Понятие о ферментах Ферменты, или энзимы, представляют

Понятие о ферментах
Ферменты, или энзимы, представляют собой высокоспециализированный класс веществ белковой природы,
используемых живыми организмами для осуществления многих тысяч взаимосвязанных химических реакций,
включая синтез, распад и взаимопревращения огромного множества и разнообразия химических соединений.
Жизнь и многообразие ее проявлений — сложная совокупность химических реакций, катализируемых
специфическими ферментами. И. П. Павлов считал ферменты "возбудителями всех химических
превращений" у живых существ. Как известно, важнейшим свойством живого организма является обмен
веществ, ускоряющим и направляющим аппаратом, основой молекулярных механизмов которого являются
ферменты. "Вся тайна животной жизни, — писал Д. И. Менделеев, — заключается в непрерывных химических
превращениях веществ, входящих в состав животных тканей".
В наше время теоретические и практические достижения энзимологии занимают ведущее место в решении
многих проблем биохимии и молекулярной биологии, включая их сравнительное и эволюционное
рассмотрение. "Под знаком молекулярной энзимологии,— говорил на III Всесоюзном биохимическом съезде
(1974) А. Е. Браунштейн, — развивается и встречное течение — реконструкция или интеграция, восходящая
от молекулярного яруса к высшим уровням структурно-функциональной организации живого и
пронизывающая весь комплекс актуальных проблем биологии и медицины".
Ферменты отличаются рядом характерных свойств от неорганических катализаторов. Прежде всего
ферменты чрезвычайно эффективны и проявляют высокую каталитическую активность в условиях умеренной
температуры (температура тела), нормального давления и в области близких к нейтральным значениям pH
среды.
Ферменты отличаются высокой специфичностью действия в отношении как природы субстрата, так и типа
химической реакции, т. е. каждый фермент катализирует в основном только одну какую-либо химическую
реакцию. Для каждого фермента характерны специфическая последовательность расположения
аминокислотных остатков и пространственная конформация. Существенной особенностью ферментов
является также то, что их активность в клетках строго контролируется как на генетическом уровне, так и
посредством определенных низкомолекулярных соединений: субстратов и продуктов реакций (эффекторов),
катализируемых этими же ферментами. Таким образом, молекула фермента характеризуется уникальностью
структуры, которая и определяет уникальность ее функции.
Учение о ферментах выделено в самостоятельную науку — энзимологию, или ферментологию. Термин
"энзим" (от греч. en zyme — в дрожжах), так же как и "фермент" (от латинск. fermentatio — брожение),
означает процесс, связанный с выделением газов. Термином "фермент" называли любой агент, вызывающий
тот или иной вид брожения, хотя, как мы увидим ниже, это понятие является более широким.
В настоящее время учреждены специальные научно-исследовательские институты по изучению ферментов,
существует ряд специальных журналов, созываются национальные и международные симпозиумы и
конференции, посвященные проблемам энзимологии. Наука о ферментах интенсивно развивается в тесной
связи со многими науками, в частности с органической, неорганической и физической химией, физиологией,
токсикологией, микробиологией, генетикой, фармакологией и др. Таким образом, эта область знаний
находится на стыке химических, биологических и медицинских наук.
Энзимология в ее современном физико-химическом и молекулярном понимании решает две главные
неразрывно связанные между собой проблемы, касающиеся, с одной стороны, структурной
макромолекулярной организации ферментов, с другой, — природы химических взаимодействий, лежащих в
основе ферментативного катализа. По этим вопросам накопление экспериментальных данных и развитие
теоретических представлений происходят настолько быстро, что любой учебник к моменту выхода в свет уже
не отражает достаточно полно современное состояние вопроса о структуре и функции ферментов.
Важно подчеркнуть, что изучение ферментов имеет огромное значение для любой фундаментальной и
прикладной области биологии, а также для многих практических отраслей химической, пищевой и
фармацевтической индустрии, занятых приготовлением катализаторов, антибиотиков, витаминов и многих
других биологически активных веществ, используемых в народном хозяйстве и медицине. На рис. 36
представлены основные области биологии и медицины, в которых идеи и методы энзимологии нашли
широкое применение. В фармакологии действие многих лекарственных препаратов основано на
определенном, хотя зачастую еще не выявленном, механизме взаимодействия их с ферментами. Успехи
общей и молекулярной энзимологии способствуют развитию новой ее ветви — медицинской энзимологии,
цели и задачи, методологические подходы которой связаны с решением проблем энзимопатологии,
энзимодиагностики и энзимотерапии. Наука о питании базируется на точных знаниях поэтапного
расщепления питательных веществ под влиянием ферментов пищеварительного аппарата, на
количественный и качественный состав которых существенно влияет характер поступающих с пищей
веществ. Многие проблемы наследственной патологии человека тесно связаны с дефектами или полным
отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы клеточного роста и развития, дифференцировки,
физиологических функций (движение, перемещение в пространстве, транспорт веществ, процессы
возбуждения и торможения и др.) определяются в большей степени работой биокатализаторов, включая их
биосинтез и инактивацию. Таким образом, есть все основания для подтверждения положения, что не только
современная биология, как отмечает акад. А. Е. Браунштейн, но и медицина "говорят на языке энзимологии".
КРАТКАЯ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ УЧЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ
Несмотря на то, что явления брожения и переваривания известны с незапамятных времен, зарождение
учения о ферментах (энзимология) относится к первой половине XIX века. Первое научное представление о
ферментах было дано в 1814 г. петербургским ученым К. С. Кирхгофом, который показал, что не только
проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превращением его в
мальтозу. Вещество, извлекаемое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крахмал в
мальтозу, получило название амилазы. Либих и Велер открыли другой агент, расщепляющий амигдалин,
содержащийся в эфирном масле горького миндаля. Действующий агент, содержащийся в миндале, был
назван эмульсином. В последующие годы были описаны другие ферменты, в частности, пепсин и трипсин,
вызывающие гидролиз белков в желудочно-кишечном тракте.
Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления в организме. Уже был известен
феномен химического катализа, означающий, что и многие реакции in vitro протекают быстро и энергично в
присутствии ничтожных количеств примесей, как будто не участвующих в реакции. В частности, была
установлена высокая каталитическая роль ряда неорганических веществ. Горение сахара на воздухе,
например, происходит очень медленно, если же добавить немного солей лития (или золы, также содержащей
ничтожные количества лития), то горение сахара идет весьма интенсивно в соответствии со следующим
уравнением:
С6Н12О6 + 602 --> 6СO2 + 6Н20
Как известно теперь, в живых организмах "горение" (а точнее окисление) углеводов также протекает быстро и
до тех же конечных продуктов обмена, т. е. СO2 и Н2O с выделением (и накоплением) энергии. Однако это
"горение" происходит при относительно низкой температуре, без пламени и, что особенно интересно, в
присутствии воды. Разумеется, в этих необычных условиях без действия ферментов, получивших
наименование биологических катализаторов, не было бы окисления сахаров. Забегая несколько вперед,
укажем, что в процессе превращения (окисления) глюкозы в организме до СО2 и Н2O участвует
последовательно около 15 различных ферментов (см. Обмен углеводов).
Биологические катализаторы, т. е. ферменты, как оказалось, не вызывают, в отличие от неорганических
катализаторов, каких-либо других (побочных) реакций, и не осуществляют реакций, невозможных по
термодинамическим условиям, но и те, и другие катализаторы только ускоряют химические реакции, обычно
протекающие очень медленно. В качестве примера можно привести одну и ту же химическую реакцию, на
которую действует и фермент, и неорганический катализатор. Так, перекись водорода может медленно
расщепляться на молекулярный кислород и воду и в отсутствие катализатора, но в присутствии
мелкораздробленной платины эта реакция протекает с высокой скоростью:
Эту же реакцию можно провести, и притом еще намного быстрее, в присутствии фермента каталазы,
содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем образуются те же конечные продукты распада перекиси
водорода. Аналогично ионы меди и особый фермент аскорбатоксидаза интенсивно катализируют окисление
аскорбиновой кислоты (витамин С) молекулярным кислородом в дегидроаскорбиновую кислоту (см. ниже).
Таким образом, можно считать установленным, что ферменты катализируют ряд химических реакций,
аналогичных химическим реакциям, катализирующимся неорганическими веществами.
Ферменты долгое время подразделяли на "организованные" и "неорганизованные" в зависимости от того,
удавалось или не удавалось осуществить изучаемую химическую реакцию in vitro в отсутствие живых клеток.
В частности, связана ли химическая реакция с жизнедеятельностью клеток микроорганизмов? Дискуссия
велась, главным образом, вокруг вопроса о сущности дрожжевого брожения и вызвала знаменитую полемику
между Л. Пастером и Ю. Либихом.
Пастер опубликовал серию работ, где показал, что спиртовое брожение осуществляется цельными,
неповрежденными дрожжевыми клетками. По его мнению, процесс брожения обусловлен размножением
дрожжевых клеток, т. е. их жизнедеятельностью; отсюда и их название "организованные" ферменты,
ферменты живой клетки, ферменты "существа". После нагревания дрожжевые клетки теряли свою
способности сбраживать сахар. Пастер, однако, не отрицал существования и "неорганизованных" ферментов,
т. е. ферментов "веществ", в частности амилазы, эмульсина, пепсина и др. Подобное противопоставление
ферментов "существ" и "веществ" имело явно виталистический характер и напоминало противопоставление
живой и неживой природы. Либих, будучи химиком, напротив, считал, что "организованных" ферментов
вообще не существует и что спиртовое брожение и сходные процессы обусловлены действием химических
веществ, которые могут быть выделены из дрожжевой клетки или любого другого объекта живой природы.
Однако Либиху не удалось выделить эти вещества, и спор не был разрешен.
Только в 1871 г. М. М. Манассеина впервые показала, что дрожжи и после разрушения клеточной структуры
(растертые с измельченным песком), когда фактически они лишены жизненных функций, способны
сбраживать сахар. Работы Бухнера (1897) окончательно решили спор в пользу Либиха. Бухнер приготовил
бесклеточный дрожжевой сок, полученный прессованием клеток под высоким давлением (до 500 ат), и,
поскольку этот сок легко разлагался при хранении бактериями из воздуха, он в качестве консерванта
добавлял сахар (эта функция сахара была известна при приготовлении джемов). К своему удивлению, он
обнаружил, что бесклеточный сок из дрожжей сбраживал сахар с образованием спирта; таким образом,
Бухнер показал, что присутствие живых организмов не обязательно для процесса брожения. Фермент
брожения получил название зимазы (от греч. zyme — дрожжи). В лаборатории А. Н. Лебедева зимаза была
получена более простым способом: настаиванием в теплой воде высушенных дрожжевых клеток.
Таким образом, благодаря исследованиям Бухнера и А. Н. Лебедева было положено начало детальному
изучению процесса анаэробного окислительно-восстановительного расщепления углеводов, который вскоре
был полностью расшифрован (см. Гликолиз). Эти же работы окончательно опровергли виталистические
представления о сущности процесса брожения. В настоящее время считается установленным, что любую из
протекающих в живых организмах (или клетках) химическую реакцию можно в принципе осуществить вне
организма (или клетки), если экспериментатору удается выделить соответствующий фермент (или систему
ферментов), катализирующий данную реакцию, и создать оптимальные условия для его действия 1.
Ряд ферментов прочно связан с морфологическими структурами клетки, в частности с биомембранами.
Для их изолирования и выделения требуется применение особых методических приемов, тогда как в
1
целостном организме имеется тесная связь между функцией фермента и его структурной связью с
клеточными образованиями.
ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ
В настоящее время получены неопровержимые экспериментальные доказательства белковой природы
ферментов. Трудно даже себе представить, что не только Вильштеттер еще в 1926 г. отрицал
принадлежность ферментов к белкам или к какому-либо известному классу органических веществ, но и
совсем недавно высказывались cомнения на этот счет. Поводом для сомнения являлись опыты, в которых,
хотя и были получены ферментативно активные растворы, но белок не мог быть обнаружен при помощи
качественных цветных реакций. Объясняется это тем, что концентрация фермента при высокой удельной
активности оказывалась ниже пороговой чувствительности химического теста на белок.
О белковой природе ферментов говорит факт инактивирования (потери активности) ферментов брожения при
кипячении, установленный еще Пастером. При кипячении имеют место явления необратимой денатурации
(см. выше) белка-фермента. Фермент при этом теряет присущие ему свойства катализировать химическую
реакцию. Точно так же белки при кипячении денатурируются и теряют свои биологические свойства
(антигенные, гормональные, каталитические). Под влиянием различных физических и химических факторов
(облучение растворов ферментов ультрафиолетовыми и рентгеновскими лучами, воздействие ультразвука,
осаждение минеральными кислотами, щелочами, алкалоидными реактивами, солями тяжелых металлов и
др.) происходит денатурация ферментов, так же как и белков.
Ферменты при гидролизе, как и белки, распадаются на аминокислоты что, бесспорно, служит веским
доказательством белковой природы ферментов. Некоторые ферменты, помимо белковой части, содержат
небелковый компонент, образуя молекулу сложного белка (см. Строение ферментов).
Поучительные данные, указывающие на белковую природу ферментов, были получены в лаборатории И. П.
Павлова. При определении переваривающей способности желудочного сока была обнаружена прямая
зависимость между этой способностью и количеством белка в соке. Отсюда было сделано заключение, что
пепсин желудочного сока является белком.
Вескими доказательствами белковой природы фермента являются его получение в чистом виде и выделение
в форме кристаллов белка. К настоящему времени получено более 200 кристаллических ферментов и
структура многих из них изучена детально при помощи современных методов белковой химии и
молекулярной физики (методами рентгеноструктурного анализа, ядерно-магнитного резонанса, электронно-
магнитного резонанса и др.). Первый кристаллический фермент (уреаза) был получен в 1926 г. Самнером.
Вслед за этим в 1930 г. Нортроп выделил в виде белковых кристаллов пепсин, в 1931 г. Нортроп и Кунитц
получили из панкреатического сока кристаллический трипсин.
Ферменты, как и все белки, обладают рядом свойств, характерных для высокомолекулярных соединений; в
частности, они наделены амфотерными свойствами (могут существовать в растворе в виде анионов,
катионов и амфионов). Они также обладают электрофоретической подвижностью благодаря наличию в них
положительных и отрицательных зарядов, а в изоэлeктрической точке не обнаруживают подвижности в
электрическом поле. Ферменты не способны к диализу через полупроницаемые мембраны. При помощи
диализа их растворы обычно можно освободить от низкомолекулярных примесей. Как белки они легко
осаждаются из водных растворов при низких температурах методами высаливания (см. выше) или
осторожным добавлением ацетона, этанола и др., не теряя при этом своих каталитических свойств.
Подобно белкам, ферменты обладают высокой молекулярной массой — от десятков тысяч до нескольких
миллионов дальтон (табл. 14).
Таблица 14. Молекулярная масса ферментов
Фермент
Молекулярная масса
Фермент
Молекулярная масса
Рибонуклеаза
13 700
Лактатдегидрогеназа
140 000
Цитохром с
15 000
Альдолаза
142 000
Трипсин
23 800
Каталаза
248 000
Пепсин
32 000
Глутаматдегидрогеназа
336 000
Гексокиназа
45 000
Уреаза
480 000
Щелочная фосфатаза
80 000
Пируватдегидрогеназа (комплекс)
4 500 000
Ферменты обладают высокой специфичностью действия, что также доказывает их белковую природу,
поскольку белки в иммунологическом отношении отличаются крайне тонкой специфичностью. Наконец,
прямым доказательством белковой природы ферментов является лабораторный синтез первого и пока
единственного1 фермента — рибонуклеазы, осуществленный в лаборатории Мерифилда в Нью-Йорке. Этот
автоматический синтез на твердой фазе состоял в последовательном включении всех 124 аминокислотных
остатков в строгом соответствии с последовательностью аминокислот (с первичной структурой)
естественного фермента — рибонуклеазы поджелудочной железы2. Искусственно синтезированный фермент
не отличался от природной рибонуклеазы по химическим, каталитическим и иммунологическим тестам.
1
Полную первичную структуру панкреатической рибонуклеазы расшифровали в 1955 г. Мур и Стейн.
Совсем недавно осуществлен искусственный синтез второго фермента — лизоцима, состоящего из
118 аминокислот.
2
Принимая во внимание перечисленные выше обстоятельства, при получении ферментов в чистом виде и при
их хранении следует учитывать одно важное свойство белков, а именно стабильность, которая определяется
рядом факторов. Одним из общих правил при работе с ферментами является оптимальная температура,
соответствующая температуре тела, а для препаративных целей — пользование температурой около 0°С.
Следует, однако, иметь в виду, что имеется несколько ферментов, весьма чувствительных к пониженной
температуре, в частности, митохондриальный фермент, катализирующий распад АТФ, при 0°С подвергается
инактивации, в то время как при комнатной температуре рн оказался стабильным. Большинство ферментов
оказывается стабильными при pH около 6,0—8,0, хотя имеются исключения. Для препаративных целей часто
прибегают к обезвоживанию фермента (удалению воды) в вакууме из замороженного раствора (этот метод
получил название лиофилизации). Осаждение из раствора ферментов спиртом или ацетоном также проводят
при низкой температуре, поскольку при комнатной температуре эти процедуры приводят к почти полной
потере энзиматической активности.
Для стабилизации фермента часто пользуются хелатообразующими агентами, в частности, к ферменту
добавляют этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), который может связывать нежелательные примеси
(содержащиеся в реактивах следы ионов тяжелых металлов: меди, свинца, ртути и др.). оказывающие
тормозящий эффект на активность. Одним из непременных условий сохранения cтабильности ферментов
является хранение этих препаратов в высушенном или замороженном состоянии (в условиях холода). Многие
ферменты стабильны в виде суспензии в концентрированных растворах сульфата аммония.
Строение ферментов
Предыдущая: Понятие о ферментах
Ферменты — простые и сложные белки. Ранее было указано (см. Химия сложных белков), что в природе
существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые целиком представлены полипептидными цепями
и при гидролизе распадаются исключительно на аминокислоты. Примерами такого рода ферментов (простых
белков) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин, папаин, уреаза, лизоцим,
рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков,
содержащих, помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент, присутствие которого
является существенным для энзиматической активности. Подобные кофакторы могут принимать различные
формы и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если константа диссоциации сложного
фермента настолько мала, что в растворе все полипептидные цепи оказываются связанными со своими
кофакторами и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает название
холофермента (холоэнзима), а кофактор — простетической группы, рассматривающейся как интегральная
часть молекулы фермента. Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом.
В литературе до сих пор употребляются и другие наименования компонентов сложных ферментов, в
частности фермент-протеид, белковый компонент, кофермент. Под коферментом часто подразумевают
дополнительную группу, легко отделяемую от апофермента при диссоциации. Предполагается, что между
простетической группой и полипептидной цепью существует ковалентная связь, как, например, в молекуле
ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы, в которой кофактор биотин ковалентно связан с апоферментом посредством
амидной связи (см. Витамины). С другой стороны, связи между кофакторами и пептидными цепями могут
быть относительно слабыми (например, водородные связи или электростатические взаимодействия и др.). В
таких случаях при выделении ферментов наблюдается полная диссоциация обеих частей и изолированный
белковый компонент оказывается лишенным ферментативной активности, пока не будет добавлен извне
недостающий кофактор. Именно к подобным изолированным низкомолекулярным органическим веществам,
применим термин "кофермент", типичными представителями которых являются В 1-, В2-, В6-, РР-содержащие
коферменты (см. Витамины). Известно также, что и простетические группы, и коферменты активно
включаются в химические реакции, выполняя функции промежуточных переносчиков электронов, атомов
водорода или различных групп, таких, как амино-, ацетильные-, карбоксильные группы.
Следует подчеркнуть, что разницу между простетической группой и коферментом нельзя абсолютизировать,
поскольку в одних случаях, например у оксидазы D-аминокислот (см. ниже), кофактор, представленный
флавинадениндинуклеотидом, может быть легко отделен от белковой части путем диализа. Тот же кофактор
прочно связан ковалентно с ферментами тканевого дыхания, выполняя функции простетической группы.
Многие двухвалентные металлы (Mg2+, Мn2+, Са2+), как будет показано ниже, также выполняют роль
кофакторов, хотя их не относят ни к коферментам, ни к простетическим группам. Однако имеется ряд
примеров, когда ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой, выполняя функции простетической
группы. В частности, очищенный фермент, катализирующий окисление аскорбиновой кислоты (витамина С) в
дезоксиаскорбиновую кислоту, содержит 8 атомов меди на молекулу; все они настолько прочно связаны с
белковой молекулой, что даже не обмениваются ионообменными смолами и не отделяются путем диализа.
Более того, методами электронного парамагнитного резонанса показано участие ионов меди в
промежуточном переносе электронов. Интересно заметить, что ионы меди также наделены каталитической
активностью при окислении аскорбиновой кислоты, однако активность повышается во многие тысячи раз,
когда ионы меди соединяются с апоферментом в единый комплекс холофермента.
В табл. 15 приводятся данные о важнейших коферментах и простетических группах ферментов, включая их
наименование, природу витамина, входящего в их состав, и характер производимой химической реакции.
Химическая природа коферментов и химические реакции, катализируемые комплексом их с апоферментом,
будут рассмотрены детально в разделе "Витамины".
Таблица 15. Важнейшие коферменты и простетические группы ферментов
Наименование (название)
Участвующий
витамин
Группы, подлежащие переносу
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД)
Никотинамид,
витамин РР
Атомы водорода (электроны)
Никотинамидадениндинуклeотидфосфат
(НАДФ)
Никотинамид,
витамин РР
Атомы водорода (электроны)
Флавинмононуклеотид, рибофлавинфосфат
(ФМН)
Рибофлавин,
витамин В2
Атомы водорода (электроны)
Флавинадениндинуклеотид (ФАД)
Рибофлавин,
витамин В2
Атомы водорода (электроны)
Коэнзим А (КоА)
B3 (пантотеновая
кислота)
Ацильные, ацетильные и другие группы
Тетрагидрофолиевая кислота (ТГФ)
Bc (фолиевая
кислота)
Метальные, метиленовые, формильные
группы или фориминогруппы
(одноуглеродные остатки)
Биоцитин
Биотин, витамин Н
Двуокись углерода (активная форма СO2)
Тиаминдифосфат (ТДФ)
Тиамин, витамин B1
Альдегиды и кетоны
Аминогруппы
Пиридоксальфосфат (ПФ)
Пиридоксин,
витамин В6
Карбоксильные группы
Карбоксильные группы1
1
Реакции отщепления (элиминирования) и
конденсации в боковых цепях аминокислот
Дезоксиаденозил- и (метил)-кобаламин (В12коферменты)
Цианкобаламин,
витамин В12
Реакции изомеризации и перемещения
метильных групп
Убихинон (коэнзим Q)
Витамин Q
(убихинон)
Атомы водорода, протоны и электроны
Получены доказательства кофакторной функции в ферментативных реакциях ряда биологически активных
соединений, не относящихся к витаминам: HS-глутатиона, АТФ, липоевой кислоты, производных нуклеозидов
(уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащих веществ и др. Сюда
же могут быть отнесены тРНК, которые в составе фермента аминоацил-тРНК-синтетазы принимают активное
участие в переносе аминокислоте рибосомы, где осуществляется синтез белка (см. Биосинтез белка).
Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных ферментов, заключающуюся в том,
что ни кофактор отдельно (включая кофермент), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не
обладают, и только их объединение, в единое целое, протекающее не хаотично, а в соответствии с
программой их структурной (трехмерной) организации, обеспечивает быстрое протекание химической
реакции.
Активный центр ферментов. При изучении механизма химической реакции, катализируемой ферментами,
исследователя всегда интересует не только определение промежуточных и конечных продуктов и выяснение
отдельных стадий реакции, но и природа тех функциональных групп в молекуле фермента, которые
обеспечивают специфичность действия фермента на данный субстрат (или субстраты) и высокую
каталитическую активность. Речь идёт, следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры
фермента, а также химической природы того участка (или участков) молекулы фермента, который
обеспечивает высокую скорость каталитической реакции.
Так как участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов чаще всего имеют небольшие
размеры по сравнению с молекулами ферментов, было высказано предположение, что при образовании
ферментсубстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно, вступает
ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об "активном центре"
фермента. Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в
молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное взаимодействие ее с молекулой субстрата и
прямое участие в акте катализа (рис. 37). Установлено, что у ферментов-протеидов в состав активного центра
входят также простетические группы.
В активном центре условно различают так называемый каталитический участок, непосредственно
вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и "контактную" (или якорную) площадку, которая
обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом. В свою
очередь молекула субстрата также содержит функционально различные участки, например при действии
эстераз или протеиназ - одну специфическую связь (или группу атомов), подвергающуюся атаке со стороны
фермента, и один или несколько участков, избирательно связываемых ферментом. Сказанное может быть
представлено в следующей общей форме:
Получены экспериментальные доказательства наличия в активном центре химотрипсина двух остатков
гистидина и остатка серина, схематически представленных в трехмерной структурной модели этого фермента
(рис. 38). Выявление химической природы и вероятной топографии групп активного центра является
проблемой первостепенной важности; она сводится к определению природы аминокислот, их
последовательности и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации аминокислотных
остатков используют ряд приемов: применение специфических ингибиторов (см. ниже) ферментов (часто это
субстратоподобные вещества или аналоги коферментов), методов мягкого (ограниченного) гидролиза в
сочетании с химической модифицацией, включающей избирательное окисление, связывание, замещение
остатков аминокислот и другие приемы.
При помощи методов ингибиторного анализа были сделаны попытки установить общность активных центров
у ферментов, относящихся к разным группам. В частности, при применении диизопропилфторфосфата (ДФФ)
(принадлежащего к типу так называемых "нервных ядов") имеет место полное выключение активного центра
холинэстеразы — фермента, катализирующего гидролиз ацетилхолина на холин и уксусную кислоту.
Оказалось, что этот ингибитор имеет близкое структурное сходство с ацетилхолином и подобно ему
взамодействует с ОН-группой остатка серина в активном центре. Вызывая фосфорилирование серина в
активном центре ряда других ферментов, ДФФ также инактивирует их действие.
Показано, кроме того, что ДФФ избирательно фосфорилирует в каждом чувствительном к нему ферменте
только один остаток серина, наделенный функциональной активностью. Учитывая этот механизм действия
ДФФ, сделаны попытки определения природы аминокислот в окружении "каталитического" остатка серина у
ряда ферментов. Полученные в этих исследованиях результаты суммированы в табл. 16.
Таблица 16. Последовательность аминокислотных остатков, расположенных вокруг серина в молекулах
ряда эстераз и протеиназ (по Г. Малеру и Ю. Кордесу)
Фермент
Последовательность остатков аминокислот вокруг серина
Химотрипсин
Гли-Асп-Сер-Гли-Гли
Трипсин
Гли-Асп-Сер-Гли-Про-Вал-
Тромбин
Асп-Сер-Гли
Эластаза
Асп-Сер-Гли
Бутирилхолинэстераза
Гли-Глу-Сер-Ала
Ацетилхолинэстераза
Глу-Сер-Ала
Алиэстераза печени
Гли-Глу-Сер-Ала-Гли-Гли
Щелочная фосфатаза (Е. coli)
Тре-Асп-Сер-Ала-Сер-Ала
Субтилизин (В. subtilis)
Гли-Тре-Сер-Мет-Ала
Протеаза (Aspergillus orizae)
Тре-Сер-Мет-Ала
Фосфоглюкомутаза
Тре-Ала-Сер-Гис-Асп
Фосфорилаза
Глн-Иле-Сер-Вал-Арг
Из табл. 16 видно, что ферменты, сходные по типу действия, хотя и различаются специфичностью, могут
иметь почти одинаковую последовательность аминокислот в тех участках, которое примыкают к остатку
серина, несущему функционально-активную гидроксильную группу. Существенное значение этой группы
серина для акта катализа было доказано, кроме того, химическим ее блокированием или удалением, когда
эстеразы полностью лишались ферментативной активности.
Предполагается, что формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза
белка-фермента (см.Биосинтез белка) на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи
превращается в трехмерное тело строго определенной конфигурации.
Образовавшийся белок приобретает функциональную (в частности, каталитическую) информацию. Любые
воздействия, приводящие к денатурации, т. е. к нарушению третичной структуры, приводят к искажению или
разрушению структуры активного центра и соответственно к потере ферментом каталитических свойств. Если
при подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белка-фермента
(ренатурировать его), то восстанавливается и его каталитическая активность. Это было показано впервые на
примере рибонуклеазы поджелудочной железы.
Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (или
центры) (от греч. аллос — другой, иной и стереос — пространственный, структурный), представляющий собой
участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно низкомолекулярные вещества
(называемые эффекторами или модификаторами), молекулы которых не сходны по строению с субстратами.
Присоединение эффектора к аллостерическому центру приводит к изменению третичной и часто также
четвертичной структуры молекулы фермента и соответственно конфигурации активного центра, вызывая
снижение или повышение энзиматической активности. Ферменты, активность которых контролируется
состоянием как активного, так и аллостерического центра, получили название аллостерических ферментов 1.
1
Ряд авторов рекомендуют пользоваться термином регуляторный центр (регуляторный фермент)
вместо аллостерического для ферментов, обладающих регуляторными функциями, поскольку в этом
случае якобы отпадает необходимость уточнения наличия на поверхности фермента особого центра
для связывания эффектора.
Отличительной особенностью аллостерических ферментов является наличие в молекуле олигомерного
фермента нескольких активных центров и нескольких аллостерических регуляторных центров,
пространственно удаленных друг от друга. Аллостерический фермент может быть представлен в виде схемы
(рис. 39), в которой каждый из двух симметрично построенных протомеров содержит активный центр,
связывающий субстрат (S), и один аллостерический центр, связывающий эффектор (М2). Получены
доказательства, что аллостерические ферменты, помимо активного центра для субстрата, содержат так
называемые эффекторные центры для него же; и хотя при связывании с эффекторным центром субстрат не
подвергается каталитическому превращению, однако он влияет на каталитическую эффективность активного
центра. Подобные взаимодействия между центрами, связывающими лиганды одного сорта, принято
обозначать гомотропными взаимодействиями, а взаимодействия между центрами, связывающими лиганды
разных сортов, — гетеротропными взаимодействиями.
ИЗОФЕРМЕНТЫ
В живой природе имеются ферменты, молекулы которых состоят из двух и более субъединиц, обладающих
одинаковой или разной первичной, вторичной и третичной структурой. Выше (см. Химия белков) было
указано, что субъединицы нередко называют протомерами, а объединенную олигомерную молекулу —
мультимером. Схематически строение некоторых ферментов-мультимеров и способы связи протомеров
представлены на рис. 40.
Следует прежде всего указать на отсутствие ковалентных, главновалентных связей между субъединицами.
Связи между последними в основном являются нековалентными, поэтому такие ферменты довольно легко
диссоциируют на протомеры. Удивительной особенностью таких ферментов является то, что активность
всего комплекса зависит от способа упаковки между собой отдельных субъединиц. Если генетически
различимые субъединицы могут существовать более чем в одной форме, то соответственно и фермент,
образованный из двух или нескольких типов субъединиц, сочетающихся в разных количественных
пропорциях, может существовать в виде нескольких сходных, но не одинаковых формах. Подобные
разновидности фермента получили название изоферментов (изоэнзимов или, реже, изозимов). В частности,
если фермент состоит из четырех субъединиц двух разных типов, например Н и М, активный фермент может
представлять собой одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ и ММММ, или
соответственно Н4, Н3М, Н2М2, НМ3, М4.
Отметим также, что в одних случаях субъединицы имеют почти идентичную структуру и каждая из них
содержит каталитически активный участок (например, β-галактозидаза, состоящая из 4 субъединиц). В других
случаях субъединицы оказываются неидентичными. Примером последних может быть триптофансинтетаза,
состоящая из двух субъединиц, каждая из которых наделена собственной энзиматической активностью.
Однако, только будучи объединенными в макромолекулярную структуру, обе субъединицы проявляют
триптофансинтетазную активность.
Термин множественные формы фермента применим к белкам, катализирующим одну и ту же реакцию, и
встречающимся в природе в организмах одного вида. Термин изозим, или изоэнзим (изофeрмент), применим
к тем множественным формам ферментов, которые появляются вследствие генетически обусловленных
различий в первичной структуре белка, но не к формам, образовавшимся в результате модификации одной
первичной последовательности.
Одним из наиболее изученных ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гельэлектрофореза (см. выше), является лактатдегидрогеназа, катализирующая обратимое превращение
пировиноградной кислоты в молочную (см. Обмен углеводов). Пять изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ)
образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов, условно обозначенных:
Н-тип (от heart — сердце) и М-тип (от muscle — мышцы). Поскольку Н-протомеры несут более выраженный
отрицательный заряд при pH 7,0—9,0, чем М-протомеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типов
(Н4), будет мигрировать при электрофорезе с наибольшей скоростью в электрическом поле к положительному
электроду (аноду). С наименьшей скоростью будет двигаться к аноду изофермент М4, в то время как
остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции. Типичную картину миграции изоферментов
ЛДГ при электрофорезе схематически можно представить следующим образом (рис. 41).
Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной активностью,
отличаются по ряду физико-химических свойств: молекулярной массе, электрофоретической подвижности,
отношению к активаторам и ингибиторам и др. Однако для каждой ткани в норме характерно свое
соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Например, в сердечной мышце преобладает Н 4, т. е. ЛДГ5 а
в скелетных мышцах и печени — М4 (ЛДГ5), как это видно из рис. 42. Эти обстоятельства широко используют
в клинической практике, поскольку изучение картины изоферментов ЛДГ (и ряда других ферментов) в
сыворотке крови может представить интерес для дифференциальной диагностики органических и
функциональных поражений органов и тканей. По картине изоферментов сыворотки крови можно судить как о
топографии патологического процесса, так и о степени поражения органа или ткани.
МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ
Особую группу ферментов составляют надмолекулярные (или мультимолекулярные) ферментные комплексы,
в состав которых входят не субъединицы, в каталитическом отношении однотипные протомеры, а разные
ферменты, катализирующие последовательные ступени превращения какого-либо субстрата. Отличительной
особенностью подобных мультиферментных комплексов является не только прочность ассоциации, но и
определенная последовательность прохождения промежуточных стадий, продиктованная порядком
расположения каталитически активных (различных) белков в пространстве ("путь" превращения в
пространстве и времени). Типичными примерами подобных мультиферментных комплексов является
пируватдегидрогеназа и α-кетоглутаратдегидрогеназа, катализирующие окислительное декарбоксилирование
пировиноградной и α-кетоглутаровой кислот в животных тканях (см. Обмен углеводов), и синтетаза высших
жирных кислот (см. Обмен липидов). Молекулярные массы этих комплексов в зависимости от источника их
происхождения варьируют от 2,3·106 до 10·106 дальтон. Ассоциация отдельных ферментов в единый
недиссоциирующий комплекс имеет определенный биологический смысл и ряд преимуществ. В частности,
при этом резко сокращаются расстояния, на которые молекулы промежуточных веществ должны
перемещаться при работе изолированных ферментов. Ряд таких мультиферментных комплексов структурно
связан с какой-либо органеллой (рибосомы, митохондрии) или с биомембраной и составляет
высокоорганизованные системы, обеспечивающие жизненно важные функции, например тканевое дыхание
(перенос электронов от субстратов к кислороду через систему дыхательных ферментов).
Механизм действия ферментов
Предыдущая: Строение ферментов
Проблема структуры и функции ферментов, вопросы механизма их действия почти ежегодно подробно
обсуждаются на многих международных симпозиумах и конгрессах. Важное место отводится рассмотрению
структуры активных центров, конкретному механизму действия различных типов ферментов, общей теории
энзиматического катализа. До установления химической природы ферментов гипотезы о механизме действия
ферментов опирались на исследования кинетики и на модельные опыты химического гомогенного катализа.
Повышение скорости химических реакций под действием ферментов объясняли:
a.
активированием субстрата в результате образования адсорбционных или молекулярных, обратимо
диссоциирующих фермент-субстратных комплексов;
b.
за счет цепных механизмов реакций с участием радикалов или возбужденных молекул,
активированных "ударом 2-го порядка".
Оказалось, что цепные механизмы реакции не играют существенной роли в биологическом катализе. После
установления химической природы ферментов подтвердилось представление, выдвинутое более 70 лет
назад Арни, Михаэлисом и Ментен, о том, что при ферментативном энзиматическом катализе фермент
соединяется (в принципе обратимо) со своим субстратом, образуя нестойкий промежуточный ферментсубстратный комплекс, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов
реакции.
Михаэлис не только постулировал образование промежуточного фермент-субстратного (ЕS)-комплекса1 (1 В
уравнениях реакций субстрат будет обозначаться символом S, фермент — Е, продукт реакции — Р.), но
и рассчитал влияние концентрации субстрата на скорость реакции (см. ниже). В процессе реакции различают
несколько стадий; присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование первичного
промежуточного соединения в один или несколько последовательных (переходных) комплексов и
протекающее в одну или несколько стадий, отделение конечных продуктов реакции от фермента. Сказанное
можно схематически проиллюстрировать следующими примерами:
E + S --> ES --> E + P
В реакциях анаболизма, допустим, А + В —> АВ, фермент может соединяться как с одним, так и с другим
субстратом или обоими субстратами:
На рис. 43 представлена схема образования промежуточного фермент-субстратного комплекса. Если
фермент в активном центре содержит кофермент, то предполагается образование тройного комплекса (рис.
44).
Поскольку фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период, долго не удавалось
показать образование такого комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного
комплекса были получены в лабораториях Кейлина и Чанса. В настоящее время экспериментальные и
математические методы кинетики, термодинамики и статистической механики химических реакций позволяют
определять для ряда ферментативных реакций кинетические и термодинамические показатели, в частности
константы диссоциации промежуточных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и равновесия
их образования.
В образовании фермент-субстратных комплексов участвуют водородные связи, электростатические и
гидрофобные взаимодействия, а также в ряде случаев ковалентные, координационные связи (примерная
схема таких связей представлена на рис. 45). Информация о природе связей между субстратом и
связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами электронного
парамагнитного и ядерно-магнитного резонанса (ЭПР и ЯМР), а также методами ультрафиолетовой и
инфракрасной спектроскопии. Для каталитической активности фермента существенное значение имеет
пространственная структура, в которой жесткие участки α-спиралей чередуются с гибкими, эластичными
линейными отрезками, обеспечивающими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим
изменениям придается большое значение в некоторых теориях ферментативного катализа. Так, согласно
гипотезе "индуцированного", или "вынужденного", контакта Кошленда, каталитически активная конфигурация
молекулы фермента и соответственно активного центра может в определенных случаях возникать лишь в
момент присоединения субстрата в результате его деформирующего воздействия. Подобная деформация
может быть представлена в виде схемы (рис. 46). Видно, что присоединение субстрата (S) к ферменту (Е),
вызывая соответствующие изменения конформации активного центра, в одних случаях приводит к
образованию активного комплекса (1), в других — к образованию неактивного комплекса (2) из-за нарушения
пространственного расположения функциональных групп активного центра в промежуточном комплексе.
В каталитическом процессе существенное значение имеют точное соответствие между ферментом и
субстратом, а также термодинамические и каталитические преимущества подобного соответствия. Гипотеза
"соответствия" предполагает существование между ферментом и субстратом не только пространственной
или геометрической комплементарности, но и электростатического соответствия, обусловленного
спариванием противоположно заряженных групп субстрата и активного центра фермента. Эта гипотеза не
отрицает и участия всей молекулы фермента, которая, вероятнее всего, определяет более узкую
субстратную специфичность. Точное соответствие обеспечивает образование эффективного комплекса
между субстратом и ферментом.
Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической точки зрения, ускоряют химические
реакции за счет снижения энергии активации1. Энергией активации называется энергия, необходимая для
перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при данной температуре. Другими
словами, это энергия, необходимая для запуска химической реакции, без которой реакция не начинается,
несмотря на ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации путем увеличения
числа активированных молекул, которые становятся реакционно-способными на более низком
энергетическом уровне (рис. 47). Как видно из рис. 47, ферментативная реакция имеет более низкую энергию
активации. Следует отметить, что как катализируемая ферментом, так и не катализируемая им реакция
независимо от ее пути имеет одинаковую величину стандартного изменения свободной энергии (ΔG1).
(1 Величину энергии активации обычно выражают в джоулях на моль (Дж/моль).)
Зависимость между константой равновесия и изменением свободной энергии реагирующих веществ математически
принято выражать формулой: ΔG = -R · T · lnК, где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; ln К —
натуральный логарифм константы равновесия; ΔG — стандартное изменение свободной энергии, т. е. уменьшение
или увеличение свободной энергии в калориях при превращении 1 моль (1 грамм-молекулы) реагирующего
вещества в 1 моль продукта. Из представленного уравнения вытекает, что при высоком значении К величина ΔG
оказывается отрицательной. Подобные реакции сопровождаются уменьшением свободной энергии. При низком
значении К величина ΔG оказывается положительной. Если константа равновесия равна единице, изменение
свободной энергии будет равно нулю и реакция является легко обратимой.
Для измерения константы равновесия и величины свободной энергии какой-либо химической реакции, например
реакции взаимопревращения глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат (см. Химия и обмен углеводов),
катализируемой ферментом фосфоглюкомутазой, определяют количество глюкозо-6-фосфата и количество
глюкозо-1-фосфата при достижении химического равновесия. В состоянии равновесия количество глюкозо-6фосфата оказывается в 19 раз больше количества глюкозо-1-фосфата. Отсюда константа равновесия К равна 19.
Подставляя эту цифру в уравнение ΔG = —R · T · lnК, получаем: ΔG = —7329 Дж/моль. Это означает, что при
превращении 1 моль глюкозо-1-фосфата в 1 моль глюкозо-6-фосфата при 25°С происходит уменьшение свободной
энергии системы на 7329 Дж.
Таким образом, в механизме ферментативного катализа ведущую роль играют промежуточные ферментсубстратные комплексы, образование которых определяется тонкой структурой активного и эффекторного
центров и уникальной структурой всей молекулы фермента, обеспечивающими высокую каталитическую
активность и специфичность действия биокатализаторов.
Кинетика ферментативных реакций
Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способность живых организмов кинетически
регулировать химические реакции, подавляя стремление к достижению термодинамических равновесий
[Малер Г., Кордес Ю., 1970]. Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния
химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия
(концентрации, pH среды, температуры, присутствия активаторов или ингибиторов) на скорость
ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение
информации, которая может способствовать пониманию механизма действия фермента.
Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что
любая химическая реакция характеризуется константой термодинамического равновесия. Она выражает
состояние химического равновесия, достигаемого системой, и обозначается K eq. Так, для реакции:
константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, деленному на
произведение концентраций исходных веществ. Значение константы равновесия обычно находят из
соотношения констант скоростей прямой (r+1) и обратной (r-1)реакций, т. е. Keq = r+1/r-1. В состоянии равновесия
скорость прямой реакции: v+1 = r+1[A]·[B] равна скорости обратной реакции: v-1 = r-1[C]·[D], т. е. v+1 = v-1,
соответственно,
Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций.
Величину, обратную константе равновесия (Keq), принято называть субстратной константой, или, в случае
ферментативной реакции, константой диссоциации фермент-субстратного комплекса, и обозначать символом
Ks. Так, в реакции:
т. е. Ks равна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к концентрации ферментсубстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить,
что константа Ks зависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства.
Чем ниже значение Ks, тем выше сродство фермента к субстрату.
При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций
(не свойственную обычным химическим реакциям), связанную с явлением насыщения фермента субстратом.
При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 48)
является почти линейной и подчиняется кинетике 1-го порядка. Это означает, что скорость реакции S -—> Р
прямо пропорциональна концентрации субстрата [S] и в любой момент времени (t) определяется следующим
кинетическим уравнением:
где [S] — молярная кoнцентрация субстрата S; —d[S]/dt — скорость убыли субстрата; r' — константа скорости
реакции, которая в данном случае имеет размерность 1/время (мин -1 или с-1).
При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна и становится постоянной и не
зависящей от концентрации субстрата [S]. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка: V
= r" (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента (см.
ниже). Различают, кроме того, реакции 2-го порядка, скорость которых пропорциональна произведению
концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности
говорят о реакциях смешанного порядка (см. рис. 48).
Изучая явление насыщения, Михаэлис и Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они
исходили из предположения, что ферментативный процесс осуществляется в виде следующей химической
реакции:
т. е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с образованием промежуточного комплекса ES,
который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на
основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение, названное в честь авторов
уравнением Михаэлиса — Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией
субстрата и скоростью ферментативной реакции:
где v — наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S]; s — константа диссоциации
фермент-субстратного комплекса, моль/л; Vmах — максимальная скорость реакции при полном насыщении
фермента субстратом.
Из уравнения Михаэлиса-Ментен следует, что при высокой концентрации субстрата и низком значении
Ks скорость реакции является максимальной, т. е. v = Vmax (реакция нулевого порядка, см. рис. 48); при низкой
концентрации субстрата (см. рис. 48), напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной
концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция 1-го порядка).
Однако следует указать, что уравнение Михаэлиса — Ментен в его классическом виде не учитывает влияния
на скорость ферментативного процесса продуктов реакции, например в реакции:
и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствования его. Так
было предложено уравнение Бриггса — Холдейна:
где Кm представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспериментально определяемой величиной.
Она может быть представлена следующим уравнением:
В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону
исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение r -1/r+1 представляет собой
константу диссоциации фермент-субстратного комплекса Ks (см. выше).
r-1
если
r+2
= Ks , то Km = Ks +
r+1
r+1
Отсюда вытекает важное следствие, что константа Михаэлиса всегда больше, чем константа диссоциации
фермент-субстратного комплекса Ks на величину r+2\r+1.
Для определения численного значения Кm обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость
ферментативной реакции v составляет половину от максимальной V max; т. е. если v = 1/2Vmax, то подставляя
значение v в уравнение Бриггса-Холдейна, получаем:
уравнения на Vmax, имеем:
разделив обе части
или Кm + [S] = 2[S], откуда Кm = [S]
Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость
данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной 1. (1Экспериментальные значения
Кm для большинства ферментативных реакций с участием одного субстрата лежат обычно в пределах
10-2—10-5 М.)
Определение величины Кm имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на
активность ферментов и т. д. Константу Михаэлиса можно вычислить из графика, представленного на рис. 49.
Отрезок на оси абсцисс, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять
собой Кm.
Следует указать, что пользоваться графиком, построенным в прямых координатах концентрация субстрата
[S0] — начальная скорость реакции (v0), неудобно, поскольку максимальная скорость (V max) является в данном
случае асимптотической величиной и определяется недостаточно точно.
Для
более
удобного
графического
представления
экспериментальных данных
Лайнуивер
и
Бэрк
преобразовали уравнение Бриггса-Холдейна по методу двойных обратных величин, исходя из того принципа,
что если существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также будут
равны. В частности,
Vmax · [S]
если v =
1
, то
Km + [S]
1
=
v
1
или
=
Vmax · [S] / (Km + [S])
Km
Vmax· [S]
[S]
=
v
Km + [S]
+
Vmax · [S]
Vmax · [S]
после преобразования получаем уравнение:
1
Km
=
v
1
+
Vmax·
[S]
Vmax
которое получило название уравнения Лайнуивера-Бэрка. Это уравнение эквивалентно уравнению прямой
линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах 1/v и 1/[S],
то получим прямую (рис. 50), тангенс угла наклона которой будет равен величине K m/Vmax; отрезок,
отсекаемый прямой от оси ординат, представляет собой 1/V max (обратную величину максимальной скорости);
если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на оси абсцисс отсекается отрезок, соответствующий
обратной величине константы Михаэлиса - 1/Km (см. рис. 50). Следует подчеркнуть, что значение V max, как и
Km, определяется более точно по сравнению с графиком, построенным в прямых координатах, при
построении графика по методу двойных обратных величин, поэтому метод нашел широкое применение в
современной энзимологии.
Основные свойства ферментов
Предыдущая: Механизм действия ферментов
К ферментам также применимы три основных критерия, характерных и для неорганических катализаторов. В
частности, они остаются относительно неизменными после реакции, т. е. освобождаются вновь и могут
реагировать с новыми молекулами субстрата (хотя нельзя исключить побочных влияний условий среды на
активность фермента). Ферменты оказывают свое действие в ничтожно малых концентрациях (например,
одна молекула фермента реннина, содержащегося в слизистой оболочке желудка теленка, створаживает
около 106молекул казеиногена молока за 10 мин при 37°С). Наличие либо отсутствие фермента или любого
другого катализатора не оказывает влияния как на величину константы равновесия, так и на изменение
свободной энергии (ΔG). Катализаторы лишь повышают скорость, с которой система приближается к
термодинамическому равновесию, не сдвигая точки равновесия. Химические реакции с высокой константой
равновесия и отрицательной величиной ΔG принято называть экзергоническими. Реакции с низкой
константой равновесия и соответственно положительной величиной ΔG (они обычно не протекают
спонтанно), называются эндергоническими. Для начала и завершения этих реакций необходим приток
энергии извне. Однако в живых системах экзергонические процессы сопряжены с эндергоническими
реакциями, обеспечивая последние необходимым количеством энергии.
Ферменты, будучи белками, обладают рядом характерных для этого класса органических соединений
свойств, отличающихся от свойств неорганических катализаторов.
Термолабильность ферментов
Поскольку скорость химических реакций зависит от температуры, реакции, катализируемые ферментами,
также чувствительны к изменениям температуры. Скорость химической реакции повышается в 2 раза при
повышении температуры на 10°С. Однако из-за белковой природы фермента тепловая денатурация белкафермента при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента с
последующим снижением скорости реакции. Так, примерно до 45-50°С преобладает эффект повышения
скорости реакции, предсказуемый теорией химической кинетики. Выше 45°С более важной становится
тепловая денатурация белка-фермента и быстрое падение скорости реакции (рис. 51).
Таким образом, термолабильность, или чувствительность к повышению температуры, является одним из
характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов. В присутствии
последних скорость реакции возрастает экспоненциально при повышении температуры (см. рис. 51).
При 100°С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляет, очевидно, только один
фермент мышечной ткани — миокиназа, которая выдерживает нагревание до 100°С). Оптимальной
температурой для действия большинства ферментов теплокровных животных является 37-40°С. При низких
температурах (0° или ниже) ферменты, как правило, не разрушаются (не денатурируются), хотя активность их
падает почти до нуля. Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. В
настоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказано существование прямой
зависимости между скоростью инактивации фермента и степенью денатурации белка. Укажем также, что на
термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация субстрата, pH среды и другие
факторы.
Зависимость активности ферментов от pH среды
Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов,
соответствующей для животных тканей в основном выработанным в процессе эволюции физиологическим
значениям pH среды (pH 6,0-8,0). При графическом изображении на кривой колоколообразной формы
имеется определенная точка, при которой фермент проявляет максимальную активность; эту точку называют
оптимумом pH среды для действия данного фермента (рис. 52). При определении зависимости активности
фермента от концентрации водородных ионов реакцию проводят при разных значениях pH среды, обычно
при оптимальной температуре и при наличии достаточно высоких концентраций субстрата. В табл. 17
приводятся оптимальные пределы pH среды для ряда ферментов.
Из табл. 17 видно, что рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений.
Исключение составляет пепсин, pH-оптимум которого равен 2,0 (при pH 6,0 он не активен и не стабилен).
Объясняется это функцией пепсина, поскольку в желудочном соке содержится свободная соляная кислота,
создающая среду примерно этого значения pH. С другой стороны, pH-оптимум аргиназы лежит в сильно
щелочной зоне (около 10,0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа
функционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне pH среды.
Таблица 17. Оптимальные значения pH для некоторых ферментов
Фермент
Фермент
pH
pH
Пепсин
1,5-2,5
Каталаза
6,8-7,0
Катепсин В
4,5-5,0
Уреаза
7,0-7,2
Амилаза из солода
4,9-5,2
Липаза панкреатическая
7,0-8,5
Сахараза кишечная
5,8-6,2
Трипсин
7,5-8,5
Амилаза слюны
6,8-7,0
Аргиназа
9,5-10,0
Согласно современным представлениям, влияние изменений pH среды на молекулу фермента заключается в
воздействии на состояние или степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, СООН-группы
дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина, NН2-группы лизина и др.).
При разных значениях pH среды активный центр может находиться в частично ионизированной или
неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на формировании
активного фермент-субстратного комплекса. Имеет значение, кроме того, состояние ионизации субстратов и
кофакторов.
Специфичность ферментов
Ферменты обладают высокой специфичностью действия. По этому свойству они часто существенно
отличаются от неорганических катализаторов. Так, мелкоизмельченные платина и палладий могут
катализировать восстановление (с участием молекулярного водорода) десятков тысяч химических
соединений различной структуры. Высокая специфичность ферментов обусловлена, как было упомянуто
выше, конформационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и
фермента и уникальной структурой активного центра фермента, обеспечивающими "узнавание", высокое
сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других химических реакций,
осуществляющихся одновременно в живых клетках.
В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной или групповой специфичностью
и с абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее
значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин расщепляет белки животного
и растительного происхождения, хотя они могут существенно отличаться друг от друга как по химическому
строению и аминокислотному составу, так и по физикохимическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет
углеводы или жиры. Объясняется это тем, что местом действия пепсина является пептидная - СО-NH-связь.
Для действия липазы, катализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, таким местом
является сложноэфирная связь. Аналогичной групповой специфичностью обладают трипсин, химотрипсин,
пептидазы, ферменты, гидролизующие α-гликозидные связи (но не β-гликозидные связи, имеющиеся в
целлюлозе) в полисахаридах и т. д. Обычно эти ферменты участвуют в процессе пищеварения, и их
групповая специфичность, вероятнее всего, имеет определенный биологический смысл. Аналогичной
относительной специфичностью обладают также некоторые внутриклеточные ферменты, например
гексокиназа, катализирующая в присутствии АТФ фосфорилирование почти всех гексоз, хотя одновременно в
клетках имеются и специфичные для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фосфорилирование.
Абсолютной специфичностью действия называют способность фермента катализировать превращение
только единственного субстрата. Любые изменения (модификации) в структуре субстрата делают его
недоступным для действия фермента. Примером таких ферментов могут служить аргиназа, расщепляющая в
естественных условиях (в организме) аргинин, уреаза, катализирующая распад мочевины, и др. (см. Обмен
простых белков).
Имеются
экспериментальные
доказательства
существования
так
называемой
стереохимической
специфичности, обусловленной существованием оптически изомерных L- и D-форм или геометрических (циси транс-) изомеров химических веществ. Так, известны оксидазы L- и D-аминокислот, хотя в природных
белках обнаружены только L-аминокислоты. Каждый из видов оксидазы действует только на свой
специфический стереоизомер1. (1 Имеется, однако, небольшая группа ферментов — рацемазы,
катализирующие изменение стерической конфигурации субстрата. Так, бактериальная аланин-рацемаза
обратимо превращает как L-, так и D-аланин в оптически неактивную смесь обоих изомеров: DL-аланин
(рацемат).)
Наглядным примером стереохимической специфичности является бактериальная аспартатдекарбоксилаза,
катализирующая отщепление СO2 только от L-аспарагиновой кислоты с превращением ее в L-аланин.
Стереоспецифичность проявляют ферменты, катализирующие и синтетические реакции. Так, из аммиака и αкетоглутарата во всех живых организмах синтезируется L-изомер глутаминовой кислоты, входящий в состав
природных белков. Если какое-либо соединение существует в форме цис- и транс-изомеров с различным
расположением групп атомов вокруг двойной связи, то, как правило, только один из этих геометрических
изомеров может служить в качестве субстрата для действия фермента.
Например, фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (трансизомер), но не действует
на малеиновую кислоту (цисизомер).
Таким образом, благодаря специфичности действия ферменты обеспечивают протекание с высокой
скоростью
лишь
определенных
реакций
из
огромного
разнообразия
возможных
превращений
в
микропространстве клеток и целостном организме, регулируя тем самым интенсивность обмена веществ.
Факторы, определяющие активность ферментов
Здесь будут кратко рассмотрены факторы, определяющие скорость реакций, катализируемых ферментами, и
более подробно будут изложены вопросы об активировании и ингибировании действия ферментов.
Как известно, скорость любой химической реакции уменьшается со временем, однако кривая хода
ферментативных реакций во времени (см. рис. 53) не имеет той общей формы, которая характерна для
гомогенных химических реакций. Снижение скорости ферментативных реакций во времени может быть
обусловлено угнетением продуктами реакции, уменьшением степени насыщения фермента субстратом
(поскольку по мере протекания реакции концентрация субстрата снижается), частичной инактивацией
фермента при заданной температуре и pH среды.
Следует учитывать, кроме того, значение скорости обратной реакции, которая может оказаться более
существенной при повышении концентрации продуктов ферментативной реакции. Учитывая эти
обстоятельства, при исследовании скорости ферментативных реакций в тканях и биологических жидкостях
обычно определяют начальную скорость реакции в условиях, когда скорость ферментативной реакции
приближается к линейной (в том числе при достаточно высокой для насыщения концентрации субстрата).
ВЛИЯНИЕ
КОНЦЕНТРАЦИИ
СУБСТРАТА
И
ФЕРМЕНТА
НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ
Из приведенного выше материала вытекает важное заключение о том, что одним из наиболее существенных
факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата. При
постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно повышается, достигая определенного
максимума (рис. 54), когда дальнейшее увеличение количеству субстрата уже не оказывает влияния на
скорость реакции или в отдельных случаях даже тормозит ее. Как видно из кривой зависимости между
скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата, при низких концентрациях субстрата
существует прямая зависимость между этими показателями, однако при высоких концентрациях скорость
реакции становится не зависящей от концентрации субстрата; в этих случаях принято считать, что субстрат
находится в избытке, а фермент полностью насыщен. Ограничивающим скорость реакции фактором в
последнем случае становится концентрация фермента.
Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от концентрации фермента. На рис. 55
представлена зависимость между скоростью реакции и повышающимися количествами фермента в
присутствии избытка субстрата. Видно, что между этими величинами существует линейная зависимость, т. е.
скорость реакции пропорциональна количеству присутствующего фермента.
Активирование и ингибирование ферментов
Предыдущая: Основные свойства ферментов
Скорость ферментативной реакции, иными словами, активность фермента определяется также присутствием
в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции и иногда модифицируют ее, вторые
— тормозят реакцию. Среди химических соединений, оказывающих влияние на активность ферментов,
встречаются разнообразные вещества. Так, НС1 активирует действие пепсина, желчные кислоты —
панкреатической липазы; некоторые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа),
растительная протеиназа папаин и др. в значительной степени активируются соединениями, содержащими
свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а некоторые также витамином С. Особенно часто в качестве
активаторов служат (выступают) ионы двухвалентных и иногда одновалентных металлов. Многие ферменты
вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при удалении цинка угольная ангидраза практически лишена
ферментативной активности; более того при действии этого фермента цинк не может быть заменен никаким
другим металлом. Известны ферменты, действие которых активируется рядом металлов, в частности,
енолаза (см. Углеводный обмен) активируется Mg2+, Mn2+, К+. В табл. 18 приведены примеры участия
металлов в действии некоторых ферментов.
Таблица 18. Металлы в активировании некоторых ферментов1 (1 Обычно трудно провести границу между
металлоферментами (металл связан комплексно н незаменим) и ферментами, активируемыми металлами
(последние лишь ускоряют реакцию и легко диссоциируют).)
Фермент
Металл
Фермент
Металл
Цитохромы
Fe
Амилаза
Са
Каталаза
Fe
Липаза
Са
Пероксидаза
Fe
Карбоангидраза
Zn
Триптофаноксидаза
Fe
Лактатдегидрогеназа
Zn
Гомогентизиказа
Fe
Уриказа
Zn
Аскорбатоксидаза
Си
Карбоксипептидаза
Zn
Тирозиназа
Си
Пептидазы
Mg
Фенолоксидаза
Си
Фосфатазы
Mg
Ксантиноксидаза
Мо
Фосфоглюкокиназа
Mg
Нитратредуктаза
Мо
Аргиназа
Mn
Альдегидоксидаза
Мо
Фосфоглюкомутаза
Mn
Пептидазы
Со
Холинэстераза
Mn
Относительно роли металлов в активирующем действии ферментов имеющиеся данные свидетельствуют о
том, что в ряде случаев ионы металлов (Со2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+) выполняют функции простетических групп
ферментов. В других случаях они способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию
фермент-субстратного комплекса. Например, ионы Mg 2+через отрицательно заряженную фосфатную группу
обеспечивают присоединение монофосфорных эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз,
катализирующих гидролиз этих соединений. В ряде случаев металл соединяется с субстратом, образуя
истинный субстрат, на который действует фермент. В частности, ионы Mg 2+ активируют креатинфосфокиназу
благодаря образованию истинного субстрата и магниевой соли АТФ. Наконец, имеются экспериментальные
доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са 2+ в молекуле амилазы слюны) в
формировании и стабилизации активного центра и всей третичной структуры молекулы фермента. Следует
отметить также нередкую роль мeталлов в качестве аллостерических модуляторов (см. рис. 59).
Взаимодействуя с аллостерическим центром, подобный металл (модулятор) способствует образованию
наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного фермент-субстратного комплекса.
Анионы
при
физиологических
концентрациях
обычно
неэффективны
или
оказывают
небольшое
активирующее влияние на ферменты. Исключение составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы,
активируемые анионами, а также слюнная амилаза, катализирующая гидролиз крахмала, активность которой
повышается ионами хлора, и аденилатциклаза, которая активируется анионами галогенов.
Ингибиторами принято называть вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций,
катализируемых ферментами. Поскольку ферменты являются белками, любые агенты, вызывающие
денатурацию белка (нагревание, кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов), приводят к инактивации
фермента. Однако подобное инактивирование относительно неспецифично. Оно не связано с механизмом
действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые специфические ингибиторы,
которые оказывают свое действие на один какой-либо фермент или на группу родственных ферментов.
Исследование этих ингибиторов имеет важное значение по ряду причин.
Во-первых, ингибиторы могут дать ценную информацию о природе активного центра фермента, а также его
функциональных групп и химических связей, обеспечивающих образование фермент-субстратного комплекса.
Известны вещества, специфически связывающие ту или иную группу в молекуле фермента, выключая ее из
сферы химической реакции. В частности, йодацетат IСН2-СООН, его амид и этиловый эфир,
парахлормеркурибензоат ClHg — С6Н4—СООН и другие реагенты сравнительно легко вступают в химическую
связь с некоторыми SH-группами ферментов. Если такие группы существенны для акта катализа, то
добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере активности фермента:
R-SH + IСН2-СООН --> HI + R—S—СН2—СООН
Ряд
других
ферментов
(холинэстераза,
трипсин
и
химотрипсин)
сильно
тормозится
фосфорорганическими соединениями, в частности диизопропилфторфосфатом
блокирования ключевой гидроксильной группы сери-на в активном центре (см. выше).
Во-вторых,
ингибиторы
нашли
широкое
применение
в
энзимологии
при
(ДФФ),
некоторыми
вследствие
исследовании
природы
множественных форм ферментов и изоферментов, отличающихся не столько по электрофоретической
подвижности, сколько по различию реакций на один и тот же ингибитор.
При помощи ингибиторов, избирательно выключающих отдельные стадии многоступенчатого
метаболического процесса, могут быть точно установлены последовательность химических реакций и
природа участвующих ферментов. В частности, этим путем при применении йодацетата, фторида и других
ингибиторов был расшифрован гликолитический путь окислительно-восстановительных превращений
глюкозы до молочной кислоты в мышечной ткани (см. Обмен углеводов), насчитывающий 11 стадий с
участием 11 ферментов и 10 промежуточных метаболитов.
На ингибировании ферментов основан механизм действия многих токсинов и ядов на организм. Так,
известно, что при отравлениях синильной кислотой смерть наступает вследствие полного торможения
дыхательных ферментов (цитохромоксидазы), в особенности клеток мозга. Токсическое влияние на организм
человека и животных некоторых инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы —
фермента, играющего первостепенную роль в деятельности нервной системы.
Рациональная химиотерапия — осознанное применение лекарственных препаратов в медицине, должна
опираться на точное знание механизма их действия, на биосинтез ферментов или работу их в организме.
Иногда метод лечения болезней человека включает применение избирательных ингибиторов. Так, ингибитор
трипсина, химотрипсина и калликреина трасилол широко используется при лечении острого панкреатита.
Избирательное ингибиторное действие на ферменты некоторых природных и синтетических соединений (так
называемых антиметаболитов) в настоящее время служит основой для разработки эффективных методов
синтеза химиотерапевтических препаратов. На этом пути открываются широкие возможности регуляции как
синтеза ферментов, так и интенсивности метаболизма.
Типы ингибирования. Несмотря на то что механизм действия большинства ингибиторов не выяснен, обычно
различают обратимое и необратимое ингибирование. Если молекула ингибитора вызывает стойкие
изменения или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется
необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование, поддающееся количественному
изучению на основе уравнения Михаэлиса — Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют
на конкурентное и неконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение
ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата. Во втором случае повышение
концентрации субстрата не изменяет степень ингибирования фермента.
Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на субстрат,
но немного отличающуюся от структуры истинного субстрата. Классическим примером подобного типа
ингибирования является торможение активности сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой. Этот фермент
катализирует окисление путем дегидрирования янтарной кислоты в фумаровую в соответствии со схемой:
Если в среду добавить малоновую кислоту (ингибитор), то в силу структурного сходства ее с истинным
субстратом янтарной кислотой (наличие двух таких же ионизированных карбоксильных групп) она будет
реагировать с активным центром с образованием фермент-ингибиторного комплекса (см. схему), однако при
этом перенос водорода от малоната не происходит. Так как структуры субстрата — янтарной кислоты и
ингибитора — малоната все же несколько отличаются, они конкурируют за связывание с активным центром, и
степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не
абсолютной концентрацией ингибитора. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу
метаболического антагонизма (рис. 56).
В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим
уравнением:
Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом (EI), в отличие от ES не
распадается с образованием продуктов реакции. Константу диссоциации EI-комплекса или ингибиторную
константу (K1) можно, следуя теории Михаэлиса — Ментен, определить как отношение констант обратной и
прямой реакций:
т. е. ингибиторная константа прямо пропорциональна произведению концентрации фермента и ингибитора и
обратно пропорциональна концентрации ЕI-комплекса.
Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Известно, например,
что для лечения
сульфаниламидные
некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют
препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с
парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты,
являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству
сульфаниламид, например, блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты
из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.
Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин (см.
Витамины), действуют как конкурентные, так называемые коферментные ингибиторы (или антивитамины),
тормозящие многие биохимические процессы в организме.
Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с
субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента.
Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на
фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент
часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым. Примерами
неконкурентного ингибирования (инактивации) является действие йодацетата, диизопропилфторфосфата, а
также диэтил-n-нитрофенилфосфата и синильной кислоты, заключающееся в связывании и выключении
функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента.
Для выяснения вопроса о типе ингибирования пользуются уравнением Михаэлиса — Ментен, графиком
Лайнуивера — Бэрка и другими более усовершенствованными уравнениями, например уравнением Эди —
Хофсти:
v = — Кm (0/[S]) + Vmах
и соответствующими графиками в прямолинейных координатах. В приведенных ниже графиках, построенных
в координатах v и [S], а также в координатах 1/v и 1/[S], V — максимальная скорость реакции, V1 —
максимальная скорость в присутствии ингибитора, К1 — ингибиторная константа; все остальные символы
были представлены выше.
Видно, что при конкурентном типе ингибирования (рис. 57) ингибитор увеличивает значение К m (на величину,
равную разнице в длине отрезков, отсекаемых от оси абсцисс), не оказывая влияния на максимальную
скорость. Это означает, что при достаточно высокой концентрации субстрата [S] ингибитор вытесняется
молекулами субстрата из комплекса EI. При неконкурентном ингибировании (рис. 58) ингибитор снижает
величину максимальной скорости. Если при этом величина К m не уменьшается, то говорят о полностью
неконкурентном ингибировании. Подобный тип ингибирования имеет место при образовании неактивных,
труднодиссоциирующих комплексов EI и (или) EIS. Часто, однако, имеет место смешанный тип ингибирования
(иногда называемый частично неконкурентным типом), при котором снижение Vmах сочетается с увеличением
Кm. Это означает, что комплекс EI сохраняет частичную активность, т. е. способность к образованию
промежуточного тройного комплекса EIS, в котором субстрат подвергается замедленному каталитическому
превращению. В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с
повышением концентрации субстрата; для этого типа торможения был предложен довольно неточный термин
бесконкурентный (от англ. uncompetitive). Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью
соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного
комплекса ESI.
Таким образом, при графическом анализе скоростей ферментативных реакций как функции концентраций
субстрата может быть получена ценная информация по кинетике ферментативных реакций, освещающая
возможный механизм ферментативного катализа.
Регуляция активности ферментов
Выше было указано, что одним из уникальных свойств живых организмов является удивительная способность
к сбалансированности катаболических (биодеградативных) и анаболических (биосинтетических) процессов.
Хотя в клетках одновременно совершаются процессы синтеза, распада и взаимопревращения сотен и тысяч
разнообразных веществ, имеется множество регуляторных механизмов, обеспечивающих постоянство
внутренней среды организма. Некоторые из этих регуляторных механизмов, среди которых важная роль
принадлежит механизмам регуляции активности ферментов, будут рассмотрены ниже.
Влияние закона действия масс. В катализируемой ферментом обратимой химической реакции, например
A+B <--> C+D, концентрация компонентов реакции и соответственно направление реакции будут
регулироваться влиянием закона действия масс. Оно, в частности, может быть показано в обратимой реакции
трансаминирования, катализируемой аланинаминотрансферазой:
Аланин + α-Кетоглутарат <--> Пируват + Глутамат.
Этот тип регуляции играет, очевидно, лишь ограниченную роль, поскольку в реальных условиях реакция
обычно протекает в одном направлении, так как образовавшиеся продукты могут оказаться субстратами для
действия других ферментов и выводиться из сферы реакции; в этих случаях устанавливается скорее
устойчивое (стационарное) состояние, чем истинное равновесие.
Изменение количества фермента. У бактерий хорошо изучен феномен индуцированного синтеза
ферментов при выращивании их на среде, где единственным источником углерода и энергии служит тот или
иной углевод, допустим, глюкоза. Замена глюкозы в среде на лактозу приводит к индуцированному или
адаптированному
(после
небольшого
периода
лагфазы)
синтезу
фермента
галактозидазы
(программированному лактозным геном, см. Синтез белка), расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу. В
животных тканях подобный быстрый синтез ферментов наблюдается сравнительно реже, и механизм,
индуцирующий синтез, изучен только для небольшого числа ферментов (тирозинтрансаминазы, серин- и
треониндегидратазы, триптофанпирролазы и др.). Однако при поступлении в организм некоторых ядов,
канцерогенных веществ, алкалоидов, инсектицидов и др. наблюдается резкое увеличение через несколько
дней активности (соответственно количества) ферментов — гидроксилаз гладкого эндоплазматического
ретикулума клеток печени; окисляющих чужеродные вещества в нетоксичные для организма продукты. С
другой стороны, описаны случаи, когда под действием подобных гидроксилаз чужеродные вещества
превращаются в организме в более токсичные соединения. Это явление, обратное детоксикации, получило
название летального синтеза.
Проферменты. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы
синтезируются в неактивной форме, в виде проферментов (зимогенов). Регуляция в этих случаях сводится к
превращению проферментов в активные ферменты под влиянием специфических агентов. Так, трипсин
синтезируется в поджелудочной железе в форме трипсиногена. Последний превращается в активный трипсин
в кишечнике под действием другого белкового фермента — энтерокиназы, впервые открытого в лаборатории
И. П. Павлова. Установлено, что активирующее действие энтерокиназы сводится к отщеплению от
трипсиногена гексапептида, приводящему к формированию нативной третичной структуры трипсина и его
активного центра (см. выше); наблюдается также аутокатализ. Превращение неактивного пепсиногена в
активный пепсин осуществляется аутокаталитически в результате ограниченного протеолиза в присутствии
НС1 и также связано с отщеплением от первого специфического ингибитора полипептидной природы (см.
Обмен простых белков). Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белковпредшественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток
органов, в которых образуются проферменты.
Химическая модификация фермента. Выше было указано (см. Химия белков), что ряд белков при
формировании третичной структуры подвергается постсинтетической модификации. Оказалось, что
ключевые ферменты энергетического обмена — фосфорилаза, гликогенсинтетаза и др. — также
контролируются путем фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими
ферментами — протеинкиназой и протеинфосфатазой, уровень активности которых в свою очередь
регулируется гормонами (см. Обмен углеводов). Уровень активности ключевых ферментов и соответственно
интенсивность процессов обмена будут определяться соотношением фосфорилированных и
дефосфорилированных форм этих ферментов.
Регуляция активности ферментов по принципу обратной связи. Во многих строго биосинтетических
реакциях основным типом регуляции скорости многоступенчатого ферментативного процесса является
ингибирование по принципу обратной связи, когда конечный продукт биосинтетической цепи подавляет
активность фермента, катализирующего первую стадию.
Предположим, что в клетках осуществляется многоступенчатый биосинтетический процесс, каждая стадия
которого катализируется собственным ферментом:
Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значительной степени определяется
концентрацией конечного продукта (Р), накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное
ингибирующее действие на первую стадию процесса, соответственно на фермент E 1.
Впервые существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было показано
у Е. coli при исследовании синтеза изолейцина и цитидинтрифосфата (ЦТФ). Оказалось, что изолейцин,
являющийся
конечным
продуктом,
избирательно
подавляет
активность
треониндегидратазы,
катализирующей первое звено процесса превращения треонина в изолейцин, насчитывающего пять
ферментативных реакций. Аналогично ЦТФ как конечный продукт биосинтетического пути оказывает
ингибирующий эффект на первый фермент (аспартаттранскарбамоилазу), регулируя тем самым свой
собственный синтез. Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи
или ретроингибирования. Существование его доказано во всех живых организмах, и в настоящее время он
рассматривается как один из ведущих типов регуляции активности ферментов и клеточного метаболиза в
целом1. (1Следует указать, что скорость реакции (как и активность ферментов) в чисто
биодеградативных
(катаболических)
процессах
регулируется
промежуточными
продуктами,
являющимися индикаторами энергетического состояния клетки (пуриновые нуклеотиды, пирофосфат,
неорганический фосфат и др.).)
С другой стороны, в амфиболических процессах (см. Введение в обмен веществ и энергии), выполняющих
одновременно биосинтетические и биодеградативные функции 2, доказано существование регуляции как по
типу ретроингибирования, так и макроэргами — индикаторами энергетического состояния клетки. (2К
амфиболическйм процессам относят такие пути, как гликолиз, гликогенолиз, цикл трикарбоновых
кислот, гексозомонофосфатный путь, трансаминирование аминокислот (см. Обмен веществ)). Для
амфиболических процессов уникальным типом регуляции, свойственным только им, является, кроме того,
активация предшественником, когда первый метаболит в многоступенчатом пути активирует фермент,
катализирующий последнюю стадию. Так, доказано активирующее влияние глюкозо-6-фосфата, являющегося
предшественником гликогена, на фермент гликогенсинтетазу.
Подобные типы ингибирования конечным продуктом и активирования первым продуктом свойственны
аллостерическим (регуляторным) ферментам (см. выше), когда эффектор, структурно отличаясь от
субстрата, связывается в особом (аллостерическом) центре молекулы фермента, пространственно
удаленном от активного центра. Поэтому принято различать аллостерический тип регуляции, включающий
как аллостерическое ингибирование, так и аллостерическую активацию. Взаимопревращения активного и
неактивного аллостерического фермента в упрощенной форме, а также конформационные изменения,
наблюдаемые при присоединении субстрата и эффекторов, представлены на рис. 59.
Видно, что присоединение отрицательного эффектора к аллостерическому центру вызывает значительные
изменения конфигурации активного центра молекулы фермента и как результат потерю сродства фермента к
своему субстрату (образование неактивного комплекса).
Аллостерические взаимодействия проявляются в характере кривых зависимости начальной скорости реакции
от концентрации субстрата или эффектора, в частности в S-образности кривых (отклонение от
гиперболической кривой Михаэлиса — Ментен). Это означает, что связывание одной молекулы субстрата
облегчает связывание второй молекулы у аллостерического центра, способствуя тем самым повышению
скорости реакции. Кроме того, для регуляторных (аллостерических) ферментов характерна нелинейная
зависимость скорости реакции от концентрации фермента.
Другие типы регуляции активности ферментов. Существует ряд других механизмов, контролирующих
скорость метаболических процессов и активность внутриклеточных ферментов. К подобным механизмам
могут быть отнесены конкуренция ферментов за общий субстрат, выключение активности одного из
нзоферментов (у множественных форм ферментов), влияние концентраций кофакторов и их формы (в
особенности ионов металлов) и явление компартментализации. Механизм компартментализации играет, повидимому, важную биологическую роль, пространственно разъединяя посредством биомембран ферменты от
своих субстратов (например, лизосомальные ферменты: протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие
гидролитические ферменты, от веществ, на которые они действуют в цитоплазме) или взаимно
несовместимые в одно и то же время метаболические процессы. Примером последних могут быть пути
синтеза жирных кислот, протекающие в основном в растворимой фракции цитоплазмы, и пути распада
жирных кислот, сосредоточенные в митохондриях.
Определение активности ферментов
Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные
трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых
концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции, в
определенных согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, pH среды и
полном насыщении фермента субстратом скорость пропорциональна концентрации фермента. О скорости
ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта
реакции.
Для выражения концентрации фермента Комиссией по ферментам Международного биохимического союза
рекомендована стандартная единица (Е). За единицу любого фермента принимается то количество его,
которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (мкмоль/мин).
Предложено новое определение международной единицы фермента катал (кат, kat), соответствующее
количеству фермента, способному вызывать превращение 1 моль субстрата в продукт в 1 с (1 моль/с).
Отношение международной единицы (Е) к каталу можно выразить следующим образом:
1 кат = 1 моль · с-1
= 60 моль · мин-1
= 60 · 106 мкмоль-мин-1
= 6-107Е;
или 1 Е=1 мкмоль · мин-1 = (1/60) мкмоль · с-1 = (1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1Е фермента
соответствует 16,67 нкат.
Рекомендовано, кроме того, проведение измерения единиц фермента при 25°С, оптимуме pH и концентрации
субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому
порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от концентрации фермента.
Для выражения активности фермента пользуются определением удельной и молекулярной активности.
Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка
(или числом каталов на 1 кг активного белка). Число молекул субстрата, подвергающихся превращению
одной молекулой фермента в минуту, принято называть числом оборотов, или молекулярной активностью.
Так, одна молекула каталазы эритроцитов способна расщепить в 1 мин 5 · 10 6 молекул перекиси водорода1.
(1Для того чтобы 1 атом неорганического железа, также катализирующий распад Н 2O2, расщеплял такое
число молекул Н2O2, которое расщепляет каталаза в 1 с, потребовалось бы более 300 лет. Этот пример
является наглядным доказательством одного из главных свойств ферментов — их высокой
каталитической активности.)
Ферменты: классификация, локализация,
применение
Предыдущая: Активирование и ингибирование ферментов
Внутриклеточная локализация ферментов
Вопрос о локализации ферментов в структурных образованиях клетки (ядро, митохондрии, микросомы и др.)
является чрезвычайно важным, особенно в препаративной энзимологии, когда перед исследователем
поставлена задача изолирования и выделения фермента в чистом виде. Сравнительно легко, обнаружить
локализацию фермента методами цито- и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкубируют с
соответствующими субстратами и после инкубации локализацию продукта реакции открывают добавлением
подходящих химических реактивов по развитию специфической окраски.
В препаративной энзимологии чаще всего пользуются методом дифференциального центрифугирования
гомогенатов тканей. Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего
дезинтегратора (см. Химия белков) и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают
дифференциальному центрифугированию при температуре от 0 до 4°С. Примерная схема
дифференциального центрифугирования гомогенатов в высокоскоростных центрифугах представлена на рис.
60. Обычно распределение ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях,
изолированных при дробном центрифугировании гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую
получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при
средней скорости центрифугирования, во фракции микросом (или рибосом), для изолирования которой
требуется очень высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной жидкости
(супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует указать, что фракция
митохондрии не является гомогенной, поскольку из нее удается изолировать частицы, известные как
"лизосомы", размер, которых занимает промежуточное место между размерами митохондрий и микросом. В
свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку она имеет своим источником
эндоплазматический ретикулум неоднородного строения.
При помощи метода фракционирования в центрифугах было показано, что ядерная фракция печени и почек
содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых
белков. Основным же местом синтеза белка, как теперь установлено, является фракция рибосом
цитоплазмы. Показано, кроме того, что ферменты гликолиза сосредоточены преимущественно в растворимой
фракции цитоплазмы, в то время как цитохромоксидаза и ферменты лимоннокислого цикла Кребса
локализованы во фракции митохондрий. С митохондриями связаны также ферменты, катализирующие
окислительное фосфорилирование и распад жирных кислот. Ферменты, катализирующие биосинтез жирных
кислот, наоборот, содержатся в растворимой фракции цитоплазмы (см. Обмен веществ).
Для изолирования и выделения ферментов из биообъектов в чистом (гомогенном) состоянии используется
весь арсенал методов выделения белков в индивидуальном виде, который был подробно рассмотрен выше
(см. Химия белков).
Классификация и номенклатура ферментов
Современная классификация и номенклатура ферментов была разработана Комиссией по
ферментам1 Международного биохимического союза и утверждена на V Международном биохимическом
конгрессе в 1961 г. в Москве. 1 В работе Комиссии принимали участие крупнейшие энзимологи мира, в том
числе от нашей страны акад. А. Е. Браунштейн.
Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего стремительным ростом числа вновь
открываемых с каждым годом ферментов, которым разные исследователи присваивали названия по своему
усмотрению. Более того, для одного и того же фермента подчас употребляли два или несколько названий,
что вносило путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов вообще не отражали тип
катализируемой реакции. Учитывая эти обстоятельства, Комиссия рекомендовала употреблять названия,
оканчивающиеся на "аза", только для индивидуальных ферментов, но не для комплексных ферментных
систем, т. е. для систем, содержащих более одного фермента.
До 1961 г. не было также единой классификации ферментов. Трудности заключались в том, что разные
исследователи за основу классификации ферментов брали различные принципы. Комиссией были
рассмотрены три принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и их
обозначения. Первый принцип — химическая природа фермента, т. е. принадлежность к флавопротеидам,
пиридоксальфосфатпротеидам, гемопротеидам, металлопротеидам и т. д. Однако этот принцип не мог
служить общей основой для классификации, так как только для небольшого числа ферментов известны
простетические группы, доступные идентификации и прямому определению. Второй принцип — химическая
природа субстрата, на который действует фермент; по этому принципу трудно классифицировать ферменты,
так как в качестве субстрата могут служить разнообразные соединения внутри определенного класса веществ
(белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленного множества промежуточных продуктов их
обмена. В основу принятой классификации положен тип катализируемой реакции, который является
специфичным для действия любого фермента; этот принцип логично использовать в качестве основы для
классификации и номенклатуры ферментов.
Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата (субстратов) и
служит основой для систематического наименования ферментов. Согласно этой классификации ферменты
делят на шесть главных классов:
1.
2.
оксидоредуктазы [показать]
трансферазы [показать]
3.
4.
гидролазы [показать]
лиазы [показать]
5.
6.
изомеразы [показать]
лигазы (синтетазы) [показать]
Список ферментов
На основании разработанной системы, которая служит основой как для классификации, так и для нумерации
(индексации) ферментов, Международная комиссия подготовила также Классификацию ферментов (КФ) с
включением списка ферментов, первоначально состоявшего к 1961 г. примерно из 900 ферментов. В
настоящее время в списке ферментов (см. Номенклатуру ферментов, 1978) насчитывается уже 2142
индивидуальных фермента. В списке для каждого фермента, помимо номера (шифра), приводятся
систематическое (рациональное) название, рекомендуемое (рабочее) название, химическая реакция, которую
катализирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия. Присвоение шифра или
номера для фермента рекомендуется проводить по четырехзначному коду.
Таким образом, код, или шифр, каждого фермента содержит четыре цифры, разделенные точками, и
составляется по следующему принципу. Первая цифра указывает на номер одного из шести главных классов
ферментов (см. выше). Вторая цифра означает подкласс, характеризующий основные виды субстратов,
участвующих в данном типе химических превращений. Например, у трансфераз вторая цифра указывает на
природу той группы, которая подвергается переносу, у гидролаз — на тип гидролизуемой связи и т. д. Эти
подклассы в свою очередь, делятся на более частные подгруппы (обозначаемые под-подклассами),
отличающиеся природой химических соединений доноров или акцепторов, участвующих в данной подгруппе
реакций. Номер, точнее цифра, подподкласса ставится на третьем месте в шифре фермента. У гидролаз,
например, эта цифра уточняет тип гидролизуемой связи, а у лиаз — тип отщепляемой группы и т. д. Первые
три цифры кода точно определяют тип фермента. Наконец, все ферменты, относящиеся к данному подподклассу, получают порядковый номер, который ставится на четвертом месте кода.
Таким образом, каждый фермент, характеризующийся постоянной совокупностью четырех цифр, имеет
соответствующий шифр. В стандартной классификации этим путем охарактеризовано более 2100 ферментов;
в качестве примера в табл. 19 приводятся два фермента из списка.
Таблица 19. Фрагмент из списка ферментов
Шифр
Систематическое
название
КФ
1.1.1.27
L-Лактат + НАД+ оксидоредуктаза
КФ
2.6.1.5
L-Тирозин: 2оксоглутаратаминотрансфераза
Рекомендуемое (рабочее)
название
Pеакция
Примечания о
специфичности и другие
зависимости
Лактатдегидрогеназа
L-Лактат + НАД+ <-> пируват + НАДН2
Окисляет и другие
гидроксимонокарбоновые
кислоты
Тирозинаминдтрансфераза
L-Тирозин + 2оксоглутарат <--> 4гидроксифенилпируват + LГлутамат
Протеид
пиридоксальфосфата
Следует особо подчеркнуть, что Международную классификацию ферментов нельзя считать абсолютно
совершенной, поскольку она в некоторых отношениях не соответствует общепринятой в органической химии
классификации химических реакций, несмотря на то что ферменты катализируют по существу те же реакции.
Применение ферментов
Ферменты являются в высшей степени избирательными инструментами, используемыми живыми
организмами для осуществления с высокой скоростью огромного разнообразия химических реакций; они
могут сохранять активность вне организма, в микропространстве клетки, уже давно привлекают внимание
ученых и широко применяются в народном хозяйстве и медицине. Ферменты нашли широкое применение в
таких отраслях промышленности, как хлебопечение, пивоварение, виноделие, чайное, кожевенное и меховое
производство, сыроварение, кулинария (для обработки мяса) и т. д. В последние годы ферменты стали
применять и в тонкой химической индустрии для осуществления таких реакций органической химии, как
окисление, восстановление, дезаминирование, декарбоксилирование, дегидратация, конденсация, а также
для разделения и выделения изомеров аминокислот L-ряда (при химическом синтезе образуются
рацемические смеси L- и D-изомеров), нашедших применение в промышленности, сельском хозяйстве,
медицине. Следует указать, что овладение тонкими механизмами действия ферментов, несомненно,
предоставит неограниченные возможности получения в огромных количествах и с высокой скоростью
полезных веществ в лабораторных условиях почти со 100% выходами.
Успехи энзимологии находят все большее применение в медицине, в частности во многих аспектах здоровья
и болезни, диагностики и лечения. Успешно развивается новое направление энзимологии — медицинская
энзимология, имеющая свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы
исследования. Медицинская энзимология развивается по трем главным направлениям, хотя возможности
применения достижений энзимологии в медицине теоретически безграничны, в частности в области
энзимопатологии, имеющей целью исследование ферментативной активности в норме и патологии. Многие
наследственные пороки обмена, как оказалось, являются результатом дефекта определенного фермента.
Так, галактоземия — наследственное заболевание, при котором наблюдается ненормально высокая
концентрация галактозы в крови, развивается в результате наследственного дефекта синтеза ключевого
фермента — галактозофосфат-уридил-трансферазы, катализирующего превращение галактозы в легко
метаболизируемую глюкозу. Причиной другого наследственного заболевания — фенилкетонурии,
сопровождающейся расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности
синтезировать фермент, катализирующий превращение фенилаланина в тирозин (см. Обмен аминокислот).
Второе направление медицинской энзимологии получило наименование энзимодиагностики, которая
развивается как по пути применения высокоочищенных ферментов в качестве избирательных реагентов для
открытия и количественного определения с диагностической целью нормальных или аномальных химических
веществ в биологических жидкостях (моча, кровь, желудочный сок и др.), так и по пути обнаружения
(открытия) самих ферментов в сыворотке крови при поражениях органов и тканей, например определение при
помощи ферментов сахара, белка и других патологических составных частей мочи при заболеваниях почек,
сердца и т. д. Для диагностики органических поражений органов широко используются ферментные тесты,
выгодно отличающиеся от других химических диагностических тестов, используемых в клинике, высокой
чувствительностью и специфичностью; сейчас известно около двух десятков тестов, основанных на
количественном определении активности ферментов (и изоферментов) главным образом в крови (реже в
моче), а также в биоптатах. Следует, однако, отметить, что из огромного числа ферментов (более 2000);
открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь
ограниченный набор ферментов и при весьма узком круге болезней (гепатиты, инфаркт миокарда,
органические поражения печени и др.). Сейчас получены доказательства, что органы и ткани человека
характеризуются специфическим ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только
индивидуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент концентрации ферментов между
внутриклеточными и внеклеточными частями тела. Поэтому любые, даже незначительные повреждения
клеток (а иногда и функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внеклеточное
пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм гиперферментемии до конца не расшифрован.
Степень повышения содержания внутриклеточных ферментов в плазме крови находится в прямой
зависимости от природы повреждающего воздействия, времени действия и от степени повреждения органов.
В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полу-жизни
в плазме крови каждого из диагностических ферментов. Отсюда становится важным выбор точного времени
ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения
(топографии) ферментов в индивидуальных органах и тканях, как и внутриклеточной локализации.
Дальнейшее развитие диагностической энзимологии преимущественно идет по двум перспективным
направлениям медицинской энзимологии: по пути упрощения и рациональной модификации уже испытанных
методов и по пути поиска новых органоспецифичных (тканеспецифичных) ферментов и изоферментов.
Третье направление медицинской энзимологии — энзимотерапия, т. е. использование ферментов и
регуляторов действия ферментов в качестве лекарственных средств, пока имеет небольшую историю. До сих
пор работы в этом направлении почти не выходят за экспериментальные рамки. В клинике нашли
применение пепсин, трипсин, химотрипсин и их смеси (абомин, химопсин) для лечения заболеваний
желудочно-кишечного тракта. Помимо протеиназ, ряд других ферментов, в частности РНК-аза, ДНКаза,
гиалуронидаза, коллагеназы, эластазы, отдельно или в смеси с протеиназами используются для обработки
ран, воспалительных очагов, ожогов, для устранения отеков, гематом, келоидных рубцов (туберкулез легких).
Ферменты применяются также для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, для растворения сгустка
крови и т. д. Так, калликреины — ферменты кининовой системы — используются для снижения кровяного
давления. Важной и многообещающей областью энзимотерапии является применение ингибиторов
ферментов. Так, естественные ингибиторы протеиназ нашли применение в терапии острых панкреатитов,
артритов, аллергических заболеваний, при которых имеет место активация протеолиза и фибринолиза,
сопровождающаяся образованием вазоактивных кининов.
Новой перспективной областью медицинской энзимологии является применение иммобилизованных
ферментов, их активаторов и ингибиторов. Такие формы ферментов, сохраняя каталитическую активность
обладают повышенной стабильностью, сниженной антигенностью и более длительным действием в
организме. Уже созданы иммобилизованные лекарственные препараты фибринолитических ферментов,
применяемые для борьбы с тромбозами.
В последние годы разрабатывается новый способ введения иммобилизованных ферментов путем внедрения
их в липидные пузырьки-липосомы, которые оказались хорошими носителями для транспорта лекарств в
организме; они биосовместимы, не вызывают иммунологических реакции и с их помощью можно вводить
ферменты внутрь клеток.
Предпринимались попытки применения ферментов для лечения злокачественных опухолей человека,
например аспарагиназы при лечении лимфогранулематоза. Этот фермент разрушает аспарагин, являющийся
незаменимым фактором для лейкозных клеток, поскольку они оказались лишенными способности его
синтезировать. Следует однако, подчеркнуть, что в этой огромной важности проблеме применения
ферментов и их эффекторов в качестве лекарственных препаратов в значительной степени господствует
эмпиризм и задача заключается в том, чтобы как приготовление ферментов, так и применение их в клинике
организовать на строго научной основе. Это, несомненно, окажет практическим врачам ценную помощь в
борьбе с заболеваниями человека.