УМУ к лабораторным работам - Институт фундаментальной
реклама
Министерство образования и науки РФ
Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Сибирский федеральный университет»
Специальный физический практикум
Методические указания к лабораторным занятиям
Квалификация (степень) выпускника «Магистр»
Красноярск
СФУ
2011
Авторы: Немцева Е.В., Белогурова Н.В., Есимбекова Е.Н., Безруких А.Е., Сутормин О.С.,
Трифонов С.В., Шадрин К.В., Кислан С.Л., Тарасова А.С., Лоренц В.А., Алиева Р.Р.
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом и
программой по дисциплине «Специальный физический практикум». Пособие содержит
тематический план занятий, представлены источники основной и дополнительной
литературы в соответствии с темами занятий. В пособие даны рекомендации для
подготовки к лабораторным занятиям, промежуточному и итоговому контролю.
Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению
«Физика», магистерские программы «Биофизика», «Окружающая среда и человек: основы
контроля и надзора».
1. Общие сведения
Дисциплина «Специальный физический практикум» имеет своей целью
расширить и углубить знания студентов по вопросам физико-химических
основ процессов в живых организмах. Изучение данного курса поможет в
формировании у них целостного естественнонаучного мировоззрения.
Для успешного освоения предлагаемого курса в полном объеме
необходимо предварительное изучение курсов «Биохимия» и «Биофизика»,
«Фотобиофизика», а также базового курса «Квантовая физика».
Курс «Специальный физический практикум» служит основой для
освоения студентами таких дисциплин как «Современные проблемы
биофизики», «Избранные главы биофизики» и др., а также в подготовке
выпускных квалификационных работ, магистерских диссертаций.
Реформирование и развитие новых технологий ведения учебного
процесса высшего профессионального образования РФ для подготовки
бакалавров, магистров (специалистов – по выделенным специальностям)
требуют формирования новой, более эффективной и системно
организованной модели структуры подготовки выпускников, а также
выработки требований к содержанию и уровню подготовки по
соответствующим основным образовательным программам (ООП). Данные
образовательные программы ориентированы на подготовку специалистов
преимущественно для научно-исследовательской и научно-педагогической
деятельности. Сегодня одним из недостатков в развитии научно-технического
потенциала страны является разрыв между образованием и фундаментальной
наукой, между академической и вузовской наукой, что делает малодоступным
для студентов и аспирантов лаборатории и уникальные установки вузов и
НИИ РАН, и тем более отраслевых предприятий, и естественно, сказывается
на качестве образования. Это значит, что для реализации ООП в вузах, а так
же подготовки кадров высшей квалификации необходимо сближение
академической науки и высшего образования. В связи с этим содержание
образовательных программ и научно-исследовательской деятельности
требуют нового программного и методического обеспечения для воспитания
специалистов новой генерации, способных к эффективному вхождению в
мировое образовательное, научное и технологическое пространство, к
успешной конкуренции на современном образовательном и информационном
рынке. Кроме того, реализация основных образовательных программ требует
также восстановление научно-педагогического резерва университетов.
Для решения этих и других проблем модернизации существующей
системы ВПО появилась необходимость детального изучения и анализа
процесса. Одним из подходов решения этой проблемы является внедрение
научного поиска в качестве активных формы обучения, и как следствие
вовлечение студентов, бакалавров, магистров, в научно-исследовательскую
деятельность, а аспирантов и молодых преподавателей и ученых СФУ еще и в
преподавательскую деятельность.
Молодыми преподавателями и аспирантами кафедры биофизики СФУ в
рамках Специального физического практикума подготовлены методические
материалы по широкому спектру лабораторных работ для предоставления
студентам возможности выбора индивидуальной образовательной траектории
по выполнению лабораторных работ. В ходе выполнения лабораторных работ
студентами будут освоены новейшие методы физико-химической биологии с
использованием
современного
уникального
оборудования
центра
коллективного пользования НОЦ «Енисей», в первую очередь лаборатории
«Оптической спектроскопии и биолюминесцентного анализа». В процессе
внедрения активных форм обучения при подготовки специалистов в области
биофизики будут применены методы абсорбционной и флуоресцентной
спектроскопии, а также методы кинетического анализа с использованием
следующих приборов: сканирующего cпектрометра Aminco®Bowman Series 2
(Thermo Spectronic, USA), биохемилюминесцентного анализатора БХЛМ
3606
(СКТБ
«Наука»,
Россия),
сканирующего
двухлучевого
спектрофотометра UVIKON-943 (Kontron Instruments, Italy), универсального
сканирующего спектрофотометра GENESYS 10S (США) с расщепленным
лучом, с диапазоном длин волн 200-1100 нм, пакетом программ для
проведения широкого спектра исследований; спектрофлюориметра Флюорат02-Панорама (ООО "Люмэкс", Россия), люминометра Terner BioSystens
(Terner BioSystens, Sunnyvale, USA) и др. Работа специального практикума
организована в том числе и по тематикам диссертационных исследований
аспирантов и молодых ученых-победителей грантов CRDF, которые, как
правило, тесно связаны с приоритетными направлениями научной работы как
на кафедрах университета, так НИИ СО РАН.
Защита лабораторных работ организована в виде научных
конференций, где каждый студент получит возможность ознакомиться еще и
с исследованиями, которые не вошли в его индивидуальный план, но были
выполнены другими студентами. Таким образом, студенты получат
возможность не только познакомиться с самыми актуальными научными
направлениями, но и смогут освоить принципы работы на
новом
уникальным для региона научном оборудовании, позволяющим выполнять
научные работы на современном уровне. Навыки этой работы в дальнейшем
пригодятся студентам при прохождении производственной и преддипломной
практик, при выполнении курсовых и дипломных работ студентами, а потом
и магистерских и кандидатских диссертаций.
2. Объем дисциплины и виды учебной работы
Вид учебной работы
Общая
дисциплины
Семестр
Всего
зачетных
единиц
(часов)
трудоемкость
Аудиторные занятия:
Лабораторные работы (ЛР)
Самостоятельная работа:
изучение теоретического курса
(ТО)
Вид итогового контроля
9
5 (180)
2(72)
1,4 (56)
1,4 (56)
3,4 (124)
3,6 (124)
Зачет
0,7 (28)
0,7 (28)
1,2(44)
1,2(44)
Зачет
10
3(108)
0,7 (28)
0,7 (28)
2,05(80)
2,05(80)
Зачет
3. Содержание дисциплины
3.1 Разделы дисциплины
№
п/п
Раздел дисциплины
1
Биофизика макромолекул
Практическое занятие №1 «Исследование конформационных изменений
модельного белка в вязких средах методами оптической спектроскопии»
Практическое занятие №2 «Влияние органических растворителей на
функционирование ферментов»
2
Биофизика клетки
Практическое занятие №3 «Определение содержания основных пигментов
фотосинтетического аппарата в листьях высших растений»
Практическое занятие №4 «Особенности метаболизма изолированной
перфузируемой печени крысы»
Экологическая биофизика
Практическое занятие №5 «Выявление детоксицирующей активности гуминовых
веществ с помощью биолюминесцентных тестовых систем на примере CrCl3»
3
4
Математическая биофизика
Практическое занятие №6 «Влияние «мутационных» процессов на переход от
маловидовой системы к многовидовой»
3.2 Содержание практических занятий
Практическое занятие №1
ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ
МОДЕЛЬНОГО БЕЛКА В ВЯЗКИХ СРЕДАХ МЕТОДАМИ
ОПТИЧЕСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
1. ТЕОРИТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ: ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ БЕЛКОВ
Опубликованы обширные данные по флуоресценции белков и пептидов. Это
связано с тем, что такие природные флуорофоры, как тирозин и триптофан, присутствуют
практически во всех белках. Флуоресценция большинства белков вызывается в первую
очередь триптофановыми остатками, индольные кольца которых — уникально
чувствительные и сложные флуорофоры. Индол, триптофан и их производные очень
чувствительны к полярности растворителя и подвержены как общим, так и
специфическим взаимодействиям с растворителем, благодаря чему спектр испускания
триптофановых остатков может отражать полярность их ближайшего окружения. На
спектры испускания белков влияют связывание субстратов, реакции ассоциации и
денатурации. Измерение поляризации отражает усредненное время релаксации
триптофановых остатков, несмотря на экспериментальные трудности, вызываемые
сложностью их поляризационного спектра. Следовательно, путем измерения поляризации
можно выявлять влияние денатурантов на структуру белка, реакции ассоциации белков с
лигандами и другими макромолекулами. И наконец, триптофан оказывается уникально
чувствительным к тушению различными веществами. В дополнение к тушению
кислородом и иодид-ионами триптофан тушится такими веществами, как акриламид,
сукцинимид, пероксид водорода, дихлорацетамид, пиридингидрохлорид, цистеин,
хлорированные углеводороды, NO3-, IO3- , Cs+, Си2+, РЬ2+, Cd2+ и Mn2+. Эта
чувствительность к различного рода тушителям обусловлена склонностью возбужденного
индольного ядра донировать электроны во время нахождения в возбужденном состоянии.
Чувствительность к тушителям позволяет определять доступность триптофановых
остатков в белках методом тушения.
Детальный анализ флуоресценции белков затрудняется как обилием факторов,
которые влияют на флуоресценцию индольной составляющей, так и наличием в
большинстве белков нескольких разных триптофановых остатков. Так как каждый остаток
находится в разном окружении, то и спектральные свойства каждого остатка в общем
случае различаются. Испускания всех остатков перекрываются во всем используемом
диапазоне длин волн, и довольно сложно разделить спектральные вклады каждого из них в
многотриптофановом белке. Кроме того, спектры испускания и кинетика затухания
интенсивности флуоресценции довольно сложны, как было найдено даже для свободного
триптофана и для белков, содержащих единственный триптофановый остаток. Например,
для большинства белков с единственным триптофановым остатком не наблюдается
единственного времени затухания флуоресценции. По этой причине нельзя просто
интерпретировать многоэкспоненциальную кинетику затухания в терминах поведения
индивидуальных остатков в многотриптофановых белках. В данной главе дается общий
обзор флуоресценции белков. Детальный обзор данных по флуоресценции аминокислот и
белков был сделан несколькими авторами, и более подробную информацию можно найти в
работах.
1.1. Спектральные свойства ароматических аминокислот
Белки содержат три аминокислотных остатка, которые могут давать вклад в
ультрафиолетовую флуоресценцию: тирозин (Туг), триптофан (Тгр) и фенилаланин (Phe).
Спектры поглощения этих аминокислот приведены на рис.1. Флуоресценция белков
обычно возбуждается в максимуме поглощения при 280 нм или больших длинах волн.
Следовательно, фенилаланин не возбуждается в большинстве экспериментальных
случаев. Более того, квантовый выход фенилаланина в белках мал, так что испускание
этого остатка наблюдается редко.
Рис. 1.1. Спектры поглощения ароматических аминокислот.
Поглощение белков при 283 нм связано с тирозиновыми и триптофановыми
остатками. При длинах волн > 295 нм поглощает главным образом триптофан. Поэтому
предполагается, что его флуоресценция может быть селективно возбуждена в диапазоне
295 — 305 нм, что и было доказано экспериментально. Однако в следующем разделе мы
опишем особенности флуоресценции тирозината при таком длинноволновом
возбуждении.
Флуоресцентные спектры испускания ароматических аминокислот приведены на
рис. 1.2. Испускание тирозина в воде происходит при 303 нм и сравнительно
нечувствительно к полярности растворителя. Максимум испускания триптофана в воде
находится при 348 нм и сильно зависит от полярности. Несколько различающиеся
максимумы испускания могут быть получены на различных приборах в зависимости от
спектральных характеристик индивидуальных оптических компонент. Важно отметить,
что тирозиновые остатки могут претерпевать ионизацию в возбужденном состоянии,
приводящую к потере протона ароматической гидроксильной группой. В основном
состоянии для этого гидроксила рК10, а в возбужденном состоянии рК уменьшается
до~4. Гидроксильная группа может диссоциировать в течение времени жизни
возбужденного состояния, что приводит к тушению флуоресценции тирозина. Ранее
полагали, что тирозинат не флуоресцирует, но выяснилось, что он слабо флуоресцирует
при 345нм.
Рис. 1.2 Флуоресцентные спектры испускания ароматических аминокислот.
1.2 Поляризационные спектры возбуждения тирозина и триптофана
\Поляризационные спектры возбуждения для тирозина и триптофана заметно
различаются. Поляризационный спектр возбуждения тирозина приведен на рис. 1.3.
Область относительно постоянной анизотропии наблюдается при 280 - 290 нм, что
указывает на преобладающий вклад единственного электронного перехода в области
длинноволновой полосы поглощения. При более коротковолновом возбуждении
анизотропия монотонно уменьшается до минимума при 235 нм, который связывают со
вторым электронным переходом. В противоположность тирозину триптофан (рис. 1.4) не
имеет постоянной поляризации в области длинноволновой полосы поглощения. Высокое
значение r0 при возбуждении на 300 нм указывает на приблизительную параллельность
диполей поглощения и испускания. Анизотропия уменьшается до минимума при 290 нм и
увеличивается при длинах волн 280 — 260 нм. Такое сложное поведение приписывается
присутствию двух электронных уровней (1La и 1Lb) в последней длинноволновой полосе
поглощения триптофана. Наличие двух возбужденных состояний с приблизительно
одинаковой энергией привело к значительному числу исследований и дискуссий о том,
какое из состояний отвечает за испускание флуоресценции. Это разногласие полностью не
устранено и сейчас, но, по-видимому, в большинстве случаев испускание белков не
структурировано из-за состояния 1La . Существование минимума r0 при 290 нм связывают
с переходом 1Lb, диполь испускания которого приблизительно перпендикулярен переходу
1
La и диполю перехода, ответственного за испускание (также 1La).
Рис. 1.3. Спектр поляризации флуоресценции тирозина в пропиленгликоле при –70 ºС
На флуоресцентный спектр испускания триптофана влияют как специфические, так
и общие взаимодействия с растворителем. Это иллюстрирует рис. 1.5, на котором
приведено влияние бутанола на спектр испускания индола в гексане. В чистом гексане
наблюдается структурированный спектр испускания, который является зеркальным
отражением перехода 1La индола. Добавление следовых количеств полярного растворителя
н-бутанола приводит к тушению такого структурированного спектра, сопровождаемому
появлением бесструктурного длинноволнового спектра испускания, являющегося
зеркальным отражением перехода 1La индола Эти результаты указывают на двойное
испускание из состояний 1La и 1Lb, причем на переход 1La растворитель влияет более
сильно, чем на переход 1Lb, и энергия перехода 1La понижается в полярных растворителях.
Большая чувствительность состояния 1La к растворителю кажется вполне обоснованной,
так как в переход 1La непосредственно вовлечен атом азота индола. Однако, как
отмечалось, потеря структуры в спектре испускания может быть связана не с двойным
испусканием из состояний 1La и 1Lb, а со специфическим влиянием растворителя на
отдельный электронный переход.
Рис. 1.4. Спектр поляризации флуоресценции триптофана в пропипенгликоле при –70 °С.
Рис. 1.5. Флуоресцентный спектр ;пускания индола. 1 - спектр испускания в гексане; 2 - в
гексане, содержащем 0,7% н-бутанола; 3 — в гексане с 5% н-бутанола; 4 - в 100%-ном
бутаноле, 5 - в воде.
1.3 Влияние растворителя на спектры испускания производных триптофана
Различная чувствительность состояний 1La и 1Lb к растворителю иллюстрируется
спектрами поглощения производных триптофана, приведенными на рис. 1.6. Напомним,
что структурированные пики в поглощении обусловлены состоянием 1Lb. Добавление 2,5%
бутанола приводит к уширению спектра и увеличению поглощения при длинах волн > 290
нм. Полагают, что этот эффект связан с длинноволновым сдвигом бесструктурного
перехода 1La при взаимодействии с полярной составляющей. Переход 1Lb менее
чувствителен к полярности растворителя и поэтому не сдвигается в длинноволновую
область. Эти результаты согласуются со спектрами испускания. Интенсивность
структурированного испускания уменьшается, но сдвиг в присутствии бутанола не
происходит (рис. 11.5). В дополнение к этому специфическому эффекту растворителя
наблюдается чувствительность индольного кольца к полярности растворителя, на что
указывает дальнейший сдвиг испускания в длинноволновую область по мере увеличения
концентрации бутанола до 100% (рис. 1.5). Подобные результаты были получены также в
работах, т.е. первоначальная потеря структурированного испускания при низких
концентрациях полярной составляющей сменяется дальнейшим сдвигом в
длинноволновую область при высоких концентрациях спирта. Авторы указанных работ
объясняют сдвиг спектра образованием специфического комплекса между спиртом и
производным индола. Образование комплекса кажется очень вероятным, но их точная
стехиометрия вызывает сомнения. В любом случае ясно, что для интерпретации
флуоресценции белков требуется рассмотрение и специфического, и общего влияния
растворителя на триптофановые остатки.
Рис. 1.6. Спектры поглощения некоторых производных триптофана. 1, 2 - н-гексилового
эфира N-стеароил-L-триптофана; 3, 4 - 3-метилиндола. Спектры 1 и 3 сняты в
метилциклогексане; 2 и 4 - после добавления 2,5% н-бутанола.
Отсутствие тирозинового испускания [2] у большинства белков зависит от
трехмерной структуры. Денатурация белков приводит к увеличению испускания
тирозинов, но их вклад обычно меньше, чем найденный для эквимолярных смесей.
Предположительными причинами отсутствия тирозиновой флуоресценции в белках были
названы: а) перенос энергии на триптофановые остатки и б) тушение близлежащими
группами полипептидной цепи.
Белки условно разделяют на 4 группы [3,4], в зависимости от экспонированности
их триптофановых остатков в растворитель:
1) Белки, содержащие полностью доступные растворителю поверхностные
триптофановые остатки – имеют спектр флуоресценции с максимумом при 350 нм;
2) Белки, содержащие частично экспонированные поверхностые триптофановые
остатки – имеют спектр флуоресценции с максимумом при 430 нм:
3) Белки с триптофановыми остатками, погруженными внутрь глобулы, но
взаимодействующими с близлежащей полярной группой – имеют спектр флуоресценции с
максимумом при 308 нм.
В целом сдвиги спектров белковых макромолекул (при условиях постоянства
длины волны возбуждения) могут иметь несколько причин [5]:
1) изменение трехмерной структуры белка как результат денатурации
(разворачивания) или связывания функциональных групп молекул (субстратов,
кофакторов); при этом меняется полярность микроокружения триптофановых остатков,
что и отражается на энергиях переходов;
2)
эффект растворителя: при усилении взаимодействия между диполем
триптофанового остатка и диполями окружающей среды понижается энергия излучаемого
кванта флуоресценции и наблюдается батахромный сдвиг.
1.4 Общая характеристика флуоресценции белков
1.4.1. Собственная флуоресценция люциферазы в вязких средах
Природный флуорофор [6] триптофан присутствует в люциферазе, в количестве 7
триптофановых остатков. Флуоресценция большинства белков вызывается в первую
очередь благодаря триптофановым остаткам, индольные кольца которых - уникально
чувствительные флуорофоры. Индол, триптофан и их производные очень чувствительны к
полярности растворителя и подвержены как к общим, так и специфических
взаимодействиям с окружающей средой, благодаря чему спектр испускания
триптофановых остатков может отражать полярность их ближайшего окружения. Таким
образом, исследуя флуоресценцию люциферазы в присутствии вязких растворителей при
критических температурах, например, 35°С можно исследовать эффекты вязких
растворителей и температуры на третичную и вторичную структуры люциферазы.
Целью работы исследовать эффекты вязких растворителей и температуры на
третичную и вторичную структуры люциферазы.
Задачи лабораторной работы:
1. Освоить методы флуоресцентной спектроскопии белковых макромолекул
2. Определить методами флуоресцентной спектроскопии конформационные
изменения модельного белка в вязких средах
Контрольные вопросы по теоретической части:
1. Какие аминокислоты относятся к природным флуорофорам?
2. Назовите максимумы спектров флуоресценции этих аминокислот.
3. Какие факторы приводят к сдвигу максимума спектра флуоресценции?
4. Каковы предположительные причины отсутствия тирозиновой флуоресценции в
белках?
5. Какое количество триптофана содержится в бактериальной люциферазе?
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Буфер и химические реагенты
Для регистрации флуоресценции используют следующие реактивы: препараты
люциферазы, калий-фосфатный буфер 0,05М (рН 7), вязкие агенты: глицерин и сахароза.
Все вязкие реагенты готовят с использование фосфатного буфера, концентрацию вещества
выражали в массовых процентах.
В качестве модельных объектов для варьирования вязкости реакционной среды
используют сахарозу и глицерин. С целью исследования работы ферментов в условиях
различного микроокружения, в том числе при варьировании вязкости реакционной среды,
используют следующее процентное содержание (по массе) глицерина и сахарозы:
Концентрации глицерина: 5%, 10%, 25%, 50%.
Концентрации сахарозы: 20%, 25%, 30%, 40%.
2.2 Используемая аппаратура
- инкубация раствора системы в присутствии и отсутствии глицерина и сахарозы
производят на термостате Vt8 termex (Россия);
- взвешивания сухих реагентов проводят на аналитических весах GR-120 (Япония);
- спектры флуоресценции и возбуждения регистрируют на люминесцентном
спектрометре Aminco Bawman Series 2 (ThermoSpectronics, США);
2.3 Методика экспериментов
2.3.1 Регистрация спектров возбуждения флуоресценции
Условия регистрации спектральных характеристик компонентов биолюмисцентной
реакции бактерий приведены в таблице 1:
Таблица 1 – условия регистрации спектральных характеристик модельного белка
Компонент
Концентрация
Длина волны
Спектральная
Напряжение на
возбуждения/
ширина щелей
ФЭУ, В
регистрации,
монохроматоров,
нм
нм
-6
Модельный белок
1*10 М
295 / 335
4
Выставляется
инидидуально
Каждый образец подвергают термостатированию в течение не менее 5 минут до
начала съемки.
Все спектры флуоресценции корректируют в соответствии с чувствительности
ФЭУ к различным длинам волн с помощью встроенной программы.
Анализ и обработку полученных результатов проводят с применением пакета
прикладных программ Micrisoft Excel, а так же с помощью управляющей программы
люминесцентного спектра Aminсo Bawman Series 2.
Величину динамической вязкости биолюминесценной системы в исследуемом диапазоне
температур берут из химического справочника [7] (таб.4-5).
Таблица 4– Динамическая вязкость органического соединения – глицерина [7]
Концентрация
0
10
20
30
50
глицерина, вес. %
Вязкость сП, при
0,719
0,826
1,07
1,46
3,10
t=35ºС
Таблица 5– Динамическая вязкость органического соединения – сахарозы [7]
Концентрация
0
20
25
30
40
сахарозы, вес. %
Вязкость сП, при
0,719
1,184
1,451
1,833
3,241
t=35ºС
3 ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
3.1 Подготовка к работе
1. Ознакомьтесь с правилами выполнения спектроскопических исследований
белков (методичка возле прибора).
2. Приготовление растворов для исследования.
Получите глицерин и сахарозу. Используя данные п.2.1, рассчитайте, навеску какой
массы надо сделать, чтобы получить необходимые концентрации глицерина (5%, 10%,
25%, 50%) и сахарозы (20%, 25%, 30%, 40%).
Получите модельный белок. Используя данные п.2.1, рассчитайте, каким объемом
буфера следует его развести, чтобы получить необходимую концентрацию (1·10 -6 М).
Перед проведением каждого исследования модельный белок в различных средах должен
инкубироваться на водяной бане в течение 5 минут.
3.2 Исследование абсорбционных свойств белков
3.2.1. Измерение спектров возбуждения модельного белка:
А) Измерьте спектры возбуждения модельного белка (концентрация 1·10-6 М), в двух
средах – растворе глицерина и сахарозы, и фосфатном буфере при температурах 35С.
Условия измерения: диапазон 250-325 нм, шаг 2 нм (medium), объем жидкости в кювете не менее 2 мл.
3.2.2. Измерение спектров флуоресценции люциферазы:
А) Измерьте спектры испускания флуоресценции люциферазы (концентрация 1·10 -6 М), в
двух средах – растворе глицерина и сахарозы, и фосфатном буфере при температурах
35С.
Условия измерения: диапазон 305-500 нм, скорость сканирования – 6 нм/с, объем жидкости
в кювете - не менее 2 мл.
3.3 Составление отчета
Отчет по работе должен состоять из титульного листа, теоретической части,
описания методов исследования, результатов и обсуждения, выводов.
Минимальный материал, предоставляемый в разделе «Результаты и обсуждение» отчета:
1. 5 спектров возбуждения и флуоресценции модельного белка в буфере, глицерине и
сахарозе при температуре 35С. Глицерин (сахароза) буфер на одной диаграмме. Диапазон
длин волн: 260-320 нм. В каждом случае должны быть указана концентрация, отмечены
максимумы.
2. Анализ спектров возбуждения и флуоресценции в виде таблицы
3. Анализ полученных результатов, на основе литературных данных.
№
Образец
λmax флуоресценции модельного
Вязкость, сП
белка
1
2
ЛИТЕРАТУРА ПО ТЕМЕ
1. Lacowicz, J.R. Principle of fluorescence spectroscopy : науч.изд. / J.R Lacowicz. New
York: Springer, 2006.-954 c.
2. Гульнов, Д.В. Исследование конформации компонентов биолюминесцентной
реакции бактерий в вязких средах методами оптической спектроскопии: диплом: защищен
27.06.10 : утв. 14.05.10 / Гульнов Дмитрий Валерьевич. – Красноярск, 2010. - 43 с.
3. Demchemko, A. P. Flousescence and Dynamics in proteins // Topics in Fluorescence
Spectroscopy, Volume 3: Biochemical Applications. ред. R.J. Lakowicz. - New York: Plenum
Publishers, 1992.- Гл.2- С.65-111
4. Eftink, M. R. Intrinsic Fluorescence of Proteins / Topics in Fluorescence Spectroscopy.
Volume 6: Protein Fluorescence. ред. R.J.Lakokicz. – New York: Plenum Publishers 2000. –
Гл.1- С.1-15
5. Ash, M. and Ash, I. Textbook of Pharmaceutical Additives. (2nd edn), Synapse
Information Resources Inc – 2002.
6. Сутормин О.С. Термостабильность биолюминесцентной биферментной системы
NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза в растворах повышенной вязкости: диплом:
защищен 28.05.11 : утв. 14.05.11 / Сутормин Олег Сергеевич. – Красноярск, 2010. - 72 с
7. Справочник химика. Т.3 / Под. ред. Б.П. Никольского. – Л.: Химия, 1965 – 1008 с.
Библиографический список
Основная литература:
1. Биофизика / В. И. Пасечник, С. А. Вознесенский [и др.] ; под ред. В. Ф. Антонов. - 1-е
изд. - Москва : Владос, 2000. - 287 с. (11 экз.)
2. Рубин, А. Б. Биофизика: в 2 т. / А. Б. Рубин ; Московский университет [МГУ] им.
М.В. Ломоносова. - 3-е изд., испр. и доп. - Москва : Московский университет [МГУ]
им. М.В. Ломоносова, 2004. (2 экз.)
3. Романовский
Математическое моделирование в биофизике. Введение в
теоретическую биофизику / Н. В. Степанова, Д. С. Чернавский ; Романовский. - Изд. 2е, доп. - Москва : Институт компьютерных исследований, 2004. - 472 с. (1 экз.)
4. Рубин, А. Б. Биофизика / А. Б. Рубин. - [2-е изд., испр. и доп.]. - Казань : Книжный дом
"Университет". Том 2 / А. Б. Рубин. - 2000. - 467 с. (2 экз.)
Дополнительная литература:
5. А.Б.Рубин.Биофизика. т.1. Теоретическая биофизика. Учебник для вузов. 2-е изд.
Книжный дом «Университет», Москва, 1999, 448с.
6. А.Б.Рубин. Биофизика. т.2. Биофизика клеточных процессов. Учебник для вузов. 2-е
изд. Книжный дом «Университет», Москва, 2000, 468с.
7. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1990. – 350 с.
8. Д.Уэстли. Ферментативный катализ. М.-Мир, 1972, стр. 34-100, 121-177.
9. Кантор С.Р., Шиммел П.Р. "Биофизическая химия", т. 1
10. Владимиров В. Л., Фотохимия и люминесценция белков, Наука, М., 1965, стр. 113-120,
140-144.
11. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических
процессов. М.: Высш. шк., Барсуков О.А., Барсуков К.А. Радиационная экология. М.:
Научный мир, 2003. – 253 с.
12. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М.:
ФИЗМАТЛИТ, 2003. – 442 с
13. Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Основы радиационной биофизики. - М.: Изд-во МГУ,
1982. - 304 с.
14. Пивоваров Ю.П., Михалев В.П. Радиационная экология: учебное пособие для высших
учебных заведений. М.: Издательский центр «Академия», 2004 г. – 240 с.
15. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. – М., Мир, 1997.
16. Методы исследования биологических процессов 1. Стационарная и не стационарная
кинетика ферментативных реакций. Специфичность //Метод. указания, Красноярск.
Сибирский Федеральный Университет, 2007
17. Суковатая И.Е., Кратасюк В.А. Кинетические методы исследования биологических
процессов 2 //Определение кинетических параметров и типов взаимодействия
ферментов с эффекторами: метод. указания, Красноярск. Сибирский Федеральный
Университет, 2007
18. Сердюк И. Методы в молекулярной биофизике: структура, функция, динамика:
учебное пособие: в 2 т. Т1/ И. Сердюк, Н. Заккаи. Дж. Заккаи - М: КДУ, 2009. – 568 с.
19. Ремизов А. Н., Максина А.Г., Потапенко А.Я. Медицинская и биологическая физика. –
М.:Дрофа, 2005. – 558 с.
20. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. – М.: Мир, 1980. – 581 с.
21. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. – М: Мир, 1986 –
496 с.
22. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: Пер. с англ.– М.: Мир, 1984.- Т.2 – 496 с.
23. Современные методы биофизических исследований: Практикум по биофизике: Учеб.
пособие для биол. спец. вузов / А.А. Булычев, В.Н. Верхотуров, Б.А. Гуляев и др.; Под
ред. А.Б. Рубина. – М.: Высш.шк., 1988. – 359 с.
24. СТО 4.2-07-2010 «Система менеджмента качества. Общие требования к построению,
изложению и оформлению документов учебной и научной деятельности»
[текст]/разраб.: Т. В. Сильченко, В. К. Младенцева, Л. В. Белошапко. – Введ.
впервые 22.10.2010 г. – Красноярск : ИПК СФУ, 2010. – 57 с.
25. А.В.Финкельштейн, О.Б.Птицын. Физика белка. Книжный дом «Университет»,
Москва, 2002, 376с.
26. Э.Корниш-Боуден. Основы ферментативной кинетики. М.-Мир, 1979, стр. 36-77, 102161, 213-221, 232-266.
27. В.Уильямс, Х.Уильямс. Физическая химия для биологов. М. Мир, 1976, стр.354-361.
28. И.В.Березин, А.А.Клесов. Практический курс химической и ферментативной
кинетики. М.-МГУ, 1976, стр.284-292.
29. Биосенсоры: основы и приложения. Под ред. Э. Тёрнера, И. Карубе, Дж. Уилсона.
30. Максимов М.Т., Оджагов Г.О. Радиоактивные загрязнения и их измерение. - М.:
Энергоатомиздат, 1989. - 304 с.
31. Радиация. Дозы, эффекты, риск. - М.: Мир, 1988. - 79 с.
32. Ярмоненко С.П., Вайсон А.А. Радиобиология человека и животных: учебное пособие.
– М.: Высшая школа, 2004. – 549 с.
33. Иммобилизованные ферменты. / под ред. И. В. Березина и др. – М., 1976.
34. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании
биологических мембран. – М., Наука, 1980
35. . Введение в биомембранологию: Учеб. пособие /Под ред. Болдырева А.А. – М., Изд-во
МГУ, 1990.
36. Экологическая биофизика : научно-педагогическое издание : в 3 т. Т. 1 Фотобиофизика
экосистем / под общ. ред. И. И. Гительзон, Н.С. Печуркин. – М.: Логос, 2001.–350 с.
Практическое занятие №2
ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ НА
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ
1. ТЕОРИТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.1. Роль различных взаимодействий в стабилизации пространственной
структуры белков.
В настоящее время получены бесспорные доказательства, что в стабилизации
пространственной структуры белков, помимо ковалентных связей (пептидные и
дисульфидные связи), основную роль играют так называемые нековалентные связи. К
этим связям относятся водородные связи, электростатические взаимодействия
заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, взаимодействия
неполярных боковых радикалов аминокислот, так называемые гидрофобные
взаимодействия и т. д. (Рис. 1).
По современным представлениям, третичная структура белка после завершения его
синтеза в рибосомах формируется совершенно автоматически, самопроизвольно и
полностью предопределяется первичной структурой. Основной движущей силой в
возникновении трёхмерной структуры является взаимодействие радикалов аминокислот с
молекулами воды. При этом неполярные гидрофобные радикалы аминокислот как бы
погружаются внутрь белковой молекулы, образуя там сухие зоны, в то время как
полярные радикалы оказываются ориентированными в сторону воды. В какой-то момент
возникает термодинамически наиболее выгодная стабильная конформация молекулы. В
такой форме белковая молекула характеризуется минимальной свободной энергией.
а – электростатическое взаимодействие; б – водородная связь; в – гидрофобные
взаимодействия неполярных групп; г – диполь-дипольные взаимодействия; д –
дисульфидная (ковалентная) связь.
Рис. 1. Типы нековалентных связей, стабилизирующих третичную структуру белка.
Эффект взаимодействия полярных групп белка с полярными молекулами воды
связан как с преобладанием полярных аминокислотных остатков на поверхности белковой
глобулы, так и с взаимодействием посредством водородных связей полярных пептидных
связей (NH-OC), принадлежащих разным участкам цепи внутри глобулы. Так как энергия
водородных связей между пептидными связями в белке и между ними и водой примерно
одинакова, это должно было бы приводить к рыхлой структуре макромолекулы в водном
растворе. Однако реально существующая структура белков упорядочена и компактна и
определяется, в основном, гидрофобными взаимодействиями, при реализации которых
важную роль играет вода.
1.2. Органические растворители и их влияние на каталитические
свойства ферментов.
Органические растворители представляют собой вещества органического
происхождения, обладающие способностью растворять различные соединения. В
химическом отношении органические растворители могут относиться к различным
классам веществ. Это, прежде всего, углеводороды и их галогенопроизводные, спирты,
простые и сложные эфиры, кетоны, нитросоединения. Органические растворители очень
широко применяются в производстве пластмасс, лаков и красок, синтетических волокон,
смол, клеев, в полиграфии, резиновой промышленности, при экстракции растительных
жиров, для химической чистки одежды; кроме того, их используют для очистки
химических соединений перекристаллизацией, при хроматографическом разделении
веществ, для создания определённой среды и т. д.
Применительно к белковым молекулам введение органических растворителей в
реакционные среды ферментов вызывает изменения каталитической активности за счёт
изменения микроокружения. Органические растворители ослабляют гидрофобные связи,
поскольку при разбавлении ими воды среда, окружающая взаимодействующие группы,
уже в меньшей степени отличается от неполярных групп. Ослабление гидрофобных
взаимодействий приводит к нарушению нативной конформации молекулы белка и
экспонированию в растворитель гидрофобных участков молекулы. Кроме того, при
введении органических растворителей в реакционные смеси ферментов наблюдается
объёмный электростатический эффект, связанный с понижением или повышением
диэлектрической проницаемости среды. Так, например, ацетон, этанол, метанол,
этиленгликоль уменьшают диэлектрическую константу среды (ε), а формамид – напротив,
увеличивает диэлектрическую константу.
В среде органических растворителей ферменты, в конечном итоге, теряют
каталитическую активность за счет денатурации. К основным механизмам денатурации
белка органическими растворителями следует отнести разрушение нативных
гидрофобных взаимодействий, а также нарушение системы водородных связей в белке.
Также одним из главных механизмов необратимой инактивации является агрегация,
которая в системах с органическими растворителями, уменьшающими диэлектрическую
проницаемость
среды, реализуется
через
межмолекулярные взаимодействия
электростатической природы.
Переход от водных растворов к водно-органическим смесям может приводить как к
монотонному снижению каталитической активности, так и к активации фермента по
сравнению с «водным» уровнем (обычно в интервале концентраций до 25 об.%). Процесс
увеличения ферментативной активности связан с ослаблением гидрофобных
взаимодействий в реакционной среде и увеличением подвижности гидрофобных
аминокислотных остатков. Также в значительной степени активация зависит от изменения
электростатических взаимодействий.
Присутствие в среде органических растворителей оказывает влияние на
каталитические стадии и на процесс образования фермент-субстратного комплекса.
Влияние органического растворителя на процесс связывания фермента с субстратом
двояко. Во-первых, органические растворители могут непосредственно влиять на
эффективность контакта участников биокаталитической реакции, поскольку связывание
осуществляется за счёт нековалентных взаимодействий (электростатических и
гидрофобных). При этом определяющим становится характер таких взаимодействий: при
гидрофобном связывании величина константы Михаэлиса Km при переходе от водных
растворов к водно-органическим смесям обычно возрастает, при электростатическом –
уменьшается. Во-вторых, присутствие органических растворителей изменяет
растворимость субстрата и его распределение в системе; при этом гидрофильные
субстраты концентрируются у поверхности фермента, а гидрофобные преимущественно
локализованы в объёме растворителя.
1.3. Биферментная система светящихся бактерий NADH:FMNоксидоредуктаза-люцифераза.
Биферментная система светящихся бактерий, применяемая in vitro, состоит из двух
ферментов: люциферазы и NADH:FMN-оксидоредуктазы.
Бактериальная люцифераза катализирует реакцию окисления длинноцепочечных
алифатических альдегидов при участии восстановленного флавинмононуклеотида, одним
из продуктов реакции является излучение света в сине-зеленой области спектра (490 нм).
Обобщённая схема реакции имеет вид:
FMNH2 + RCHO + O2 → FMN + RCOOH + H2O + hν.
(1)
Время, требуемое для одного каталитического цикла люциферазы, намного
больше, чем время жизни субстрата FMNH2, который автокаталитически окисляется
растворённым кислородом менее чем за 1 секунду. Поэтому для достижения
стационарной
кинетики
биолюминесценции
применяют
различные
методы
восстановления FMN до FMNH2, такие как фотовосстановление, восстановление при
помощи химических агентов.
Также для обеспечения восстановленным флавинмононуклеотидом широко
применяется сопряжение люциферазной реакции с реакцией, катализируемой
NADH:FMN-оксидоредуктазой:
NADH + FMN + H+ → NAD+ + FMNH2.
(2)
В присутствии оксидоредуктазы число оборотов люциферазы увеличивается, что
позволяет наблюдать длительное свечение.
Схема бактериальной биолюминесцентной реакции представлена на рисунке 2.
Рис. 2. Биолюминесцентная реакция, катализируемая бактериальной люциферазой
Несмотря на незначительные различия в структуре люцифераз различных видов
бактерий все они представляют собой αβ-гетеродимер, состоящий из двух гомологичных
субъединиц (α и β), молекулярная масса которых соответственно 40 и 35 кДа (Рис. 3).
Изгибы α- и β-субъединиц очень похожи, оба принимают форму скрученного бочонка
([β/α]8). Две субъединицы связаны большой соприкасающейся поверхностью. Активный
центр фермента расположен, главным образом, на α-субъединице.
Рис. 3. Третичная структура бактериальной люциферазы (Vibrio harveyi)
NADH:FMN-оксидоредуктаза является гомодимером, состоящим из двух
одинаковых полипептидных цепей длиной 218 аминокислотных остатков (Рис. 4).
Молекулярная масса NADH:FMN-оксидоредуктазы составляет 50 кДа.
Рис. 4. Третичная структура NADH:FMN-оксидоредуктазы (Vibrio fischeri)
В мировой практике биферментная реакция светящихся бактерий используется,
главным образом, для разработки специфических методов анализа различных
метаболитов и активности ферментов. Кроме того, ферментативные системы светящихся
бактерий используют в качестве тест-объекта для определения интегральной токсичности
различных сред. Различные варианты сопряжения ферментативных реакций с
бактериальной биолюминесценцией позволили создать комплекс ферментативных тестов,
чувствительных к различным группам поллютантов.
Цель работы:
Исследовать влияние органических растворителей на функционирование
биферментной системы светящихся бактерий NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза
на примере этанола.
Задачи:
1) Определить зависимость интенсивности свечения биферментной
системы
NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза
от
концентрации этанола в реакционной смеси.
2) Охарактеризовать полученную зависимость исходя из механизмов
действия органических растворителей на белковые макромолекулы.
3) Оценить концентрацию этанола, при которой наблюдается
максимальная
активация
интенсивности
свечения
(Ca),
концентрацию этанола, при которой происходит потеря половины
ферментативной активности (C50).
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе используются лиофилизированные препараты высокоочищенных
ферментов
(комплект
реактивов
аналитической
биолюминесценции, КРАБ),
произведённые в лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции Института
биофизики СО РАН (Красноярск). Один флакон лиофилизированного препарата содержит
0,5 мг люциферазы (L) EC 1.14.14.3 из рекомбинантного штамма Escherichia coli
(Photobacterium leiognathi) и 0,15 ед. активности NADH:FMN-оксидоредуктазы (R) EC
1.5.1.29 (Vibrio fischeri). Во флакон с препаратом ферментов вносится 3 мл 0,05 М калийфосфатного буфера, раствор во время измерений хранится на льду.
В работе используются следующие реактивы: NADH и FMN («Serva», Германия),
тетрадеканаль («Merck», Германия), 96 % этанол. Для приготовления растворов
используется 0,05 М калий-фосфатный буфер pH 6,8.
Состав реакционной смеси для измерения интенсивности биолюминесценции:
1) (500-X) мкл буфера;
2) X мкл этанола;
3) 5 мкл раствора КРАБа;
4) 50 мкл 0,0025 % раствора тетрадеканаля;
5) 10 мкл 0,5 мМ раствора FMN;
6) 100 мкл 0,1 мМ раствора NADH.
При этом количество добавляемого этанола (X мкл) принимает значения: 0, 5, 10,
20, 40, 70, 100.
Интенсивность биолюминесценции регистрируется на биолюминометре Lumat LB
9507 («Berthold Technologies», Германия).
3. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
1) Приготовить необходимые растворы. Для получения 0,0025 %
раствора тетрадеканаля необходимо добавить к 5 мл буфера 50 мкл
0,25 % спиртового раствора тетрадеканаля. Для получения раствора
NADH концентрации 0,1 мМ необходимо взвесить на
аналитических весах 0,0007 г NADH и добавить к этой навеске 10
мл буфера.
2) Включить компьютер и прибор, на компьютере включить
программу WinTerm.
3) Произвести
измерения
интенсивности
биолюминесценции
биферментной системы NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза в
присутствии в реакционной смеси различного количества этанола.
Для измерения поместить в пластиковую кювету с помощью
микропипеток со сменными наконечниками в указанном для
реакционной смеси порядке (1-6) указанные объёмы растворов
реактивов,
кювету
поместить
в
кюветное
отделение
биолюминометра и зарегистрировать максимальное значение
интенсивности свечения. Измерение каждой экспериментальной
точки повторить 3 раза.
4) Построить
зависимости
интенсивности
биолюминесценции
биферментной системы NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза
от концентрации этанола, выраженной в объемных %, и от
молярной концентрации этанола. Для расчёта концентраций
воспользоваться алкоголеметрическими таблицами. При этом
учесть, что в работе использовался 96 %-ый по массе водный
раствор этанола.
5) Охарактеризовать полученную зависимость исходя из механизмов
действия органических растворителей на белковые макромолекулы.
6) Оценить концентрацию этанола (в об.% и М), при которой
наблюдается максимальная активация интенсивности свечения (Ca).
7) Оценить концентрацию этанола (в об.% и М), при которой
происходит потеря половины ферментативной активности (C50).
8) Составить отчет по проделанной работе, который должен
содержать:
графики
зависимостей
интенсивности
биолюминесценции биферментной системы от концентрации
этанола, выраженной в объемных %, и от молярной концентрации
этанола; схему расчёта концентраций этанола; характеристику
полученной зависимости; рассчитанные значения Ca и C50.
4. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1) Какие виды взаимодействий, стабилизирующих пространственную
структуру белков, вы знаете? Охарактеризуйте механизмы, лежащие
в основе данных взаимодействий.
2) Что такое органические растворители?
3) Какое действие оказывают органические растворители на
пространственную структуру белков?
4) За счёт чего происходит ослабление гидрофобных взаимодействий в
присутствии органических растворителей?
5) Почему при добавлении органических растворителей изменяются
электростатические взаимодействия?
6) Что представляет собой биферментная система светящихся
бактерий NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза?
7) Каково практическое значение биферментной системы светящихся
бактерий?
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1) Суковатая, И.Е. Кинетика биолюминесцентной реакции в
нетрадиционных средах: автореф. дис. канд. биол. наук / И.Е.
Суковатая. – Красноярск: ИБФ СО РАН, 2000. – 23 с.
2) Березов, Т.Т. Биологическая химия: Учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф.
Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.
3) Рубин, А.Б. Биофизика: в 2 т. Т. 1: Теоретическая биофизика / А.Б.
Рубин. – М.: МГУ, 2004. – 448 с.
4) Днепровский, А.С. Теоретические основы органической химии /
А.С. Днепровский, Т.И. Темникова. – Л.: Химия, 1991. – 560 с.
5) Гладилин, А.К. Стабильность ферментов в системах с
органическими растворителями / А.К. Гладилин, А.В. Левашов //
Биохимия. – 1998. – Т. 63. – Вып. 3. – С. 408-421.
6) Roda, A. Bioluminescence in analytical chemistry and in vivo imaging /
A. Roda, M. Guardigli, E. Michelini, M. Mirasoli // Trends in Analytical
Chemistry. – 2009. – V. 28. - № 3. – P. 307-322.
7) Roda, A. Biotechnological applications of bioluminescence and
chemiluminescence / A. Roda, P. Pasini, M. Mirasoli, E. Michelini, M.
Guardigli // Trends Biotechnol. – 2004. – V. 22. – P. 295-303.
8) Kratasyuk, V.A. The use of bioluminescent biotests for study of natural
and laboratory aquatic ecosystems / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova,
M.I. Gladyshev, E.B. Khromichek, A.M. Kuznetsov, E.A. Ivanova //
Chemosphere. – 2001. – V. 42. - № 8. – P. 909-915.
9) Кратасюк, В.А. Использование светящихся бактерий в
биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон //
Успехи микробиологии. – 1987. - № 21. – С. 3–30.
Практическое занятие №3
СПЕКТРАЛЬНО-ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ РАЗРЯЖЕННОГО ФОТОПРОТЕИНА
ОБЕЛИНА
1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Фотопротеин представляет собой стабильный фермент-субстратный комплекс,
состоящий
из
белка и
«преактивированного» кислородом субстрата, 2гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком внутри
гидрофобной полости. Добавление ионов кальция к фотопротеину инициирует
биолюминесцентную реакцию, в ходе которой происходит окислительное
декарбоксилирование связанного с белком субстрата и излучение фотона света (рис.1).
Благодаря этому свойству фотопротеины успешно используют как индикаторы ионов
кальция в биологических и медицинских исследованиях. Продукт биолюминесцентной
реакции – комплекс белка с целентерамидом – принято называть разряженным
фотопротеином. Также существует Са2+-независимая биолюминесценция, результатом
которой является образование разряженного фотопротеина в отсутствии ионов кальция
под воздействием различных физико-химических факторов, например температуры.
Одним из наиболее изученных фотопротеинов является обелин, выделенный из
гидроидного полипа Obelia longissima.
Рис. 1. Схема биолюминесцентной реакции фотопротеина обелина
В настоящее время используют рекомбинантные фотопротеины полученные генноинженерными методами: кДНК фотопротеина клонируется и экспрессируется в клетках
E.coli. Полученный, таким образом, белок эффективно превращается в фотопротеин
инкубированием с синтетическим субстратом – целентеразином – и кислородом в
буферном растворе в присутствии восстановителей (меркаптоэтанола или дитиотриетола).
Полученные in vitro рекомбинантные фотопротеины близки по свойствам к природным.
Биолюминесценция фотопротеинов наблюдается в диапазоне длин волн 465-495 нм
и зависит от организма, из которого фотопротеин выделен. Например, акворин имеет
максимум биолюминесценции при 465 нм, тогда как обелин из O. longissima – при 485 нм.
Фотопротеины, связанные с 2-гидропероксицелентиразином, не флуоресцируют при
фотовозбуждении, но проявляют яркую флуоресценцию после реакции, оставаясь
связанными с продуктом реакции – целентерамидом. Для акворина максимумы
фотолюминесценции Са2+-разряженного белка и биолюминесценции близки. В то же
время, фотолюминесценция Са2+-разряженного обелина сдвинута по сравнению с
биолюминесценцией в длинноволновую область и наблюдается при 510 нм.
1.1. Термоинактивация рекомбинантного обелина
Установлено, что в фотопротеине обелине протекает реакция окисления
целентеразина под действием температуры в отсутствии ионов Са2+. Продукт реакции
называется
терморазряженным
обелином.
Зависимость
интенсивности
биолюминесценции фотопротеина от времени инкубации приведена на рисунке 2, из
которого видно, что при температуре 20°С активность не меняется в течение часа.
○- 20°С; Δ - 30°С; - 40°С; □ - 50°С; L – интенсивность люминесценции,
Lmax – интенсивность люминесценции в начальный момент времени
Рис. 2. Инактивация рекомбинантного обелина в зависимости от температуры и
времени инкубации
При комнатной температуре (18-20°С) активность белка сохраняется в течение
суток, а при хранении в холодильной камере (около 4°С) – в течение нескольких месяцев.
При инкубации в течение часа при 30°С активность теряется на 15-18 %. Повышение
температуры до 40°С приводит к резкому снижению активности белка за это же время (на
95 %), а при 50°С уже через 30 минут остается только 3% от первоначальной активности.
Падение активности обелина хорошо аппроксимируется экспонентой, т.е. процесс
инактивации подчиняется кинетике мономолекулярной реакции:
kin
Об
Обin.
(1)
Более подробно ознакомиться с теоретическими основами данной работы следует,
используя литературные источники, указанные в п.5 данного пособия.
Цель
работы:
выявить
особенности
спектральных
характеристик
фотолюминесценции фотопротеина обелина, разряженного под действием температуры
(терморазряженный обелин), в зависимости от длины волны возбуждения и при
добавлении ионов кальция.
Задачи:
1. Построить спектры испускания терморазряженного обелина при разных длинах
волн возбуждения.
2. Построить спектры испускания терморазряженного обелина, полученные при
различных концентрациях кальция.
3. Построить спектр возбуждения терморазряженного обелина при различных
концентрациях кальция.
4. Сравнить спектры испускания терморазряженного обелина (полученные при
различных концентрациях ионов кальция) при фиксированной длине волны
возбуждения. Выявить наличие или отсутствие изменений.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе используется препарат фотопротеина обелина, который был
предварительно инкубирован при температуре 40 0С в течение 18 ч (Собелина = 0,5 мг/мл).
Спектры фотолюминесценции регистрировали на люминесцентном спектрометре
LS55 PerkinElmer. Параметры регистрации спектров испускания: диапазон длин волн 200900 нм, диапазон длин волн возбуждения варьировался от 250 до 400 нм, диапазон
напряжений 790 В, скорость сканирования 7 нм/с, размер щели 4 нм.
Были сняты спектры фотолюминесценции при добавлении хлорида кальция в
ферментативную систему. Концентрация хлорида кальция в кювете:
1) 7▪10-7 М; 2) 4,9▪10-6 М; 3) 2,5▪10-5 М; 4) 8,5▪10-5 М; 5) 0,039 М
3. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ
Все спектры предварительно сгладить с помощью математического пакета Origin 8.5.1 и
убрать двойные лучепреломления с помощью Matlab или Origin 8.5.1.
1) - построить на одном графике реальные спектры испускания терморазряженного
обелина при разных длинах волн возбуждения;
- построить на одном графике нормированные спектры испускания
терморазряженного обелина при разных длинах волн возбуждения.
2) Построить реальные и нормированные спектры испускания терморазряженного
обелина при одной концентрации кальция, но при разных длинах волн
возбуждения.
3) Построить реальные и нормированные спектры испускания терморазряженного
обелина при разных концентрациях кальция, но при одной длине волны
возбуждения.
4) - построить реальные спектры возбуждения терморазряженного обелина при
разных концентрациях кальция;
- построить нормированные спектры возбуждения терморазряженного обелина при
разных концентрациях кальция. Сравните спектры.
По результатам проделанной работы составьте отчет (презентацию).
3.1. Работа с программой Origin 8.5.1
Алгоритм для того чтобы убрать двойные лучепреломления с помощью Origin 8.5.1.:
1) Удалите часть данных спектра, где есть двойные лучепреломления. Скопируйте
оставшиеся данные и вставьте их в Origin 8.5.1.
2) Постройте график и зайдите в Analusis→Mathematies→Interpolate/Extrapolate→open
Dialog.
3) Выберите подходящий метод. Выставите точное количество недостающих точек и
установите диапазон интерполяции.
4) Поставьте галочку на Auto Preview. Это позволит просмотреть, как будет проходить
интерполяция, если вам такая интерполяция не подходит, то поменяйте метод.
5) Нажмите ОК. В данных скопируйте недостающий диапазон чисел и достройте
спектр.
4. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1) Что такое люминесценция, на какие виды она подразделяется по способу возбуждения и
по длительности послесвечения?
2) Приведите основные характеристики люминесценции и ее законы, в чем заключается
люминесцентный анализ и каковы его преимущества?
3) Что такое фотопротеин? Какими способами можно получить разряженный фотопротен?
4) Различаются ли спектры испускания терморазряженного обелина от длины волны
возбуждения?
5) Различаются ли спектры испускания при одной волне возбуждения, но при различной
концентрации кальция? В чем заключаются различия.
6) Различаются ли спектры возбуждения терморазряженного обелина от концентрации
ионов кальция?
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1) Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С.
Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Журн. молекулярной биологии. – 2006. – Т.
40. С. 404-417.
2) Введение в спектральный и люминесцентный анализ: Учеб.-метод. посо-бие / В.Г.
Лещенко.-Мн.: БГМУ, 2002.– 37 с.
3) Основы флуоресцентной спектроскопии/ Дж. Лакович. – М.: Мир, 1986. – 496 с.
4) Discharged photoprotein obelin: Fluorescence peculiarities / N.V. Belogurova, N.S.
Kudryasheva // J. of Photochemistry and Photobiology B: Biology. – 2010. - № 101. – Р.
103–108.
Практическое занятие №4
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОСНОВНЫХ ПИГМЕНТОВ
ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА В ЛИСТЬЯХ ВЫСШИХ
РАСТЕНИЙ
1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.1. Фотосинтез.
Процесс фотосинтеза – образование органического вещества из неорганических
соединений – играет огромную роль в энергетике биосферы. За счет фотосинтеза
обеспечиваются потребности человечества в запасах пищи, топлива, кислорода, а также
сырья для разных отраслей промышленности. Суммарное уравнение фотосинтеза
растений следующее:
CO2 + 2H2O hν {CH2O} + O2 + H2O
∆H ≈ 112 ккал/моль-1,
{CH2O} – фрагмент молекулы углевода.
В химическом аспекте это реакция синтеза сложных органических веществ из
простых соединений – воды и углекислоты, которая, в отличие от других биохимических
реакций синтеза, протекает за счет энергии света. С термодинамической точки зрения это
реакция эндергоническая и идет с запасанием энергии.
Фотосинтез
зеленых
растении
представляет
собой
окислительновосстановительную реакцию, в которой 4 электрона переносятся «вверх» против
термодинамического потенциала, преодолевая разность потенциалов 1,2 В (см. схему).
Движущей силой при этом служит энергия света.
Однако не у всех фототрофов источником водорода при фотосинтезе служит вода.
У фотосинтезирующих микроорганизмов в качестве донора водорода используются
другие водородсодеращие вещества, например, органические кислоты и неорганические
соединения серы. Поэтому в наиболее общем виде итоговая реакция фотосинтеза
выглядит так:
CO2 + 2H2D = {CH2O} + 2D + H2O,
где D – донор электронов.
Преобразование поглощенной энергии света осуществляется в серии
последовательных реакций и может быть подразделено на три этапа: 1) поглощение света
пигментами и образование возбужденных молекул; 2) первичные фотохимические
реакции, в которых принимают участие возбужденные молекулы пигментов. На этом этапе
происходит трансформация энергии, преобразование энергии возбужденного состояния в
химическую; 3) химические темновые реакции, в которых участвуют продукты
фотохимических реакций. На этой стадии происходит дальнейшая стабилизация
первичных фотопродуктов и преобразование их в стабильные химические соединения.
Необходимыми компонентами фотосинтезирующих систем являются пигменты,
которые служат первичными фоторецепторами в процессе фотосинтеза. Пигменты – это
соединения, избирательно поглощающие свет в видимой части солнечного спектра. При
освещении белым светом их окраска определяется теми лучами, которые они отражают
или пропускают. Поглощение пигментами световой энергии обусловлено наличием в их
молекуле хромофорных групп. Хромофорные группы представляют собой систему
сопряженных двойных связей, включающие большое число легко возбуждаемых светом πэлектронов. Для перехода π-электронов в возбужденное состояние достаточно энергии
квантов видимой области спектра. Все пигменты фотосинтезирующих организмов обычно
подразделяют на три группы: хлорофиллы и фикобелинпротеиды –пигменты
тетрапиррольной природы, а также каротиноиды.
У всех эукариотных растений пигменты локализованы в хлоропластах – в
органоидах клетки, которые являются центрами превраения солнечной энергии. У
прокариотных водорослей и фотосинтезирующих бактерий хлоропластов нет. Пигменты,
принимающие участие в фотосинтезе, у них локализованы в мембранных структурах –
тилакоидах и ламеллах.
1.2. Хлорофиллы.
Все фотосинтезирующие организмы содержат эти зеленые пигменты. По своей
природе хлорофиллы являются Mg-порфиринами. Центральным атомом, связывающим
четыре пиррольных кольца (I – IV), служит Mg. В результате образуется большое
порфириновое кольцо с сопряженными по кругу двойными связями. Чередующиеся
ординарные и двойные связи включают множество делокализованных π-электронов,
которые принимают участие в поглощении света. Кроме того, в структуре хлорофилла
имеется одно циклопентановое кольцо (V), которое включает высокоактивную в
химическом отношении кетогруппу, которая участвует в образовании ассоциатов молекул
хлорофилла и комплексов пигмента с молекулами воды.
Длинная углеводородная цепь (остаток фитола), присоединенная к порфириновой
части молекулы хлорофилла обладает липофильными свойствами. Фитольный остаток
служит своего рода неполярным якорем, с помощью которого молекулы хлорофилла
взаимодействуют с липидами и гидрофобными белками. Все это имеет значение для
создания определенной пространственной ориентации молекул хлорофилла и
поддержания структуры хлоропластов.
Рис. 1. Хлорофиллы a (А) и b (Б).
В настоящее время известно около 10 пигментов, входящих в группу хлорофиллов
и отличающихся друг от друга некоторыми структурными особенностями. Наиболее
распространены среди них хлорофиллы a, b (рис. 1) и бактериохлорофилл. Хлорофилл a
входит в состав пигментного аппарата всех фототрофов, кроме фотосинтезирующих
бактерий, содержащих бактериохлорофиллы. Хлорофилл b, который находится
вхлоропластах высших растений и в зеленых водорослях, отличается от хлорофилла a тем,
что вместо –CH3 у 3-го углеродного атома (в II кольце) имеется –COH-группа.
Порфириновое кольцо хлорофилла поглощает красные и сине-фиолетовые лучи,
пропуская значительную часть зеленых (рис. 2). Этим объясняется зеленый цвет
хлорофилла. Именно молекулы хлорофилла a (у растений) и бактериохлорофилла a (у
фотосинтезирующих бактерий) являются теми пигментами, которые непосредственно
входят в реакционный центр фотосинтеза и принимают участие в преобразовании
световой энергии. Остальные хлорофиллы служат «антеннами». Они поглощают энергию
света и передают ее к хлорофиллу a или бактериохлорофиллу a.
Рис. 2. Спектры поглощения хлорофиллов a, b и каротиноидов.
1.3. Фикобилинпротеиды.
Фикобилинпротеиды (билихромпротеиды) – водорастворимые пигменты красного
или голубого цвета. Они входят в состав пигментных систем сине-зеленых и красных
водорослей, а также криптофитов. Хромофорами фикобилинпротеидов являются
фикоцианобилин (рис. 3) и фикоэритробилин, состоящие из четырех пирролных колец,
которые образуют открытую, не содержащую металла цепь. По химической структуре
фикобилины близки к желчным пигментам. Хромофорные группы фикобилинов очень
прочно связаны с белком, и для их отщеплении требуются жесткие воздействия,
приводящие к рузрушению ковалентных связей между белком и хромофором.
Конфигурация π-электроной системы фикобилинов отличается от циклической системы
хлорофилла, что определяет отличие спектров поглощения у данных групп пигментов.
Фикобилины поглощают световую энергию в зеленой и желтойобластях спектра.
Поглощенную световую энергию они с высокой эффективностью передают к
фотохимически активным формам хлорофилла a.
Рис. 3. Фикоцианобилин.
1.4. Каротиноиды.
Каротиноиды – большая группа пигментов желтого, оранжевого и красного цвета.
В настоящее время их найдено больше 300. Однако непосредственно в фотосинтезе
участвуют лишь некоторые их них. физиологическая роль многих каротиноидов еще не
выяснена. По химическому составу каротиноиды могут быть разделены на две группы: 1)
каротины – ненасыщенные углеводороды, содержащие только углерод и водород; 2)
ксантофиллы, которые кроме углерода и водорода содержат еще и кислород. Все
каротиноиды представляют собой производные изопрена:
Большая часть каротиноидов имеет молекулу, состоящую из 8 изопреновых
остатков, которые соединены в длинную цепь. Система конъюгированных двойных связей
является хромофорой каротиноидов. Каротиноиды могут быть ациклическими,
моноциклическими (имеющими одно замкнутое кольцо) и бициклическими (имеющими
два кольца). Кольца могут рассматриваться как производные ионона двух типов: αиононовые и β-иононовые (рис.4).
a
b
Рис. 4. Производные ионона: a) α-иононовые; b) β-иононовые.
Формулы некоторых каротиноидов приведены ниже (рис. 5).
a
b
c
Рис. 5. Каротиноиды: a) β-каротин; b) лютеин; c) зеаксантин.
Каротиноиды поглощают свет преимущественно в сине-фиолетовой области
спектра, чем и объясняется их желто-красная окраска. Основными каротиноидами пластид
высших растений и зеленых водорослей являются β-каротин и ксантофиллы лютеин,
виолаксантин и неоксантин. Эти четыре пигмента составляют ~98 % от общего
количества каротиноидов зеленых листьев. Большое разнообразие каротиноидных
пигментов характерно для сине-зеленых водорослей, которые являются первыми
фотосинтезирующими организмами, перешедшими от фоторедукции к фотосинтезу с
выделением кислорода. Состав каротиоидов сине-зеленых водорослей заметно отличается
от пигментного состава высших растений. Из каротиноидных пигментов у них
преобладают β-каротин, эхиненон и миксоксантофилл. Два последних не обнаружены у
других представителей растительного мира. Многообразие каротиноидов у сине-зеленых
водорослей связано с их филогенетическим происхождением, со способностью к
существованию при очень разнообразных, порою экстремальных условиях внешней
среды, с их чрезвычайной эврибионтнотью.
Роль каротиноидов при фотосинтезе полностью не раскрыта. Доказано, что
каротиноиды играют роль вспомогательных пигментов, которые передают энергию
поглощенных квантов хлорофиллу или бактериохлорофиллу. Благодаря этому более полно
используется та часть видимого спектра, которая не поглощает хлорофилл. Во-вторых,
существенное значение в реакциях фотосинтеза имеет защитная функция каротиноидов,
которые, поглощая в области больших энергий, выполняют роль экранов,
предохраняющих хлорофилл и другие биологически активные соединения клетки от
фотодеструкции. В-третьих, возможно, что каротиноиды принимают участие в процессах
выделения кислорода растениями на свету. Было высказано предположение (Сапожников,
1965), что светоиндуцированные взаимопревращения зеаксантина и виолаксантина (так
называемый виолаксантиновый цикл) могут играть роль в выделении O2 при фотосинтезе.
Механизм этого процесса в настоящее время не выяснен.
Из вышеизложенного видно, что наличие разных пигментов обеспечивает
поглощение растениями солнечного света в широком спектральном диапазоне,
эффективную миграцию и локализацию энергии возбуждения на активных центрах. Набор
и содержание пигментов в растениях зависит от систематического положения фототрофов,
от их онтогенетического состояния и условий существования. В процессе эволюции
растения разных местообитаний вырабатывали свой характерный набор пигментов,
позволяющий им при различных условиях существования наиболее эффективно
использовать доступный свет.
Интенсивность и спектральный состав солнечного света, доступные для растений
разных экологических групп, различаются. Травянистые растения в лиственных и
хвойных лесах довольствуются светом, который проникает сквозь кроны деревьев и ярус
кустарников. На долю тропических трав, растущих под тенью раскидистых деревьев и
лиан, проникает едва лишь десятая часть полного дневного света. Даже в посевах одной
культуры на долю нижних ярусов листьев приходится гораздо меньше световой энергии,
чем на долю верхних. При прохождении через толщу листьев уменьшается интенсивность
света, увеличивается доля рассеянного света, инфракрасной и коротковолновой радиации.
С экологической точки зрения виды травяного покрова в лесу относятся к числу
теневыносливых растений. Они лучше растут в затененных местах и часто не встречаются
за пределами леса. К тенелюбивым и теневыносливым относятся многие комнатные
растения (аспидистра, папоротники, плющ, ) которые на своих естественных местах
обитания растут в условиях довольно слабого освещения. Эти растения приспособлены к
меньшей интенсивности света и плохо растут под прямыми солнечными лучами.
Приспособленность растений к определенному световому режиму отражается в их
пигментном аппарате. Хлоропласты в листьях теневыносливых растений крупные и
богаты хлорофиллом. По сравнению со светолюбивыми теневыносливые растения
содержат больше хлорофилла на единицу массы. Их листья имеют насыщенную зеленую
окраску. В связи с этим теневыносливые растения очень эффективно поглощают
доступный им свет. Кроме того, в «теневых» растениях увеличивается содержание
хлорофилла b, сильно поглощающего коротковолновые лучи. В результате этого
соотношение хл a/хл b уменьшается. Если у светолюбивых растений соотношение хл a/хл
b в среднем составляет ~3,5 – 3,9, то у теневыносливых растений оно примерно 2,5.
Теневые растения содержат также относительно много каротиноидов. Хотя эти изменения
в соотношении отдельных пигментов у теневыносливых растений не дают видимых
цветовых эффектов в окраске листьев, их можно рассматривать как явление
«хроматографической адаптации» к существованию растений в определенном световом
экотипе.
Растения гор привыкли к мощному потоку ультрафиолетовых лучей. Альпийские
растения крайне светолюбивы и имеют высокое соотношение хл a/хл b (~5,5). Клеточный
сок многих из них богат антоцианами. Поглощая активный ультрафиолетовый свет, они
предохраняют фотосинтетический аппарат растений от перегрева и фотоокисления.
Приспособленность пигментного аппарата к интенсивности и спектральному
составу света особенно ярко выражена у водных фототрофов. Солнечный свет, проходя
через слой воды, толщиной несколько метров, становится менее интенсивным и синезеленым. Глубоководные водоросли, подобно «теневым»растениям, характеризуются
высоким содержанием пигментов. У бурых и красных водорослей, которые обитают в
глубокой воде, куда проникает мало красных лучей и где преобладает синевато-зеленый
свет, в пигментном аппарате вместе с хлорофиллом содержатся фукоксантин, фикоэритрин
и каротиноиды. Эти пигменты способны поглощать лучи той спектральной области,
которые пропускаются толстыми слоями воды.
Кроме того, для водорослей характерны хроматические изменения, вызванные
фенотипическими причинами (фенотипическая адаптация). Перестройки в пигментном
аппарате водорослей настолько выражены, что изменяется их окраска. Она может
изменяться в зависимости от условий внешней среды: температуры, освещения, среды
питания. Красные водоросли, растущие на поверхности водоемов, часто имеют зеленую
окраску, сине-зеленые водоросли зеленеют в красном свету, синеют – в зеленом, желтеют –
в сине-зеленом и т.д. Изменения окраски водорослей в этом случае связано с
перераспределением соотношения пигментов фотосинтетического аппарата, главным
образом хлорофилла a и фикобилинпротеидов.
Следовательно, пигментный комплекс фототрофов представляет собой сложную и
лабильную систему, которая чутко реагирует на изменение условий внешней среды и
приспособляется к ним в пределах своей наследственно закрепленной программы.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для извлечения пигментов из растительных тканей и их разделения обычно
пользуются смесью полярных (спирт, ацетон) и неполярных (петролейный эфир, гексан,
бензин) растворителей. Так как пигменты быстро выцветают на свету, их экстракцию
проводят в затемненном помещении с предварительно охлажденными растворителями.
Чтобы предотвратить изомеризацию пигментов, экстракцию следует провести возможно
быстрее. Пигменты извлекают последовательно несколькими порциями растворителя,
фильтруя каждый раз раствор пигментов через стеклянный фильтр. При растирании
листьев добавляют небольшое количество MgCO3 или CaCO3 для нейтрализации кислот
клеточного сока и предотвращения феофитинизации пигментов.
Количественное определение пигментов основано на их способности поглощать
лучи определенной длины волн. Регистрацию оптической плотности раствора пигментов
проводят на спектрофотометре. При использовании спектрофотометрии для определения
концентрации хлорофилла a и b в растворе без их разделения вопрос осложняется тем, что
спектры хлорофиллов a и b сильно перекрываются и невозможно найти две длины волны,
в которых поглощение обуславливалось бы полностью одним пигментом. Однако
имеющиеся различия в спектрах поглощения обоих хлорофиллов все же позволяют
выбрать точки, где поглощение одного пигмента заметно превышает поглощение другого.
Это обстоятельство и используется при проведении количественного определения
хлорофилла a и b без их разделения.
В зависимости от природы растворителя, используемого для извлечений пигментов,
их концентрации рассчитываются по следующим формулам:
1)
В 80 %-ном ацетоне (Vernon, 1960):
Ca(мг/л) = 11,63∙D665 – 2,39∙D649,
Cb(мг/л) = 20,11∙D649 – 5,18∙D665;
2)
В 100 %-ном ацетоне (Wettstein, 1957):
Ca(мг/л) = 9,784∙D662 – 0,990∙D644,
Cb(мг/л) = 21,426∙D644 – 4,650∙D662;
3)
В 96 %-ном спирте (Wintermans, De Mots,1965):
Ca(мг/л) = 13,70∙D665 – 5,76∙D649,
Cb(мг/л) = 25,80∙D649 – 7,60∙D665;
Цель работы: оценить состояние фотосинтетического аппарата по содержанию
основных пигментов.
Задачи:
1) отобрать растительный материал для анализа;
2) определить спектрофотометрически содержание хлорофиллов a, b и
каротиноидов в исследуемом материале;
3) рассчитать соотношение хл a/b, показать адаптацию пигментного аппарата
растений к световому режиму окружающей среды.
Объектами исследования могут служить: листья растений разных световых
экотипов; листья или хвоя одного и того же растения, однако растущие при разном
световом режиме (листья внутри кроны, на верхушке побегов и т.д.); листья разного
возраста.
Ход работы. Для решения задачи необходимо провести экстракцию пигментов и
определить на спектрофотометре их концентрацию. Навеску растительного материала
(100 – 200 мг) размельчают ножницами, помещают в маленькую ступку, добавляют на
кончике скальпеля немного MgCO3, приливают 4 – 5 мл 80 %-ного ацетона и тщательно
растирают. Полученную вытяжку сливают по палочке на стеклянный фильтр, вставленный
в колбу Бунзена, соединенную с воздушным насосом. Отсасывают жидкость при помощи
насоса. После этого в ступку приливают еще немного ацетона, растирают, снова вливают
на фильтр и отсасывают. Эту операцию повторяют еще несколько раз, пока раствор,
стекающий из фильтра, не будет абсолютно бесцветным.
Вытяжку переливают в мерную колбу на 25 мл, колбу Бунзена споласкивают
несколько раз небольшими порциями ацетона и доводят чистым ацетоном объем вытяжки
в мерной колбе до метки. Работа количественная, нельзя терять ни одной капли!
Полученная ацетоновая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.
Концентрацию хлорофилла a и b определяют на спектрофотометре. Для этого часть
полученного экстракта наливают в кювету спектрофотометра. Вторую кювету,
заполненную чистым растворителем (80 %-ный ацетон), используют как контрольную.
Кюветы помещают в кюветную камеру спектрофотометра и определяют оптическую
плотность (D) вытяжки при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения
хлорофилла a и b в 80 %-ном ацетоне. Для хлорофилла a в 80 %-ном ацетоне максимум
поглощения в красной области спектра наблюдается при λ = 665 нм, для хлорофилла b –
при λ = 649 нм. Каротиноиды определяют при λ = 440,5 нм. Концентрацию хлорофилла a и
b в вытяжке рассчитывают по формуле Вернона:
Ca(мг/л) = 11,63∙D665 – 2,39∙D649,
Cb(мг/л) = 20,11∙D649 – 5,18∙D665,
где Ca, Cb – концентрация хлорофилла a и b в мг/л.
Для определения концентрации каротиноидов (мг/л) в суммарной вытяжке
пигментов может быть использована формула Веттштейна:
Скар = 4,695∙D440,5 – 0,268(Ca+b),
где Ca+b – суммарное содержание хлорофиллов a и b в растворе (мг/л).
Установив концентрацию пигментов в вытяжке, определяют их содержание в
исследуемом материале с учетом объема вытяжки и навески пробы:
A = V∙C/(P∙1000),
где С – концентрация пигментов в мг/л; V – объем вытяжки в мл (25 мл); P – навеска
растительного материала в г (0,1 – 0,2 г); А – содержание пигмента в растительном
материале в мг/г сырой массы.
3. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1) названия основных фотосинтетических пигментов и их спектральные характеристики;
2) функциональная обусловленность строения молекулы хлорофилла (функции атома Mg,
углеводородного хвоста, часть молекулы ответственная за поглощение квантов света);
3) вывод формулы расчета оптической плотности исследуемого образца;
4) Z-схема фотосинтеза;
5) альтернативные фотосинтетические механизмы (фотосинтез бактерий);
6) влияние внешних условий на содержание основных фотосинтетических пигментов.
4. ТРЕБОВАНИЯ К ПРЕДОСТАВЛЯЕМОМУ ОТЧЕТУ
Отчет по завершенной работе должен быть выполнен в виде презентации,
содержащей в себе информацию об особенностях условий произрастания исследуемого
вида растения в естественной среде и таблицу данных по содержанию основных
пигментов фотосинтетического аппарата нескольких растительных образцов, собранных с
различных участков одного растения, либо с различных растений одного вида, растущих в
неодинаковых условиях по освещенности. Данные должны быть статистически
обработаны: проведен расчет дисперсии, ошибки среднего и критерий Стьюдента. Выводы
относительно состояния фотосинтетического аппарата должны быть сделаны, опираясь на
литературные данные.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ
1. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии
растений. М.: Всш. шк., 1975.
2. Либберт Э. Физиология растений. М.: Мир, 1976.
3. Рубин Б.А. Курс физиологии растений. М.: Высш. шк.,1976.
4. Тарчевский И.А. Основы фотосинтеза. М.: Высш. шк., 1977.
Практическое занятие №5
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ИЗОЛИРОВАННОЙ
ПЕРФУЗИРУЕМОЙ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ\
1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Изолированный перфузируемый орган – уникальная экспериментальная модель для
исследования физиологических и биохимических аспектов реакции организма на любые
воздействия. В связи с особой ролью печени в метаболизме изолированная перфузия этого
органа особенно часто применяется для биохимических исследований [1-3].
Термин «перфузия» в узком смысле слова обозначает ток жидкости или крови через
сосудистое русло органа. Метод перфузии изолированных органов определяется как
поддержание органа, изолированного от организма в жизнеспособном состоянии при
помощи механически поддерживаемой циркуляции искусственной среды через сосудистое
русло. Среда, протекая через орган, приходит в тесный контакт с большим количеством
клеток, приносит питательные вещества и обеспечивает удаление продуктов обмена.
Метод перфузии изолированных органов вошел в арсенал экспериментальных
исследований в физиологии и медицине как удобная модель для изучения функции
органов как в норме, так и при различных воздействиях.
За всю историю существования метода перфузия изолированной печени была
применена для решения множества задач, поэтому исследователями использовались самые
различные виды животных: от привычных лабораторных крыс, кроликов, собак до
миниатюрных мышей, крупных свиней и таких экзотических, как скат. Однако в
настоящее время наиболее совершенной является система для перфузии печени крыс. Этот
орган годится для различных органических, токсикологических и эндокринологических
исследований [4-5].
Изолированная перфузируемая печень крысы очень часто применялась как метод
для исследования действия гормонов. Такие исследования могут быть полезны для
трансплантации, поскольку могут помочь в обеспечении длительного сохранения
жизнеспособности и функциональной активности органа.
Первое описание аппарата для перфузии изолированной печени с целью
наблюдения секреции желчи у кролика относится к 1873 г.
В настоящее время во всем мире наиболее распространена самая простая модель
перфузии – «открытая», «незамкнутая» или нерециркуляционная (рис. 1). Ее
принципиальную схему можно представить следующим образом: есть сосуд, в который
перфузионная смесь, нагнетаемая насосом, втекает в орган, есть сосуд, из которого
оттекающий перфузат попадает, например, в пробирку. При этом поддерживают
температуру и влажность (либо во влажной камере, либо в условиях in situ т.е. «на месте»).
Длительность такой перфузии не превышает 2-3 ч. Чаще всего такие эксперименты
применяют для исследования метаболизма веществ в печени.
Рисунок 1 – Схема нерециркуляционной перфузии
Более сложной и физиологически более приближенной к условиям in vivo является
рециркуляционная перфузия. Здесь используется замкнутый контур циркуляции жидкости,
искусственные легкие – оксигенатор и искусственное сердце - насос. В такой системе уже
можно создавать условия, имитирующие гомеостаз (рис. 2).
Мультиорганные культуры
Рис. 2. Схема рециркуляционной перфузии в мультиорганном варианте
Изолированная перфузируемая печень крысы очень часто применяется как метод
для исследования действия биологически активных веществ. Такие исследования могут
быть полезны для трансплантации, поскольку могут помочь в обеспечении длительного
сохранения жизнеспособности и функциональной активности органа.
1.1. Строение печени крысы
Печень – самая большая железа в теле позвоночных. Большая часть органа
находится в правом подреберье. Печень прикрепляется связками к диафрагме, брюшной
стенке, желудку и кишечнику и покрыта тонкой фиброзной оболочкой – глиссоновой
капсулой. Печень – мягкий, но плотный орган красно-коричневого цвета,
подразделяющийся посредством междолевых вырезок на четыре доли: срединную,
правую, левую и хвостатую. В центре висцеральной поверхности расположены ворота
печени – участок вхождения сосудов, нервов и выхода печеночных протоков [7].
1 – междолевая вырезка
2 – левая доля печени
3 – хвостатая доля печени
4 – пищевод
5 – желудок
6 – селезенка
7 – сальник большой (длинная складка
брюшины, свисающая впереди поперечной
ободочной кишки и петель тонкой кишки в
виде фартука и образованная четырьмя
листками брюшины)
8 – двенадцатиперстная кишка
9 – общий желчный проток
10 – вена порта
11 – правая доля печени
12 – средняя доля печени
Рисунок 3 – Печень крысы
Сложная структура печени прекрасно приспособлена для выполнения ее уникальных
функций. Доли состоят из мелких структурных единиц – долек. Долька состоит из
печеночных клеток – гепатоцитов, расположенных вокруг центральной вены. Гепатоциты
объединяются в слои толщиной в одну клетку – т.н. печеночные пластинки. Они
радиально расходятся от центральной вены, ветвятся и соединяются друг с другом,
формируя сложную систему стенок; узкие щели межу ними, наполненные кровью,
известны под названием синусоидов. Синусоиды эквивалентны капиллярам; переходя
один в другой, они образуют непрерывный лабиринт. Печеночные дольки снабжаются
кровью от ветвей воротной вены и печеночной артерии, а образующаяся в дольках желчь
поступает в систему канальцев, из них – в желчные протоки и выводится из печени.
Воротная вена печени и печеночная артерия обеспечивают печень необычным,
двойным кровоснабжением. Обогащенная питательными веществами кровь из
капилляров желудка, кишечника и нескольких других органов собирается в воротную
вену, которая вместо того, чтобы нести кровь к сердцу, как большинство других вен,
несет ее в печень. В дольках печени воротная вена распадается на сеть капилляров
(синусоидов). Термин «воротная вена» указывает на необычное направление транспорта
крови из капилляров одного органа в капилляры другого (сходную систему
кровообращения имеют почки и гипофиз).
Второй источник кровоснабжения печени, печеночная артерия, несет
обогащенную кислородом кровь от сердца к наружным поверхностям долек. Воротная
вена обеспечивает 75–80%, а печеночная артерия 20–25% общего кровоснабжения
печени. Кровь из обоих источников попадает в конечном итоге в синусоиды, где
смешивается и идет к центральной вене. От центральной вены начинается отток крови к
сердцу через долевые вены в печеночную (не путать с воротной веной печени) [7].
1.2. Функции печени
Переваривание жиров
Печень образует и выделяет желчь. Желчь содержит кислоты, соли, фосфолипиды,
холестерин и пигменты. Соли желчных кислот и свободные желчные кислоты эмульгируют жиры,
чем облегчают их переваривание; превращают жирные кислоты в водорастворимые формы;
обладают антибактериальным действием [7].
Накопительная
Все питательные вещества, всасываемые в кровь из пищеварительного тракта проходят
через печень и в ней перерабатываются. При этом часть аминокислот (фрагментов белков) и часть
жиров превращаются в углеводы.
Биосинтез
В печени синтезируются белки плазмы крови – глобулины и альбумин, а также протекают
реакции превращения аминокислот (дезаминирование и переаминирование).
Регуляторная
Печень участвует в синтезе глюкозы, например из аминокислот (глюконеогенезом), а так
же регулирует ее уровень в крови.
Детоксикация
Лекарства и другие потенциально токсичные соединения могут превращаться в клетках
печени в водорастворимую форму, что позволяет их выводить в составе желчи; они могут также
подвергаться разрушению либо конъюгировать (соединяться) с другими веществами с
образованием безвредных, легко выводящихся из организма продуктов [7].
Способность к регенерации
У печени есть громадный внутренний резерв, она обладает удивительной способностью
восстанавливаться после повреждений, поэтому человек и другие млекопитающие могут выжить
даже после удаления 70% ткани печени [7].
Цель: Выявить динамику ряда физиологических и биохимических показателей
жизнедеятельности изолированной перфузируемой печени крысы.
Задачи:
1. Оценить динамику физиологических параметров (сопротивление сосудов органа,
скорость продукции желчи) изолированной перфузируемой печени крысы.
2. Оценить динамику биохимических параметров (уровень глюкозы в оттекающем
перфузате, уровень молочной кислоты в оттекающем перфузате, уровень мочевины
в оттекающем перфузате) изолированной перфузируемой печени крысы.
3. На основе полученных данных сделать выводы о функционировании печени крысы
в условиях изолированной перфузии.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Метод перфузии
Перфузия изолированных органов, один из наиболее подходящих методов для
исследования висцеральных функций организма. С одной стороны, исключено
интегрирующее влияние со стороны всего организма (исключена нервная система), с
другой – сохранены не только естественная архитектоника тканей (что возможно и в
тканевой культуре), взаимодействие со стромальной тканью, органные кровоток и
лимфоотток с микроциркуляцией и диффузионными потоками, но и более или менее (в
зависимости от условий перфузии) гомеостаз и адекватная «физиологическая» функция
органа [6].
В настоящее время модель изолированной перфузируемой печени используют для
самых различных целей, среди которых исследования глюконеогенеза [8],
эритрообразовательных функций печени, биотрансформации различных веществ [9, 10], а
так же для лечения опухолевых заболеваний [11, 12, 13] и др.
1. Метод определения давления в воротной вене (импеданс сосудов)
Артериальное давление в ходе эксперимента определяли прямым манометрическим
измерением. Единицы измерения – сантиметры водного столба.
2. Метод определения объемной скорости выделения желчи печенью
Объемную скорость желчеотделения во время изолированной перфузии определяли
путем прямого забора оттекающей желчи в мерный цилиндр и расчета изменения объема в
единицу времени.
3. Метод определения потребления кислорода в перфузате
Потребление кислорода органом оценивали путем измерения его напряжения в
оттекающем перфузате потенциометрическим методом.
Потребление кислорода вычисляется по формуле:
П 100 V
(1)
где П – потребление кислорода (мВ), V – показания прибора (мВ).
4. Метод определения концентрации глюкозы в перфузате
Концентрацию глюкозы в перфузате определяли глюкозо-оксидазным методом с
использованием набора «Глюкоза-ФКД» (ООО «Фармацевтика и клиническая
диагностика»).
Расчет концентрации глюкозы в пробах проводили по формуле:
C 10
Eo
Eкол ,
(2)
где С – концентрация глюкозы, ммоль/л; Ео – оптическая плотность опытной пробы, ед.
отн. плотн.; Екол – оптическая плотность калибровочной пробы, ед. отн. плотн.; 10 –
концентрация глюкозы в калибраторе, ммоль/л.
5. Метод определения концентрации мочевины в перфузате
Концентрацию
мочевины
в
перфузате
определяли
уреазным/глутаматдегидрогеназным методом с использованием набора «Мочевина-Витал»
(«Витал Диагностикс Спб»).
Расчет концентрации мочевины в пробах проводили по формуле:
C 13,3
Eo1 Eo 2 Eконтроль1 Eконтроль2
Eкол1 Eкол 2 Eконтроль1 Eконтроль 2 ,
(3)
где С – концентрация мочевины, ммоль/л; Ео1 – оптическая плотность опытной пробы
после 30 секунд инкубации, ед. отн. плотн.; Ео2 – оптическая плотность опытной пробы
после 90 секунд инкубации, ед. отн. плотн.; Екол1 – оптическая плотность калибровочной
пробы после 30 секунд инкубации, ед. отн. плотн.; Екол2 – оптическая плотность
калибровочной пробы после 90 секунд инкубации, ед. отн. плотн.; Еконтроль1 – оптическая
плотность калибровочной пробы после 30 секунд инкубации, ед. отн. плотн.; Еконтроль2 –
оптическая плотность калибровочной пробы после 90 секунд инкубации, ед. отн. плотн.;
13,3 – концентрация мочевины в калибраторе, ммоль/л.
6. Определение концентрации лактата
Концентрация лактата определяется энзиматичетким колориметрическим методом с
использованием набора реагентов серии «Витал-Европа».
Расчет концентрации лактата:
С 3,3
Е пр
Е кол
(4)
где Епр – экстинкция опытной пробы, Екал – экстинкция калибратора, 3,3 – концентрация
молочной кислоты в калибраторе в моль/л.
2.2. Схема установки
В работе используются крысы-самцы Wistar массой тела 200-250г. Операцию
выделения печени проводят под общим тиопентал-натриевым наркозом (100 мг/кг массы
животного). Стабилизацию гемостаза осуществляют внутривенным введением в бедренную
вену гепарина (1000ед/кг массы). Печень после канюлирования воротной вены
инфузируется (под давлением 5-7 см вод. ст.) охлажденным до +10°С раствором Кребса –
Хенселейта. После канюлирования грудного отдела полой вены печень подключают к
установке для перфузии изолированных органов.
Перфузат
Оксигенато
р
Термостат
Насос
О2+СО2
Теплообменник
Термостат
Блок
артериальн
ых датчиков
ОРГАН
Блок
венозных
датчиков
Забор проб
Раствор Кребса – Хенселейта (перфузат, перфузионная среда), заменяющий кровь,
циркулирующая при помощи перистальтического насоса (выполняет функцию сердца)
проходит через оксигенатор (выполняет функцию легких), где он обогащается смесью
кислорода и углекислого газа. Далее перфузат проходит через теплообменник, где он
нагревается до 37С, после чего но проходит через сосудистую систему органа. Блок
артериальных датчиков и блок венозных датчиков регистрируют параметры перфузионной
среды перед ее входом в орган и после него соответственно. Забор проб перфузионной
среды для биохимического анализа осуществляется после органа.
3. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ
Перед началом работы необходимо надеть халат и хирургические перчатки.
Подготовка экспериманта (60 минут)
1. Протереть руки спиртом.
2. Сделать навески согласно стандартным концентрациям солей для раствора Кребса
– Хенселейта.
3. Простерилизовать фильтр под УФ-лампой.
4. Приготовить раствор Кребса – Хенселейта.
5. Отфильтровать раствор Кребса – Хенселейта.
6. Собрать установку для перфузии изолированного органа.
7. Заполнить установку культуральной средой.
8. Поставить внутрибрюшинно в качестве наркоза тиопенталнатриевую инъекцию из
расчета 100мг/кг массы тела животного.
9. Подготовить крысу к операции (положить на операционный стол, протереть
поверхность брюшины («пузо») спитром).
10. Отойти от стола и наблюдать за хирургом.
Перфузия (60 минут + 30 минут операция)
11. Собрать пробы перфузионной среды в течение 60 минут перфузии. Первые полчаса
перфузии пробы забираются каждые 10 минут, затем каждые 5 минут.
12. Записывать в тетрадь показатели перфузии:
сопротивление сосудов [мм.вод.ст.];
напряжение кислорода в оттекающем перфузате [мВ];
продукцию желчи печенью [мм];
температуру перфузата на входе в орган [37С];
значение рН перфузионной жидкости перед входом в орган;
значение рН перфузионной жидкости после прохождения ею сосудистой
системы органа;
Обработка результатов
13. Определить спектрофотометрическим методом экстинкции глюкозы, молочной
кислоты и мочевины в пробах, отобранных за время перфузии.
14. С помощью формул (2) – (4) получить концентрации соответствующих
метаболитов в пробах, отобранных за время перфузии.
15. Построить графики вида F=f(t), где t – время перфузии, F – значение
соответствующего измеряемого параметра в момент забора пробы. Параметры:
сопротивление сосудов органа;
потребление кислорода (потребление вычисляется по формуле (1));
скорость продукции желчи (при вычислении Δt считать равным 1);
уровень глюкозы в оттекающем перфузате;
уровень молочной кислоты в оттекающем перфузате;
уровень мочевины в оттекающем перфузате;
16.На основе полученных результатов сделать выводы о функционировании печени
крысы в условиях изолированной перфузии.
4. ТРЕБОВАНИЯ К ОФОРМЛЕНИЮ ОТЧЕТА
1. Отчет оформить в виде презентации.
2. Предоставить краткие теоретические сведения о перфузии изолированных органов, ее
видах. Охарактеризовать объект лабораторной работы
3. Предоставить графики физиологических и биохимических показателей жизнедеятельности
изолированной перфузированной печени крысы (всего 6 графиков).
4. Сделать выводы о характере метаболизма изолированной перфузируемой печени крысы.
5. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Дайте определение термину «перфузия». В чем заключается суть метода перфузии
изолированных органов?
2. Какие 2 вида перфузии изолированных органов существуют?
3. Назовите основные функции печени и охарактеризуйте каждую из них.
4. Объясните схему установки для разомкнутой перфузии изолированных органов.
6. ЛИТЕРАТУРА ПО ТЕМЕ
1. Bessems M., Hart N.A., Tolba R. et al. // Lab.Anim. 2006. 40(3). P.236-246.
2. Chaib S.// Nutrition. 2005. Vol. 21(11-12). P.1173-1173.
3. Kenny J.R., Grime K. // Xenobiotica. 2006. 36(5). P.351-365.
4. Нефедов В.П., Рупенко А.П., Валук В.А., Панов А.В., Вавилин В.А // Успехи
гепатологии. 1990. Вып. XV. С. 335-352.
5. Под редакцией Нефедова В.П. Механизмы гомеостаза в изолированных системах и
организме. Межвед. об. научных трудов. Красноярск,1984, 232с.
6. Нефедов, В.П. Управление функциональной активностью органов при перфузии
[Текст] / В.П. Нефедов, В.А. Самойлов, Р.А. Гареев, Т.Д. Ким. – Новосибирск: Наука,
1981. – 205 с.
7. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы, 2001, 121c.
8. Exton, J.H. Control of Gluconeogenesis in Liver / J.H. Exton // The journal of biological
chemistry. – 1966. – Vol.242, No. 11. – P. 2622–2636.
9. Irwin B. Levitan. Regulation of Tyrosine Transaminase in the Isolated Perfused Rat Liver /
Irwin B. Levitan, Thomas E. Webb. // The journal of biological chemistry. – 1969. – Vol.244,
No. 17. – P. 4684–4688.
10. Pastor, C. M. Oxygen Supply Dependence of Urea Production in the Isolated Perfused Rat
Liver / C. M. Pastor, D. R. Morel, T. R. Billar // Am J Respir Crit Care Med. – 1998. – Vol
157. – P. 796–802.
11. Ravikumar, T.S. Percutaneous Hepatic Vein Isolation and High-Dose Hepatic Arterial
Infusion Chemotherapy for Unresectable Liver Tumors / 45T.S. Ravikumar, G. Pizzorno, W.
Bodden, J. Marsh, R. Strair, J. Pollack, R. Hendler, J. Hanna, E. D'Andrea. // Journal of
Clinical Oncology – 1994. – Vol 12, No 12. – P. 2723–2736.
12. Ravikumar, T.S. Percutaneous Hepatic Vein Isolation and High-Dose Hepatic Arterial
Infusion Chemotherapy for Unresectable Liver Tumors / 45T.S. Ravikumar, G. Pizzorno, W.
Bodden, J. Marsh, R. Strair, J. Pollack, R. Hendler, J. Hanna, E. D'Andrea. // Journal of
Clinical Oncology – 1994. – Vol 12, No 12. – P. 2723–2736.
13. H. Richard Alexander. Current Status of Isolated Hepatic Perfusion With or Without Tumor
Necrosis actor for the Treatment of Unresectable Cancers Confined to Liver / H. Richard
Alexander, David L. Bartlett, Steven K. Libutti // The oncologist. – 2000. – Vol 5. – P. 416–
424.
Практическое занятие №6
ВЫЯВЛЕНИЕ ДЕТОКСИЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ГУМИНОВЫХ
ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ТЕСТОВЫХ
СИСТЕМ НА ПРИМЕРЕ CrCl3
1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
В настоящее время остро стоит проблема экологического мониторинга состояния
окружающей среды. Одними из самых распространенных поллютантов являются соли
металлов, являющиеся отходами различных производств.
Существующий на сегодняшний день метод покомпонентного химического анализа
проб и последующее сравнение с ПДК из-за большой трудоемкости и длительности
анализа не подходит для экспресс анализов и полевых измерений. Кроме того,
отличительной особенностью этого метода является его исключительная избирательность
к поллютантам, поэтому не учитываются эффекты синергизма или антагонизма в
растворах сложного состава.
Указанного недостатка лишен биологический способ анализа. Среди биотестов
широко известны биолюминесцентные тестовые системы, основанные на свечении
морских бактерий и выделенных из них ферментативных систем. Эти биотесты уже более
сорока лет используются для мониторинга химической токсичности среды. Здесь в
качестве тестируемого параметра используется интенсивность люминесценции бактерий,
что обеспечивает несложную приборную регистрацию данной физиологической функции
организма.
Особенно важно изучать токсичность растворов солей металлов в условиях,
приближенных к природным. Поэтому актуальными являются исследования токсичности
растворов в присутствии гуминовых веществ – высокомолекулярных продуктов окисления
и полимеризации органических веществ в почве и донных отложениях. Процессы
гумификации, трансформации и миграции гуминовых веществ – вторые по массопереносу
в природе после фотосинтеза. Гуминовые вещества (ГВ), включающие в своей структуре
разнообразные химические группы, оказываются способными к детоксикации множества
вредных веществ, таких как ПАВ, углеводородов нефти, органических окислителей, солей
тяжелых металлов и др.
Более подробно ознакомиться с теоретическими основами данной работы следует,
используя литературные источники, указанные в п.5 данного пособия.
Цель работы: Выявление детоксицирующей активности гуминовых веществ c
помощью биолюминесцентных тестовых систем на примере CrCl3
Задачи:
5. Измерить интенсивность биолюминесценции биферментной системы в
присутствии раствора CrCl3
6. Измерить интенсивность биолюминесценции биферментной системы в
присутствии раствора CrCl3 и гуминовых веществ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе используется комплект реактивов аналитической биолюминесценции
(КРАБ), который включает лиофилизованные препараты люциферазы Photobacterium
leiognathi (0,5 мг/мл) и NADH:FMN-оксидоредуктазы из Vibrio fischeri (0,15 ед.
активности), изготовленные в лаборатории нанобиотехнологии и биолюминесценции
института биофизики СО РАН (Красноярск).
В работе используются следующие
реактивы: никотинамидадениндинуклеотид (NADH), флавинмононуклеотид (FMN),
тетрадеканаль, хлорид хрома (CrCl3·6H2O) марки «ч».
В качестве источника гуминовых веществ используется препарат «Гумат-80» (ООО
«Гумат», Иркутск). Препарат получен механохимической реакцией бурого окисленного
угля (Черемховское месторождение, Россия) со щелочью (КОН, NaOH). Кинетика
биолюминесцентного сигнала регистрируется на биохемилюминометре TriStar LB 941
(Berthold technologies, Германия) или 3606 (Конструкторское бюро “Наука”, Красноярск,
Институт биофизики СО РАН).
Кроме того используется набор кювет для биолюминометра, микропипетки
емкостью от 2,5 до 5000 мкл, флаконы и пробирки емкостью 5-10 мл и другое
лабораторное оборудование.
Реакционные смеси
При исследовании действия на люминесцентную систему двух сопряженных
ферментативных реакций редокс-активных соединений и гуминовых веществ использются
следующие свежеприготовленные растворы: 4∙10-4 М раствор NADH, 5,4∙10-4 М раствор
FMN, 50 мкл 0,25% раствора тетрадеканаля, тщательно размешанный в 5 мл 0,05 М калийфосфатного буфера (рН 6,8) для получения 0,0025% раствора тетрадеканаля. КРАБ
разводят 0,05 М калий-фосфатным буфером (1 мл на флакон КРАБ). Разведенный КРАБ до
начала работы необходимо настаивать в течение 30 минут.
Исследования люминесценции системы двух сопряженных реакций с солями металлов и
гуминовыми веществами проводятся в смеси следующего состава:
1) Контроль
4. 2,5 мкл раствора препарата ферментов «КРАБ»;
5. 25 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля;
6. 100 мкл 0,05 М натрий – фосфатного буфера;
7. 25 мкл 5,4∙10-4 М раствора FMN (в растворе С(FMN) = 5,4∙10-5 М);
8. 100 мкл 4∙10-4 М раствора NADH (в растворе С(NADH) = 1,6∙10-4 М).
2) Измерение с CrCl3
9. 2,5 мкл раствора препарата ферментов «КРАБ»;
10. 25 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля;
11. 75 мкл 0,05 М натрий – фосфатного буфера;
12. 25 мкл 5,4∙10-4 М раствора FMN (в растворе С(FMN) = 5,4∙10-5 М);
13. 25 мкл раствора исследуемой соли (C(CrCl3)=3∙10-3 M);
14. 100 мкл 4∙10-4 М раствора NADH (в растворе С(NADH) = 1,6∙10-4 М).
3) Измерение с CrCl3 и гуминовыми веществами
15. 2,5 мкл раствора препарата ферментов «КРАБ»;
16. 25 мкл 0,0025% раствора тетрадеканаля;
17. 70 мкл 0,05 М натрий-фосфатного буфера;
18. 25 мкл 5,4∙10-4 М раствора FMN (в растворе С(FMN) = 5,4∙10-5 М);
19. 25 мкл раствора исследуемой соли (C(CrCl3)=3∙10-3 M);
20. 5 мкл гуминовых веществ (взять 3 концентрации: С1(ГВ) = 1/32 г/л; С2(ГВ) = 1/256
г/л; С3(ГВ) = 1/512 г/л);
21. 100 мкл 4∙10-4 М раствора NADH (в растворе С(NADH) = 1,6∙10-4 М).
Общий объем смеси – 250 мкл. Во всех случаях запуск реакции осуществляется
добавлением в реакционную смесь NADH.
3. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ
1) В стеклянную кювету или планшет (зависит от биолюминометра) поместите с
помощью микропипетки смеси указанные в пункте “реакционные смеси” в том же
порядке. 2) Замерте интенсивность биолюминесценции в течение 3 минут. Каждое
измерение проводите в трех - шести повторностях.
3) Определите максимальную интенсивность свечения для контрольных (без
токсичных соединений – Ik) и опытных (Io) растворов. Отношение I=Io/Ik используйте для
характеристики воздействия солей металлов на люминесценцию.
4) Эффективность влияния гуминовых веществ на систему с солями металлов на
люминесценцию охарактеризуйте отношением интенсивности опытных образцов к
контрольным.
5) Рассчитайте коэффициенты детоксикации общей токсичности среды (K), как
отношение интенсивности люминесценции в присутствии гуминовых веществ (IГВ) к
интенсивности люминесценции в их отсутствии (I):
K=IГВ/I
Статистическая обработка результатов и построение графиков следует проводить с
использованием пакетов прикладных программ MS Office или LibreOffice.
6) По результатам проделанной работы составьте отчет, содержащий посчитанные
коэффициенты детоксикации для 3 различных концентраций гуминовых веществ.
Построить графики с кинетическими кривыми всех исследуемых в работе зависимостей
(контроль, интенсивность с солью, интенсивность в присутствии гуминовых веществ).
4. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1) Что такое биолюминесцентные тестовые системы?
2) В чем преимущества биолюминесцентных тестов по сравнению с
традиционными методами?
3) Какие есть механизмы воздействия солей металлов на биолиминесцентные
системы?
4) Какие отличительные особенности строения гуминовых веществ?
5) Какие механизмы задействованы в снижении токсичности растворов солей
металлов гуминовыми веществами?
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1) Кудряшева Н.С., Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Физико-химические основы
биолюминесцентного анализа (доступно в интернет: http://window.edu.ru/window/catalog?
p_rid=26509)
2) Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: Изд-во
МГУ, 1990
3) Перминова И.В., Жилин Д.М. Гуминовые вещества в контексте зеленой химии.
В: Зеленая химия в России, В.В. Лунин, П. Тундо, Е.С. Локтева (Ред.). М.: Изд-во МГУ,
2004, с. 146-162. ( В интернете: www.mgumus.chem.msu.ru/publication/2004/perminovaguminovye-04.pdf)
Практическое занятие №7
ВЛИЯНИЕ «МУТАЦИОННЫХ» ПРОЦЕССОВ НА ПЕРЕХОД ОТ
МАЛОВИДОВОЙ СИСТЕМЫ К МНОГОВИДОВОЙ
1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Одной из важнейших проблем современной биофизики является проблема
происхождения и развития жизни. И, несмотря на то, что многие основные этапы в этой
концепции достаточно подробно описаны, существует множество белых пятен, таких как
парадокс Дарвина-Вернадского, проблема Кастлера, проблема хиральности, без
прояснения которых дальнейшее развитие данной теории затруднено.
Так как экспериментальные исследования проблемы происхождения и эволюции
жизни на Земле осложнены отсутствием данных о том времени, когда эти процессы
происходили, естественным является тщательное математическое и компьютерное
моделирование ее важнейших этапов.
В данной работе предлагается изучить этап перехода от маловидовой системы к
многовидовой в процессе эволюции жизни на Земле, т. е. тот период, на котором от
самосформировавшегося предшественника живой клетки под воздействием внешних
условий, генерирующих случайные «мутации», образуется многовидовое сообщество
близких «предклеток», связанных простыми взаимодействиями.
I.1. Модель хемосферы
Согласно концепции происхождения жизни, предложенной учеными Института
биофизики [Барцев, 2005], предшественником биосферы был геохимический цикл фазовообособленных автокаталитических систем.
Автокатализаторы для автокаталитического размножения использовали энергию
базовых реакций в геохимическом цикле.
Не останавливаясь на природе автокатализаторов, главное - они размножаются по
Моно, и сильно упрощая биосферу, ее можно представить следующей установкой (рис. 1).
Реагенты и другие вещества, необходимые для возникновения и существования
фазово-обособленных автокаталитических систем, подаются в проточный реактор
идеального перемешивания с выбранной постоянной скоростью. Возникающие в реакторе
автокаталитические системы эволюционируют в протоке в результате конкуренции за
необходимые для их существования реагенты. Вещества, удаляемые из реактора,
разделяется на чистую воду, которая после внесения в нее необходимых веществ из блока
регенерации возвращается в реактор, и все остальные вещества, включая хемомассу,
которые поступают в хранилище и затем регенерируются в физико-химическом блоке.
Предполагается, что автокаталитические системы самоформируются в реакторе с
определенной невысокой вероятностью и изменяют свои свойства случайным образом с
более высокой вероятностью. В результате конкуренции на протоке происходит
естественный дарвиновский отбор, и параметры эволюционирующих автокаталитических
систем закономерно изменяются в определенных направлениях. Более сложная картина
наблюдается при возникновении и эволюции в реакторе нескольких типов
автокаталитических систем с взаимодействием между ними. В соответствии с рисунком
сделана компьтерная модель.
Рис. 1. Упрощенная схема экспериментальной установки с замкнутым циклом
круговорота веществ для моделирования начальных стадий эволюции хемосферы
(1. Проточный реактор идеального перемешивания, моделирующий жидкую планетарную
среду, в которой развиваются фазовообособленные автокаталитические системы.
2. Сепаратор, отделяющий воду от хемомассы, продуктов химических реакций,
протекающих в реакторе, и других веществ, поступающих из реактора. 3. Хранилище всех
веществ, поступающих из реактора. 4. Физико-химический блок регенерации веществ,
используемый для получения веществ, необходимых для создания реакционной среды.
5. Устройство для приготовления реакционной среды).
1.2. Взаимодействие автокатализаторов
В соответствии с представленной моделью, в системе взаимодействуют два
автокатализатора, связанные по типу хищник-жертва, и их метаболизм будем описывать
реакциями:
S E1 n1 *E1 P1 ,
(1)
E1 E 2 n2 * E 2 P2
В соответствии с реакциями (1) процессы в системе описываются системой
дифференциальных уравнений:
d S (S S ) * D (S ) * E ,
0
1
1
dt
d E ( ( S ) D )* E ( E )* E ,
1
1
2 1
2
dt 1
d E ( ( E ) D )* E ,
2 1
2
dt 2
d P ( S )* E D * P ,
1
1
dt 1 1
d P ( E )* E D * P ,
2 1
2
2
dt 2
m *S
1 ( S ) 1
,
K1 S
(E )
2
1
m2 * E1
,
K 2 E1
(2)
где S, E1, E2, P1, P2 – концентрации субстрата, первого и второго автокатализатора,
и их продуктов соответственно, S0 – начальная концентрация субстрата первого
автокатализатора, μ1(S) и μ2(E1) - удельные скорости роста автокатализаторов, m1 и m2 –
максимальные скорости роста автокатализатора для каждого из субстратов, K1, K2 константы Моно, D – скорость протока.
Предложенная система может существовать в нескольких режимах:
1. Оба автокатализатора
представленная на рис.2.
вымываются
из
реактора.
Например,
картина,
Рис. 2. Зависимость концентраций автокатализаторов, их субстратов и продуктов от
времени при следующем наборе констант: S0 = 1, E1нач = 0.001, E2нач = 0.001, m1 = 0.39, m2
= 0.45, K1 = K2 = 0.1, D = 0.4
2. Один автокатализатор вымывается из реактора, концентрация второго постоянна.
(Рис. 3)
Рис. 3. Зависимость концентраций автокатализаторов, их субстратов и продуктов от
времени при следующем наборе констант: S0 = 1, E1нач = 0.001, E2нач = 0.001, m1 = 0.5, m2 =
0.2, K1 = K2 = 0.1, D = 0.3
3. Выживают оба автокатализатора, их концентрации постоянны (Рис.4.).
Рис. 4. Зависимость концентраций автокатализаторов, их субстратов и продуктов от
времени при следующем наборе констант: S0 = 1, E1нач = 0.001, E2нач = 0.001, m1 = 0.5, m2 =
0.7, K1 = 0.1, K2 = 0.65, D = 0.32
4. Режим колебаний. (Рис. 5.)
Рис. 5. Зависимость концентраций автокатализаторов, их субстратов и продуктов от
времени при следующем наборе констант: S0 = 1, E1нач = 0.001, E2нач = 0.001, m1 = 0.5, m2 =
0.7, K1 = 0.1, K2 = 0.4, D = 0.3
Цель работы: исследование влияния «мутационных» процессов на переход от
маловидовой системы к многовидовой.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Оборудование: персональный компьютер (оперативная память не менее 2Гб).
Интерфейс программы
Разработан специальный интерфейс, который отображает двумерные и трехмерные
графические картины развития системы (Рис.6), а также позволяет регулировать
изменяемые параметры системы посредством панели опций. (Рис. 7).
Рис. 6. Среда для моделирования различных систем с учетом мутаций
Программные возможности позволяют добавление и исключение различных свойств,
расширяющих системы взаимодействующих видов, и реализацию различных вариантов
отображения результатов.
Точками обозначены разные популяции одного вида, отличающиеся между собой по
константе Моно или/и максимальной скорости роста из-за наличия «мутаций» в системе.
В первом, левом трёхмерном, окне по ОХ отображается константа Моно представленной
разновидности особей, по OY - текущая концентрация хемомассы особей представленной
популяции, по OZ – максимальная скорость роста популяции.
Кнопки C1_V_K1 и C2_V_K1 переключают трехмерную раскладку для жертвы и
хищника соответственно.
В правой половине расположены окна, отображающие зависимость концентраций
автокатализаторов (синим – жертвы, зелёным - хищника) и субстрата (красным) от
времени (верхнее окно справа) и изменения основных параметров видов: максимальной
скорости роста (красным) и константы Моно (зелёным) для жертвы (левое нижнее окно) и
для хищника (правое нижнее окно).
Рис.7. Панель опций, позволяющая варьировать изменяемые параметры
системы
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Нажмите кнопку Опции и выставьте значения всех параметров, как на
Рис. 7., кроме Диапазонов Vmax и const Моно, скорости протока.
2. Выпишите значения максимальных скоростей роста и констант Моно
атокатализаторов при каждом режиме существования системы(см. подписи к Рис.2
- 5).
3. Рассчитайте диапазоны Vmax и const Моно, исходя из того, что интервал констант, в
пределах которого могут выбираться параметры для «мутантов», задан таким
образом, что наиболее вероятными значениями выборки являются константы
удельных скоростей роста и константы Моно.
Рекомендуется для диапазона Vmax использовать m1,2 - 0.1 и m1,2 + 0.1, а для const Моно
K1,2 – 0.05 и K1,2 + 0.05.
4. Выставьте в окне Опции параметры Диапазонов Vmax и const Моно для режима,
когда один автокатализатор вымывается из реактора, а концентрация второго
постоянна. Выставьте скорость протока для данного случая. Нажмите кнопку OK в
нижнем правом углу панели Опции. Затем нажмите последовательно кнопки Заново
и Старт.
5. Пронаблюдайте, как изменяются текущие концентрации различных популяций
хищника и жертвы (трёхмерные картины) во времени. Зафиксируйте (используя
Print Screen) текущее изображение окна программы при достаточно большом
количестве выполненных программой шагов. Достаточным считается такое
количество вычислений, когда виден установившийся режим существования
(вымывание, стационар, колебания). Затем нажмите Стоп.
6. Сравните полученную зависимость концентраций автокатализаторов от времени с
зависимостью при отсутствии мутаций (Рис. 3.).
7. Как при введении мутаций в систему изменяются основные параметры
автокатализаторов, максимальная скорость роста и константа Моно? Объясните,
почему в большинстве случаев Vmax стремится к наибольшему значению диапазона,
а константа Моно – к наименьшему?
8. Выполните пункты 4-7 для одного из оставшихся режимов (вымывание одного из
автокатализаторов,
стационарное существование обоих автокатализаторов,
колебания концентраций автокатализаторов).
4. УКАЗАНИЯ ПО ОФОРМЛЕНИЮ ОТЧЕТА
1. Отчет должен состоять из трех частей: теоретической, расчетной и результатов.
2. Теоретическая часть должна содержать краткое описание проблемы и проводимого
исследования.
3. Расчетная часть должна включать таблицу, заполненную данными, полученными в
пункте IV.3.
4. Результаты должны содержать минимум две картины, полученные запуском и
работой программы, оформленные в виде рисунков.
5. Выводы должны основываться на пунктах IV.6 и IV.7
5. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Какие теории происхождения жизни вы знаете? Чем они отличаются между
собой? Какие известные ученые склонялись к каждой из них?
2. Какие белые пятна существуют в современной концепции происхождения
жизни? Как вы их понимаете?
3. Как вы понимаете термины геохимический цикл, хемосфера, автокатализатор,
фазовая обособленность?
4. Какие признаки жизни вы знаете? Какие из них вы считаете основными
характеристиками жизни? Почему?
5. Если бы вы моделировали хемосферу, какие элементы установки (Рис.I.1.) вы
бы добавили или опустили? Почему?
6. В каком члене какого уравнения отражена связь хищника и жертвы?
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Вернадский В.И. Живое вещество и биосфера. Наука, Москва, 1994.
Общие проблемы физико-химической биологии и биотехнологии, 1991, т.19.
Опарин А.И. Возникновение жизни на земле. Москва, 1957.
Печуркин Н. С. Энергия и жизнь. Наука, Новосибирск, 1988.
Фолсом К. Происхождение жизни. Мир, Москва, 1982.
Барцев С.И., Межевикин В.В. Естественный отбор на протоке как
универсальный механизм эволюции предбиологических автокаталитических
систем. Доклады Академии Наук, т.388, № 3, С. 405-408, 2003.
7. Барцев С.И., Межевикин В.В. Добиологические механизмы естественного
отбора самовоспроизводящихся молекулярных систем. В кн. Очерки
экологической биофизики. Под ред. Т.Г.Воловой, Из-во СО РАН, Новосибирск,
С.120-127, 2003.
8. Bartsev S.I., Mezhevikin V.V. Pre-biotic stage of life origin under non-photosynthetic
conditions. Advances in Space Research, 35 (2005), pp.1643-1647.
9. Bartsev S.I., Mezhevikin V.V. Theoretical and computing modeling of evolution of
autocatalytic systems in flow reactor. International Workshop “Biosphere Origin and
Evolution”, June 26-29, 2005, Novosibirsk, Russia, P.60. (Международное рабочее
совещание «Происхождение и эволюция биосферы», 26-29 июня 2005г.,
Новосибирск, Россия)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Учебно-методические материалы по дисциплине
Основная литература:
1. Кольман, Ян. Наглядная биохимия [Текст] = Taschenatlas der Biochemie
: [справочник] / Я. Кольман, К.-Г. Рем. - 4-е изд. - М. : БИНОМ.
Лаборатория знаний, 2011. - 469 с. (1 экз.)
2. Сердюк, Игорь. Методы в молекулярной биофизике. Структура.
Функция. Динамика : учебное пособие : [в 2 томах]/И. Сердюк, Н.
Заккаи, Д. Заккаи ; науч. ред. И. Сердюк. Том 1. - 2009. - 567 с. (12 экз.)
3. Сердюк, Игорь. Методы в молекулярной биофизике. Структура.
Функция. Динамика [Текст] : учебное пособие : [в 2 томах] / И.
Сердюк, Н. Заккаи, Д. Заккаи ; науч. ред. И. Сердюк. Том 2. - 2010. 733 с. (11 экз.)
4. Блюменфельд, Лев Александрович. Решаемые и не решаемые проблемы
биологической физики [Текст] : [монография] / Л. А. Блюменфельд. Изд. 2-е. - М. : Едиториал УРСС, 2010. - 158 с. (2 экз.)
5. Джаксон, Мейер. Молекулярная и клеточная биофизика / М. Б.
Джаксон. - М. : Мир : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 551 с. (5
экз.)
6. Белозерский, Г. Н. Радиационная экология [Текст] : учебник для вузов
по специальности "Экология" : допущено учебно-методическим
объединением по классическому университетскому образованию / Г. Н.
Белозерский. - Москва : Academia (Академия), 2008. - 383 с. (10 экз.)
Дополнительная литература:
7. Владимиров, Ю. А. Физико-химические основы фотобиологических
процессов [Текст] : учебник для студентов / Ю. А. Владимиров, А. Я.
Потапенко. - 2-е изд., перераб. и доп. - Москва : Дрофа, 2006. - 286 с. (1
экз.)
8. Кудряшов, Ю. Б.
Радиационная биофизика: (ионизирующие
излучения) [Текст] : учебник для студентов: допущено Министерством
образования РФ / Ю. Б. Кудряшов ; под ред.: Ю. Б. Мазурик, М. Ф.
Ломанов ; Московский университет [МГУ] им. М.В. Ломоносова. Москва : Физматлит [Физико-математическая литература], 2004. - 442
с. (72 экз.)
9. Пивоваров, Ю. П. Радиационная экология [Текст] : учебное пособие
для студентов вузов по специальности "Экология": рекомендовано
Учебно-методическим объединением по образованию в области
экологии и устойчивого развития / Ю. П. Пивоваров, В. П. Михалев. Москва : Academia (Академия), 2004. - 239 с. (16 экз.)
10.Финкельштейн, А. В. Физика белка [Текст] : курс лекций : учебное
пособие для вузов по биологическим специальностям : допущено
Министерством образования РФ / А. В. Финкельштейн, О. Б. Птицын ;
Российская академия наук [РАН]. Институт белка. - Москва : Книжный
дом "Университет", 2003. - 375 с. (1 экз.)
11.В. А. Кратасюк [и др.]. История и методология биологии и биофизики :
учеб. пособие / – Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – 172 с.
12.Барсуков, О.А., Барсуков К.А. Радиационная экология. М.: Научный
мир, 2003. – 253 с.
13.Пивоваров Ю.П., Михалев В.П. Радиационная экология: учебное
пособие для высших учебных заведений. М.: Издательский центр
«Академия», 2004 г. – 240 с.
14.Методы исследования биологических процессов 1. Стационарная и не
стационарная кинетика ферментативных реакций. Специфичность
//Метод. указания, Красноярск. Сибирский Федеральный Университет,
2007
15.Суковатая И.Е., Кратасюк В.А. Кинетические методы исследования
биологических процессов 2 //Определение кинетических параметров и
типов взаимодействия ферментов с эффекторами: метод. указания,
Красноярск. Сибирский Федеральный Университет, 2007
16.Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. – М.,
Мир, 1997.
17.Рубин А.Б., Биофизика. т.1. Теоретическая биофизика. Учебник для
вузов. 2-е изд. Книжный дом «Университет», Москва, 1999, 448с.
18.Рубин А.Б., Биофизика. т.2. Биофизика клеточных процессов. Учебник
для вузов. 2-е изд. Книжный дом «Университет», Москва, 2000, 468с.
19.Келети Т., Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1990. – 350 с.
20.Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Основы радиационной биофизики. М.: Изд-во МГУ, 1982. - 304 с.
21.Уэстли Д.. Ферментативный катализ. М.-Мир, 1972, стр. 34-100, 121177.
22.Кантор С.Р., Шиммел П.Р. "Биофизическая химия", т. 1
23.Владимиров В. Л., Фотохимия и люминесценция белков, Наука, М.,
1965, стр. 113-120, 140-144.
24.Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. – М.: Мир, 1980. – 581 с.
25.Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. – М:
Мир, 1986 – 496 с.
26.Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: Пер. с англ.– М.: Мир,
1984.- Т.2 – 496 с.
27.Ремизов, А. Н.
Медицинская и биологическая физика [Текст] :
учебник для медицинских специальностей вузов : рекомендован
Министерством образования РФ / А. Н. Ремизов. - 3-е изд.,испр. Москва : Высшая школа, 1999. - 616 с. Современные методы
биофизических исследований: Практикум по биофизике: Учеб. пособие
для биол. спец. вузов / А.А. Булычев, В.Н. Верхотуров, Б.А. Гуляев и
др.; Под ред. А.Б. Рубина. – М.: Высш.шк., 1988. – 359 с.
28.Корниш-Боуден А.Э., Основы ферментативной кинетики. М.-Мир,
1979, стр. 36-77, 102-161, 213-221, 232-266.
29.Уильямс В., Уильямс Х., Физическая химия для биологов. М. Мир,
1976, стр.354-361.
30.Березин И.В., Клесов А.А., Практический курс химической и
ферментативной кинетики. М.-МГУ, 1976, стр.284-292.
31.Биосенсоры: основы и приложения. Под ред. Э. Тёрнера, И. Карубе,
Дж. Уилсона.
32.Максимов М.Т., Оджагов Г.О. Радиоактивные загрязнения и их
измерение. - М.: Энергоатомиздат, 1989. - 304 с.
33.Радиация. Дозы, эффекты, риск. - М.: Мир, 1988. - 79 с.
34.Ярмоненко С.П., Вайсон А.А. Радиобиология человека и животных:
учебное пособие. – М.: Высшая школа, 2004. – 549 с.
35.Иммобилизованные ферменты. / под ред. И. В. Березина и др. – М.,
1976.
36.Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в
исследовании биологических мембран. – М., Наука, 1980
37.Введение в биомембранологию: Учеб. пособие /Под ред. Болдырева
А.А. – М., Изд-во МГУ, 1990.
Электронные ресурсы:
1.
История и методология биологии и биофизики [Электронный ресурс] :
электрон. учеб.-метод. комплекс по дисциплине / В. А. Кратасюк, И. Е.
Суковатая, И. В. Свидерская [и др.]. – Электрон. дан. (165 Мб). –
Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – (История и методология био-логии и
биофизики : УМКД № 1314/599-2008 / рук. творч. коллектива В. А.
Кратасюк).
Режим
доступа:
http://catalog.sfu-kras.ru/cgibin/irbis64r_91/cgiirbis_64.exe?Z21ID=&P21DBN=UMKD&I21DBN=UM
KD&S21REF=1&S21CNR=5&S21STN=1&S21FMT=fullwebr&C21COM
=S&S21P03=I=&S21LOG=1&S21ALL=%28%3C.%3EI%3D57:001.8%28
075%29%2F%D0%98%2090-187593%3C.%3E%29
2.
Современные аппаратура и методы исследования биологических
систем : учебное пособие/Министерство образования и науки РФ,
Российская академия наук [РАН]. Сибирское отделение [СО]. Институт
биофизики, Сибирский федеральный университет [СФУ]; под ред.: Э.
Д. Сински, Т. Г. Волова. – 2011.
Режим доступа: http://lib2.sfu-kras.ru/elib/b28/0231337.pdf
3. Специальный биофизический практикум: биология, физика и химия
биолюминесценции: лаб. практикум для магистрантов направления
подготовки 020400.68 "Биология", 011200.68 "Физика" / Л. А. Франк, В.
Н Петушков [и др.] ; Сиб. федерал. ун-т, Рос. акад. наук, Сиб. отд-ние,
Ин-т биофизики. - Красноярск : СФУ, 2012. - 111 с. : ил., цв.ил. (Специальный биофизический практикум: биология, физика и химия
биолюминесценции : УМКД / рук. творч. коллектива Л. А Франк). Библиогр.: с. 110-111. Режим доступа: http://catalog.sfu-kras.ru/cgi
in/irbis64r_91/cgiirbis_64.exe?Z21ID=&P21DBN=EBOOK&I21DBN=EB
OOK&S21REF=1&S21CNR=5&S21STN=1&S21FMT=fullwebr&C21CO
M=S&S21P03=I=&S21LOG=1&S21ALL=%28%3C.%3EI%3D%D0%91%
D0%91%D0%9A28.0%2F%D0%A4503-004068%3C.%3E%29
Информационные ресурсы:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Электронный фотобиологический справочник [Электронный ресурс]. –
Режим доступа : http://www.photobiology.info.
Электронная библиотека http://www.twirpx.com/
Научная электронная библиотека http://elibrary.ru/defaultx.asp
Nature Publishing Group http://www.nature.com/
American Society for Photobiology [Электронный ресурс]. – Режим
доступа : http://www.photobiology.org/
Журналы издательства Annual Reviews
http://www.annualreviews.org/action/showJournals
Cambridge University Press http://www.journals.cambridge.org/archives/
Institute of Physics http://iopscience.iop.org/journals?type=archive
Web of Science
http://apps.webofknowledge.com/UA_GeneralSearch_input.do?product=UA
&search_mode=GeneralSearch&SID=W2aheM4EFbHgbODcMFB&preferen
cesSaved=
Oxford University Press (Oxford Journals) http://www.oxfordjournals.org/
SCOPUS http://www.scopus.com/home.url
Springer, Kluwer http://link.springer.com/
Американское химическое сообщество http://portal.acs.org
PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Springer, Kluwer http://www.springerlink.com/
Science (AAAS) http://www.sciencemag.org/
