Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет технологий и управления имени К.Г. Разумовского (Первый казачий университет)» Биохимия спиртового брожения Выполнил: студент гр. АТПз-19 Бутин Павел Юрьевич Проверил: Димитровград 2021 Содержание: Введение Брожение Основные типы брожения История спиртового брожения Спиртовое брожение Этапы спиртового брожения Литература: Введение В 1850 г. Пастер установил, что виноградная кислота состоит из двух изомерных форм, имеющих одну и ту же химическую формулу, но кристаллизующихся в виде кристаллов, формы которых относятся друг к другу, как несимметричный предмет к своему зеркальному отображению. Эти формы отличаются друг от друга определенным физическим признаком, именно, - противоположным вращением плоскости поляризации. Явление это было объяснено Вант-Гоффом в 1874 г. с точки зрения пространственного расположения атомов. Пастер установил, что плесневый гриб Penicillium glaucum, развиваясь на растворах виноградной кислоты, в первую очередь потребляет одну из двух форм, именно правовращающую, встречающуюся в виде естественного продукта. От изомерии виноградной кислоты он перешел к изомерии амиловых спиртов, образующихся при спиртовом брожении. Это заставило его обратиться к изучению брожений и их природы. В 1855 г. Пастер обнаружил, что сырой амиловый спирт брожения состоит из двух химически тождественных амиловых спиртов: оптически неактивного и способного вращать плоскость поляризованного света. Уже в прежних своих кристаллографических исследованиях Пастер пришел к обобщению, что оптически активные вещества свойственны только органическому миру и их образование связано с процессом жизни. Отсюда Пастер сделал логическое заключение, что и оптически активный амиловый спирт возникает в процессе брожения при участии живого организма. Если это верно, то брожение есть процесс, связанный с жизнью, сам же фермент должен быть живым организмом. В результате длинного ряда блестящих исследований Пастером была создана теория брожения. Сам Пастер говорит: "Вовлеченный, даже, вернее сказать, вынужденный логическим развитием моих исследований, я перешел от кристаллографии и молекулярной возбудителей брожения". Поскольку фрукты химии к изучению сбраживаются в своем натуральном состоянии, брожение появилось раньше человеческой истории. Однако, люди с некоторых пор научились контролировать процесс брожения. Есть веские доказательства того, что люди сбраживали напитки в Вавилоне около 5000 г. до н.э. , в Древнем Египте около 3000 г. до н.э. , в доиспанской Мексике около 2000 г. до н.э. и в Судане около 1500 г. до н.э. Также существуют данные о дрожжевом хлебе в Древнем Египте около 1500 г. до н.э. и сбраживания молока в Вавилоне около 3000 г. до н.э. Китайцы, вероятно, первыми стали сбраживать овощи. Жизнь микробов возможна и без доступа кислорода воздуха. Энергия, необходимая для жизнедеятельности организма, в этих условиях образуется в результате процессов брожения. Наиболее распространены виды брожений, в процессе которых (преимущественно происходит Сахаров) под распад органических влиянием веществ микроорганизмов, представляющий совокупность окислительно-восстановительных реакций. Брожения никогда не приводят к полному окислению органических веществ. Многие характерные формы брожения протекают без участия кислорода воздуха - анаэробно. Поскольку свободный кислород, имеющийся на нашей планете, образовался в результате фотосинтеза, возникшего на более поздних этапах развития жизни на Земле, совершенно очевидно, что анаэробный способ извлечения энергии - брожение - более древний, чем процесс дыхания. Брожение известно людям с незапамятных времен. Тысячелетиями человек пользовался спиртовым брожением при изготовлении вина. Еще раньше было известно о молочнокислом брожении. Люди употребляли в пищу молочные продукты, готовили сыры. При этом они не подозревали, что эти процессы происходят с помощью микроорганизмов. Термин "брожение" был введен голландским алхимиком Ван Хельмонтом в XVII в. для процессов, идущих с выделением газов (fermentatio - кипение). Затем в XIX в. основоположник современной микробиологии Луи Пастер показал, что брожение является результатом жизнедеятельности микробов, и установил, что микроорганизмами. различные брожения вызываются разными Брожение Броже?ние (тж. сбра?живание, фермента?ция) — «это такой метаболический процесс, при котором регенерируется расщепления органического донорами, и субстрата могут служить акцепторами (происходящий АТФ, водорода». молекул питательных веществ, выражению Луи и — это анаэробный метаболический например Пастера, одновременно Брожение без участия кислорода) а продукты распад глюкозы. «брожение — это жизнь По без кислорода». Большинство типов брожения осуществляют микроорганизмы — облигатные или факультативные анаэробы. Брожение не высвобождает всю имеющуюся в молекуле энергию, поэтому промежуточные продукты брожения могут использоваться в ходе клеточного дыхания. Термин брожение также используется в более широком смысле, для обозначения бурного роста микроорганизмов в соответствующей среде. При использовании в этом смысле не делается различия между аэробным и анаэробным метаболизмом. Брожение часто используется для приготовления или сохранения пищи. Говоря о брожении, обычно имеют в виду брожение сахара (превращение его в спирт) с использованием дрожжей, но, к примеру, при производстве йогурта используются другие виды брожения. Использование брожения человеком обычно предполагает применение определенных видов и штаммов микроорганизмов. Вина иногда улучшают с использованием процесса взаимного брожения. Продукты брожения — это по сути отходы, получившиеся во время превращения пирувата с целью регенерации NAD+ в отсутствие кислорода. Стандартные примеры продуктов брожения — этанол (питьевой спирт), молочная кислота, водород и углекислый газ. Однако продукты брожения могут быть более экзотическими, такими как масляная кислота, ацетон, пропионовая кислота, 2,3-бутандиол и др. Основные типы брожения Спиртовое брожение (осуществляется дрожжами и некоторыми видами бактерий), в ходе него пируват расщепляется на этанол и двуокись углерода. Из одной молекулы глюкозы в результате получается две молекулы питьевого спирта (этанола) и две молекулы углекислого газа. Этот вид брожения очень важен в производстве хлеба, пивоварении, виноделии и винокурении. Если в закваске высока концентрация пектина, может также производиться небольшое количество метанола. Обычно используется только один из продуктов; в производстве хлеба алкоголь улетучивается при выпечке, а в производстве алкоголя двуокись углерода обычно уходит в атмосферу, хотя в последнее время её стараются утилизировать. Молочнокислое брожение, в ходе которого осуществляют пируват восстанавливается молочнокислые бактерии и до молочной другие кислоты, организмы. При сбраживании молока молочнокислые бактерии преобразуют лактозу в молочную кислоту, превращая молоко в кисломолочные продукты (йогурт, простокваша и др.); молочная кислота придаёт этим продуктам кисловатый вкус. Молочнокислое брожение происходит также в мышцах животных, когда потребность в энергии выше, чем обеспечиваемая дыханием, и кровь не успевает доставлять кислородОбжигающие ощущения в мышцах во время тяжелых физических упражнений соотносятся с получением молочной кислоты и сдвигом к анаэробному гликолизу, поскольку кислород преобразуется в двуокись углерода аэробным гликолизом быстрее, чем организм восполняет запас кислорода; а болезненность в мышцах после физических упражнений вызвана микротравмами мышечных волокон. Организм переходит к этому менее эффективному, но более скоростному методу производства АТФ в условиях недостатка кислорода. Затем печень избавляется от излишнего лактата, преобразуя его обратно в важное промежуточное звено гликолиза — пируват. Считается, что анаэробный гликолиз был первым живых организмов источником до энергии для общих того, предков всех как концентрация кислорода в атмосфере стала достаточновысокой и поэтому эта форма генерации энергии в клетках — более древняя. За очень редкими исключениями она существует и у всех ныне живущих клеток. Уксуснокислое брожение осуществляют многие бактерии. Уксус (уксусная кислота) При — прямой результат бактериальной ферментации. мариновании продуктов уксусная кислота предохраняет пищу от болезнетворных и вызывающих гниение бактерий. История спиртового брожения Сбраживание В течение столетий сахаров известно пивовары и с глубокой виноделы древности. использовали способность некоторых дрожжей вызывать спиртовое брожение, в результате которого сахара превращаются в спирт. Приготовление спиртных напитков, основанных на брожении спиртовом, было известно людям в глубокой древности. Однако суть процесса превращения сахаров в спирт выяснена только в сер. 19 в. Химическое уравнение брожения спиртового дано французскими химиками А.Лавуазье (1789) и Ж.Гей-Люссаком (1815). Разноречивые мнения о сущности брожения привели к длительному научному спору между Л. Пастером и Ю. Либихом. Согласно химической теории Ю. Либиха молекулярные колебания белковых веществ передаются сахару, расшатывают его молекулу, превращая ее в молекулы спирта и диоксида углерода. Убедительные опыты Пастера в 1857 с использованием микроскопических организмов — дрожжей отвергли несостоятельную теорию Либиха. Пастером была защищена биологическая теория, определяющая брожение как результат анаэробного обмена веществ дрожжей. Работами С. П. Костычева и В. И. Палладина доказано, что анаэробный распад молекулы сахара является начальным этапом кислородного дыхания. В 1871 рус. врачбиохимик М. М. Манассеина первая указала на возможность бесклеточного брожения спиртового, а в 1897 братьями Э. и Т. Бухнер была раскрыта ферментативная сущность реакций процесса благодаря использованию простого метода получения бесклеточного дрожжевого сока, разработанного русским биохимиком А.Н. Лебедевым. Процесс брожения спиртового исследовался многими выдающимися отечественными и зарубежными биохимиками и физиологами: Л. А. Ивановым, А. Гарденом, К. Нёйбергом, Г. Эмбденом, О. Мейергофом, Я. Парнасом и др. Первый значительный шаг в изучении химизма брожения спиртового был сделан Ивановым и Лебедевым, доказавшими участие фосфатов в брожении сахарных растворов. Большое значение имело открытие Иванова, доказавшего, что анаэробному распаду при брожении подвергается не свободная молекула гексозы, а предварительно образующийся ее фосфорный эфир. Последующее изучение механизма Б. с. показало, что первым этапом химических реакций является гликолиз, объединяющий реакции, протекающие в живых клетках до образования пировиноградной кислоты. Эти реакции осуществляются с тем же запасом энергии и тем же ферментативным путем как в анаэробных (спиртовое брожение), так и в аэробных условиях (дыхание). Спиртовое брожение Спиртовое брожение - это процесс окисления углеводов, в результате которого образуются энергия. этиловый Брожение спирт, углекислота производят и выделяется главным образом дрожжи, а также некоторые бактерии и грибы В различных странах для микроорганизмы. получения спирта используют различные Например, в Европе используют в основном дрожжи из рода Saccharomyces, в Южной Америке - бактерии Pseudomonas lindneri, в Азии - а также мукоровые грибы. Спиртовое брожение вызывают дрожжи, некоторые плесневые грибы и бактерии. Типичное брожение с высоким выходом спирта наблюдается в результате жизнедеятельности культурных дрожжей (сахаромицес). В промышленном производстве спирта используют различные материалы: пшеницу, рожь, ячмень, кукурузу, картофель, свеклу, древесные опилки, солому и т. Клетчатку соломы и древесных опилок предварительно подвергают кисличному гидролизу, а крахмал зерновых злаков - осахариванию солодом. Химизм спиртового брожении зависит от характера субстрата, концентрации в нем сахара, реакции среды (pH), вида и расы дрожжей, окружающей температуры, Наибольший выход спирта отмечают в результате аппаратного брожения. В бродильной промышленности используются дрожжи и низшего брожения. верхового Верховое брожение лучше развивается при температуре 18-30°; протекает бурно, с обильным выделением углекислого газа, пенообразованием и появлением пленки на поверхности субстрата. Дрожжи применяют в верхового брожения спиртовой промышленности и хлебопечении. Низовое брожение совершается спокойно; его используют в пивоварении; развивается оно при низкой температуре (4 - 10°) с постепенным просветлением субстрата. Дрожжи обычно оседают на дно сосуда Сбраживаться могут лишь углеводы, и притом весьма избирательно. Дрожжи сбраживают только некоторые 6-углеродные сахара (глюкозу, фруктозу, маннозу). Реакция спиртового брожения подобна гликолизу. Расхождение начинается только после образования пирувата. Конечный этап гликолиза заменяется двумя ферментативными реакциями. Сначала пируват подвергается декарбоксилированию, продуктом которого является ацетальдегид. Данная реакция происходит при участии пируватдекарбоксилазы, ТПФ и ионов магния. После ацетальдегид восстанавливается водородом, который отщепляется от кофермента НАДН. При этом ацетальдегид восстанавливается до этанола. Собственно, цель спиртового брожения — это окисления NADH, чтобы он мог снова принять участие в гликолизе. Катализатором является алкогольдегидрогеназа. Таким образом, продуктами спиртового брожения являются этанол и CO2, а не молочная кислота, как в молочнокислом брожении. В результате получается реакция: C6H12O6 - > 2C2H5OH + 2CO2 + 23,5?104 джглюкоза - > этиловый спирт + углекислота + энергия Процесс спиртового брожения - многоступенчатый, состоящий из цепи химических реакций. Превращения глюкозы до образования пировиноградной кислоты происходят так же, как и при дыхании. Эти реакции происходят без участия кислорода (анаэробно). Далее пути дыхания и брожения расходятся. При спиртовом брожении пировиноградная кислота превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Эти реакции протекают в две стадии. Сначала от пирувата отщепляется СО2 и образуется уксусный альдегид; затем уксусный альдегид присоединяет водород, восстанавливаясь в этиловый спирт. Все реакции катализируются ферментами. В восстановлении альдегида участвует кроме НАД·H2. главных продуктов, разнообразны, но Обычно образуются присутствуют при спиртовом брожении, побочные. Они довольно в небольшом количестве: амиловый, бутиловый и другие спирты, смесь которых называется сивушным маслом соединение, от котерого зависит специфический аромат вина. Образование побочных веществ связано с тем, что превращение глюкозы частично идет другими путями. Спиртовое брожение протекает обычно при pH 3-6. Если его проводить в щелочной среде, например в присутствии NaHCO3, также происходит накопление в сбраживаемом растворе глицерина. Оказалось, что в щелочных условиях ацетальдегид не может акцептировать электроны, поскольку в этих условиях он участвует в реакции дисмутации с образованием уксусной кислоты и этилового спирта. Акцептором электронов, как и в предыдущем случае, служит фосфодиоксиацетон. Процесс брожения в щелочной среде можно представить в виде следующего уравнения: 2C6H12O6 ® Глюкоза 2C3H8O 3+ глицерин CH3-COOH+ уксусная CH3-CH2OH+ кислота этиловый 2CO2. спирт биологический смысл спиртового брожения заключается в том, что образуется определенное количество энергии, которая запасается в форме АТФ, а затем расходуется на все жизненно необходимые процессы клетки. Процесс молочнокислого брожения имеет большое сходство со спиртовым брожением. Отличие заключается лишь в том, что при молочнокислом брожении пировиноградная кислота не декарбоксилируется, а, как и при гликолизе в животных тканях, восстанавливается при участии ЛДГ за счет водорода НАДН. Известны 2 группы молочно-кислых бактерий. Бактерии одной группы в процессе брожения углеводов образуют только молочную кислоту, а бактерии другой из каждой молекулы глюкозы «производят» по одной молекуле молочной кислоты, этанола и СО2. Существуют и другие виды брожения, конечными продуктами которых могут являться пропионовая, масляная и янтарная кислоты, а также другие соединения. Этапы брожения Последовательность протекающих на и взаимосвязь отдельных реакций, промежуточных этапах брожения, схематически представлена ниже (молекула глюкозы для простоты изображена в виде цепи). 1. Фосфорилирование D-глюкозы за счет АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата. Эта первая реакция гликолиза катализируется тексокиназой. В клетке количество свободной D-глюкозы сравнительно не велико; большая ее часть находится в фосфорилированной форме: АТФ + Dглюкоза - АДФ + D-глюкозо-б-фосфат. 2. Превращение D-глюкозо-б-фосфата во фруктозо-6-фосфат в результате реакции изомеризации, катализируемой фосфогексозоизомеразой: фосфат. 3. присоединенияеще D-глюкозо-б-фосфат Фосфорилирование одного # D-фруктозо-б- D-фурктозо-б-фосфата остатка фосфорной кислоты с путем образованием фруктозо-1,6-дифосфата. В этой второй „пусковой" реакции используется еще одна молекула АТФ при участии фермента фосфофруктокиназы. Доказано, что суммарная скорость гликолиза лимитируется именноэтой реакцией, катализируемой фосфофруктокиназой: АТФ + Dфруктозо-б-фосфат -> АДФ + О-фруктозо-1, 6-дифосфат. 4. Расщепление фруктозо-1, 6-дифосфата на 2 фосфотриозы: глицеральдегид3-фосфат и диоксиацетонфосфат. Реакция катализируется альдолазой: 0фруктозо-1, 6-дифосфат «^диоксиацетонфосфат + D-глицеральдегид-3- фосфат. 5. В последующие реакции гликолиза может непосредственно включаться только одна из двух образующихся фосфотриоз, а именно глицеральдегид-3фосфат. Однако и диоксиацетонфосфат благодаря присутствию в клетке специфического фермента триозофосфатизомеразы полностью преобразуется в глицеральдегид-3-фосфат. В результате этой реакции обеспечивается полное использование глюкозы в энергетическом клетки: диоксиацетонфосфат «± D-глицеральдегид-З-фосфат. обмене 6. Окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата. Реакция катализируется специфической дегидрогеназой (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназой) и триозофосфата называется реакцией гликолитического окисления-восстановления. Окисление глицеральдегид-3фосфата, катализируемого дегидрогеназой, является единственный окислительным этапом на всем протяжении гликолиза. Однако кислород в этой реакции не участвует. Требуется лишь присутствие окислителя НАД + , который при этом восстанавливается до НАД • Н (символом НАД обозначается окислительно-восстановительный кофермент никотинамидадениндинуклеотид, НАД+ — его окисленная форма, НАД-Н— восстановленная): D-глицеральдегид-З-фосфат + НАД+ + Фн -> 1,3-дифосфоглицерат +НАДН + Н +7. Перенос фосфатной группы от 1,3-дифосфоглицерата на АДФ. Под действием двух ферментов (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и фосфоглицераткиназы) энергия, высвобождающаяся при окислении альдегидной группы до карбоксильной, запасается в форме энергии фосфатных связей АТФ. 1,3-Дифосфоглицерат + АДФ # 3-фосфоглицерат + АТФ. Глицеральдегид-3-фосфат + Фн + АДФ + НАД+ <* 3-фосфоглицерат + + АТФ + НАД-Н + Н+. (к реакциям 1 и 3) 8. Превращение 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат катализируется фосфоглицеромутазой: 3- фосфоглицерат <± 2-фосфоглицерат. 9. Дегидратация 2-фосфоглицерата с образованием фосфоенолпирувата катализируется енолазой: 2- фосфоглицерат # фосфоенолпируват + N20. 10. Перенос фосфатной группы от фосфоенолпирувата катализируется на,АДФ с образованием пируваткиназой фосфотрансферазой): фосфоенолпируват + пирувата и АТФ (АТФ: пируватАДФ ^ пируват + АТФ. Образование пировиноградной кислоты — поворотный этап анаэробного расщепления сахара, являющийся общим для дыхания, гликолиза и брожения всех видов. Основное значение гликолиза состоит в перестройке структуры молекулы глюкозы в высокоактивный и лабильный в химическом отношении пируват, что облегчает биохимическое превращение исходного субстрата на последующих 11. Если этапах кислород окислительно-восстановительных отсутствует, то дальнейшие процессов. превращения пировиноградной кислоты происходят анаэробным путем, в процессе брожения (молочнокислого, спиртового и др.). При брожении последний этап гликолиза, катализируемого лактатдегидрогеназой, заменен двумя др. ферментативными реакциями, при участии соответственно пируват- декарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. В результате этих реакций образуется этиловый спирт — конечный продукт спиртового брожения. А. Пируват -+> Ацетальдегид + СO2 (необратимая реакция). Б. Ацетальдегид + НАД-Н + Н+ «± Этанол + НАД+. Суммарное уравнение спиртового брожения: С6Н1206 + 2Фн + 2АДФ -> 2С,Н5ОН + 2СO2 + + 2АТФ. При введении специфическихингибиторов формы брожения спиртового изменяются. Вторая форма брожения Нёйберга. Для получения глицерина в сбраживаемую среду вводят бисульфит натрия, который связывает ацетальдегид и предотвращает этим реакцию восстановления его до спирта. Водород восстановленного НАД- Н2 в этом случае используется на восстановление фосфоглицеринового альдегида до глицерина (реакции 4 и 5). Таким образом, при брожении сульфитированного виноградного сусла происходит накопление в виноматериалах глицерина и ацетальдегида в виде бисульфитного производного. Эту форму брожения называют глицеропировиноградным брожением. Третья форма брожения Нёйберга. При щелочной реакции среды ход брожения изменяется: половина молекул ацетальдегида окисляется до уксусной кислоты, другая — восстанавливается до этилового спирта. Происходит подкисление субстрата. В процессе брожения спиртового в отсутствие кислорода воздуха высвобо ждается лишь незначительная часть энергии (117кДж), потенциально заложенной в одном моле глюкозы (2817кДж), тогда как при дыхании — полном окислении глюкозы до СO2 и Н20 — значительно больше (1504кДж). Доступ кислорода, обеспечивающий более эффективное в энергетическом отношении аэробное дыхание, предохраняет клетки от излишних трат веществ, происходящих в процессе анаэробиоза. Подобное действие кислорода, выражающееся в угнетении брожения дыханием в значительном снижении потребления глюкозы, названо Пастера эффектом. Явление торможения дыхания дрожжей и активация брожения при аэрации получило названиеКрэбтри эффекта. При брожении спиртовом кроме основных продуктов распада угле водов — этилового спирта и углекислого газа — образуются вторичные про дукты (глицерин, янтарная кислота, ацетальдегид, уксусная, пировиноградная, молочная и лимонная кислоты, 2,3-бутиленгликолъ, ацетоин, диацетил, эфиры, высшие спирты). Исходным продуктом образования большинства вторичных продуктов является ацетальдегид, который в дозе 400мг/дм3 угнетает брожение, а при более высоких его дозах дрожжи теряют жизнеспособность. Поэтому для физиологической необходимостью превращать дрожжей ацетальдегид является в более безвредные продукты — в этиловый спирт и вторичные продукты, играющие важную роль в обмене веществ дрожжевой клетки и обогащающие вина полезными компонентами, обусловливающими их букет и вкус. При брожении дрожжи выделяют в среду сульфгидрильные SH-соединения (глютатион, цистеин), снижающие редокспотенциал Eh, являющийся важным показателем технологического процесса, т.к. развитие вина, начиная с выдержки и кончая созреванием и старением, связано в основном с течением окислительно-восстановительных реакций. Количество таких соединений обусловлено особенностями расы дрожжей и условиями брожения. Многочисленные исследования окислительно-восстановительных процессов и редокссистем сусла и вина проведены А. К. Родопуло. На брожение спиртовое, кроме виноделия, основано пивоварение, производство этилового спирта, глицерина, приготовление теста в хлебопечении. Литература: Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 2015, с.263 XuMuK.ru - БРОЖЕНИЕ - Химическая энциклопедия Шапошников В. Н., Техническая микробиология, М., 2014; Прескот С., Дан С., Техническая микробиология, пер. с англ., М., 2018; Пастер Л., Избр. труды, пер. с франц., т. 1—2, М., 2016; Кретович В. Л., Основы биохимии растений, 4 изд., М., 2015; Фробишер М., Основы микробиологии, пер. с англ., М., 2013; Фердман Д. Л., биохимия, М., 2011; Работнова И. Л., Общая микробиология, М., 2014. Брожение (хим. процесс) //
