Загрузил Заинаб Касимова

Спецпрактикум, Флуоресценция

реклама
Министерство науки и высшего образования РФ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования
«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Химический институт им. А.М. Бутлерова
КАФЕДРА ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
КАСИМОВА ЗАЙНАБ РИНАДОВНА
ОТЧЕТ ПО ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЕ
МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Студент 4 курса
Группа 07-608
Касимова З.Р.
Казань–2019
1
Цель работы: ознакомление с методом флуоресценции, устройством
импульсного спектрофотометра Fluorolog 3 (FL 3-221- NIR), приобретение
умения регистрировать и анализировать электронные спектры испускания и
возбуждения органического соединения (эозина В) в растворах.
Флуоресценцией называют излучательный переход возбужденного
состояния с самого нижнего синглетного колебательного уровня S1 в основное
состояние S0. в общем случае флуоресценцией называют разрешенный по
спину излучательный переход между двумя состояниями одинаковой
мультиплетности: между синглетными уровнями S1 → S0 или триплетным Т1
→ Т0. Типичное время такого возбужденного состояния составляет 10 -8 ̶ 10-6
с.
Согласно представлениям квантовой химии, электроны в атомах
расположены на энергетических уровнях. Каждому электронному уровню (S0,
S1, S2) сопутствует несколько колебательных подуровней (υ0, υ1, υ2). При
поглощении света (hνA – процесс, происходит за время порядка 10–15с)
электрон переходит с одного из колебательных уровней основного
электронного состояния S0 на некоторый высший колебательный уровень
состояний S1 или S2 (принцип Франка-Кондона) с сохранением спина. После
этого большинство молекул претерпевают быструю релаксацию, т.е. электрон
спускается на самый нижний колебательный уровень состояния S1. Эта
внутренняя конверсия происходит за время порядка 10–12 с и заканчивается до
процесса «возвращения» возбужденного электрона в основное состояние.
Следовательно, испускание чаще всего осуществляется из равновесного
возбуждённого состояния (S0); это и есть процесс флуоресценции.
К важнейшим характеристикам флуоресценции относятся:
Стоксов сдвиг. Сдвиг полосы испускания относительно полосы
поглощения в сторону больших длин волн (спектр испускания – зависимость
интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны
возбуждающего света; cпектр возбуждения – зависимость интенсивности
испускания при определённой длине волны от длины волны возбуждающего
2
света). Одной из основных причин Стоксова сдвига является быстрая
релаксация на нижний колебательный уровень первого возбужденного
электронного состояния S1 (т.е. потеря энергии). Cдвиг может быть смещен
под влиянием растворителя и реакций в возбуждённых состояниях.
Испускание без сдвига наблюдается в газах, когда их концентрации малы
настолько, что возбуждённые молекулы не претерпевают столкновений с
другими до процесса испускания.
Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения.
Спектр испускания обычно не зависит от длины волны возбуждения,
поскольку при возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни
избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний
колебательный уровень состояния S1. Иногда испускание может происходить
как из S1, так и из S2 состояния (например, в азулене).
Правило зеркальной симметрии. Обычно спектр флуоресценции
представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее
поглощения, соответствующего переходу из S0 в S1. Cимметричная природа
спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены
одними и теми же переходами, а также сходством колебательных
энергетических уровней состояний S0 и S1. Из этого правила есть много
исключений.
Они
бывают
обусловлены
различным
геометрическим
положением ядер в основном и возбуждённом состояниях (например, у
дифенила). Другой причиной являются возможные реакции в возбуждённых
состояниях. Молекулы пирена при возбуждении переходят в эксимеры
(возбуждённые димеры), испускание которых смещено в длинноволновую
область по сравнению с мономером.
Время затухания флуоресценции – средний промежуток времени, в
течение которого молекула остаётся в возбуждённом состоянии, прежде чем
вернуться в основное.
Квантовый выход флуоресценции − отношение числа испущенных
фотонов к поглощённым.
3
Вещества, проявляющие флуоресценцию, называются флуорофорами –
это, как правило, органические вещества, содержащие систему сопряженных
π-связей. Наиболее известными являются хини, РОРОР, флуоресцин,
акридиновые красители (акридиновый желтый, акридиновый желтый),
родамины (родамин 6G, родамин В), белки (флуоресценция белков
обусловлена содержанием в них остатков флуоресцирующих аминокислот),
кофакторы, лантаноиды и др.
O
O
OH
(C2H5)2N
O
N(C2H5)2
COOH
COOH
антрацен
родамин В
флуоресцеин
N
N
O
O
POPOP
N
O
PPO
2,5-дифенилоксазол
n-бис[2-(5-фенилоксазолил)]бензол
Рис.1 Примеры флюорофоров
4
Схема прибора:
450 Вт ксеноновая лампа
(без озона) и150 Вт
ксеноновая
пульсирующая лампа
Двойной монохроматор
возбуждения
возбуждения
Одинарный
монохроматор
испускания
детектор УФ
и видимого
диапазона
Двойной монохроматор
испускания
Кюветное
отделение
Рис.2 Блок-схема спектрофлуориметра Fluorolog 3 (FL 3-221- NIR)
Ход работы:
Приготовление серии калибровочных растворов:
1. Исходный раствор 1мМ родамина разбавляли дистиллированной водой до
получения растворов с концентрациями 0,0025 мМ, 0,0045 мМ, 0,0065 мМ, 0,0085
мМ, 0,015 мМ объемом 2,5 мл.
1.Включили лампу, блок управления прибором и компьютер.
2. Прогрели лампу в течение 20-30 минут для ее стабильной работы.
3. На компьютере в программе FluorEssence выбрали тип эксперимента Excitation.
4. Откалибровали монохроматор возбуждения по спектру лампы. Для этого:
а)
нажали
на
кнопку
Load…,
выбрали
в
папке
c/program
files/JobinYvon/Data/ExperimentTemplates файл ISOLampCal.xml.
б) нажали внизу панели на кнопку Run.
5
в) с помощью курсора проверили положение реперного пика (467 нм).
5. Откалибровали монохроматор испускания. Для этого:
а) поставили в кюветное отделение кювету с дистиллированной водой.
б)
нажали
на
кнопку
Load…,
выбрали
в
папке
c/program
files/JobinYvon/Data/ExperimentTemplates файл WaterRaman.xml.
в) нажали внизу панели на кнопку Run.
г) с помощь курсора проверили положение реперного пика (397 нм).
Запись спектров возбуждения:
1. Нажали на кнопку M на верхней панели, выбрали тип эксперимента Excitation.
2. Выбрали пункт Monos, поставили галочки в пунктах Excitation1 и Emission1.
Ввели нужные значения длины волны испускания (Emission) и диапазон
сканирования длин волн возбуждения (Excitation).
3. Введите ширину щели 3 нм (Slits) для обоих монохроматоров (во избежание
засвечивания детекторов).
4. В пункте Detectors выбрали время интегрирования 0.05 с (Integration Time).
5. Выбрали детекторы R и S, поставив в табличке Enable галочку напротив этих
детекторов.
6. С помощью нижних табличек Signal Algebra и Operations ввели формулу S/R и
добавили её (Add) в табличку Formulas.
7. Нажали внизу панели на кнопку Run.
Запись спектров испускания:
1. Нажали на кнопку M на верхней панели, выберите тип эксперимента Emission.
2. Выполнили пункты 2 – 4 для записи спектров возбуждения.
3. Выбрали детектор S, поставив в табличке Enable галочку напротив этого детектора;
для записи скорректированного спектра поставили галочку в графе Correction.
4. В нижней табличке Signal Algebra выбрали Sc (скорректированный сигнал) и
добавили его (Add) в табличку Formulas.
5. Нажали внизу панели на кнопку Run.
Вычитание фонового сигнала:
1. Поставили в кюветное отделение кювету с растворителем (этанол).
2. Выполнили пункты 1 – 5 для записи спектров испускания. При этом в табличке
Enable галочку в графе Correction не ставили.
3. В нижней табличке Signal Algebra выбрали S (нескорректированный сигнал) и
добавили его (Add) в табличку Formulas.
6
4. Нажали внизу панели на кнопку Run.
5. Создали файл бланка, нажав на кнопку Make Overlay File.
6. Заменили кювету с растворителем на кювету с исследуемым раствором.
7. Выполнили пункты 1–5 для записи спектров испускания. При этом в табличке
Enable поставили галочки в графах Correction и Blank. Затем, нажав Subtract,
выбрали созданный ранее ***.spc файл.
8. Нажали внизу панели на кнопку Run.
Определение зависимости флюоресценции от концентрации растворов
эозина В
Приготовили растворы родамина в воде с концентрациями 0,0025 мМ, 0,0045 мМ,
0,0065 мМ, 0,0085 мМ, 0,015 мМ, объемами 2,5 мл путем последовательного
разбавления. Поочередно помещаем приготовленные растворы в кюветы, начиная с
наименьшей концентрации. Регистрируем спектры поглощения каждого раствора.
Полученные результаты:
0,0025 мМ
1000000
Интенсивность, мкА
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
530
540
550
560
570
Длина волны, нм
Рис.3 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0025 мМ
7
Интенсивность, мкА
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
50000
0
490
515,5
541
566,5
592
Длина волны, нм
Рис.4 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0045 мМ
Интенсивность, мкА
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
490
515,5
541
566,5
Длина волны, нм
Рис.5 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0065 мМ
8
592
Интенсивность, мкА
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
490
515,5
541
566,5
592
Длина волны, нм
Рис.6 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,0085 мМ
Интенсивность, мкА
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
490
515,5
541
566,5
Длина волны, нм
Рис.7 Спектр испускания раствора родамина концентрации 0,015 мМ
9
592
Интенсивность,
мкА
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
490
515,5
541
566,5
592
Длина волны, нм
Рис.8 Спектр испускания раствора родамина с неизвестной концентрацией
концентрация
образца, мМ
длина волны при
интенсивность при
максимальной эмиссии, максимальной
нм
эмиссии,мкА
0,0025
549,8
867216,2
0,0045
552,1
1397030
0,0065
551,5
2419950
0,0085
552,3
2847110
0,015
552,8
5411760
Х
550,8
1963300
10
Градуировочный график
6000000
y = 4E+08x - 122780
Интенсивность
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
0,000
0,005
0,010
0,015
Концентрация расворов, ммоль/л
Методом линейной аппроксимации было получено уравнение прямой
зависимости максимальной флюоресценции от концентрации раствора
родамина. Подставив в уравнение значение интенсивности, рассчитали
неизвестную концентрацию. С = 0,00521 мМ
Вывод: в ходе работы ознакомились с методом флуоресцентной
спектроскопии; были приобретены навыки работы с устройством импульсного
спектрофотометра Fluorolog 3 (FL 3-221- NIR), умения регистрировать
электронные спектры испускания раствора органического соединения –
родамина разной концентрации; определена концентрация раствора родамина
с помощью градуировочного графика зависимости испускаемого излучения от
концентрации раствора.
11
Скачать