифицированных кадров. ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кафедра биологии с курсом медицинской генетики Благодарю за внимание! Краснодар, 2020
