ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Тихонович Ольга Геннадьевна Лаборатория нейрофизиологии ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ НАН Беларуси Введение В настоящее время для экспериментальных целей используют около 250 видов животных 1903 г. - начало научно обоснованного разведения лабораторных животных (Учение Иогансенна о «чистых линиях») Выведены: Более 250 линий мышей Более 60 линий крыс 10 линий морских свинок Правильный выбор тест-системы – основа успеха биологического эксперимента Группы экспериментальных животных: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Традиционные лабораторные животные Домашние или сельскохозяйственные животные Генетически контролируемые Контролируемые по микрофлоре Новые виды лабораторных животных Трансгенные животные МЫШЬ (Mus Musculus) – основной объект медико-биологических исследований Масса тела взрослых особей: 18 – 22 г (у большинства инбредных линий), до 40 г. ( у аутбредных животных) Половая зрелость: 30-35 дней Физиологическая зрелость: 8-10 недель Продолж. беременности: 19-21 день Возраст отсадки от матери: 3-4 недели Количество пометов в год: 4-9 пометов Количество детенышей в помете: 10-12 (у аутбредных), 3-4 (у инбредных животных) типы разведения Инбредное скрещивание Рандомбредное скрещивание Гибриды (F1: DBA x C57Bl) Аутбредное скрещивание Беспородные белые мыши Основные принципы работы с лабораторными животными Получение достоверных воспроизводимых результатов, стандартизация исследований Гуманное обращение с животными, соблюдение биоэтических норм Защита здоровья персонала Актуальность использования качественных животных Воспроизводимость результатов исследования Минимальное количество животных для получения достоверных результатов Сведение к минимуму воздействия патогенов на результаты исследования Снижение риска профессиональных заболеваний у персонала Получение качественных животных Специализированные питомники Генетический мониторинг Микробиологический мониторинг Соблюдение правил транспортировки Наличие необходимой документации Размещение, карантин и адаптация Внутренние факторы, влияющие на качество животных Генетическая характеристика линии/ популяции Генетический мониторинг Цель: определить/подтвердить генетическую однородность инбредных линий Методы: реципрокная изотрансплантация кожных лоскутов проверка генотипов окраски мандибулярный метод анализ специфических изоферментов выявление гетерозиготности по рецессивным летальным генам или генам, детерминирующим морфологические признаки ВНЕШНИЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЖИВОТНЫХ Физические Биологические Химические Социальные ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЖИВОТНЫХ РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ МЫШЕЙ И КРЫС Температура: 18-26 °С Влажность: 30-70 % Освещение: до 325 люкс на расстоянии 1 м от пола, 12-часовой фотопериод Шум: до 85 дБ ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЖИВОТНЫХ Воздух (10-15-кратная смена в течение часа) Корм Вода Подстил не должны содержать токсичных агентов СОЦИАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЖИВОТНЫХ Клетки должны обеспечивать нормальные социальные взаимоотношения и удовлетворять нормальным физиологическим и поведенческим потребностям животных Животные Масса тела, г Площадь пола Высота, см на одно животное, кв.см Мыши Крысы до 25 77 13 > 25 97 13 до 200 148 18 до 400 258 18 БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЖИВОТНЫХ Вирусы Бактерии, микоплазмы, грибы Эктопаразиты, эндопаразиты Стандарты категорий качества животных по состоянию здоровья Axenic – безмикробные животные, полученные методом кесарева сечения или трансплантации эмбрионов Gnotobiotic (животные с определенной флорой) – безмикробные животные, которым была привита смесь строго определенных микроорганизмов («коктейль Шедлера») Specific Pathogen Free (SPF) - животные, свободные от определенной патогенной микрофлоры. Pathogen – животные, у которых выявлен один из инфекционных агентов Caesarean derived - форма SPF-животных, которые были получены методом редеривации, чтобы избавить их от специфических патогенов Viral Antibody Free или Viral Adventitious Free (VAF) –животные, свободные от антител к патогенным или случайным вирусам, обязательным для мониторинга Conventional - конвенциональные животные с неизвестной флорой Minimal Diseases (MD) – клинически здоровые животные, однако, являются носителями некоторых условно патогенных микроорганизмов Цели качественного содержания животных Обеспечение жизнедеятельности лабораторных животных в соответствии с видовыми особенностями и принципами гуманного обращения с ними Сведение к минимуму воздействия факторов, способных повлиять на экспериментальные данные Обеспечение экологической и биологической безопасности ЗАКОНОДАТЕЛЬНЫЕ И НОРМАТИВНЫЕ ДОКУМЕНТЫ , РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ РАБОТУ С ЛАБОРАТОРНЫМИ ЖИВОТНЫМИ «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» (ПОСТАНОВЛЕНИЕ РБ № 131 от 31.10.2006г. ) «Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных» (U.S.A.,1996) гуманное обращение с животными и их рациональное использование Основные принципы и правила гуманного обращения с лабораторными животными Значимость для решения задач биомедицинских исследований Использование подходящих видов животных в соответствующих количествах Исключение или сведение до минимума дискомфорта, дистресса и боли Применение седативных средств, анальгетиков, анестетиков Определение конечных точек эксперимента Уход за животными Квалифицированный персонал Отклонения от основных принципов допустимы только в случае обоснованной необходимости БИОЭТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАБОТЫ С ЛАБОРАТОРНЫМИ ЖИВОТНЫМИ Европейские Конвенции и протоколы с поправками • European Convention for the Protection of Animals Kept for Farming • • • • • • Purposes, N 87 of 10 March 1976; The Protocol of Amendment to the European Convention for the Protection of Animals Kept for Farming Purposes, N 145 of 6 February 1992; European Convention for the Protection of Animals during International Transport, N 65 of 13 December 1968; European Convention for the Protection of Animals for Slaughter, N 102 of 10 May 1979; European Convention on the Protection of Pet Animals, N 125 of 13 November 1987. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimentation and other Scientific Purposes, N 123 of 18 March 1986; Protocol of Amendment to the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes, Strasbourg, 22 June 1998 http://worldanimal.net/council.html http://www.uku.fi/laitokset/vkek/Sopimus/convention.html БИОЭТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАБОТЫ С ЛАБОРАТОРНЫМИ ЖИВОТНЫМИ Закон о защите животных, принятый в США в 1966 году, и поправки к нему, принятые в 1970, 1976, 1985 и 1990 годах http://www.nal.usda.gov/awic/legislat/usdaleg1.htm ОРГАНИЗАЦИИ, РЕГЛАМЕНТИРУЮЩИЕ РАБОТУ С ЛАБОРАТОРНЫМИ ЖИВОТНЫМИ AAALAC –Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care ICLAS - International Council for Laboratory Animal Science FELASA - Federation of European Laboratory Animal Science Associations LASA - Laboratory Animal Science Association AALAS – American Association for Laboratory Animal Science AFSTAL - Association Française des Sciences et Techniques de Animal de Laboratoire AISAL - Associazione Italiana per Scienze degli Animali da Laboratorio Balt-LASA - Baltic Laboratory Animal Science Association BCLAS - Belgian Council for Laboratory Animal Science CLASA - Czech Laboratory Animal Science Association CCAC - Canadian Council on Animal Care NVP - Nederlandse Vereniging voor Proefdierkunde Scand-LAS - Scandinavian Society for Laboratory Animal Science SECAL - Sociedad Española para las Ciencias del Animal de Laboratorio SGV - Schweizerische Gesellschaft für Versuchstierkunde ИНСТИТУТСКАЯ КОМИССИЯ ПО КОНТРОЛЮ ЗА СОДЕРЖАНИЕМ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЖИВОТНЫХ В состав Комиссии должны входить не менее 5 членов, среди них в обязательном порядке как минимум один: врач ветеринарной медицины, имеющий опыт работы с лабораторными животными, который несет прямую ответственность за работу с животными научный сотрудник, имеющий большой опыт работы с лабораторными животными сотрудник, непосредственно не участвующий в научных исследованиях член Комиссии, представляющий интересы общественности в отношении должного содержания и использования животных, не являющийся сотрудником учреждения ИНСТИТУТСКАЯ КОМИССИЯ ПО КОНТРОЛЮ ЗА СОДЕРЖАНИЕМ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЖИВОТНЫХ Компетенция Комиссии контроль и оценка институтских программ работы с лабораторными животными в отношении их гуманного содержания и рационального использования рассмотрение, утверждение или не утверждение протоколов-заявок на работу с лабораторными животными инспекция работ с животными по утвержденным протоколам-заявкам инспекция помещений, в которых осуществляются работы с животными оценка подготовленности персонала, работающего с животными Комиссия вправе приостановить работу с животными в случае существенного отклонения от утвержденного протокола-заявки ПРОТОКОЛ-ЗАЯВКА НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ 1. Резюме 2. Обоснование исследования 2.1. Описание общего подхода к проблеме 2.2. Библиографический поиск 3. Цель, гипотеза 4. Материалы и методы 4.1. План эксперимента и основные методы исследования 4.2. Необходимые лабораторные животные и обоснование заказа 4.2.5. Улучшение, уменьшение, замещение 4.3. Технические методы 4.3.1. Длительное ограничение активности 4.3.2. Хирургические вмешательства 4.3.3. Манипуляции с животными 4.3.4. Адъюванты 4.3.5. Участь животного после эксперимента 4.3.6. Эвтаназия 4.3.7. Боль 4.3.7.1. Категория боли 4.3.7.1.1. Отсутствие боли 4.3.7.1.2. Облегчаемая боль 4.3.7.1.3. Не облегчаемые боль или страдание ПРОТОКОЛ-ЗАЯВКА НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ 5. Биологически опасные факторы, техника безопасности 6. Обязательства и гарантии Как руководитель исследования, описанного в данном протоколезаявке, я принимаю на себя соответствующие обязательства и даю следующие гарантии: 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. Использование животных Дублирование исследований Статистическая достоверность Биологически опасные факторы, техника безопасности Квалификация и подготовка сотрудников Ответственность Болезненные процедуры Руководитель исследования Подпись _________________ Дата ______ ПРОТОКОЛ-ЗАЯВКА НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА И ГАРАНТИИ 6.1. Использование животных Я обязуюсь, что животные, утвержденные для исследования в данном протоколе-заявке, будут использованы только в тех процедурах и таким образом, как здесь описано 6.2. Дублирование исследований Я провел поиск, чтобы убедиться , что этот протокол-заявка не содержит ненужного дублирования ранее выполненных экспериментов 6.3. Статистическая достоверность Я заверяю, что в исследовании будет задействовано минимальное число животных, необходимое для получения статистически достоверных результатов 6.4. Биологически опасные факторы, техника безопасности Я принял во внимание и привел этот документ в соответствии со всеми действующими правилами и требованиями, касающимися радиационной, химической и биологической безопасности ПРОТОКОЛ-ЗАЯВКА НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА И ГАРАНТИИ 6.5. Квалификация и подготовка сотрудников Я подтверждаю, что персонал, выполняющий процедуры с животными, в профессиональном отношении подготовлен и обучен должным образом 6.6. Ответственность Я признаю этические нормы и административные обязанности, связанные с выполнением этого протокола-заявки, и я гарантирую, что все лица, связанные с данным исследованием, будут гуманно обращаться с животными 6.7. Болезненные процедуры Я буду проводить эксперименты, которые потенциально могут вызывать боль и страдания у животных, и которые не планируется облегчать с помощью анестезии или анальгезии Я гарантирую, что отсутствуют альтернативные процедуры, которые позволили бы достичь целей запланированного эксперимента Манипуляции с животными 1. Формирование экспериментальных групп 2. Обращение с животными и фиксация 3. Идентификация животных 4. Клинический осмотр 5. Введение веществ 6. Методы забора крови Формирование экспериментальных групп 1. Вес тела 2. Пол 3. Возраст 4. Физическая активность 5. Стадия заболевания 6. Физиологические характеристики Фиксация животных Мыши Фиксация за хвост (держать ближе к его основанию) Не держать за хвост в течение длительного времени ! Фиксация на ровной поверхности Фиксация в руке Фиксация животных Крысы Фиксация за основание хвоста Крупных крыс фиксируют , обхватывая грудную клетку Для фиксации агрессивных крыс используют перчатки Помещение крысы на лабораторный халат Фиксация крысы в руке Фиксация за холку Фиксация животных Хомячки Морские свинки Кролики Идентификация животных Ушная метка Татуировка Ушные клипсы Электронные чипы Цветовые метки Ампутация пальцев Идентификация Карточка клетки Крыса CD 4♂ Исследователь: Иванов И.И. Исследование: 10-05WSD Протокол-заявка: 48/04 Группа: 2 – WSD 50мг/кг 21 22 23 24 25 1 Клинический осмотр •В клетке •В руках •На открытой площадке Поведение, активность, темперамент Движение, поза, мышечный тонус Внешний вид, состояние кожи и шерсти, выделения из естественных отверстий Физиологические параметры Введение веществ Внутрижелудочным зондом Введение веществ Внутримышечно (im) Musculus quadriceps femoris Nervus ischiadicus Введение веществ Подкожно (sc) Введение веществ Внутрибрюшинно (ip) Введение веществ Внутривенно (iv) Dorsal vein Spine Skin Lateral vein Ventral artery Объемы введения (мл/кг) Species Oral sc ip im iv bolus iv slow injection Mice 10 (50) 10 (40) 20(80) 0.05(0.1) 5 (25) Rat 10(40) 5(10) 10(20) 0.1(0.2) 5 (20) Guinea pig 10(30) 5(10) 5(20) 0.1(0.5) 1 (-) Rabbit 10(15) 1(2) 5(20) 0.25(0.5) 2 (10) () – maximal allowable volume Введение веществ 1) Внутрижелудочным зондом, per os 2) Внутримышечно – im 3) Подкожно – sc 4) Внутрибрюшинно - ip 5) Внутривенно – iv 6) Внутрикожно - id 7) Через прямую кишку – per rectum 8) В ЦНС (intrathecal, i.c.v) Забор крови Из орбитального синуса Sagital section of eyeball. Eyelid (1), eyelashes (2), lens (3), vitreous body (4), introduced capillary (5), bone (6), retroorbital venous sinus (7), ophthalmic nerve (8), retina (9). Забор крови Из хвостовой вены Прогревание хвоста (37С, 5-8 мин) Из латеральной вены хвоста: через иглу шприца ампутация кончика хвоста (5 мм) Объем крови ~ 0.1 мл для мышей, ~ 1.5 мл для крыс Возможны повторные процедуры Dorsal vein Spine Skin Ventral artery Забор крови Из поверхностной вены бедра Без анестезии Размер иглы 25-27G Объем крови ~ 0.1 ml Возможны повторные процедуры Забор крови Из ушной вены кролика, морской свинки Рекомендуется под анестезией (xylazine, acepromazine) Размер иглы 20G Объем крови до 40 мл Забор крови Из подъязычной вены Рекомендуется под анестезией Для веностаза рекомендуется собрать кожу на холке Размер иглы 23G Объем крови 0.2-1 мл Возможны повторные процедуры Забор крови в терминальном состоянии Из сердца Анестезия Объем крови (до 10 мл – крысы, 1 мл - мыши) Игла 25-30G Из брюшной аорты или полой вены Под анестезией или непосредственно после эвтаназии Большой объем крови Игла 25-18G Методы эвтаназии • Физические методы: •Цервикальная дислокация •Декапитация •Замораживание в жидком азоте (для новорожденных) •Обескровливание • Химические методы: •Неингаляционные агенты •Ингаляционные агенты • СО2 Методы эвтаназии: CO2 - камера Спасибо за внимание
