Фармакопейные оптические методы анализа лекарственных средств (рефрактометрия, поляриметрия, фотоколориметрия) Оптическая спектроскопия объединяет методы фармацевтического анализа, основанные на взаимодействии света и среды (например, раствора ФС). В результате взаимодействий возможны: - Преломление луча света (рефрактометрия). - Поворот плоскости поляризованного света (поляриметрия). - Поглощение (absorption) света (электронная спектроскопия в видимой части спектра - это фотоколориметрия). Оптическая схема рефрактометрии Оптическая схема поляриметрии Оптическая схема фотоколориметрии I = I oe − a ( ) cl Электромагнитное излучение λ=с/ν Е=hν Interaction Область Волновое число 10 (см-1) Radiation 8 107 X-Ray Inner Nuclear ElecExcitatron tion Excitation 106 105 104 V I S UV Valence Electron Excitation NIR 103 MIR 102 101 FIR Infra Red Molecule Vibration 10-1 1 ESR 10-2 10-3 NMR Mikro Wave Radio Wave Molecule Rotation Spin Orientation in Magnetic Fields Длина волны (м) 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 101 Призма Ньютона (1666 г) – расщепление солнечного света на его составляющие Каждый охотник желает знать, где сидит фазан 1.Рефрактометрия В фармацевтическом анализе рефрактометрия используется для определения подлинности и количественного анализа. ИДЕНТИФИКАЦИЯ (подлинность) КОНЦЕНТРАЦИЯ (количественный анализ) • Закон преломления света, который лежит в основе рефрактометрии, был открыт в 1620 г. голландским астрономом и математиком Снеллом (Снелл ван Ройен Виллеброрд,1580-1626): при прохождении луча света через границу различных сред направление распространения изменяется sin n2 = sin X n1 где φ – угол падения, Х - угол преломления, n1 и n2 – показатели преломления сред • Закон преломления света, который лежит в основе рефрактометрии, был открыт в 1620 г. голландским астрономом и математиком Снеллом (Снелл ван Ройен Виллеброрд,1580-1626): при прохождении луча света через границу различных сред направление распространения изменяется sin n2 = sin X n1 где φ – угол падения, Х - угол преломления, n1 и n2 – показатели преломления сред Показатель преломления n - отношение скорости света в вакууме (Vо) к скорости света в данной среде (V ): n(λ) = Vо/V - отношение скоростей света в граничащих средах. - для жидкостей и твердых тел n обычно определяют относительно воздуха, а для газов - относительно вакуума. Показатель преломления (рефракции) n - это отношение синуса угла падения луча (sinα) к синусу угла его преломления (sinβ): sin α n = -------sin β Показатель преломления в вакууме равен единице. Eur.Ph. 2.2.6. REFRACTIVE INDEX The refractive index of a medium with reference to air is equal to the ratio of the sine of the angle of incidence of a beam of light in air to the sine of the angle of refraction of the refracted beam in the given medium. Unless otherwise prescribed, the refractive index is measured at 20 ± 0.5 °C, with reference to the wavelength of the D-line of sodium (λ= 589.3 nm); the symbol is then . Refractometers normally determine the critical angle. In such apparatus the essential part is a prism of known refractive index in contact with the liquid to be examined. Calibrate the apparatus using certified reference materials. When white light is used, the refractometer is provided with a compensating system. The apparatus gives readings accurate to at least the third decimal place and is provided with a means of operation at the temperature prescribed. The thermometer is graduated at intervals of 0.5 °C or less. n20D – что это значит? показатель преломления при 20°С для D-линии спектра натрия (λ = 589 нм) Показатель преломления зависит от: • • • • • температуры Т0, длины волны света λ, концентрации раствора, природы растворителя. Для газов необходимо учитывать зависимость n от давления (указывать его или приводить данные к нормальному давлению). Температурная зависимость nТ = n²º + (20- Т0) x 0.0002, где nТ – показатель преломления при измеряемой температуре, n²º показатель преломления при 200С, Т0 - температура, при которой проводилось измерение. Для воды и водных растворов при температурах 20±5°С поправку вносить не нужно ! Рефрактометры Аббе • Создан в 1869 году немецким физиком-оптиком Эрнстом Аббе • Наиболее часто используемый тип рефрактометров в фармацевтическом анализе • Основные рабочие части: 1- исследуемая жидкость; 2- осветительная призма; 3 – измерительная призма; 4 – падающий луч; 5 – 4 поле зрения Внешний вид рефрактометров Определение концентрации вещества в растворе n - no С = -------F , где С - концентрация раствора, %; n - показатель преломления анализируемого раствора; no - показатель преломления растворителя при той же температуре; F - , рефрактометрический фактор, равный величине прироста показателя преломления при увеличении концентрации на 1%. Значения F - в справочной литературе. Можно определить самостоятельно экспериментальным путем. Для часто выполняемых определений существуют таблицы и диаграммы. Области применения: Медицина - клинические лабораторные исследования: Для определение белка в моче, сыворотке крови, плотность мочи, анализ мозговой и суставной жидкости, плотности субретинальной и других жидкостей глаза. • • • • • • • Фармация: Для исследования водных растворов различных лекарственных препаратов: кальция хлорида (10%, 20%); новокаина (1%, 2%, 10%, 20%, 40%); Эфедрина гидрохлорида (5% ); глюкозы (5%, 25%, 40%); магния сульфата (25%); натрия хлорида (10%); кордиамина и др. • !!!!! http://www.authorstream.com/Presentation/goutamiperala1520737-refractometry-ppt/ 2.Поляриметрия Около 400 фармацевтических субстанций - это хиральные соединения • «Энантиомерная чистота подтверждается измерением оптического вращения • ФС для рацемических ЛС включают метод измерения оптического вращения – поляриметрию • Но при низком удельном оптическом вращении одного из энантиомеров используют метод кругового дихроизма (circular dichroism) • Талидомид – рацемат. Один энантиомер эффективен против тошноты, а другой тератогенен. Оба энантиомера легко преобразуются друг в друга в организме • Этамбутол: один энантиомер используется при лечении туберкулёза, другой вызывает слепоту • Напроксен: один энантиомер используется для лечения артрита, но другой оказывает гепатотоксическоe действие без анальгетического эффекта • Расположение рецепторов стероидов также показывает специфичность стереоизомеров • Только L-анаприлин является мощным бетаблокатором, а D-анаприлин – нет. • Активность пенициллина стереозависима. Антибиотик должен подражать D-аланиновым цепям, которые присутствуют в клеточных стенках бактерий, чтобы реагировать с энзимом транспептидазой. • L-меторфан (левометорфан) – мощный опиоидный анальгетик, а D-изомер, декстрометорфан – средство для облегчения кашля. • S-карведилол, средство, реагирующее с адренорецепторами, в 100 раз сильнее блокирует βрецепторы, чем R(+) изомер. Но оба изомера примерно одинаково блокируют α-рецепторы. • D-изомеры первитина и амфетамина – сильные стимуляторы ЦНС, а L-изомеры обоих средств стимулируют периферическую нервную систему. Оптическая изомерия Оптическими пространственные изомерами изомеры, называются молекулы которых относятся между собой как предмет и несовместимое с ним зеркальное изображение Оптическая изомерия Атом углерода с четырьмя разными заместителями называется хиральным атомом (или ассиметричным) (от греческого heiros «ладонь») Чем больше хиральных атомов в молекуле, тем больше у вещества может быть оптических изомеров Число оптических изомеров=2n n-число ассиметричных атомов С Оптическая изомерия Оптические изомеры имеют одинаковый цвет, температуру кипения, плотность. Оптические изомеры обладают свойством оптической активности НО (!) – по-разному вращают плоскость поляризации пропущенного через них поляризованного света. Один изомер будет вращать ее влево, другой — вправо Поляризованный свет Неполяризованный свет распространяется во всех направлениях, перпендикулярных к направлению его движения. Поляризованный свет - световые волны, электромагнитные колебания которых распространяются только в одном направлении. Величина угла вращения зависит от: 1. природы оптически активного вещества 2. длины пути, т. е. толщины слоя оптически активного вещества или его раствора (в дм) Закон Био: угол вращения изменяется пропорционально длине слоя оптически активного вещества 3. длины волны света 4. для растворов - от природы растворителя 5. концентрации оптически активного вещества Влияние температуры в большинстве случаев незначительно ! Используемые определения: 1. Угол оптического вращения жидкости - это угол вращения (в поляризованного света градусах) плоскости при длине волны D- линии натрия (λ=589,3 нм), измеренный при 20 0С в исследуемом жидком веществе, при толщине слоя жидкости 1 дм, разделенный на плотность, выраженную в г/см3. 2. Удельное оптическое вращение раствора вещества - это угол вращения (в градусах) плоскости поляризованного света натрия (λ=589,3 нм), при длине волны D-линии измеренный при 20 0С в исследуемом жидком веществе, при толщине слоя раствора 1 дм с концентрацией вещества 1 г/мл. Удельное вращение вещества всегда определяют относительно данного определенной концентрации. растворителя при Особые случаи: • Если указано в монографии, то угол вращения может быть измерен при температуре, отличающейся от 200С, и при других длинах волн (зеленая линия спектра ртути - 546,1 нм или некоторые длины волны в ультрафиолетовой области) • Поляриметр должен позволять проводить измерения с точностью до 0,010. При поверке поляриметра шкала проверяется с использованием сертифицированных кварцевых пластин. • Линейность шкалы может быть проверена с помощью раствора сахарозы. • Угол вращения рацемической смеси равен - …… Методика измерения: 1)Определить нулевую точку поляриметра. Определение закрытой нуля производят поляриметрической только трубке; при для жидкостей ноль определяют с пустой трубкой (воздух), а для твердых веществ – при заполнении используемым растворителем. Методика измерения: 2) Определить угол вращения поляризованного света при длине волны Dлинии натрия (λ=589,3 нм) при 20 ± 0.5 °C, если нет других указаний. Изменение температуры возможно только в случае специальных указаний в ФС Расчетные формулы Расчет удельного оптического вращения проводят по следующим формулам: 1. Для жидкостей: 2. Для раствора вещества: где C – концентрация раствора в г/л. Расчетные формулы Расчет содержания С в г/л или содержания С’ в % (m/m) проводят по следующим формулам: 3. где: α - угол вращения при 20 ± 0.5°C, градусы ι - длина поляриметрической трубки, дм ρ 20 - плотность при 20°C, г/см3 ГФ 12, Ph Eur 7.0 Измерение величины угла вращения проводят либо для оценки чистоты оптически активного вещества, либо для определения его концентрации в растворе. Явление мутаротации (от латинского muto-изменяю и rotatio вращение) - изменение величины оптического вращения растворов оптически активных соединений вследствие их эпимеризации, в химии углеводов под мутаротацией обычно подразумевается эпимеризация полуацетального атома углерода. В случае глюкозы мутаротация объясняется установлением равновесия: в равновесном состоянии присутствует 38 % aльфаформы и 62 % бета-формы. Промежуточная альдегидная форма содержится в ничтожно малой концентрации. Преимущественное образование β-формы объясняется тем, что она более термодинамически стабильна -гидроксил при С-1 занимает экваториальное положение Явление мутаротации характерно для моносахаридов, восстанавливающих олигосахаридов, лактонов и др. Процесс установления равновесия может катализироваться кислотами и основаниями. Например, в частной фармакопейной статье (EPh) - для завершения мутаротации галактозы добавляют аммиак. 3. Спектрофотометрия. Фотоколориметрия I = I oe − a ( ) cl • Абсорбционная спектрофотомерия – метод основанный на измерении количества поглощенного веществом электромагнитного излучения в определенной узковолновой области. • УФ-СФМ – используют монохроматическое излучение в области от 190-380нм. • В видимой области – немонохроматическое излучение в области 380-780нм. ФОТОКОЛОРИМЕТРИЯ Определение Спектрофотометрия — физико-химический метод исследования растворов и твердых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в • ультрафиолетовой (200—400 нм), • видимой (400—800 нм); • инфракрасной (>800 нм) областях спектра Распределение энергии по уровням в молекуле • Самый низший энергетический уровень, т.е. уровень с наименьшей энергией, называется основным. Все прочие уровни относятся к возбужденным. Энергетический переход частицы (т.е. увеличение её энергии) с основного уровня на первый возбужденный называется основным переходом, все остальные переходысоставными, комбинированными. • Интенсивность полосы поглощения зависит от вероятности перехода из одного электронного состояния в другое и от концентрации светопоглощающих частиц. Диаграмма молекулярных орбиталей (связывающих и разрыхляющих*) и энергии переходов электронов Е Закон Бугера-Ламберта-Бера – основной закон спектрофотометрии I = I oe − a ( ) cl I T= Io Io A = log( ) = cb I T – пропускание светового потока, Io - интенсивность падающего света, I - интенсивность проходящего света, A – оптическая плотность (absorpion) с - концентрация растворенного вещества (моль/л), ε - молярный коэффициент погашения/поглощения, ранее - коэффициент экстинкции (л см-1 моль-1) l - длина пути светового потока (толщина кюветы, см). Удельный коэффициент поглощения 1% это оптическая плотность раствора с 1см концентрацией 1% (масса/объем) и толщине поглощающего слоя 1 см 1% 1см E A = E M =E c - связь между молярным и удельным коэффициентами погашения. М- молярная масса растворенного вещества, с- молярная концентрация раствора Схема фотоколориметра Применение спектрофотометрии в фармакопейном анализе 1) Оценка подлинности 2) Оценка чистоты 3) Количественный анализ 4) Определение цветности раствора Спектры растворов фармацевтических субстанций NB! Поглощение в УФ-области NB! Поглощение в УФ- и видимой области Количественное определение В лекарственных средствах: • стероидных гормонах 238-242нм - преднизолон в таблетках и мазях, преднизолон ацетат в мази, метилтестостерон в табл., • производных бензодиазепина – фенозепам 331и 320нм., • фенолов – резорцин 1-2% в спиртовом растворе. Основным условием для анализа является соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера в пределах соответствующих концентраций. Существует 3 метода: 1.Содержание вещества высчитывают в % на основании предварительно рассчитанной величины поглощения Е1%,1см (Содержание Кортизона ацетата в таблетках) 2.Сравнение с поглощением стандартного образца, определяемого в тех же условиях. ГСО и РСО– вещества, с которыми проводят сравнения испытуемых ЛВ при их анализе с использованием физ-хим методов. 3. Построением градуировочного графика. Отклонение от закона Бугера-Ламберта-Бера (уравнение прямой!). Почему работаем в области А = 0,2 – 0,8? Концентрация аналита: - при высоких концентрациях (>0,01моль • л-1) электростатические взаимодействия между частицами снижают оптическую плотность; - изменение показателя преломления при высокой концентрации аналита – поглощение света ассоциатами. Может происходить как снижение, так и увеличение А. Производная спектрофотометрия Вместо зависимости абсорбции от длины волны A=F(λ) может применяться зависимость первой (или производной более высокого порядка) от длины волны: dA/dλ = F (λ). Это позволяет выявить спектральные детали, которые в обычном режиме могут быть не замечены. d A d = cl n n d d n n где п порядок производной
