Химические свойства

1
МЕТОДЫ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕCКИ АКТИВНЫХ
ЩЕСТВ И ИХ СВОЙСТВА.
ВЕ-
1. Физические, химические и биологические свойства биологически активных веществ.
2. Качественный химический анализ биологически активных веществ.
3. Методы количественного определения биологически активных веществ.
В Государственный Реестр лекарственных средств (2001 г.) включено около 300
наименований лекарственного растительного сырья и около 600 препаратов растительного
происхождения. Поэтому оценка качества лекарственного растительного сырья, т.е. установление возможности применения его как лекарственного средства (лекарства), является одной
из задач специалиста-провизора. Определяют подлинность и доброкачественность лекарственного растительного сырья, т.е. соответствие тем требованиям, которые предъявляет к
сырью нормативный документ.
Одним из важных показателей качества лекарственного растительного сырья является содержание основных биологически активных веществ (БАВ). Их определение проводится с
помощью химических и физико-химических методов анализа, основанных на физических,
химических и биологических свойствах БАВ.
Физические, химические и биологические свойства БАВ.
Физические свойства.
По агрегатному состоянию эфирные масла, жирные масла и безкисло- родные алкалоиды представляют собой жидкости.
Эфирные масла - летучие жидкости, представляющие собой смеси органических веществ различной природы, вырабатываемые растениями и обусловливающие их запах.
Жирные масла - сложные нелетучие органические вещества растительного и животного происхождения, представляющие собой смеси различных глицеридов.
По цвету эфирные и жирные масла - чаще всего бесцветные или желтоватые. Эфирные
масла могут быть и окрашенными: например, красное - масло тимьяна, синее - от присутствия азуленов масло цветков ромашки и травы тысячелистника. Жирные масла при нагревании оставляют жирное пятно на бумаге, эфирные - испаряются без остатка.
Запах масел, особенно эфирных, ароматный, характерный, плотность колеблется от 0,8 до
1,19, но большей частью меньше единицы.
Безкислородные алкалоиды (анабазин, кониин, пахикарпин, никотин) бесцветные или
окрашенные маслянистые жидкости с неприятным запахом. Все указанные жидкости не
растворимы в воде, но хорошо растворяют в спиртах, жирах, неполярных органических
растворителях (хлороформ, ди-этиловый и петролейный эфиры), обладают оптической активностью, масла способны к рефракции.
При охлаждении, а иногда при комнатной температуре эфирные масла застывают в
кристаллическую массу - стеароптен, оставшаяся жидкая часть на зывается элеоптеном.
Эфирные масла и безкислородные алкалоиды способны перегоняться с водяным паром.
К твердым кристаллическим или аморфным веществам относятся: горечи, полисахариды, сердечные гликозиды, сапонины, простые фенольные соединения, кумарины, хромоны,
лигнаны, флавоноиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, кислородсодержащие
алкалоиды, водорастворимые витамины.
Цвет.
Бесцветные или слегка желтоватые - горечи (монотерпеноидные иридоиды), полиса-
2
хариды, сердечные гликозиды, сапонины,
простые фенольные соединения, кумарины, хромоны, лигнаны, флавоноиды группы флавана, аскорбиновая кислота, большинство
кислородсодержащих алкалоидов. Флавоноиды, производные флавонов, витамин К - желтые; халконы, ауроны и каротиноиды - оранжевые; антоцианы - красного или синего цвета
в зависимости от реакции среды (кислая или щелочная); антраценпроизводные - желтого,
оранжевого или красного цвета; дубильные вещества - желтые или желто-бурые.
Вкус.
Большинство БАВ без запаха, горького вкуса: горечи, сердечные гликозиды, кумарины, хромоны, некоторые флавоноиды, антраценпроизводные, алкалоиды. Гомогликозиды
без запаха и вкуса. Дубильные вещества вяжущего вкуса, аскорбиновая кислота - кислого.
Растворимость.
БАВ в растениях встречаются в виде гликозидов и агликонов: иридоиды, полисахариды, сердечные гликозиды, сапонины, простые фенольные соединения, кумарины, хромоны,
лигнаны, флавоноиды, антраценпроизводные, дубильные вещества.
Гликозиды растворимы в воде и водных растворах низших спиртов (метиловом и этиловом) и плохо растворимы в органических растворителях (бензоле, эфире хлороформе).
Полисахариды не растворяются в спирте и неполярных органических растворителях.
Растворимость полисахаридов в воде варьирует: некоторые линейные гомополисахариды
не растворяются в воде, сложные и разветвленные полисахариды либо растворяются в воде, либо образую гели.
Гидрофильные сердечные гликозиды хорошо растворяются в воде, плохо - в липидах,
липофильные - легко растворяются в липидах, плохо - в воде.
Агликоны нерастворимы в воде, но хорошо растворимы в неполярных органических
растворителях (эфире, хлороформе), спиртах, ацетоне.
Катехины и лейкоантоцианидины растворимы в воде, спиртах и ацетоне, плохо растворяются в других органических растворителях.
Дубильные вещества хорошо растворяются в воде с образованием коллоидных растворов, растворимы также в этиловом и метиловом спирте, ацетоне, этилацетате, бутаноле, пиридине, не растворимы в хлороформе, бензоле, диэтиловом эфире и других неполярных растворителях.
Алкалоиды в растениях встречаются в виде солей и виде оснований.
Алкалоиды-соли хорошо растворимы в воде и этиловом спирте (особенно в разбавленном), плохо или совсем не растворимы в органических растворителях (хлороформ,
этиловый эфир, дихлорэтан и др.).
Исключения: хинина сульфат плохо растворяется в воде; скополамина гидробромид
растворяется в хлороформе.
Алкалоиды-основания обычно плохо растворяются в воде, но легко растворяются в органических растворителях.
Исключения: цитизин, кофеин, кодеин хорошо растворяются и в воде и в органических
растворителях.
Все гликозиды и алкалоиды оптически активны.
3
Возгоняются при высокой температуре: кумарины, антраценпроизводные, отдельные алкалоиды (кофеин, никотин).
Флюоресцируют в УФ-свете:
- сердечные гликозиды - оттенками желтого, зеленого и голубого цветов;
- простые фенолы, кумарины - голубым, синим, фиолетовым, зеленым и желтым цветом;
- большинство хромонов и лигнанов - желтым или желто-зеленым цветом;
- флавоны, флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы — коричневым цветом;
- флавонолы и их 7-гликозиды - желтым или желто-зеленым цветом;
- ксантоны - оранжевым цветом;
- катехины - бесцветным и голубым цветом;
- антраценпроизводные - розовым, красным, оранжевым, желтым цветом;
- некоторые алкалоиды: цитизин - фиолетовым, берберин - желто-зеленым цветом;
- витамин К - красным, но под действием УФ-лучей быстро разрушается, флуоресценция
переходит в зеленую.
Специфическим свойством сапонинов является их способность снижать поверхностное натяжение жидкостей (воды) и давать при встряхивании стойкую обильную пену. Такая поверхностная активность связана с наличием в молекулах сапонинов одновременно
как гидрофильного, так и липофильного остатков.
Химические свойства
Химические свойства гликозидов многообразны и обусловлены наличием гликозидной
связи и строением сахаров и агликона. Под действием ферментов при наличии воды гликозиды гидролизуются. Возможен гидролиз ферментативный, кислотный и щелочной. Оптимальной для ферментативного гидролиза является температура 30-50 °С, при температуре
свыше 50°С ферменты денатурируют.
Химические свойства сердечных гликозидов обусловлены наличием стероидного ядра, лактонного кольца, углеводной цепи и присутствием гликозидной связи. Самыми нестойкими в молекулах сердечных гликозидов являются лактонное кольцо и гликозидная
связь.
В случае, когда на конце углеводной цепи находятся глюкоза или рамноза, сердечные
гликозиды легко обрывают конечную молекулу моносахарида и образуют вторичные гликозиды.
Реакции на стероидную структуру основаны на способности стероидного ядра сердечных гликозидов и стероидных сапонинов подвергаться дегидратации под действием кислотных реагентов (уксусный ангидрид, конц. серная кислота, трихлоруксусная кислота) с
образованием окрашенных комплексных соединений (реакция Либермана-Бурхарда).
Реакции на ненасыщенное лактонное кольцо сердечных гликозидов основаны на
способности ненасыщенного лактонного кольца легко окисляться полинитросоединениями
(нитропруссид натрия, пикриновая кислота) в щелочной среде с образованием окрашенных в
желтый или красный цвет продуктов реакции.
4
Реакции на углеводную часть молекулы гликозида основаны на способности моносахаридов углеводной цепи образовывать окрашенные комплексы с различными
реактивами. Моносахара, входящие в состав гликозида вступают во все цветные реакции,
свойственные углеводам (с раствором Феллинга, серебряного зеркала).
Фенольные гликозиды дают:
- растворимые в воде феноляты с гидроксидом натрия: флавоноиды и кумарины - желтого; антрагаикозиды - вишнево-красного цвета;
- окрашенные комплексные соли с хлоридом окисного железа или железоаммонийными квасцами от зеленой до фиолетовой окраски (простые фенолы, кумарины, лигнаны,
флавоноиды, дубильные вещества);
-
с хлоридом алюминия - желтую окраску с желто-зеленой флюоресценцией (флавоноиды);
-
с ацетататом свинца и магния, солями меди, молибдена, циркония (все фенольные соединения);
- реакцию азосочетания с солями диазония с образованием азокрасителя в
зависимости от структуры от желтого до вишнево-красного цвета.
Флавоноиды способны восстанавливаться (проба Синода),
простые фенольные соединения – (гидрохинон) окисляться раствором йода.
Дубильные вещества легко окисляются кислородом воздуха, перманганатом калия и
другими окислителями. Они способны образовывать прочные межмолекулярные связи с
белками и другими полимерами (пектиновые вещества, целлюлоза), легко адсорбироваться
на кожном порошке, целлюлозе, клетчатке.
Из водных растворов дубильные вещества осаждаются желатином, алкалоидами основным ацетатом свинца, бихроматом калия, сердечными гликозидами.
Алкалоиды образуют нерастворимые (или слабо растворимые) осадки с комплексными йодидами металлов, высокомолекулярными неорганическими кислотами, высокомолекулярными органическими веществами кислого характера (общеалкалоидные осадочные
реакции).
Алкалоиды вступают в реакции, зависящие от наличия в их молекулах различных
функциональных групп. Например, морфин содержит фенольный гидроксил, поэтому он со
щелочами образует феноляты;
дает реакции с хлоридом окисного железа и другими реактивами.
ГРУППЫ СЫРЬЯ ПО БАВ
1. Полисахариды
с порошком микрохимические реакции на слизь:
- с тушью;
5
- с метиленовым си-
ним;
- с раствором КОН;
- проделать микрореакцию на крахмал с раствором Люголя;
- проделать реакцию на одревесневшие элементы - с 1% спиртовым раствором флороглюцина и концентрированной НCl (1-2 капли).
Подлинность лекарственного растительного сырья подтверждают качественными реакциями.
Фармакопейными (ГФ-Х1, вып.2) являются следующие:
- на инулин:
1) альфа-нафтол и конц. серная кислота окрашивает корни одуванчика в фиолетоворозовый цвет;
2) альфа-нафтол и конц. серная кислота окрашивает корневища и корни девясила в
красно-фиолетовый цвет, тимол и конц. серная кислота - в оранжево-красный цвет.
- на слизь:
1) раствор аммиака (NH3) или едкого натра (NаОН) окрашивает корни алтея в желтый цвет;
2) при смачивании водой цветки липы ослизняются;
3) на порошок семян льна выполняют гистохимическую реакцию с раствором туши.
При помощи качественных реакций чаще выявляются слизи:
Под влиянием раствора NaOH они приобретают лимонно-желтоватый цвет, пoд воздействием метиленового синего - голубой.
На фоне черной туши слизь имеет вид бесцветных сгустков.
Количественное определение
полисахаридов ГФ-Х1, вып.2 предлагает для листьев подорожника большого и слоевищ ламинарии. Метод определения
- гравиметрический (весовой), основанный на осаждении полисахаридного водного
извлечения 95% спиртом. Стадии анализа:
1) экстракция полисахаридов водой;
2) осаждение полисахаридов из водного извлечения 95% спиртом;
3) высушивание осадка и доведение его до постоянной массы.
В слоевишах ламинарии, кроме того, определяют содержание йода после сжигания
навески бромйодометрическим методом.
Там же определяют содержание песка (SiO2).
В сырье алтея, липы, льна, мать-и-мачехи, подорожника блошного количественного
6
определения биологически активных ведят.
ществ и экстрактивных веществ не прово-
2. Оценка качества сырья, содержащего жиры. Методы анализа.
Существующая в фармации нормативная документация предусматривает качественные реакции на жиры при проведении микроскопического анализа
плодов и семян - ГФ-Х1, вып. 1, стр.279:
готовят поперечный срез плодов и семян в растворе Судана III и подогревают; капли
жирного масла окрашиваются в оранжево-розовый цвет.
Этой реакцией, в частности, подтверждают наличие жирного масла в эндосперме семян льна.
Количественное определение жира в лекарственном растительном сырье:
Определение содержания жира в растительном сырье проводят в жиромасличной
промышленности, в сельском хозяйстве, в пищевой промышленности.
Метод определения - гравиметрический. Метод основан на растворимости жиров в
органических растворителях. Наиболее часто используют метод Сокслета и метод Рушковского.
По методу Сокслета определяют массу жирного масла после отгона органического
растворителя.
По методу Рушковского о масссе жирного масла судят по убыли массы навески сырья
после обработки органическим растворителем. Определение ведется в аппарате Сокслета.
Определение длительное (от 16 часов до 3-х суток), недостаточно точное, т.к. извлекаются
не только жиры, но и пигменты, каротиноиды, смолистые вещества.
3. Эфирные масла
Метод количественного определения содержания эфирного масла в растительном сырье основан на:
- физических свойствах эфирного масла - летучести и практической нерастворимости
в воде;
- на отсутствии химического взаимодействия эфирного масла и воды;
- на законе Дальтона о парциальных давлениях.
Согласно закону, смесь жидкостей закипает тогда, когда сумма их парциальных давлений достигает атмосферного давления.
Следовательно, давление паров смеси жидкостей (вода + эфирное масло) достигнет
атмосферного давления еще до кипения воды.
В соответствии с ГФ-Х1, вып. 1, стр.290 (раздел «Общие методы анализа») определение проводят одним из 4 методов в зависимости от количества в сырье эфирного масла, его
состава, плотности и термолабильности.
7
Метод 1 и 2 применяют, если эфирное масло имеет плотность меньше 1 и не растворяется в воде.
Метод 3 и 4 применяют для сырья, содержащего эфирное масло, которое претерпевает изменения, образует эмульсию, легко загустевает и имеет плотность близкую к единице.
Метод 1 (метод Гинзберга) - применяют для сырья, где много эфирного (масло термостабильное), в его составе преобладают моно- и бициклические монотерпены. Приемник
для сбора эфирного масла помещается в экстрактивной колбе.
Этим методом определяют содержание эфирного масла в сырье можжевельника, мяты, шалфея, эвкалипта, тмина.
Метод 2 (метод Клавенджера) - используют, когда сырье содержит эфирного масла
менее 0.2-0.3 %.
Этот метод дает меньшую ошибку опыта. Приемник вынесен за пределы экстракционной колбы, что позволяет определить в сырье содержание термолабильного эфирного
масла. Этим методом определяют содержание эфирного масла в сырье ромашки, тмина,
мяты, шалфея, эвкалипта.
Метод 3 (метод Клавенджера). Приемник см. 2-й метод. В приемник прибавляют
органический растворитель для разрушения эмульсии или растворения загустевшего или
тяжелого масла. Определяют эфирное масло в сырье аниса, аира, тысячелистника.
Метод 4 впервые включен в ГФ Х1 и отличается от 3-его метода возможностью
контролировать температуру конденсации. Во время гидродистилляции температура в отстойнике не должна превышать 25°С.
В ГФ-Х1, вып.2, стр.227 на побеги багульника болотного даны два показателя содержания эфирного масла в сырье:
- если сырье предназначено для получения экстемпоральных лекарственных форм, то
эфирного масла должно быть не менее 0.1%;
-
если сырье предназначено для получения ледина, то эфирного масла должно
быть не менее 0.7%.
В таком эфирном масле дополнительно определяют содержание ледола методом газо-жидкостной хроматографией. Ледола должно быть не менее 17%.
Сырье, содержащее эфирное масло, которое при перегонке претерпевает изменения,
образует эмульсию, легко загустевает или имеет плотность, близкую к единице, анализируют методами 3 или 4.
4. Качественные реакции на антраценпроизводные
Из сырья антраценпроизводные извлекают водой или спиртом различной концентрации.
Для получения свободных агликонов, гликозиды в растительном сырье подвергают
гидролизу, свободные агликоны извлекают этиловым эфиром и хлороформом.
8
Для обнаружения антраценпроизводных в сырье используют качественные
реакции, основанные на химических свойствах и хроматографическое исследование.
1. Реакция образования фенолятов со щелочью:
а) по характерной оранжевой окраске корней и коры или
на сухом сырье - при нанесении нескольких капель 10%-ного раствора натрия гидроксида на сырье появляется вишнево-красное пятно.
Положительный результат наблюдается, если антраценпроизводные присутствуют в
окисленной форме. Рекомендована ГФ-Х1 для подтверждения подлинности Cortex Frangulae;
б) с водным извлечением (1:10) - при добавлении к водному извлечению из сырья
нескольких капель 10%-ного раствора щелочи образуется вишнево-красное окрашивание производные антрахинона,
желтое окрашивание - производные антранола и антрона;
фиолетовое окрашивание – ализарин.
Окраска при взаимодействии со щелочью появляется только у окисленных форм антраценопроизводных,
а восстановленные формы четкой реакции с NaOH не дают, и для их обнаружения
необходимо осуществить предварительное окисление; например, свежесобранная кора крушины дает эту реакцию с NaOH только после предварительной обработки ее пероксидом водорода.
в) реакция Борнтрегера. Позволяет обнаружить эмодины в присутствии других антраценпроизводных.
Проба основана на способности антрагликозидов подвергаться щелочному гидролизу с
образованием свободных агликонов.
Одновременно производится окисление восстановленных форм.
После подкисления гидролизата агликоны извлекают эфиром.
Эфирный слой окрашивается в желтый цвет.
При встряхивании эфирного слоя с аммиаком эмодины, имеющие гидроксильные
группы в бета-положении, переходят в водный слой, окрашивая его в вишнево-красный
цвет.
Хризофанол остается в органическом слое, окрашивая его в желтый цвет.
Предложена в ГФ-Х1 для подтверждения подлинности Cortex Frangulae, Folia Sennae,
Fructus Rhamni catharticae, Radices Rhei, Rhizomata et radices Rubiae.
2. Реакция микросублимации (микровозгонки).
Основана на способности АП возгоняться при 200 °С с последующей конденсацией на
холодной поверхности без изменения основной структуры.
И может быть проведена в двух вариантах:
в пробирке и на предметном стекле.
9
При нанесении на сублимат раствокрасное окрашивание.
ра натрия гидроксида образуется вишнево-
Дана в ГФ-Х1 для подтверждения подлинности Согtех Frangulae.
3.Реакция образования лаков.
Основана на способности антраценпроизводных образовывать со спиртовым раствором магния ацетата комплексы, окрашенные в вишнево-красный цвет.
4.Для качественного обнаружения производных антрацена часто используется бумажная и тонкослойная хроматография.
О присутствующих веществах судят по характеру их флуоресценции в УФ-свете до и после
обработки хроматограмм соответствующими реагентами (парами аммиака, растворами едких
щелочей).
Количественное определение.
Все методы количественного определения антраценпроизводных в сырье основаны на
отделении свободных агликонов после кислотного гидролиза. Агликоны экстрагируют в
органический растворитель и определяют различными методами.
1. Фотоэлектроколориметрический метод.
Основан способности окрашенных фенолятов поглощать свет при длине волны 530540 нм.
Предложен в 1957 г. Аутергоффом (Германия), модифицирован А.С. Романовой и
А.И. .Баньковским (НПО «ВИЛАР», 1965).
Аутергофф предложил гидролиз и экстракцию агликонов объединить в одну стадию
кипячением навески сырья с ледяной уксусной кислотой и с последующей экстракцией диэтиловым эфиром.
Стадии определения суммы производных антрацена:
1- гидролиз антраценпроизводных и экстракция агликонов из сырья;
2- получение окрашенных солей
Эфирное извлечение обрабатывают в делительной воронке отдельными порциями щелочно-аммиачного раствора (5% раствор NаОН, содержащий 2% раствора аммиака).
Антраценпроизводные в виде окрашенных фенолятов переходят в водную фазу (обрабатывают до тех пор, пока последняя порция щелочно-аммиачного раствора не будет
оставаться бесцветной).
3- окисление восстановленных форм антраценпроизводных
Для перевода всех форм антраценпроизводных в окисленные, часть щелочноаммиачного раствора фенолятов нагревают на водяной бане в течение 15 мин. Восстановленные формы окисляются кислородом воздуха и вступают в реакцию со щелочноаммиачным раствором, окраска становится интенсивнее (сырье крушины и ревеня). В сырье марены красильной окисление восстановленных форм проводят пергидролем.
4 - измерение оптической плотности окрашенных растворов с пофотоэлектроколориметра (ФЭК) при длине волны 530-540 нм (зеленый фильтр).
10
Содержание антраценпроизводных в
сырье (%) рассчитывают по калибровочному графику, построенному по кобальта хлориду (СоС12 в пересчете на истизин (хризацин).
Фотоэлектроколориметрический метод рекомендован ГФ-Х1 для определения содержания (%)антраценпроизводных в сырье крушины, ревеня, марены красильной.
В корневищах и корнях марены красильной по ФС регламентируется определение
связанных производных антрацена.
Количественное содержание связанных производных антрацена определяют вычитанием количества свободных производных антрацена (агликонов} из суммы производных
антрацена.
При определении свободных производных антрацена отсутствует стадия гидролиза антрагликозидов. Агликоны извлекают из сырья эфиром, получают окрашенные феноляты, окисляют восстановленные формы пергидролем, определяют оптическую плотность
окрашенных фенолятов по калибровочному графику, построенному по кобальта хлориду,
рассчитывают содержание свободных производных антрацена в сырье марены красильной.
2. Спектрофотометрический метод.
Этим методом определяют содержание антраценпроизводных в листьях сенны.
Основные стадии метода:
- экстракцию сеннозидов проводят водой при нагревании;
-
водное извлечение очищают от смолистых веществ;
-
окисление восстановленных форм проводят с помощью FeCl3;
-
гидролиз гликозидов антрахинонов проводят 50%-ным раствором серной кислоты;
-
оптическую плотность окрашенных растворов измеряют с помощью спектрофотометра
при длине волны 523 нм;
- содержание суммы производных антрацена в пересчете на хризофанол вычисляют
по калибровочному графику, построенному по кобальта хлориду.
5. Качественный анализ дубильных веществ.
Для получения суммы дубильных веществ растительное сырье экстрагируют горячей
водой в соотношении 1:30 или 1:10.
Качественные реакции на дубильные вещества можно подразделить
на 2 группы:
1) Общие реакции осаждения – для обнаружения дубильных веществ
2) Групповые – для установления принадлежности дубильных веществ к определенной группе
Для обнаружения дубильных веществ в растительном сырье используют следующие
реакции:
11
1. Специфической реакцией на дубильные вещества является реакция осаждения желатином. Используют 1 %-й раствор желатина на 10 %-ном растворе хлорида натрия. Появляется хлопьевидный осадок, растворимый в избытке желатина. Отрицательная реакция с желатином свидетельствует об отсутствии дубильных веществ.
2. Реакция с солями алкалоидов. Образуется аморфный осадок за счет образования
водородных связей с гидроксильными группами дубильных веществ и атомами азота
алкалоида.
Эти реакции дают одинаковый результат независимо от группы дубильных веществ.
Реакции, позволяющие определить группу дубильных веществ.
1.Реакция Стиасни – с 40 % раствором формальдегида и конц. HCl Конденсированные дубильные вещества образуют осадок кирпично-красного цвета
2.Бромная вода (5 г брома в 1 л воды) - к 2-3 мл испытуемого раствора прибавляют
по каплям бромную воду до появления в растворе запаха брома; в случае присутствия
конденсированных дубильных веществ образуется оранжевый или желтый осадок.
3. Окрашивание с солями трехвалентного железа, железоаммонийными квасцами –
черно-синее (дубильные вещества гидролизуемой группы, которые являются производными пирогаллола)
или черно-зеленое (дубильные вещества конденсированной группы, которые являются производными пирокатехина).
4.Катехины дают красное окрашивание с ванилином
(в присутствии конц. HCl или 70 %-ной H2SO4 развивается яркая красная окраска).
Катехины образуют при этой реакции окрашенный продукт следующего строения:
OH
OH
O
HO
CH3-O
OH
CH
OH
O
5. Реакцией отличающей пирогалловые танниды от пирокатехиновых является реакция
нитрозометилуретаном.
При кипячении растворов дубильных веществ с нитрозометилуретаном танниды пирокатехинового ряда осаждаются полностью,
а присутствие пирогалловых таннидов можно обнаружить в фильтрате путем прибавления железоаммиачных квасцов и натрия ацетата – фильтрат окрашивается в фиолетовый
цвет.
12
6. Свободная эллаговая кислота дает
красно-фиолетовую окраску при
добавлении нескольких кристаллов нитрита натрия и трех-четырех капель уксусной
кислоты.
7. Для обнаружения связанной эллаговой кислоты (или гаксаоксидифеновой) уксусную кислоту заменяют 0,1 н. серной или соляной кислотой (кармино-красная окраска,
переходящая в синюю).
8. Дубильные вещества с белками создают непроницаемую для воды пленку (дубление). Вызывая частичное свертывание белков, они образуют на слизистых оболочках и
раневых поверхностях защитную пленку.
9. При соприкосновении с воздухом (например, резке свежих корневищ) дубильные вещества легко окисляются, превращаясь во флобафены или красени, которые обусловливают темно-бурую окраску многих кор и других органов, настоев.
Флобафены нерастворимы в холодной воде, растворяются в горячей воде, окрашивая отвары и настой в бурый цвет.
10. С 10 %-ным раствором среднего ацетата свинца (одновременно добавляют 10
%-ный раствор уксусной кислоты) :
образуется белый осадок, нерастворимый в уксусной кислоте – дубильные вещества гидролизуемой группы
(осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют содержание конденсированных
дубильных веществ, с 1 %-ным раствором железоаммонийных квасцов – черно-зеленое
окрашивание);
белый осадок, растворимый в уксусной кислоте – дубильные вещества конденсированной группы.
11. Для идентификации отдельных соединений используют хроматографический
анализ, рассматривая в УФ-свете. Обработку хроматограмм производят раствором железа
хлорида или ванилиновым реактивом
Структуру устанавливают с помощью ИК-спектров, ПМР-спектров.
Реакция с 1 %-ным спиртовым раствором железоаммониевых квасцов является
фармакопейной, проводится с отваром из сырья – кора дуба, корневище змеевика, соплодия ольхи, плоды черники;
А также непосредственно в сухом сырье – кора дуба, кора калины, корневища бадана.
Количественное определение.
1.
Гравиметрические или весовые методы – основаны на количественном осаждении дубильных веществ желатином, ионами тяжелых металлов или адсорбцией
кожным (гольевым) порошком.
Официальным в дубильно-экстрактовой промышленности является весовой единый
метод (ВЕМ):
В водных вытяжках из растительного материала вначале определяют общее количество растворимых веществ (сухой остаток) путем высушивания определенного объема вытяжки до постоянной массы;
13
затем из вытяжки удаляют дубильные вещества, обрабатывая ее обезжиренным
кожным порошком; после отделения осадка в фильтрате вновь устанавливают количество
сухого остатка.
Разность в массе сухого остатка до и после обработки вытяжки кожным порошком показывает количество подлинных таннидов.
2. Титриметрические методы.
К ним относятся:
1) Желатиновый метод - Метод Якимова и Курницкой – основан на способности дубильных веществ образовывать нерастворимые комплексы с белками. Водные извлечения из сырья титруют 1 % раствором желатина, в точке эквивалентности комплексы
желатино-таннаты растворяются в избытке реактива.
Титр устанавливают по чистому таннину. Точку валентности определяют путем отбора
наименьшего объема титрованного раствора, вызывающего полное осаждение дубильных
веществ.
Метод наиболее точный, т.к. позволяет определить количество истинных дубильных
веществ.
Недостатки: длительность определения и трудность установления точки эквивалености.
2) Перманганатометрический метод (метод Левенталя в модификации Курсанова).
Это фармакопейный метод, основан на легкой окисляемости перманганатом калия в кислой среде в присутствии индикатора и катализатора индигосульфокислоты, которая в точке эквивалентности раствора меняется от синего до золотисто-желтого.
Особенности определения, позволяющие оттитровать только макромолекулы дубильных
веществ: титрование проводится в сильно разбавленных растворах (извлечение разбавляеттся в 20 раз) при комнатной температуре в кислой среде, перманганат добавляется медленно, по каплям, при интенсивном перемешивании.
Метод экономичный, быстрый, прост в исполнении, но недостаточно точен, так как
перманганат калия окисляет частично и низкомолекулярные фенольные соединения.
3) Для количественного определения таннина в листьях сумаха и скумпии
используется метод осаждения дубильных веществ сульфатом цинка с последующим
комплексонометрическим титрованием трилоном Б в присутствии ксиленолового
оранжевого.
3. Физико-химические методы.
1) Фотоэлектроколориметрические - основаны на способности ДВ образовывать
окрашенные соединения с солями трехвалентного железа, фосфорно-вольфрамовой кислотой, реактивом Фолина-Дениса и др.
2) Хроматоспектрофотометрические и нефелометрические методы используют в научных исследованиях.
6. Методы анализа сырья, содержащего сапонины.
Наличие сапонинов в лекарственном растительном сырье можно установить при помощи качественных реакций, которые проводят непосредственно с сырьем или с извлечени-
14
ем из него.
Качественные реакции на сапонины основаны на их физических, химических и биологических свойствах. Для проведения качественных реакций готовят водный настой 1:10
при нагревании на водяной бане. После охлаждения настой фильтруют.
Реакции, основанные на физических свойствах.
Для проведения реакции на пенообразование берут две пробирки, в одну добавляют 5
мл 0,1 моль/л HCl, в другую добавляют 5 мл 0,1 моль/л NaOH и сильно встряхивают. Если
образуется стойкая пена в обеих пробирках или в пробирке с кислотой – это говорит о кислых тритерпеновых сапонинах.
Стероидные сапонины дают дают обильную, стойкую пену в щелочной среде.
Химические методы.
Относятся реакции осаждения сапонинов и цветные реакции.
1.Из водных растворов сапонины осаждаются гидроксидами бария и магния, солями
меди, ацетатом свинца.
Причем тритерпеновые – осаждаются средним ацетатом свинца, а стероидные – основным.
2. Из спиртовых извлечений (или растворов) стероидные сапонины и тритерпеновые
сапонины выпадают в осадок при добавлении 1% спиртового раствора холестерина в виде
холестеридов.
3. Стероидные сапонины, так же как и сердечные гликозиды, дают реакцию Либермана-Бухарда с уксусным ангидридом и кислотой концентрированной серной – образуется
быстро переходящая окраска от розовой до зеленой и синей.
4. Реакция Санье - стероидные сапонины от тритерпеновых можно отличить по реакции с 1% раствором сурьмы треххлористой, концентрированной серной кислотой, содержащей уксусный ангидрид, если образуется желтое окрашивание.
Учитывая, что многие из перечисленных химических реакций могут давать и другие
соединения, проводят еще и биологические испытания.
На биологических свойствах сапонинов
основана реакция гемолиза с 2 % взвесью эритроцитов в изотоническом растворе.
Кровь становится прозрачной, ярко-красной. Для проведения этой реакции из растительного сырья готовят настой на изотоническом растворе.
Государственная фармакопея XI издания (вып.2) рекомендует использовать качественные реакции для подтверждения подлинности для трех видов сырья.
1. Корневища с корнями синюхи голубой. С водным извлечением проводится реакция
пенообразования, основанная на способности сапонинов снижать поверхностное натяжение
жидкости (воды) и давать в отваре стойкую и обильную пену после встряхивания.
2. Корни аралии маньчжурской. Метанольное извлечение хроматографируют в тонком закрепленном слое силикагеля (на пластинках «Силуфол») в системе растворителей
хлороформ-метанол-вода (61:32:7). В качестве свидетелей используют раствор «Сапарала».
Хроматограмму проявляют 20% H2SO4 и нагревают в сушильном шкафу (1=105°С) в течение 10 мин. Появляются 3 пятна вишневого цвета на уровне пятен аралозидов в «сапарале».
3. Корни женьшеня.
15
а) Реакция с порошком корня
женьшеня (на гликозиды). При нанесении
конц. H2SO4 на порошок корня женьшеня через 1-2 минуты появляется кирпично-красное
окрашивание, переходящее в красно-фиолетовое, а затем - в фиолетовое.
б) Наличие панаксозидов доказывают при помощи разделения извлечения из корня
женьшеня в тонком слое силикагеля и последующим проявлением хроматограммы раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты при нагревании. Панаксозиды проявляются в виде
розовых пятен.
Единого метода количественного определения сапонинов в лекарственном растительном сырье нет.
Чаще всего используют физико-химические методы:
1.Потенциометрический метод. Метод основан на определении изменения электродвижущей силы (ЭДС) в результате титрования. Метод используется для определения суммы
аралозидов в корнях аралии маньчжурской.
Этапы определения: - подготовительный;
и их кислотный гидролиз:
экстракция аралозидов метиловым спиртом
+ H2SO4
COOR2 R1, R2
R1O
R1, R2 – сахара
COOH
HO
олеаноловая кислота
- очистка от сопутствующих веществ - осаждение олеаноловой кислоты в результате смены
растворителя (разбавление спиртового извлечения водой и охлаждение);
- растворение олеаноловой кислоты в горячей смеси метилового и изобутилового спиртов
(1:1,5);
- количественное определение - титрование раствором едкого натра (0,1 моль/л) в смеси метилового спирта и бензола:
16
+ NaOH
COOH H2 O
HO
COONa
HO
Точку эквивалентности определяют потенциометрически.
2. Спектрофотометрический метод. Метод основан на способности сапонинов и их
окрашенных комплексов поглощать монохроматический свет при определенной длине
волны. Метод предложен для определения содержания сапонинов в следующих видах сырья:
а) корневища с корнями диоскореи ниппонской. Проводят кислотный гидролиз сапонинов с последующим проведением реакции свободного агликона (диосгенина) с реактивом (п-диметиламинобензальдегид). Образуется окрашенный комплекс;
б) корни солодки. Проводят осаждение глицирризиновой кислоты концентрированным раствором аммиака. Осадок растворяют и определяют оптическую плотность полученного раствора.
3. Гравиметрический метод - определение экстрактивных веществ. Метод основан на
определении сухого остатка после высушивания суммы веществ, извлеченных из сырья
соответствующим экстрагентом. Метод предложен для оценки качества сырья женьшеня,
почечного чая, синюхи голубой, солодки.
В сырье астрагала шерстистоцветкового и заманихи высокой количественное содержание биологически активных веществ не определяют.
4. Ранее для количественной оценки сырья использовали определение гемолитического индекса и пенного числа.
Количественное определение сапонинов гемолитическим методом основано на предположении, что гемолитическое действие прямо пропорционально количеству вещества в
растворе.
Гемолитический индекс – наименьшая концентрация извлечения из сырья, которая
вызывает полный гемолиз эритроцитов. Для этого к настою сырья на изотоническом растворе добавляют 2% взвесь бараньих эритроцитов. В результате гемолиза кровь становится прозрачной, ярко-красной, лакированной (эритроциты перейдут в плазму). Расчет проводят на 1
г испытуемого вещества.
5. Пенное число – наименьшая концентрация извлечения из 1 г сырья, при встряхивании которого в течение 15 секунд образуется пена, устойчивая в течение 15 минут.
6. Определяли силу действия сапонинового сырья на рыбах, то есть рыбный индекс.
Это наименьшая концентрация извлечения, при которой гибнут рыбы массой до 0,5 г, длиной 3-4 см в течение 1 часа.
17
7. Анализ сырья, содержащего СГ.
Качественные реакции на СГ проводят с очищенным спиртовым извлечением из
растительного сырья.
Все реакции на СГ можно разделить на 3 группы:
- реакции
Килиани);
на углеводную часть молекулы (2-дезоксисахара)
(реакция Келлер-
- на стероидную структуру (реакция Либермана-Бухарда);
- на лактонное ненасыщенное кольцо.
1. Реакции на стероидную структуру.
Основаны на способности стероидного ядра СГ подвергаться дегидратации под действием кислотных реагентов (уксусный ангидрид, конц. серная кислота, трихлоруксусная
кислота) с образованием окрашенных комплексных соединений. Образующиеся в результате реакций окрашивания меняются во времени, поэтому необходимо наблюдать их в момент соприкосновения реактивов, а затем отмечать изменение окраски в течение 10-15 минут.
Для СГ обычно проводят реакции:
1. Реакция Либермана-Бурхарда. При взаимодействии СГ со смесью уксусного ангидрида и конц. серной кислотой появляется розовое окрашивание, переходящее в зеленое.
2. Реакция Розенгейма. При взаимодействии СГ с 90% водным раствором трихлоруксусной кислоты появляется розовое окрашивание, переходящее в лиловое и затем в синее.
3. Реакция с хлоридом сурьмы (III). СГ при взаимодействии с хлоридом сурьмы в
среде уксусного ангидрида образуют лиловое окрашивание
2. Реакции на ненасыщенное лактонное кольцо.
Основаны на способности ненасыщенного лактонного кольца легко окисляться в щелочной среде с образованием окрашенных продуктов реакции. Для СГ обычно проводят
реакции:
1. Реакция Балье. При взаимодействии с пикриновой кислотой в щелочной среде СГ
образуют комплексы, окрашенные в оранжевый цвет.
2. Реакция Кедде. При взаимодействии с 3,5-динитробензойной кислотой СГ образуют комплексы, окрашенные в красный цвет,
3. Реакция Легаля. При взаимодействии с нитропруссидом натрия в щелочной среде
СГ образуют комплексы, окрашенные в красный цвет.
4. Реакция Раймонда. При взаимодействии с мета-динитробензолом СГ образуют
комплексы, окрашенные в красно-фиолетовый цвет.
3. Реакции на углеводную часть молекулы.
18
Основаны на способности моносахаридов углеводной цепи образовывать
окрашенные комплексы с различными реактивами.
1. Моносахара, входящие в состав СГ, после предварительного гидролиза вступают
во все цветные реакции, свойственные углеводам (Феллинга, серебряного зеркала).
1. Для дезоксисахаров используют реакцию Келлер-Килиани.
Дезоксисахара в присутствии сульфата железа (III), ледяной уксусной кислоты и конц.
серной образуют комплексы, окрашенные в синий или сине-зеленый цвет. Необходимым
условием для проведения этой реакции является отсутствие на конце углеводной цепи
обычных сахаров (глюкозы).
Достоверное заключение о присутствии в лекарственном растительном сырье СГ
можно сделать только при положительном результате всех трех групп качественных реакций на различные части молекулы.
В ГФ-Х1 на сырье наперстянок пурпурной и крупноцветковой, ландыша майского и
горицвета весеннего качественных реакций не предусмотрено.
Кроме того, СГ образуют нерастворимые комплексы с растворами дубильных веществ,
что используется при отравлениях СГ.
Количественное определение СГ проводят методом биологической стандартизации (ГФ-Х1, вып.2, с. 163-175).
Метод основан на способности СГ вызывать в токсических дозах остановку сердца
животных в стадию систолы. В качестве подопытных животных используют лягушек, голубей или кошек. Чувствительность животных к сердечным гликозидам определяют в
сравнении со стандартными индивидуальными веществами или экстрактами, которые вырабатывают в специальных научно-исследовательских институтах. Активность выражают в
единицах действия (ЕД), которые, в зависимости от вида животных обозначают:
ЛЕД - «лягушачьи» ЕД, КЕД - «кошачьи» ЕД или ГЕД «голубиные» ЕД.
ЛЕД соответствует наименьшей дозе стандартного препарата, вызывающей остановку
сердца стандартной лягушки (самец травяной лягушки массой 28-33 г). В нормативной документации на лекарственное сырье и препараты, содержащих СГ, обязательно указывается ВАЛОР (количество ЕД в 1 г сырья).
Недостатками метода биологической стандартизации являются его трудоемкость, высокая стоимость, большая ошибка опыта (до 25%).
Поэтому нормативная документация на некоторые виды сырья и препараты требует
определять их количественное содержание физико-химическими методами (хроматофотоэлектроколориметрическим или хроматоспектрофотометрическим) методами. Они основаны на предварительном хроматографическом разделении СГ с последующим фотоэлектроколориметрическим или спектрофотометрическим определением.
8. Методы анализа сырья, содержащего простые фенольные
соединения.
Качественный и количественный анализ сырья основан на физических и химиче-
19
ских свойствах.
Качественный анализ.
Включает качественные реакции и хроматографические пробы.
Фенольные соединения в виде гликозидов извлекают из растительного сырья водой, затем извлечения очищают от сопутствующих веществ, осаждая их растворами ацетата свинца. С очищенным извлечением выполняют качественные реакции.
Простые фенолы и агликоны фенологликозидов дают
характерные для фенольных соединений реакции:
-
с железоаммонийными квасцами
-
с солями тяжелых металлов
-
с диазотированными ароматическими аминами.
Специфические реакции (ГФ Х1):
- на арбутин (сырье толокнянки и брусники) используют цветные качественные реакции:
-
с кристаллическим сульфатом закисного железа.
Реакция основана на получении комплекса, изменяющего окраску от сиреневого до
темного с дальнейшим образованием темно-фиолетового осадка.
- с 10 %-ным раствором натрия фосфорно-молибденовокислого в кислоте хлористоводородной.
Реакция основана на образовании комплексного соединения синего цвета.
-
на салидрозид (сырье родиолы розовой):
-
реакция азосочетания с диазотированным сульфацилом натрия с образованием азокрасителя вишнево-красного цвета.
OH
O
OH
2
+
N= N
SO2 - N - C - CH3
Cl
N=N-R
R-N=N
Na
CH2 - CH2 -O - glucosa
салидрозид
CH2-CH2-O-gluc
азокраситель
Хроматографическое исследование
Используется ТСХ для обнаружения простых фенольных соединений в сырье родио-
20
лы розовой (ГФ Х1, вып. 2, ст. 75, с. 364-
366).
Проба основана на разделении веществ в тонком слое силикагеля (пластинка «Силуфол») метанольного извлечения из сырья в системе растворителей хлороформ-метанолвода (26:14:3) с последующим проявлением хроматограммы диазотированным сульфацилом натрия. Пятно салидрозида с Rf = 0,42 окрашивается в красноватый цвет.
OH
O
OH
2
+
N= N
SO2 - N - C - CH3
Cl
R-N=N
N=N-R
Na
CH2-CH2-O-gluc
CH2 - CH2 -O - glucosa
Количественное определение.
Для количественного определения простых фенологликозидов в лекарственном растительном сырье используют различные методы: гравиметрические, титриметрические и
физико-химические.
1. Гравиметрическим методом определяют содержание флороглюцидов в корневищах папоротника мужского. Метод основан на извлечении флороглюцидов из сырья диэтиловым эфиром в аппарате Сокслета. Извлечение очищают, отгоняют эфир, полученный сухой остаток высушивают и доводят до постоянной массы. В пересчете на абсолютно сухое
сырье содержание флороглюцидов не менее 1,8%.
2. Титриметрический йодометрический метод используется для определения содержания арбутина в сырье брусники и толокнянки. Метод основан на окислении агликона
гидрохинона до хинона 0,1 М раствором йода в кислой среде и в присутствии натрия гидрокарбоната.
Выделяют стадии определения:
1. Извлечение арбутина из сырья водой
2. Очистка водного извлечения основным ацетатом свинца
3. Кислотный гидролиз арбутина. Гидролиз проводится концентрированной серной кислотой в присутствии цинковой пыли, чтобы выделившийся свободный водород
предотвращал собственное окисление гидрохинона.
4. Титрование 0,1 М раствором йода. В качестве индикатора используют раствор крахмала.
O
OH
OH
J2
H2SO4, Zn
O - glucosa
OH
+
O
2 HJ
21
3. Спектрофотометрический метод используется для определения содержания салидрозида в сырье родиолы розовой.
Метод основан на способности окрашенного азокрасителя поглощать монохроматический свет при длине волны 486 нм. Стадии определения:
1. Извлечение салидрозида водой
2. Очистка водного извлечения осаждением балластных веществ раствором ацетата
свинца и натрия сульфата
3. Получение окрашенного азокрасителя по реакции салидрозида с диазотированным
сульфацилом натрия
4. Определение оптической плотности окрашенного раствора с помощью спектрофотометра при длине волны 486 нм
5. удельного показателя поглощения ГСО салидрозида Е1%1см = 253.
Содержание салидрозида не менее 0,8 %.
9. Качественное определение.
Специфических реакций для всех групп флавоноидов не существует.
Часто используют следующие качественные реакции и хроматографическое исследование:
1. Характерной реакцией на флавоноиды - Цианидиновая проба или
проба Синода (проба Chinoda)(основана на восстановление их атомарным водородом
в кислой среде в присутствии магния или цинка).
Флавоноиды при восстановлении магнием или цинком в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты образуют красное окрашивание, обусловливаемое
образованием антоцианидинов:
OH
O
HO
OH
O
HO
O
R
OH
Mg+HCl
2H+
O
OH
OH
OH
H
OH
хроменол
OR
HCl
- H2O
22
OH
+
O
HO
OH
Cl
-
OH
OH
цианидин хлорид
Реакция очень чувствительна, основана на восстановлении карбонильной группы и
образовании антоцианида.
Халконы и ауроны при помощи цианидиновой реакции не обнаруживаются, но при
добавлении конц. HCl (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.
1. Борно-лимонная реакция с реактивом Вильсона (по 0,5 г борной и лимонной кислот в метаноле).
Реакция отличия флавоноидов от фуранохромонов. Флавоноиды дают комплексы с
борной кислотой желтой окраски с желто-зеленой флюоресценцией, которые не разрушаются лимонной кислотой (образование батохромного комплекса):
OH
O
HO
OH
OH
O
O
B
O
O=C
O
C=O
3. Реакция с треххлористой сурьмой.
5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет:
23
OH
O
HO
OH
OH
O
O
Sb
Cl
Cl
2. С 2-5 %-ным спиртовым раствором AlCl3 желто-зеленое окрашивание говорит о
наличии флавоноидов. Образуются хелатные комплексы за счет водородных связей, возникающих между карбонильной и оксигруппой, желтого цвета с желто-зеленой флюоресценцией.
Эта реакция приведена в ГФ Х1 изд. для подтверждения подлинности сырья
зверобоя, горца перечного и птичьего. Аналогично образуются комплексы с солями
циркония.
3. Реакция с солями железа (хлорид окисного железа), образуются комплексные соединения, окрашенные в черно-синий цвет, если флавоноиды триоксипроизводные и в
зеленый, если диоксипроизводные.
4. Реакция с 1 %-ным раствором основного ацетата свинца.
Антоцианидины дают синий аморфный осадок. Флавоны, халконы и ауроны – осадки ярко-желтого цвета.
5. Реакция с 10 %-ным раствором щелочи с образованием фенолятов желтого цвета
на флавоны и флавонолы. Антоцианидины образуют со щелочами соли от синего до
оливково-зеленого цвета.
6. Реакция азосочетания с диазосоединениями. Образуется азокраситель оранжевого,
красного или вишнево-красного цвета.
8. С 1 %-м раствором ванилина в конц. HCl образуют красно-малиновое окрашивание катехины (производные флороглюцина и резорцина).
4. С раствором аммиака, щелочи флавоны, флаваноны, флавонолы, флаванонолы дают желтое окрашивание, при нагревании переходящее в оранжевое или красное;
халконы и ауроны тотчас же дают красное или пурпурное окрашивание.
Чистые катехины окрашивания не дают, однако присутствие даже в небольшом количестве примесей (продуктов окисления) вызывает появление желтой окраски.
Антоцианы в присутствии аммиака или карбоната натрия дают синее или фиолетовое
окрашивание.
5. С 1 %-м раствором ванилина в конц. HCl образуют красно-малиновое окрашивание
катехины (производные флороглюцина и резорцина).
6. Флавоны, халконы, ауроны, содержащие свободные орто-гидроксильные группировки в кольце В, при обработке спиртовых растворов средним уксуснокислым свинцом образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый и красный цвета.
24
Антоцианы образуют осадки, окра-
шенные как в красный, так и в синий цве-
та.
7. С 1-2 %-ным спиртовым раствором AlCl3 желто-зеленое окрашивание говорит о
наличии флавоноидов.
С целью обнаружения флавоноидов в растительном материале широко
используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента, колоночная хроматография.Используют различные системы растворителей:
-
БХ чаще всего БУВ (бутанол-уксусная кислота- вода) 4:1:5; 4:1:2;
-
ТСХ – хлороформ-метанол 8:3; 8:2.
Обнаружение компонентов на хроматограмме осуществляется просматриванием их в
УФ свете.
Идентифицируют флавоноиды по характерному свечению на хроматограммах в УФсвете и после проявления хромогенными реактивами.
Катехины и лейкоантоцианиды не флюоресцируют. Гликозиды флавонов и изофлавонов флюоресцируют голубым или синим светом, флавонолов – темно-коричневым или
черным, агликоны флавонов – коричневым, флавонолов – желтым, халконы и ауроны имеют желтую или оранжевую флюоресценцию.
После просматривания в УФ свете хроматограммы можно обработать одним из реактивов:
1) 5 %-ным спиртовым раствором AlCl3 c последующим нагреванием при 105 0С в течение 3-5 минут; (ярко-желтая окраска пятна в видимом свете и яркую желто-зеленую флуоресценцию в УФ –свете);
2) с 5 %-ной SbCl3 в четыреххлористом углероде (реактив Мартини-Беттоло); Желтая
или желто-оранжевая окраска указывает на наличие флавонов, флавонолов, флаванонов и
изофлавонов;красная или красно-фиолетовая – халконов.
3) с 2 %-ным спиртовым раствором щелочи
4) при обработке пятна парами аммиака усиливается голубая флуоресценция (изофлавоноиды)
что позволяет получить зоны с более яркой флуоресценцией в УФ свете.
5) Реактив Вильсона (раствор борной и б\в лимонной кислоты в б\в метаноле)
6) Реакция азосочетания – на наличие 7-оксифлаванолов, 7-оксиизофлаванолов.
Хроматографические методы анализа.
С целью обнаружения флавоноидов в растительном материале широко
используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.
Обнаружение компонентов на хроматограмме осуществляется просматриванием их в
УФ свете.
25
При этом флавоны, флавонол-3гликозиды, флаваноны, халконы и их 7гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен; ксантоны в виде оранжевых пятен.
Изофлавоны при этом не проявляются.
После просматривания в УФ свете хроматограммы можно обработать одним из реактивов:
1) 5 %-ным спиртовым раствором AlCl3 c последующим нагреванием при 105 0С в течение 3-5 минут; (ярко-желтая окраска пятна в видимом свете и яркую желто-зеленую флуоресценцию в УФ –свете);
2) с 5 %-ной SbCl3 в четыреххлористом углероде (реактив Мартини-Беттоло); Желтая
или желто-оранжевая окраска указывает на наличие флавонов, флавонолов, флаванонов и
изофлавонов;красная или красно-фиолетовая – халконов.
3) с 2 %-ным спиртовым раствором щелочи
4) при обработке пятна парами аммиака усиливается голубая флуоресценция (изофлавоноиды)
что позволяет получить зоны с более яркой флуоресценцией в УФ свете.
Реактив Вильсона (раствор борной и б\в лимонной кислоты в б\в метаноле)
5) Реакция азосочетания – на наличие 7-оксифлаванолов, 7-оксиизофлаванолов.
Количественное определение.
В последние годы все большее распространение получают различные:
1. физико-химические методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а
именно, быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и,
что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного
сырья.
К таким методам относятся фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия,
денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.
1. Сущность хроматоденситометрического метода заключается в выделении и
разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме.
Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности определения,
так как в данном случае исключается стадия элюирования.
2. фотоэлектроколориметрический метод, основанный на измерении оптической
плотности окрашенных растворов, полученных в цветных реакциях флавоноидов с солями
различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде, в реакции азосочетания с солями диазония.
ГФ Х1 издания дает ФЭК-метод для определения содержания суммы флавоноидов в
листьях вахты трехлистной. Предварительно сырье очищают от хлорофилла хлороформом,
получают спиртовое извлечение флавоноидов, затем измеряют оптическую плотность окра-
26
шенного раствора с помощью фотоэлектроколориметра. Содержание суммы флавоноидов рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному образцу рутина.
Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в смеси с кверцитином.
В настоящее время широко используется метод спектрофотометричекий.
3. Спектрофотометрический метод (СФМ)
СФМ основан на способности флавоноидов или их окрашенных комплексов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны.
1)
Получают спиртовое извлечение и измеряют собственное поглощение в:
-
цветках бессмертника песчаного при длине волны 315 нм, рассчитывают содержание флавоноидов на изосалипурозид с использованием оптической плотности ГСО
изосалипурозида;
-
корнях стальника при длине волны 260 нм; рассчитывают на
-
цветках пижмы измеряют оптическую плотность флавоноидов и фенолкарбоновых
кислот в буферном растворе и пересчитывают на лютеолин с учетом оптической
плотности ГСО лютеолина;
2)
ононина;
Получают спиртовое извлечение, затем проводят реакцию образования комплекса с 2 %-ным раствором алюминия хлорида и измеряют оптическую
плотность в:
-
траве зверобоя в пересчете на рутин с учетом оптической плотности ГСО рутина;
-
траве горца перечного в пересчете на кверцетин с учетом удельного показателя
поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом;
-
траве горца птичьего в пересчете на авикулярин с учетом удельного показателя
поглощения комплекса авикулярина с алюминия хлоридом.
3) Получают извлечение антоцианов 1 %-ным раствором хлористоводородной
кислоты из цветков василька синего, при этом образуются окрашенные оксониевые
соли, у которых измеряют оптическую плотность и пересчитывают на 3,5 дигликозид
цианидина (цианин) с учетом удельного показателя поглощения цианина в 1 %-ном
растворе хлористоводородной кислоты.
1.
Хроматоспектрофотометрический метод.
1. Предварительное разделение флавоноидов в тонком слое сорбента (цветки боярышника). Стадии определения:
- получение спиртового извлечения;
-
очистка извлечения;
-
хроматографическое разделение флавоноидов на пластинке «Силуфол» в системе растворителей хлороформ-метанол 8:2 вместе со свидетелем ГСО гиперозида;
27
- идентификация гиперозида и свиде-
теля на пластинках в УФ-свете;
- элюирование гиперозида и ГСО смесью диоксана и воды 1:1;
- измерение оптической плотности испытуемого раствора и ГСО при длине 565 им;
-
расчет содержания гиперозида.
2. Предварительное разделение на колонке с полиамидом (плоды боярышника)
Стадии определения:
- получают спиртовое извлечение;
-
отгоняют спирт и обрабатывают остаток 10%-ным раствором натрия хлорида;
-
полученный раствор наносят на колонку с полиамидом;
- элюируют флавоноиды с колонки 95%-ным этанолом, собирают окрашенный в желтый цвет элюат в мерную колбу на 25 мл;
- измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 365 нм;
- параллельно измеряют оптическую плотность элюата ГСО гиперозида, полученного
аналогично элюату флавоноидов;
- пересчитывают на гиперозид с учетом оптической плотности элюата ГСО
гиперозида.
3. В траве сушеницы топяной выделяют следующие стадии количественного
определения:
- получают спиртовое извлечение;
-
отгоняют спирт и остаток обрабатывают 10%-ным раствором натрия хлорида;
-
полученный раствор переносят на колонку с полиамидом;
- элюируют флавоноиды с колонки 95%-ным этанолом и собирают окрашенный в темно-желтый цвет элюат в мерную колбу на 50 мл;
- измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 338 нм;
- параллельно определяют оптическую плотность раствора стандартного вещества
сравнения (СОВС) калия бихромата;
- пересчитывают на гнафалозид А с учетом оптической плотности СОВС и
коэффициента пересчета калия бихромата на гнафалозид А и поправочного
коэффициента на неполное элюирование гнафалозида А с полиамидного сорбента.
4. Количественное содержание ксантонов в траве золототысячника:
- получают извлечение подкисленным 60%-ным этанолом;
-
2 мл извлечения наносят на колонку с полиамидным сорбентом;
- элюируют ксантоны 95%-м этанолом и собирают окрашенный в желтый цвет элюат в
мерную колбу на 50 мл;
28
- получают окрашенный комплекс с
алюминия хлоридом;
- измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса;
- параллельно измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса ГСО алпизарина с
алюминия хлоридом;
- пересчитывают на алпизарин с учетом оптической плотности комплекса ГСО алпизарина с алюминия хлоридом.
Количественное определение.
В последние годы все большее распространение получают различные:
1. физико-химические методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а
именно, быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и,
что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного
сырья.
К таким методам относятся фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия,
денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.
Сущность хроматоденситометрического метода заключается в выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой
окрашенной зоны на хроматограмме.
Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности определения,
так как в данном случае исключается стадия элюирования.
Используется фотоколориметрический метод, основанный на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным
реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.
Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в смеси с кверцитином.
В настоящее время широко используется метод спектрофотометричекий.
10. Методы анализа кумаринов
Для обнаружения кумаринов в растительном сырье проводят качественные реакции и хроматографическое исследование, используя лактонные свойства кумаринов:
- вступать в реакцию разрыва лактонного кольца (лактонная проба);
- давать окрашенные растворы с диазосоединениями;
- флуоресцировать в УФ-свете.
Качественный анализ
1. Лактонная проба (предложена Г.А.Кузнецовой). Параллельно проводят контроль-
29
ный опыт.
Методика: 1 мл извлечения, содержащего кумарины, наливают в две пробирки.
В одну добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора натрия гидроксида.
Обе пробирки нагревают на водяной бане, затем в обе прибавляют 4 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают.
Если в пробирке, куда добавляли щелочь, раствор остался желтым и прозрачным, значит, реакция положительная, так как образуется желтая растворимая в воде соль кумаровой кислоты.
В контрольной пробирке при добавлении воды раствор мутнеет, кумарины не растворяются в воде и выпадают в осадок.
При подкислении щелочного раствора лактонное кольцо замыкается и кумарины выпадают в осадок.
NaOH
O
H2CO3
HO
O
O
HO
C
ONa
ONa
2. Реакция образования азокрасителя. Реакция проводится с продуктами, полученными после реакции разрыва лактонного кольца.
Методика: В пробирку добавляют 1 мл свежеприготовленного диазореактива. Чаще
всего, в качестве диазореактива используют диазосульфаниловую кислоту. Образуется
азокраситель от желтого до вишнево-красного цвета.
1. Для идентификации кумаринов используют методы бумажной и тонкослойной
хроматографии. При этом используют системы растворителей:
- н-бутанол-уксусная кислота-вода БУВ (4:1:5)
- н-гексан-бензол-метанол (5:4:1);
- петролейный эфир-бензол-метанол (5:4:1);
Идентифицируют кумарины по характерной флюоресценции в УФ свете или проявляют
хромогенными реактивами.
В качестве проявляющих реактивов служат 1%-ный спиртовый раствор алюминия хлорида,
10%-ный раствор щелочи или пары аммиака.
Широкие возможности для обнаружения в растениях и сырье кумаринов, не только их
суммы, но и отдельных соединений, открылись после внедрения хроматографического анализа. При этом указанные реактивы используют и для обработки хроматограмм.
4. Хроматографические методы удобны для выделения индивидуальных кумаринов.
30
Количественное определе-
ние.
Для количественного определения кумаринов в лекарственном РС используют гравиметрические, титриметрические и физико- химические методы анализа.
По существующей нормативной документации для количественного определения кумаринов в лекарственном растительного сырье используют физико-химические методы анализа.
1. Полярографический метод. Определение кумаринов в плодах пастернака.
Основан на восстановлении кумаринов на ртутно-капельном электроде в альфапироновом кольце по месту двойной связи в положении 3,4. Присоединяют галоген - йод,
в качестве реактива используют тетраэтиламмоний йодид. Содержание комариное в пересчете на ксантотоксин не менее 1%.
2. Спектрофотометрический метод. Основан на способности кумаринов поглощать
монохроматический свет при определенной длине волны в зависимости от концентрации исследуемого раствора. Используют
для определения содержания простых кумаринов в траве донника лекарственного (не
менее 0.4%) и пиранокумаринов в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского (не
менее 3 %). Получают хлороформное извлечение из сырья и измеряют у него оптическую
плотность с помощью спектрофотометра.
3. Хроматоспектрофотометрический метод. Применяют для определения содержания фуранокумаринов в плодах амми большой, псоралеи костянковой, листьях инжира.
Стадии определения:
1. Получение хлороформного извлечения из сырья.
2. Разделение суммы кумаринов методом хроматографии на бумаге в системе растворителей, указанной в нормативной документации.
3. Идентификация кумаринов в УФ-свете по характерному свечению.
4. Элюирование веществ с бумаги. Каждое вещество отдельно
элюируют 95 %-ным этанолом.
5. Измерение оптической плотности растворов с помощью спектрофотометра при длине волны, указанной в нормативной документации.
6. Расчет содержание каждого соединения с учетом удельного
показателя поглощения.
Плоды амми большой: бергаптена и изопимпинеллина не менее 0,6 %.
Плоды псоралеи костянковой: псоралена и изопсоралена не менее 0,9 %.
Листья инжира: псоралена и бергаптена не менее 0,7%, отдельно псоралена менее 0,42
%.
4. Гравиметрический (весовой) метод.
Основан на избирательной растворимости отдельных кумаринов в различных растворителях и способности лактонного кольца кумарина к раскрытию и обратному замыканию в
зависимости от рН среды.
Используется редко только для определения суммы кумаринов.
5. Фотоэпектроколориметрический метод.
31
Основан на измерении оптической
плотности окрашенного раствора, полученного по реакции азосочетания с солями диазония при определенной длине волны.
Содержание суммы кумаринов рассчитывают по калибровочному графику, построенному по известному веществу.
Алкалоиды - Различают
общие качественные реакции, с помощью которых доказывается присутствие алкалоидов в сырье или в извлечении из сырья, и
частные качественные реакции, с помощью которых доказывают или индивидуальный алкалоид или определенную группу алкалоидов.
Общие реакции –
это либо реакции осаждения, либо реакции окрашивания.
Реакции осаждения основаны на способности алкалоидов к комплексообразованию.
Образующиеся комплексы нерастворимы или мало растворимы в воде.
Общеалкалоидные осадочные реактивы можно разделить на несколько групп:
1 группа.
Йод и его растворы.
Образуют с алкалоидами перйодиды, плохо растворимые в воде:
1) пары йода используют для открытия алкалоидов на хроматограммах;
2) раствор йода в KJ (реактив Вагнера, реактив Бушарда).
С алкалоидами образуют бурые, трудно растворимые в воде осадки.
2 группа.
Комплексные йодиды металлов:
1) Реактив Драгендорфа - калия тетрайодовисмутат (KBiJ4) - образует оранжевые
или красно-бурые нерастворимые осадки.
Реакцию с реактивом Драгендорфа, согласно действующей НД, используют для
обнаружения (проявления) алкалоидов крестовника плосколистного на хроматограмме.
2) Реактив Майера - тетрайодомеркурат калия (K2HgJ4) - образует осадки белого
или желтоватого цвета.
Реакцию с реактивом Майера широко используют для проверки полноты экстракции
алкалоидов при их количественном определении в сырье красавки обыкновенной, белены
черной, дурмана обыкновенного, анабазиса безлистного.
3 группа.
Реакгивы комплексных неорганических кислот (высокомолекулярные органические вещества кислого характера):
1) Реактив Бертрана - раствор кремневольфрамовой кислоты
(SiO2 . 12 WO3 . 4 H2O ) - образует белый аморфный осадок. Реакцию с реактивом
32
Бертрана используют:
- для подтверждения наличия алкалоидов в извлечении из листа барбариса и травы
пассифлоры (качественные реакции);
-
для проверки полноты экстракции алкалоидов при их количественном определении в траве плауна-баранца и чистотела, листьях и корнях барбариса;
2) реактив Шейблера - раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты (НзРО4 .12 WО3 .
2Н2О) - образует белые аморфные осадки;
3) реактив Зоненштейна - раствор фосфорно-молибденовой кислоты (НзРО4 •
12МоОз 2Н2О) - образует желтоватые аморфные осадки.
Все эти реактивы высокочувствительны и часто используются в исследовательских работах.
4 группа.
Органические вещества кислотного характера:
1) раствор пикриновой кислоты - дает осадки желтого цвета.
Реакцию используют для осаждения алкалоида скополамина при его гравиметрическом определении в семенах дурмана индейского;
2) раствор танина - образует беловатые или бурые осадки.
Танин используют в качестве противоядия при отравлении алкалоидами. Танин блокирует поступление и всасывание алкалоидов.
Реакции окрашивания (частные реакции)
основаны на окислении, конденсации, дегидратации алкалоидов концентрированными кислотами и другими окислителями.
Используют:
1) конц. H2SO4 - качественная реакция на корень барбариса (берберин) получается
оранжево-красное окрашивание,
и на наличие алкалоидов в очищенном извлечении (сухой остаток) из корневищ с
корнями чемерицы – образуется бурое окрашивание;
2) конц.HNO3 - качественная реакция на корень барбариса (берберин) - красно-бурое
окрашивание;
3) раствор H2O2 - качественная реакция на корень барбариса (берберин) - фиолетовое окрашивание;
4) раствор K2Cr2O7 и конц.H2SO4 - качественная реакция на стрихнин - краснофиолетовое окрашивание;
5) раствор K2Cr2O7 и конц.НNO3 - качественная реакция на бруцин - оранжевокрасное окрашивание.
Две последние реакции на наличие алкалоидов в очищенном извлечении из семян
чилибухи.
6) реакция на алкалоиды спорыньи - алкалоиды переводят в соли винной кислоты и
добавляют реактив Ван-Урка (конц.H2SO4 + FeCl3 + п-диметиламинобензальдегид) – образуется фиолетовое окрашивание.
33
Эту реакцию используют для подтверждеколичественного определения алкалоидов.
ния подлинности сырья, а также в методе
В анализе могут быть использованы:
- реактив Эрдмана - смесь конц.HNОз и конц.Н2SO4 ;
- реактив Марки - раствор формалина в конц. H2SO4;
- реактив Фреде - раствор молибдата натрия в конц. H2SO4.
Окраска в зависимости от алкалоидов различна.
Для некоторых алкалоидов существуют групповые качественные реакции, такие как:
«реакция Витали-Морена» (тропановые алкалоиды),
«мурексидная проба» (на пуриновые алкалоиды),
H3C
N
O
O
H3C
O
CH3
N
N
H2O2
H3C
N
+
O
C=O
CH3
O
N
NH
N
O
CH3
NH2
метил-
1,3-диметилаллоксан
мочевина
O
O
HO
O
N
N
OH
N
HCl
O
O
O
H3C
N
O
O
CH3
O
N
O
O
CH3
CH3
CH3
N
тетраметилаллоксантин
1,3-диметилалуровая
кислота
O
O
H3C
CH3
N
O
NH4OH
N
N
N
CH3
O
NH4O
N
O
CH3
аммонийная соль тетраметилпурпуровой кислоты
Эта реакция основана на разрушении молекулы пурина при нагревании с окислителем
34
(перекисью водорода, бромной водой,
азотной кислотой). Происходит образование смеси производных аллоксана и его изомера диалуровой кислоты. Взаимодействуя между собой, они образую метилированные производные аллоксантина, которые под действием
избытка раствора аммиака приобретают пурпурно-красное окрашивание. Окраска обусловлена появлением аммонийной соли метилированного производного пурпуровой кислоты.
Таким образом, общей специфической качественной реакции на алкалоиды не существует.
Если проводят поиск алкалоидсодержащих растений, то всегда выполняют 5-10
реакций с общеалкалоидными реактивами, т.к. чувствительность реакций различна. Обычно эти реакции выполняют капельным способом на стеклянных пластинках.
Для выделения или разделения суммы алкалоидов пользуются методом хроматографии на бумаге.
Для обнаружения алкалоидов достаточно нанести на полоску фильтровальной бумаги каплю испытуемого раствора и "проявить" соответствующим реактивом.
Количественное определение алкалоидов
Единой методики количественного определения содержания алкалоидов в растительном сырье не существует, т.к. их химическая структура, физические кие свойства различны.
Разработаны индивидуальные методики определения содержания алкалоидов или
групповые методики (определение тропановых алкалоидов). Все методики количественного определения алкалоидов в растительном сырье многоэтапные. Относительная точность их невелика.
В ходе анализа обычно выделяют следующие этапы (стадии):
1. Извлечение суммы алкалоидов из сырья.
Алкалоиды извлекают в виде солей или в виде оснований.
Alk-соли - В этом случае сырье обрабатывают слабыми растворами органических
или минеральных кислот, соли которых хорошо растворимы в воде или спирте. Используют винную, лимонную, уксусную, серную, соляную и другие кислоты.
В извлечение попадают углеводы, белки и другие сопутствующие вещества.
Alk-основания – В этом случае сырье смачивают концентрированным раствором
аммиака. Едкие щелочи не используют, т.к. они образуют феноляты, вызывают гидролиз,
изомеризацию алкалоидов.
Раствор аммиака вытесняет алкалоиды-основания из солей.
Алкалоиды-основания извлекают органическим растворителем (эфиром, хлороформом, бензолом и др.). В извлечение попадают воски, каротиноиды, фенольные соединения.
Извлечение проводят многократно новыми порциями до полного истощения. Полученные порции объединяют.
2. Очистка извлечения от балластных веществ.
Обычно проводят путем двух- или трехкратной сменой растворителя. Реже используют
ионообменную или адсорбционную хроматографию.
35
3. Разделение суммы алкалоикалоидов.
дов и выделение индивидуальных ал-
Выполняют в тех случаях, когда оценку качества сырья проводят не по сумме алкалоидов, а по содержанию индивидуального алкалоида, определяющего основное фармакологическое действие сырья.
Разделение основано на различных физико-химических свойствах
алкалоидов, извлеченных из сырья:
1) на способности перегоняться с водяным паром.
Например, пахикарпин из суммы алкалоидов травы софоры толстоплодной отделяют
путем отгонки его с водяным паром;
2) на различной растворимости алкалоидов в органических растворителях.
Например, колхамин из суммы алкалоидов клубнелуковиц безвременника отделяют, используя его плохую растворимость в ацетоне;
3) на различной растворимости полученных комплексов с общеалкалоидньми реактивами, т.е. используют реакции осаждения. Например, скополамин из суммы алкалоидов семян дурмана индейского отделяют в виде солей пикриновой кислоты
(пикрата).
Для разделения используют также различные виды хроматографии.
4. Собственно количественное определение проводят различными методами:
1) гравиметрический (весовой) метод.
Алкалоиды переводят в весовую форму, осадок отделяют, высушивают, взвешивают.
Этим методом определяют алкалоиды-основания клубнелуковиц безвременника. плауна-баранца; алкалоиды-соли травы крестовника плосколистного, семян дурмана индейского, листьев барбариса;
2) титриметрические методы:
а) ацидиметрического прямого титрования (алкалоиды побегов анабазиса, травы софоры толстоплодной, семян чилибухи);
Ь) ацидиметрического обратного титрования (алкалоиды листьев и корней красавки, листьев белены, листьев дурмана обыкновенного, травы термопсиса ланцетного, корневищ с корнями чемерицы),
с) для определения алкалоидов чая используют йодометрический метод
титрования;
обратного
d) титрование в неводных средах:
- точку эквивалентности определяют, используя индикатор на алкалоиды
(корневища кубышки, травы барвинка малого, клубней с корнями стефании
гладкой);
- точку эквивалентности определяют потенциометрически (алкалоиды травы чистотела)
36
3) физико-химические (инструментальные) методы:
а) фотоэлектроколориметрический метод (алкалоиды коробочек мака снотворного, рожков спорыньи, травы мачка желтого, листьев катарантуса розового, листьев унгернии Виктора, травы крестовника плосколистного, травы софоры толстоплодной,
травы паслена дольчатого, клубней с корнями стефании гладкой);
Ь) спектрофотометрический метод (алкалоиды корней барбариса, семян и травы
термопсиса очередноцветкового, травы маклейи, плодов стручкового перца);
с) полярографический метод (алкалоиды семян термопсиса ланцетного, корневищ
кубышки желтой).
прозрачка
Так, например, количественное определение алкалоидов группы тропана в листьях красавки, белены, дурмана Государственная Фармакопея XI (вып.2, ст. 13, 17, 24)
предлагает проводить ацидиметрическим методом (вариант обратного титрования).
Метод основан на способности тропановых алкалоидов-оснований образовывать соли под действием кислоты хлористоводородной, т.е. на слабых основных свойствах алкалоидов; избыток кислоты хлористоводородной титруют раствором натрия гидроксида.
При этом, предварительно алкалоиды переводят в форму оснований, извлекают их из
сырья эфиром, проводят очистку методом двукратной смены растворителей, удаляют экстрагент и растворяют сухой остаток суммы оснований алкалоидов в кислоте хлористоводородной (НС1), избыток которой оттитровывают щелочью.
Содержание суммы алкалоидов вычисляют в процентах в пересчете на гиосциамин в
абсолютно сухом сырье.
Этапы определения:
-
подготовительный;
-
экстракция из сырья: алкалоиды переводят в форму оснований, извлекают из сырья эфиром без нагревания;
-
очистка полученного извлечения: проводят методом двукратной смены растворителей;
-
непосредственно количественное определение: удаление экстрагента, растворение сухого остатка суммы оснований алкалоидов в кислоте хлористоводородной
(алкалоиды-основания переводят в форму солей); титрование избытка кислоты
хлористоводородной натрия гидроксидом;
-
расчет результатов по формуле, сопоставление с данными нормативной документации.
Подобное определение рекомендовано и для травы термопсиса ланцетного (ГФХ1, вып. 2, ст. 59).
Оценку количественного содержания алкалоидов в семенах чилибухи (ГФ Х, ст.606)
проводят ацидиметрическим методом (прямое титрование).
37
При этом, предварительно алкалоиды переводят в форму оснований, извлекают из сырья эфиром, проводят экстракционную очистку, удаляют экстрагент, растворяют
сухой остаток суммы оснований алкалоидов в этаноле и титруют хлористоводородной
кислотой (НС1).
Количественное определение алкалоидов в сырье спорыньи проводят
элетроколориметрическим методом (ГФ-Х, ст. 599).
12. Анализ сырья, содержащего СГ.
Качественные реакции на СГ проводят с очищенным спиртовым извлечением из
растительного сырья.
Все реакции на СГ можно разделить на 3 группы:
- реакции
Килиани);
на углеводную часть молекулы (2-дезоксисахара)
(реакция Келлер-
- на стероидную структуру (реакция Либермана-Бухарда);
- на лактонное ненасыщенное кольцо.
1. Реакции на стероидную структуру.
Основаны на способности стероидного ядра СГ подвергаться дегидратации под действием кислотных реагентов (уксусный ангидрид, конц. серная кислота, трихлоруксусная
кислота) с образованием окрашенных комплексных соединений. Образующиеся в результате реакций окрашивания меняются во времени, поэтому необходимо наблюдать их в момент соприкосновения реактивов, а затем отмечать изменение окраски в течение 10-15 минут.
Для СГ обычно проводят реакции:
1. Реакция Либермана-Бурхарда. При взаимодействии СГ со смесью уксусного ангидрида и конц. серной кислотой появляется розовое окрашивание, переходящее в зеленое.
2. Реакция Розенгейма. При взаимодействии СГ с 90% водным раствором трихлоруксусной кислоты появляется розовое окрашивание, переходящее в лиловое и затем в синее.
3. Реакция с хлоридом сурьмы (III). СГ при взаимодействии с хлоридом сурьмы в
среде уксусного ангидрида образуют лиловое окрашивание
2. Реакции на ненасыщенное лактонное кольцо.
Основаны на способности ненасыщенного лактонного кольца легко окисляться в щелочной среде с образованием окрашенных продуктов реакции. Для СГ обычно проводят
реакции:
1. Реакция Балье. При взаимодействии с пикриновой кислотой в щелочной среде СГ
образуют комплексы, окрашенные в оранжевый цвет.
38
2. Реакция Кедде. При взаимодействии с 3,5-динитробензойной кислотой
СГ образуют комплексы, окрашенные в красный цвет,
3. Реакция Легаля. При взаимодействии с нитропруссидом натрия в щелочной среде
СГ образуют комплексы, окрашенные в красный цвет.
4. Реакция Раймонда. При взаимодействии с мета-динитробензолом СГ образуют
комплексы, окрашенные в красно-фиолетовый цвет.
3. Реакции на углеводную часть молекулы.
Основаны на способности моносахаридов углеводной цепи образовывать окрашенные комплексы с различными реактивами.
1. Моносахара, входящие в состав СГ, после предварительного гидролиза вступают
во все цветные реакции, свойственные углеводам (Феллинга, серебряного зеркала).
2. Для дезоксисахаров используют реакцию Келлер-Килиани.
Дезоксисахара в присутствии сульфата железа (III), ледяной уксусной кислоты и конц.
серной образуют комплексы, окрашенные в синий или сине-зеленый цвет. Необходимым
условием для проведения этой реакции является отсутствие на конце углеводной цепи
обычных сахаров (глюкозы).
Достоверное заключение о присутствии в лекарственном растительном сырье СГ
можно сделать только при положительном результате всех трех групп качественных реакций на различные части молекулы.
В ГФ-Х1 на сырье наперстянок пурпурной и крупноцветковой, ландыша майского и
горицвета весеннего качественных реакций не предусмотрено.
Кроме того, СГ образуют нерастворимые комплексы с растворами дубильных веществ,
что используется при отравлениях СГ.
Количественное определение СГ проводят методом биологической стандартизации (ГФ-Х1, вып.2, с. 163-175).
Метод основан на способности СГ вызывать в токсических дозах остановку сердца
животных в стадию систолы. В качестве подопытных животных используют лягушек, голубей или кошек. Чувствительность животных к сердечным гликозидам определяют в
сравнении со стандартными индивидуальными веществами или экстрактами, которые вырабатывают в специальных научно-исследовательских институтах. Активность выражают в
единицах действия (ЕД), которые, в зависимости от вида животных обозначают:
ЛЕД - «лягушачьи» ЕД, КЕД - «кошачьи» ЕД или ГЕД «голубиные» ЕД.
ЛЕД соответствует наименьшей дозе стандартного препарата, вызывающей остановку
сердца стандартной лягушки (самец травяной лягушки массой 28-33 г). В нормативной документации на лекарственное сырье и препараты, содержащих СГ, обязательно указывается ВАЛОР (количество ЕД в 1 г сырья).
Недостатками метода биологической стандартизации являются его трудоемкость, высокая стоимость, большая ошибка опыта (до 25%).
39
Поэтому нормативная документация на некоторые виды сырья и препараты
требует определять их количественное содержание физико-химическими методами (хроматофотоэлектроколориметрическим или хроматоспектрофотометрическим) методами. Они
основаны на предварительном хроматографическом разделении СГ с последующим фотоэлектроколориметрическим или спектрофотометрическим определением.
13. Оценка качества сырья, содержащего витамины.
Методы анализа.
Согласно существующей нормативной документации подтверждают присутствие витаминов только в листьях крапивы. Определяют наличие витамина К1.
Метод определения хроматографический. Определение основано на способности витамина К1 флюоресцировать в УФ-свете.
Экстрагируют из растительного сырья витамин К1 гексаном.
Хроматографическое разделение проводят восходящим способом на пластинке «Силуфол» при температуре 40-70 0С.
Система растворителей: бензол - петролейный эфир (1:1). Готовую хроматограмму выдерживают в УФ-свете при длине волны 360 нм (2 минуты). На пластинке— должно появиться пятно с желто-зеленой флюоресценцией.
Количественное определение витаминов проводят в плодах шиповника (витамин С) и
облепихи (каротиноиды в пересчете на β-каротин).
Плоды шиповника - ГФ XI изд., стр.274 - витамина С должно быть не менее 0,2%.
Метод определения - титриметрический. Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия.
HO
OH
Cl
HCl
+
H
O
O
ONa
N
O
HOCH
Cl
CH2OH
аскорбиновая кислота
O
2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия
O
Cl
+
H
O
O
NH
HO
OH
HOCH
Cl
CH2OH
дигидроаскорбиновая
2,6-дихлорфенолиндофенол
кислота (восстановленная форма)
+
NaCl
40
2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой - красную, а при восстановлении - обесцвечивается.
Определение ведут в кислой среде. В качестве титранта используют натриевую соль.
Титруют до розового окрашивания.
Для сырья шиповника, которое используют для изготовления «Холосаса», «Каротолина» и сиропов определяют содержание органических кислот (не менее 2,6%). Метод прямого титрования, основанный на нейтрализации органических кислот раствором NаОН. Индикаторы - фенолфталеин и метиленовый синий. Титруют до лилово-красной окраски.
Плоды облепихи свежие - ФС 42-1052-76.
Содержание каротиноидов в пересчете на β-каротин должно быть не менее 10 мг%.
Метод определения фотоэлектроколориметрический.
Метод основан на определении оптической плотности естественно окрашенного раствора каротиноидов при длине волны 450 нм.
Растворитель - бензин или петролейный эфир. Стандартный раствор - бихромат калия.
Оценку качества витаминосодержащего сырья проводят и по другим группам биологически активных веществ: полисахаридов (трава череды), флавоноидов (трава сушеницы),
дубильных веществ (кора калины), экстрактивных веществ (кора калины, цветки календулы, столбики с рыльцами кукурузы, трава пастушьей сумки).
Для сырья крапивы, рябины, земляники, смородины - количественного определения
биологически активных веществ не проводят.
Из 88 видов лекарственного растительного сырья, включенного в ГФ-Х1 в 17 видах
сырья не проводится количественной стандартизации сырья.
1. Цветки липы.
10. Плоды черники.
2. Цветки календулы.
11. Плоды жостера слабительного
3. Цветки бузины черной.
12. Плоды рябины.
4. Листья мать-и-мачехи.
13.Плоды калины.
5. Листья крапивы.
14. Семена льна.
6. Трава хвоща полевого.
15. Семена тыквы.
7. Трава горца почечуйного.
16.Семена лимонника.
8. Корни алтея.
17. Плоды лимонника.
9. Корневища и корни девясила.
Биологические свойства.
Сердечные гликозиды способны вызывать в токсических дозах остановку сердца животных в стадию систолы. В качестве подопытных животных используют лягушек, голубей
или кошек. Чувствительность животных к сердечным гликозидам определяют в сравнении
со стандартными индивидуальными веществами или экстрактами, которые вырабатывают в
специальных научно-исследовательских институтах.
Сапонины в виде гликозидов токсичны для холоднокровных (рыбы, ля-гушки, круглые
черви). Они нарушают функцию жабр, которые являются не столько органом дыхания, но и
41
регулятором солевого осмотического давления в морганизме. Сапонины парализуют или
вызывают гибель холоднокровных даже в небольших разведениях (1:1000000).
Также они обладают гемолитической активностью, т.е. способны растворять липидную
часть оболочки эритроцитов. В результате этого оболочка из полупроницаемой становится
проницаемой, гемоглобин свободно поступает в плазму крови и растворяется в ней. Образуется красный прозрачный раствор - «лаковая кровь».
В связи с этим сапонины не применяются для внутривенного введения, так как вызывают анемию. При приеме внутрь, после гидролиза в желудочно-кишечном тракте до агликонов, сапонины теряют гемолитическую активность. Все указанные выше свойства биологически активных веществ используются в анализе лекарственного растительного сырья.
Качественный химический анализ.
Для установления подлинности лекарственного растительного сырья используют простейшие качественные реакции и хроматографические пробы на действующие и сопутствующие вещества, основанные на их свойствах. Методика изложена в соответствующей
нормативной документации на исследуемый вид сырья в разделе "Качественные реакции".
По технике выполнения и характеру получаемых результатов химические реакции делят на несколько групп;
1) качественные реакции;
2) микрохимические реакции;
3) гистохимические реакции;
4) микросублимация.
Качественные реакции.
I. Качественные реакции выполняют на сухом сырье с такими видами сырья: коры дуба, калины, крушины, корневища бадана, корневища и корни девясила, корни одуванчика,
алтея, женьшеня, барбариса, цветки липы, семена льна, склероции спорыньи (всего по существующей НД - для 12 видов сырья).
II. В основном качественные реакции проводят с извлечением из лекарственного растительного сырья. Исходя из свойств биологически активных веществ, их извлекают из сырья
водой, спиртом различной концентрации или органическим растворителем, реже с добавлением щелочи или кислоты.
Водное извлечение готовят из сырья содержащего гликозиды: полисахариды, сапонины, фенологликозиды, антрагликозиды, дубильные вещества.
Подкисленной водой извлекают из сырья алкалоиды в виде солей.
Большую группу биологически активных веществ извлекают этиловым и метиловым спиртом различной концентрации (сердечные гликозиды, кумарины, лигнаны, флавоноиды).
Если реакция достаточно специфична и чувствительна, то ее проводят с неочищенным
извлечением из сырья. Например:
1) общеалкалоидные осадочные реакции;
42
2) реакции с раствором хлорида алюминия на флавоноиды (трава зверо- боя, горца
птичьего, горца перечного);
|
3) проба Синода на флавоноиды в цветках бессмертника;
4) реакция с раствором щелочи на антраценпроизводные (кора крушины, корни ревеня);
5) реакция с раствором железоаммонийных квасцов на дубильные веще- ства (кора дуба, корневища змеевика, бадана).
Часто проведению реакции мешают сопутствующие вещества (белки, амины, стерины,
хлорофилл), в этом случае используют очищенное извлечение (например, из сырья, содержащего сердечные гликозиды, кумарины, алкалоиды, фенологликозиды, лигнаны).
Очищают извлечение осаждением сопутствующих веществ раствором ацетата свинца и
сульфата натрия или используют прием смены растворителей, либо метод распределительной хроматографии.
Микрохимические реакции.
Микрохимические реакции проводят обычно одновременно с микроскопическим анализом, наблюдая результаты под микроскопом:
1) на эфирное и жирное масло с раствором Судан III;
2) на одревесневшие лигнифицированные элементы с раствором флорог-люцина и 25%
раствором серной кислоты или конц. хлористоводородной кислоты. На кору дуба (порошок) проводят реакцию с железоаммонийными квасцами, результат реакции изучают под
микроскопом.
Гистохимические реакции.
Гистохимические реакции — это такие реакции, с помощью которых можно выявить те
или иные соединения непосредственно в клетках или структурах, где они локализуются.
По ГФ-Х1 гистохимические реакции проводят на слизь с раствором туши в корнях алтея
и семенах льна.
Микросублимация.
Микросублимация - непосредственное выделение из сухого растительного материала веществ, которые легко возгоняются при нагревании. Полученный сублимат исследуют под
микроскопом, затем проводят микрохимическую реакцию с соответствующим реактивом
(ГФ-Х1 - кора крушины).
Хроматографический анализ.
Для разделения многокомпонентных смесей, какими являются извлечения из сырья,
для очистки и идентификации соединений используют хроматографию.
По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную и газожидкостную хроматографию. Чаще используют распределительную восходящую хроматографию на бумаге и в тонком слое сорбента - силикагель, окись алюминия, различные полимеры (неподвижная фаза). В качестве подвижной
фазы используют систему растворителей. Для эффективного разделения имеет значение
43
подбор компонентов подвижной фазы.
Руководствуются элюотропным рядом растворителей по Шталю (гексан, гептан, циклогексан, четыреххлористый углерод, бензол, хлороформ, эфир, этилацетат, пиридин, ацетон, этанол, метанол, вода). Растворители расположены в порядке возрастания полярности.
Система растворителей и методика указаны в нормативной документа- ции на сырье.
Чаще используют: бутанол-уксусная кислота-вода (БУВ) 4:1:5 4:1:2; хлороформ-метанол
1:9, 2:8; уксусная кислота-вода 15:85.
При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге или пластинке зоны или пятна, которые обнаруживают по их свечению в ультрафиолетовом свете. В
зависимости от химической природы вещества буде наблюдаться характерная флюоресценция. Достоверность идентификации сырья методом хроматографии повышается, если
полученную хроматограмму проявить хромогенными реактивами. Используют реактивы
для качественных реакций, которые дают специфические, устойчивые окраски.
Методом хроматографии на бумаге подтверждают подлинность сырья, содержащего
флавоноиды (трава череды, листья вахты трехлистной, корни стальника), алкалоиды, антраценпроизводные, кумарины.
В тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол» идентифицируют са-понины (корни
аралии и женьшеня), флавоноиды (трава хвоща полевого, цветки и плоды боярышника),
фенологликозиды (корневища и корни родиолы розовой), витамины (листья крапивы, кора
калины), лигнаны, иридоиды.
Широко используют все методы хроматографии в научно- исследовательских целях
для выделения и анализа всех биологически активных веществ лекарственных растений.
При анализе побегов багульника болотного (ГФ—Х1) и его эфирного масла, используемых для производства препарата «Ледин», применяют метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Метод ГЖХ высокочувствителен, универсален, специфичен и позволяет автоматизировать процесс контроля. Недвижной фазой является жидкость, нанесенная на
твердый инертный носитель, подвижной фазой является газ. Разделение компонентов происходит за счет различной растворимости компонентов эфирного масла в неподвижной фазе (жидкости).
Компоненты перемещаются по неподвижной фазе с различной скор , стью, в результате чего выходят друг за другом в потоке газа-носителя. В качестве газа-носителя применяют азот, гелий, водород. Анализ проводится в различных газовых хроматографах марки
ЛХМ-72, "Хром-4" с плазменным ионизационным детектором с применением внутреннего
стандарта. Хроматограмма записывается на диаграммной ленте в виде пиков.
В последнее время успешно развивается высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Это вариант колоночной хроматографии на полиамиде, но подвижная фаза
(жидкость) проходит через колонку с большой скоростью за счет высокого давления. Это
удобно для разделения, качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений (например, сердечные гликозиды).
Подлинность сырья, содержащего горечи, подтверждает органолептиче-ский показатель - горький вкус. Показатель горечи - это наибольшее разведение водного извлечения из
1 г сырья или препарата, при котором ощущается горький вкус. В качестве стандарта используется раствор хинина (1:200 000). В настоящее время этот показатель используется
только в поисковых работах.
Методы количественного определения БАВ.
44
Методики определения количественного содержания действующих веществ описаны в
соответствующей частной нормативной документации. Выбор метода зависит от физических и химических свойств БАВ. Используют гравиметрические (весовые), титриметрические (объемные) и физико-химические (инструментальные) методы анализа.
Гравиметрические методы.
Гравиметрические (весовые) методы основаны на избирательной различной растворимости биологически активных веществ в воде и неполярных органических растворителях.
Применяют для сырья, содержащего гликозиды, например, полисахариды (хорошо растворимы в воде и нерастворимы в крепких спиртах - осаждаются 95% этанолом), сапонины
(растворимы в метиловом спирте и не растворимы в диэтиловом эфире и ацетоне); лигнаны, дубильные вещества (осаждение желатином, солями тяжелых металлов или адсорбция
кожным порошком); алкалоиды, выделяемые в виде солей или в виде оснований.
Методы просты в исполнении, но длительны, т.к. выделившийся осадок отделяют
фильтрованием или центрифугированием, высушивают и доводят до постоянной массы.
Кроме того, метод дает завышенные результаты, потому что, вместе с БАВ осаждаются и
сопутствующие вещества. Но для некоторых видов сырья, например, содержащего полисахариды, этот метод наиболее специфичен.
Гравиметрический метод предложен в ГФ-Х1 на листья подорожника большого, траву
череды, слоевища ламинарии; в частных НД - на сырье безвременника, дурмана индейского, плауна-баранца.
Титриметрические методы.
Титриметрические (объемные) методы основаны на химических свойствах биологически активных веществ:
1. На их способности легко окисляться:
- перманганатом калия (дубильные вещества);
- раствором йода (простые фенольные соединения - арбутин);
- 2,6-дихлорфенолиндофеолятом натрия (аскорбиновая кислота).
2. На основных свойствах основаны титриметрические методы определения алкалоидов. Алкалоиды ведут себя как основания и могут быть определены путем:
|
- прямого титрования (например, сырье анабазиса, софоры толстоплодной, чилибухи);
- обратного титрования (сырье белены, дурмана, красавки, трава термопсиса, корневища с корнями чемерицы) растворами кислот.
Слабые основания определяют методом кислотно-основного титрования и в неводных
средах, где титрантом служит хлорная кислота. Точку эквивалентности устанавливают по
индикатору или потенциометрически (ГФ-Х1 - трава чистотела — метод неводного потенциометрического титрования).
Титриметрические методы экономичны, быстры в исполнении, но недостаточно точны
и дают завышенные результаты. С их помощью можно определить только сумму биологически активных веществ.
45
Физико-химические методы.
Наиболее точны и высокочувствительны фотометрические методы (фотоколориметрия и спектрофотометрия), основанные на измерении количества света, поглощенного веществом, суммой веществ или комплексом вещества в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной области спектра. Используют фотометрические методы для определения почти
всех групп биологически активных веществ (сердечные гликозиды, экдистероны, сапонины, кумарины, хромоны, лигнаны, флавоноиды, антраценпроизводные, дубильные вещества, алкалоиды, каротиноиды).
Фотоэлектроколориметрические методы основаны на измерении степени поглощения немонохроматического (полихроматического) света на довольно широком участке
спектра окрашенных растворов с помощью фотоэлектроколориметра. Для получения окрашенных соединений используют реактивы, дающие яркие, устойчивые окраски; на флавоноиды, кумарины, фенологликозиды проводят реакцию образования азокрасителя с диазотированными сульфаниламидами (ГФ-Х1 - листья вахты, корневища и корни родиолы розовой),
Для анализа алкалоидов используют частные цветные реакции, основанные на
окислении, конденсации и дегидратации алкалоидов концентрированными кислотами
(коробочки мака, трава мачка желтого).
Антраценпроизводные дают вишнево-красное окрашивание со щелочами (кора
крушины, корни ревеня, корневища и корни марены красильной).
Спектрофотометрические методы основаны на способности веществ и их окрашенных продуктов реакции избирательно поглощать монохроматический свет в определенной области спектра. Такими свойствами обладают флавоноиды, кумарины, антраценпроизводные, сапонины, индивидуальные алкалоиды, экдистероны. Измерение
проводят с помощью спектрофотометра. Для большинства видов сырья, содержащих
флавоноиды, измеряют:
- собственное поглощение суммы флавоноидов (ГФ-Х1 - цветки бессмертника, цветки
пижмы);
- поглощение окрашенного комплекса с алюминия хлоридом (трава горца перечного,
горца птичьего, зверобоя, листья сумаха, скумпии).
Для сырья, содержащего антраценпроизводные, используют реакцию со щелочью (листья сенны).
Для сырья, содержащего фенологликозиды, используют реакцию диазо-тирования
(корневища и корни родиолы розовой).
Наиболее точными являются хроматоспектрофотометрические методы, основанные
на разделении веществ при помощи хроматографии с последующим их определением спектрофотометрически. Можно определять количественное содержание как суммы, так и индивидуальных веществ. Применяют для определения индивидуальных алкалоидов (цитизин в траве термопсиса очередноцветкового, берберин в корнях барбариса), флавоноидов
(плоды и цветки боярышника, трава сушеницы), кумаринов (плоды амми большой), ксантонов (трава золототысячника), ланатозидов в сырье наперстянки шерстистой.
Реже для анализа лекарственного растительного сырья применяется флюорометрия,
полярография, денситометрия, амперометрия, кондуктометрия.
Определение эфирного масла.
46
Количество эфирного масла в сырье определяют при приемке сырья и в процессе его
хранения.
Методы количественного определения основаны на легкой летучести эфирных масел и
способности их перегоняться с водяным паром. В зависимости от физических и химических
свойств компонентов, входящих в состав масла, используют 4 метода. Все методики описаны в ГФ XI изд., вып.1, стр.290 в разделе «Общие методы анализа». Содержание масла выражают в объемно-весовых процентах. Масса сырья, степень его измельчения, время перегонки, метод и возможные растворители указаны в соответствующей НД на лекарственное
растительное сырье.
Определение сердечных гликозидов.
Все лекарственное растительное сырье, содержащее сердечные гликозиды подвергается биологической стандартизации на лягушках кошках, голубях. Активность выражается
соответственно в ЛЕД, КЕД, ГЕД. Общие методы оценки биологической активности описаны в ГФ-Х1, вып.2, стр.163 в разделе «Биологические методы контроля качества лекарственных средств». Валор, т.е. содержание единиц действия в растительном сырье и особенности методики определения приведены в соответствующих частных нормативных документах.
Метод основан на способности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах
остановку сердца животных в стадию систолы. Чувствительность животных к сердечным
гликозидам определяют в сравнении со стандартом.
Недостатками метода биологической стандартизации являются его трудоемкость, высокая стоимость, большая ошибка опыта (до 25%).
Из 88 видов лекарственного растительного сырья, включенного в ГФ-Х1 в 17 видах
сырья не проводится количественной стандартизации сырья.
1. Цветки липы.
10. Плоды черники.
2. Цветки календулы.
11. Плоды жостера слабительного
3. Цветки бузины черной.
12. Плоды рябины.
4. Листья мать-и-мачехи.
13.Плоды калины.
5. Листья крапивы.
14. Семена льна.
6. Трава хвоща полевого.
15. Семена тыквы.
7. Трава горца почечуйного.
16.Семена лимонника.
8. Корни алтея.
17. Плоды лимонника.
9. Корневища и корни девясила.
При разработке и пересмотре НД ставится задача предусмотреть оценку качества сырья по количественному содержанию основных биологически активных и экстрактивных
веществ. При этом используются современные физико-химические методы анализа природных соединений.