На правах рукописи 03.00.13 - физиология Дворжак Антон Юрьевич
реклама
На правах рукописи Дворжак Антон Юрьевич ВОЗБУЖДАЮЩАЯ ГАМК-ЭРГИЧЕСКАЯ СИНАПТИЧЕСКАЯ ПЕРЕДАЧА В НЕОКОРТЕКСЕ МЫШЕЙ В РАННИЙ ПОСТНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД 03.00.13 - физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Андрей Глебович Камкин Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Виктор Михайлович Смирнов кандидат биологических наук Александр Евгеньевич Гайдуков Ведущая организация: Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН Защита состоится «23» ноября 2009 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. Автореферат разослан «25» сентября 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент 2 Т. Е. Кузнецова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Процессы кортикогенеза и механизмы его регуляции нельзя сегодня считать изученными. Тем не менее любое нарушение этого процесса может приводить к тяжелым последствиям. Так, частой причиной эпилепсии и других неврологических расстройств являются кортикальные мальформации, возникающие вследствие нарушения клеточной миграции и синаптогенеза в кортикальной пластинке. Со стороны мягкой мозговой оболочки и со стороны желудочков процесс созревания кортикальной пластинки контролируется двумя временными популяциями клеток, расположенными в маргинальной зоне и в подпластинке, соответственно. Эти наиболее филогенетически древние зоны неокортекса содержат дифференцированные нейроны, которые играют роль подмостков для развивающейся коры и исчезают в первый месяц постнатального развития. На молекулярном уровне основным регулятором кортикогенеза является белок экстраклеточного матрикса рилин. У людей гомозиготных по рилин-дефицитному гену наблюдается полное нарушение структуры коры, приводящее к сильному отставанию в развитии, генерализованным эпилептическим припадкам, двигательным нарушениям и др. Основным источником рилина в коре являются рано созревающие нейроны маргинальной зоны – клетки Кахаля-Ретциуса. Помимо продукции рилина эти клетки экспрессируют разнообразные каналы и рецепторы для разных нейротрансмиттеров, включая ГАМКА-рецепторы (ГАМК – гамма-аминомасляная кислота). Эти клетки получают возбуждающие ГАМК- эргические входы и образуют плотные горизонтально ориентированные сплетения аксонов, формирующие контакты с поверхностными клетками кортикальной пластинки и образующие глубокие нисходящие проекции в подпластинку. Таким образом, клетки Кахаля-Ретциуса (клетки-КР) принимают участие в работе нейронных сетей развивающегося неокортекса, однако, детальных данных об источниках и свойствах входов на клетки-КР в настоящее время нет. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось изучение возбуждающей ГАМК-эргической синаптической передачи на клетки-КР в неокортексе у мышей в ранний постнаталь- 3 ный период. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи: 1. Изучить постсинаптические токи в клетках Кахаля-Ретциуса. 2. Определить количество ГАМК-эргических входов на клетках Кахаля-Ретциуса и попытаться выявить их возможный (е) источник(и). 3. Дать фармакологическую характеристику постсинаптических ГАМКА рецепторов и оценить их насыщенность. 4. Исследовать особенности пресинаптической терминали синапсов на клетках Кахаля-Ретциуса. Дать количественную оценку следующим параметрам: квантовому выбросу и размеру пула везикул, готовых к высвобождению, а также рассчитать вероятности высвобождения медиатора. 5. Изучить влияние внеклеточной ГАМК на ГАМК-эргическую синаптическую передачу в синапсах на клетках Кахаля-Ретциуса. 6. Оценить эффективность синаптической передачи (процент стимулов, приводящих к генерации потенциалов действия на постсинаптической мембране) на клетки Кахаля-Ретциуса при разных частотах стимуляции. Научная новизна работы В данной работе впервые было показано наличие двух типов ГАМК-эргических синапсов на клетках-КР, образованных разными аксональными проекциями и генерирующих постсинаптические токи с разной кинетикой нарастания. Нами было показано, что эти синапсы различаются постсинаптическими рецепторами и их насыщенностью, а также квантовым выбросом медиатора, вероятностью высвобождения нейротрансмиттера из синаптической везикулы и размером везикулярного пула, готового к высвобождению. В этой работе мы обнаружили, что разные синапсы обладают разной чувствительностью к внеклеточной ГАМК, а также по-разному пропускают сигналы, приходящие с разными частотами. Теоретическая и практическая значимость результатов исследования Теоретическое значение работы заключается в том, что впервые были подробно описаны два различных типа входов на клетки-КР. Это, в свою очередь, является качественно новым шагом в понимании того, как организованы нейронные сети на ранних этапах постнатального развития, когда кортикальные нейроны ещё не спо4 собны выполнять свои функции. Полученные данные также указывают на наличие дистантно расположенных потенциальных регуляторов кортикогенеза и раскрывают механизмы, через которые осуществляется контроль и координация процессов миграции и синаптогенеза в развивающейся коре. Практическая значимость результатов заключается в том, что на базе полученных данных можно осуществлять целенаправленный поиск фармакологических препаратов для изучения регуляции кортикогенеза с целью лечения и профилактики неврологических заболеваний. Полученные данные также могут быть использованы для поиска новых методов ранней диагностики таких заболеваний, как аутизм, шизофрения, эпилепсия и др. Апробация работы Основные положения работы были опубликованы в двух западных журналах (Dvorzhak A. и др. 2008; Kirmse K. и др. 2007) и в одном отечественном журнале (Дворжак А.Ю. и др, 2009). Результаты данных исследований также докладывались на научных конференциях сотрудников Института нейрофизиологии Берлинского университета (Германия, 20.02.2007 и 19.02.2008) и на международном форуме европейского общества нейронаук (6th FENS, Женева, Швейцария, 07.2008). Диссертация апробирована на Совместной научной конференции кафедры фундаментальной и прикладной физиологии МБФ РГМУ и кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. Ломоносова (Москва, 2009). Внедрение результатов исследования Результаты диссертации используются в научно-исследовательской работе и учебном процессе на кафедре фундаментальной и прикладной физиологии МБФ ГОУ ВПО РГМУ. Публикации Материалы диссертации изложены в 4 научных публикациях в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 2 статьи – в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из 5 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, их обсуждение и список использованной литературы. 5 Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, включая 42 рисунков и список литературы из 177 источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работу выполняли на потомстве мышей линии C57BL/6J, взятых в постнатальный период с 1ого по 7ой дни (день родов – 0), в соответствии с «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 6.04.1973 № 1045-73». Для экспериментов использовали сагиттальные переживающие срезы мозга толщиной 200 мкм. В экспериментальной работе применяли следующие растворы. Раствор для препарирования содержал (в мМ): 125 NaCl, 4 KCl, 10 глюкозы, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 0,5 CaCl2 и 2,5 MgCl2 – и постоянно аэрировался карбогеном (газовая смесь 5% CO2 и 95% O2), pH раствора доводился до 7,3 c применением одномолярных растворов HCl и NaOH. Инкубационный раствор содержал (в мМ): 125 NaCl, 4 KCl, 10 глюкозы, 1,25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 2 CaCl2 и 1 MgCl2 – и постоянно аэрировался карбогеном, pH - 7,3, осмолярность 330 мОсмоль/л. Внутрипипеточный раствор для заполнения patch-пипеток, содержал (в мМ): 100 калий-глюконата, 50 KCl, 5 NaCl, 0,5 СaCl2, 5 ЭГТА, 25 Hepes, 2 MgАТФ и 0,3 ГТФ. Перед использованием pH раствора доводился до 7,2 с помощью КОН, осмолярность 320 мОсмоль/л. Метод приготовления переживающих срезов мозга. После быстрой декапитации животного под эфирной анестезией, из черепа изымали мозг и перемещали его в чашку Петри, заполненную “ледяным” раствором для препарирования. Далее, используя вибратом, делали сагиттальные срезы мозга толщиной 200 мкм. Срезы инкубировали в инкубационном растворе при комнатной температуре (23-30 0С) не менее 1 ч и затем перемещали в регистрационную камеру (объёмом 0,4 мл) установки для электрофизиологических исследований, где срезы постоянно омывали потоком (2 мл/мин) инкубационного раствора при комнатной температуре. Идентификация клеток Кахаля-Ретциуса Идентификацию клеток-КР осуществляли визуально на основании следующих морфологических критериев: 1) локализация в маргинальной зоне коры (1-ый слой); 2) горизонтальная ориентация; 3) большая овоидная сома; 4) наличие одного толсто6 го дендритного ствола, направленного параллельно поверхности мягкой оболочки мозга. Для экспериментов использовали клетки, локализованные в 17 и 18 полях зрительной коры. Правильность выбора клетки контролировали следующими электрофизиологическими критериями: 1) относительно деполяризованный мембранный потенциал -40 ~ -50 мВ; 2) наличие токов, активируемых гиперполяризацией (Ihтоков); 3) низкая частота генерации потенциалов действия (ПД) при деполяризации (обычно не более 1 ПД); 4) наличие спонтанных ГАМК-эргических постсинаптических токов. Электрофизиологические исследования в переживающих срезах мозга Электрофизиологические исследования на клетках-КР проводили с помощью стандартной микроэлектродной техники фиксации потенциала на целой клетке (patch-clamp метод в конфигурации whole-cell). Для этого использовали стеклянные микропипетки, заполненные внутриклеточным раствором (сопротивление 3-5 Мом). Регистрируемый сигнал фильтровали на 3 кГц, оцифровывали на частоте 10 кГц и записывали на жёсткий диск ЭВМ. Контактную разность потенциалов (< 5 мВ) не компенсировали. В режиме фиксации потенциала (voltage-clamp), потенциал удерживали на - 70 мВ. Сопротивление доступа контролировали гиперполяризационной ступенькой в 10 мВ. Компенсация последовательного сопротивления не применялась. Клетки, имевшие последовательное сопротивление более 40 МОм, либо показавшие изменение последовательного сопротивления более чем на 20% в течение всего эксперимента, не включали в анализ. Метод регистрации миниатюрных постсинаптических токов Для оценки квантового выброса, то есть постсинаптических токов (ПСТ), вызываемых выбросом медиатора из отдельной везикулы, регистрировали миниатюрные ПСТ (минПСТ), используя тетродотоксин (0,5 мкМ), блокатор потенциалупраляемых Na+-токов. Спонтанные минПСТ в клетках-КР отличаются очень низкой частотой возникновения (порядка 0,01 Гц), что не позволяет провести полноценный статистический анализ. Для решения этой проблемы использовали 10-минутную преинкубацию срезов с 50 мкМ N-этилмалеимида (NEM). Это сульфгидрилалкилирующий агент, который отсоединяет Gi/0 белки, чувствительные к коклюшному токсину, от своих рецепторов. Тем самым он блокирует работу тонически акти7 вированных внутриклеточных путей подавления спонтанного экзоцитоза нейротрансмиттера в пресинаптических терминалях. NEM на несколько порядков увеличивает частоту спонтанных минПСТ, но при этом не изменяет их амплитуду и кинетику (Kirmse K & Kirischuk S, 2006). Нестационарный дисперсионный анализ шума Для анализа проводимости постсинаптических лиганд-управляемых ионных каналов мы использовали нестационарный дисперсионный анализ шума (nonstationary variance analysis) миниатюрных ПСТ на фазе спада. Для этого мы использовали программу, написанную C. Henneberger (Институт нейрофизиологии, Берлин, ФРГ). Подробное описание анализа можно найти в статье: Traynelis S.F. и др.; Neuron, 1993, № 11(2), P.279-10. Метод электрической стимуляции клеток Кахаля-Ретциуса Для характеристики свойств синапсов на клетках-КР мы регистрировали вызванные ПСТ (вПСТ), используя фокальную электрическую стимуляцию нервных волокон в маргинальной зоне неокортекса с помощью униполярного электрода. Стимуляцию осуществляли прямоугольными электрическими импульсами тока с длительностью 0,5 мс. Силу тока стимуляции подбирали так, что бы она была минимальной (т.е. стимулировался один отдельный аксон). Стимуляция считалась минимальной при выполнении следующих условий: 1) латентность вПСТ должна оставаться стабильной (флуктуации не более 20%); 2) стимуляция с амплитудой на 20% меньше исходной должна быть не способна вызывать вПСТ; 3) увеличение силы стимуляции на 20 % не должно изменять ни средней амплитуды, ни формы вПСТ. Обычно сила стимулирующего тока при минимальной стимуляции варьировала от 1 до 2 мкА. Метод парной стимуляции Для оценки синаптической пластичности входов использовали минимальную электрическую стимуляцию парами импульсов с интервалом между парами 10 с и интервалом между стимулами в паре 50 мс (рис.3 А). В процессе обработки записи усредняли и определяли средние амплитуды ответов на первый (вПСТ1) и второй (вПСТ2) стимулы. Согласно квантовой модели синаптической передачи, средняя амплитуда вПСТ1 пропорциональна квантовой амплитуде (Q), размеру везикулярного 8 пула, готового к высвобождению (readily releasable pool - RRP) и вероятности высвобождения медиатора (Pr): вПСТ1=Q*RRP*Pr. Также мы рассчитывали парное отношение: ПО = вПСТ2/ вПСТ1. Это отношение негативно коррелирует с вероятностью высвобождения медиатора, однако механизмы такой парной пластичности до конца не изучены (Zucker R.S. и др., 2002). Метод высокочастотной стимуляции Для оценки размера синаптического пула везикул, готовых к высвобождению, а также квантовой амплитуды использовали высокочастотную стимуляцию - 40 стимулов, подаваемых с частотой 20 Гц (см. Kirmse K. и др., J.Neurosci., 2006, №26(16), P.4216-11). Повторяющаяся стимуляция ведёт к высвобождению всех везикул, готовых к высвобождению. В конце стимуляции везикулы высвобождаются, как только они достигают пресинаптической мембраны. Таким образом, с каждым последующим стимулом амплитуда вПСТ уменьшается и к концу стимуляции стремится к квантовой амплитуде (рис.4 А). Для оценки квантовой амплитуды использовали синхронные вПСТ на последние 20 стимулов. Для оценки везикулярного пула, готового к высвобождению, строили график зависимости кумулятивной амплитуды вПСТ от количества стимулов. После 10-20 стимулов кумулятивная амплитуда вПСТ стабилизируется, что выражается в её линейном росте с увеличением количества стимулов (рис.4 Б). С помощью обратной экстраполяции к нулевому стимулу линейного компонента на графике зависимости кумулятивной амплитуды вПСТ от количества стимулов можно определить величину, соответствующую амплитуде вПСТ на первый стимул при 100% вероятности высвобождения медиатора (Q*RRP), т. е. произведение квантовой амплитуды (Q) на размер везикулярного пула, готового к высвобождению (RRP). Таким образом, использовав среднюю амплитуду вПСТ1, полученных посредством парной стимуляции и поделив её на величину, полученную в результате обратной экстраполяции графика кумулятивной амплитуды, можно рассчитать вероятность высвобождения медиатора: Pr = вПСТ1/ (Q*RRP) Обработка данных и статистика Все данные обрабатывали после экспериментов с помощью программы PeakCount V3.2 (программа написана Henneberger C, Институт нейрофизиологии, 9 Берлин). Статистический анализ и последующую обработку проводили с помощью программ Prism v 4.03, Corel Draw 12 и приложений MS Office 2003. Все результаты представлены, как среднее ± стандартная ошибка среднего (СОС), в скобках указано количество данных (n) и вероятность ошибки (p). Все бары на графиках отображают СОС. Различия между средними значениями тестировались с помощью непарного теста Стьюдента (t-теста). Использование других тестов оговаривается отдельно. Для проверки распределения данных на нормальность использовали тест Колмогорова-Смирнова. РЕЗУЛЬТАТЫ и их ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика постсинаптических токов в клетках Кахаля-Ретцуса С помощью patch-clamp метода регистрировали спонтанные ПСТ в клетках-КР. Они имели среднюю амплитуду 71 ± 14 пА и возникали с частотой 0,13 ± 0,05 Гц (n = 6). Эти токи были нечувствительны к DNQX (10 мкМ) и APV (50 мкМ) (блокаторам глутаматных рецепторов) и полностью, но обратимо блокировались бикукуллином (10 мкМ) и габазином (20 мкМ) (блокаторы ГАМКА рецепторов). Таким образом, регистрируемые ПСТ имели ГАМК-эргическую природу. Далее мы регистрировали миниатюрные ПСТ (минПСТ), добавив 0,5 мкМ тетродотоксина без NEM в проточный раствор (см. методы). МинПСТ в клетках-КР имели низкую частоту 0,07 ± 0,01 Гц (n = 11). Анализируя записи, мы обнаружили наличие двух типов минПСТ, различающихся разной кинетикой нарастания и шумом на фазе спада, но одинаковые по кинетике спада (рис.1 А, Б). Для увеличения частоты спонтанных минПСТ мы использовали преинкубацию срезов с 50 мкМ NEM (см. методы), что позволило нам провести статистический анализ минПСТ. Распределение времени нарастания (от 10 до 90% амплитуды) минПСТ наилучшим образом апроксимировалось суперпозицией двух функций Гаусса (Рис. 1 В; р < 0,01; F-тест) со средними значениями 0,52 ± 0,04 мс и 1,22 ± 0,05 мс (n = 17; р < 0,001). На основании этого мы разделили минПСТ на токи с быстрой кинетикой нарастания (минПСТб, время нарастания < 1мс) и токи с медленной кинетикой нарастания (минПСТм, время нарастания > 1мс). 10 Рис. 1. Два типа миниатюрных ПСТ в клетках Кахаля-Ретциуса. А. Пример записи минПСТ. На увеличенном фрагменте записи продемонстрированы два последовательных события с разной кинетикой нарастания. Б. Скалированные по амплитуде индивидуальные минПСТ с быстрой (чёрная линия) и с медленной (серая линия) кинетикой нарастания (верхняя часть рисунка) демонстрируют одинаковую кинетику спада (нижняя часть рисунка). В. Распределение времени нарастания (от 10% до 90% от амплитуды) минПСТ оптимально апроксимируется суперпозицией двух функций Гаусса (для данной клетки: 0,5 ± 0,13 и 1,05 ± 0,91 мс; среднее ± стадартное отклонение; n = 320). Г. Распределение временной константы спада минПСТ оптимально апроксимируется одной функцией Гаусса (для данной клетки: 16,5 ± 4,7 мс; среднее ± стандартное отклонение; n = 280). Д. Распределение амплитуды минПСТ мономодально, но сильно скошено. Е. Амплитуда минПСТ не коррелирует со временем нарастания. Ж. Временная константа спада минПСТ не коррелирует со временем нарастания. З. Амплитуда минПСТб значимо больше амплитуды минПСТм (белые столбики; ***-p<0,001). Временная константа спада минПСТб и минПСТм значимо не различалась (серые столбики). 11 Распределение амплитуды минПСТ было мономодальным, но сильно скошенным (рис.1 Д). Медианная амплитуда минПСТб была значимо больше медианной амплитуды минПСТм (24,2 ± 1,6 и 55,1 ± 5,2 пА для минПСТм и минПСТб соответственно; n = 17; р < 0,001, рис.1 З)., более того более быстрым событиям соответствовала большая амплитуда (рис.1 Е). Последний факт, а также само существование токов с разной кинетикой нарастания можно объяснить эффектом дендритного фильтрования, т. е. более дистально расположенные синапсы должны генерировать более медленные токи с меньшей амплитудой, нежели проксимальные дендриты. Однако распределение временной константы спада минПСТ было нормальным (рис.1 Г) и, более того, не наблюдалось корреляции между временем нарастания и временной константой спада (рис.1 Ж). Другой возможной причиной, объясняющей наблюдаемые факты, может быть наличие двух типов синапсов на клетках-КР. Для проверки этой гипотезы мы провели анализ шума на фазе спада минПСТ и попытались разделить минПСТ фармакологически. Разные миниатюрные ПСТ обусловлены разными ГАМКА рецепторами. Проведя нестационарный анализ шума минПСТ на фазе спада, мы выявили, что разные токи обусловлены постсинаптическими рецепторами с разной средней взвешенной проводимостью одиночных каналов: 34,4 ± 3,9 пСм для минПСТб и 18,4 ± 3,8 пСм для минПСТм (р < 0,001; n = 9). Далее мы исследовали чувствительность минПСТ к золпидему, аллостерическому модулятору ГАМКА-рецепторов. В зависимости от концентрации золпидем потенцирует ГАМКА-рецепторы с разными субъединицами (Ki в нМ для 1 – 20, 2/3 – 450 и 5 – 15000). В концентрации 100 нМ золпидем специфически модулирует ГАМКА рецепторы с 1 субъединицей. В наших экспериментах 100 нМ золпидема не влияли ни на медианную амплитуду (107 ± 9 % от контроля; p > 0,3; однопопуляционный t-тест), ни на время полуспада минПСТб (109 ± 12 % от контроля; p > 0,2; n = 18; однопопуляционный t-тест; рис.2). В противоположность минПСТб, золпидем значимо пролонгировал минПСТм (время полуспада: 131 ± 9 % от контроля; p < 0,001; однопопуляционный t-тест), но не изменял медианную амплитуду минПСТм (104 ± 6 % от контроля; p > 0,4; n = 18; однопопуляционный t-тест; рис.2). 12 Рис.2. Модуляция минПСТ золпидемом. Диаграмма влияния 0,1 и 2 мкМ золпидема (Зол) на амплитуду (ампл.) время полуспада (спад) и вариацию (CV) минПСТ. (*** - p < 0,001; * - p < 0,05 – однопопуляционный t-тест). Все данные были отнормированы к контролю. В концентрации 2 мкМ золпидем модулирует ГАМКА рецепторы, содержащие уже не только 1, но и 2, 3 субъединицы. В наших экспериментах, 2 мкМ золпидема значимо увеличивали медианную амплитуду (126 ± 5 % от контроля; p < 0,001) и время полуспада минПСТб (166 ± 8 % от контроля; p < 0,001; n = 14; однопопуляционный t-тест; рис.3). В то же время медианная амплитуда минПСТм под действием 2 мкМ золпидема не изменялась (108 ± 9 % от контроля; p > 0,3), тогда как время полуспада минПСТм, как и в случае 100 нМ, значимо увеличивалась (173 ± 10 % от контроля; p < 0,001; n = 14; однопопуляционный t-тест; рис.2). Интересно, что вариация минПСТм (CV = среднее значение /стандартное отклонение), при 2 мкМ золпидема значимо снижалась (88 ± 3 % от контроля; p < 0,05; n = 14; однопопуляционный t-тест; рис.2). Последний факт, а также то, что 2 мкМ золпидема пролонгируют, но не изменяют амплитуду минПСТм, можно объяснить тем, что медленные синапсы насыщаются выбросом медиатора из одной везикулы. Дальнейшее увеличение концентрации золпидема до 20 мкМ никак не изменяло общей картины эффектов на минПСТ. Основываясь на полученных результатах, мы 13 заключили, что разные минПСТ обусловлены разными постсинаптическими ГАМКА рецепторами в разных синапсах на клетках-КР. Вызванные постсинаптические токи Для ответа на вопрос о том, обусловлены ли разные группы синапсов разными проекциями, мы использовали метод парной электрической стимуляции аксонов в маргинальной зоне неокортекса и регистрировали вызванные ПСТ (вПСТ). Анализ полученных данных показал, что вПСТ также можно разделить на две группы на основании их кинетики нарастания (рис.3 А, Б, В). Быстро нарастающие (< 1 мс) вПСТ (вПСТб) имели среднее время нарастания 0,58 ± 0,02 мс (n = 57), тогда как у медленных (>1 мс) вПСТ (вПСТм) оно составляло 1,24 ± 0,04 мс (n = 18) (рис.3 Б). При этом временная константа спада у разных групп вПСТ значимо не различалась (21 ± 3 и 23 ± 2 мс для вПСТб и вПСТм соответственно). Таким образом, мы заключили, что разные синапсы на клетках-КР образованы отдельными проекциями, мы назвали их быстрыми (генерируют вПСТб) и медленными (генерируют вПСТм). Для определения источников входов на клетки-КР стимулировали нервные волокна в разных зонах коры. Мы обнаружили, что стимуляция в глубоких слоях кортикальной пластинки и в подпластинке приводит к возникновению только вПСТм, следовательно, медленные проекции являются аксонами ГАМК-эргических интернейронов подпластинки. Локализовать источники быстрых проекций нам не удалось. Вызванные ПСТб возникали исключительно при стимуляции в рамках маргинальной зоны. Поскольку ГАМК-эргические интернейроны в маргинальной зоне не проецируют аксоны на клетки-КР (Soda T. и др. 2003), то мы полагаем, что быстрые входы образованы аксонами ГАМК-эргических нейронов из zona incerta вентрального таламуса (Lin C.S. и др. 1990). Средняя амплитуда вПСТм значимо не отличалась от амплитуды вПСТб (96 ± 11 и 84 ± 10 пА для вПСТб (n = 57) и вПСТм (n = 18), соответственно; p = 0,53; рис.3 Г). ПО для вПСТб было значимо выше, чем для вПСТм (1,49 ± 0,08 и 1,01 ± 0,05 для вПСТб (n = 57) и вПСТм (n = 18) соответственно; р < 0,01; рис.3 Д). Последний факт может указывать на большую вероятность высвобождения медиатора в медленных проекциях, чем в быстрых проекциях. 14 Рис. 3. Два типа вПСТ и их свойства. А. Примеры записей вПСТ с быстрой (слева) и медленной (справа) кинетикой нарастания, полученные путём парной стимуляции. На верхней части рисунка представлено 20 пар индивидуальных вПСТ, на нижней – усреднённые записи. Б. Время нарастания вПСТ распределено бимодально. В. Сравнение скалированных по амплитуде усреднённых вПСТ с быстрой (чёрная линия) и медленной (серая линия) кинетикой нарастания. Г. Средняя амплитуда вПСТ на первый стимул при парной стимуляции (вПСТ1) для быстрых (вПСТб) и медленных проекций (вПСТм) значимо не различается. Д. Отношение средних амплитуд ответов на первый и второй стимулы при парной стимуляции (ПО) для быстрых проекций (вПСТб) значимо больше, чем для медленных (вПСТм). (** - p < 0,01). Для проверки этой гипотезы мы использовали высокочастотную стимуляцию (см. методы, рис.4 А). Согласно нашим результатам, амплитуда последних вПСТ (т.е. квантовая амплитуда) в быстрых проекциях была значимо больше, чем в медленных проекциях (54 ± 6 и 32 ± 3 пА для вПСТб (n = 22) и вПСТм (n = 10) соответственно; р < 0,05; рис.4 В). Количество везикул, готовых к высвобождению значимо не различалось (12,1 ± 1,5 и 14,4 ± 2,5 для вПСТб (n = 22) и вПСТм (n = 10) соответственно; р < 0,36; рис.4). Рассчитанная вероятность высвобождения в быстрых входах была значимо ниже, чем в медленных (12 ± 1% и 19 ± 1% для вПСТб (n = 22) и 15 вПСТм (n = 10) соответственно; р < 0,01; рис.4 Г). Таким образом, выдвинутая нами гипотеза подтвердилась. Рис. 4. Параметры рассчитанные с помощью высокочастотной стимуляции. А. Пример записи ответов на высокочастотную стимуляцию. На увеличенном фрагменте записи представлены так называемые последние вПСТ, средняя амплитуда которых стремится к квантовой амплитуде (Q). Б. Принцип определения размера везикулярного пула (RRP), готового к высвобождению, по стабильному компоненту графика зависимости кумулятивной амплитуды вПСТ от количества стимулов. В. Квантовая амплитуда (последние вПСТ) быстрых входов (вПСТб) значимо больше квантовой амплитуды медленных входов (вПСТм) (* - р < 0,05). Г. Количество везикул, готовых к высвобождению (RRP), значимо не различается в быстрых медленных входах. Д. Вероятность высвобождения (Pr) быстрых входов значимо меньше вероятности высвобождения медленных входов. (* - р < 0,01). Разная чувствительность входов к внеклеточной ГАМК ГАМК-эргическая синаптическая передача на клетки-КР тонически подавляется экстраклеточной ГАМК через пресинаптические ГАМКБ рецепторы (Kirmse K. и Kirischuk S., 2006). В связи с этим мы предположили, что разная вероятность высво16 бождения медиатора в синапсах на клетках-КР обусловлена разной их чувствительностью к внеклеточной ГАМК. Для проверки этой гипотезы мы изучали действие 1 мкМ CGP (блокатор ГАМКБ-рецепторов), 10 мкМ баклофена (агонист ГАМКБрецепторов) и 40мкМ SNAP (блокатор ГАМК транспортеров 2 и3 его типов) на вПСТ при парной стимуляции. CGP значимо увеличивал среднюю амплитуду и понижал ПО, как быстрых, так и медленных входов (рис.5 А). В быстрых синапсах ПО снижалось с 1,68 ± 0,17 в контроле до 0,89 ± 0,11 в присутствии CGP (р < 0,001; n = 16; парный t-тест), а в медленных с 1,05 ± 0,05 в контроле до 0,87 ± 0,08 в присутствии CGP (р < 0,05; n = 7; парный t-тест; рис.5 А, В). При этом разные входы демонстрировали одинаковое значение ПО в присутствии CGP (р > 0,8). Баклофен сильно снижал среднюю амплитуду вПСТ и увеличивал ПО (рис.5 Б). В быстрых синапсах ПО увеличивался с 1,44 ± 0,16 в контроле до 2,17 ± 0,26 в присутствии баклофена (р < 0,001; n = 8; парный t-тест), а в медленных с 1,13 ± 0,09 в контроле до 1,99 ± 0,16 в присутствии баклофена (р < 0,01; n = 4; парный t-тест; рис.5 Б, Д). В присутствии баклофена ПО значимо не различался в быстрых и медленных входах (р > 0,65). Таким образом, эксперименты с CGP и баклофеном показали, что быстрые входы сильнее подавлены ГАМКБ рецепторами, чем медленные. Основным источником внеклеточной ГАМК в маргинальной зоне неокортекса являются ГАМК транспортеры 2 и 3 типов. Для выявления роли внеклеточной ГАМК в подавлении входов на клетки-КР мы использовали SNAP. В быстрых синапсах ПО снижалось с 1,39 ± 0,27 в контроле до 0,81 ± 0,16 в присутствии SNAP (р < 0,01; n = 8; парный t-тест), а в медленных с 0,93 ± 0,07 в контроле до 0,78 ± 0,08 в присутствии SNAP (р < 0,05; n = 4; парный t-тест) (рис.5 Г). В присутствии SNAP ПО значимо не различался в быстрых и медленных входах (р > 0,8). Таким образом, мы заключили, что быстрые входы более чувствительны к внеклеточной ГАМК, чем медленные. 17 Рис. 5. Разная чувствительность входов к внеклеточной ГАМК. А. Записи вПСТб (верхние) и вПСТм (нижние) в контроле и в присутствии 1 мкМ CGP. Рисунок демонстрирует усреднённые записи, артефакты удалены. Б. Записи вПСТб (верхние) и вПСТм (нижние) в контроле и в присутствии 10 мкМ баклофена. Рисунок демонстрирует усреднённые записи, артефакты удалены. В. Эффект 1 мкМ CGP на ПО вПСТб и вПСТм. Г. Эффект 40 мкМ SNAP на ПО вПСТб и вПСТм. Д. Эффект 10 мкМ баклофена на ПО вПСТб и вПСТм. Примечание: * - p<0,5; ** - p<0,01; *** - p<0,001; нз – не значимо. Вызванные постсинаптические потенциалы Для понимания физиологической роли разных входов мы исследовали вызванные постсинаптические потенциалы (вПСП), образуемые быстрыми (вПСПб) и медленными (вПСПм) проекциями (рис.6 А). Для предотвращения возникновения ПД во внутрипипеточный раствор был добавлен QX-314 (2 мМ). Подобно вПСТ, время нарастания вПСПб (6,5 ± 0,6 мс; n = 25) было значимо меньше времени нарастания вПСПм (10,4 ± 1,2 мс; n = 7; р < 0,01; рис.6 В), тогда как время полуспада значимо не различалось в обеих популяциях вПСП (74 ± 4 и 70 ± 8 мс для мПСПб (n = 25) и минПСТм (n = 7) соответственно; р > 0,5; рис.6 Г). Амплитуда вПСПб (25 ± 2 мВ; n = 25) значимо не отличалась от амплитуды вПСПм (16 ± 2 мВ; n = 7) (рис.6 Б). Среднее значение амплитуды вПСП без пропусков, у вПСПб 18 было значимо больше чем у вПСПм (32 ± 1 и 22 ± 1 мВ для вПСПб (n = 25) и вПСТм (n = 7) соответственно; р < 0,001; рис.6 Б). Рис. 6. Вызванные ПСП и их амплитудно-временные характеристики. А. Примеры вПСП с быстрой (вПСПб – сверху) и медленной (вПСПм – снизу) кинетикой нарастания. Б. Среднее значение амплитуды вПСП (2 левых столбца) с быстрой и медленной кинетикой нарастания значимо не различается, в то время, как средняя амплитуда вПСП без учёта пропусков значимо больше у вПСПб. (*** - р < 0,001). В. Время нарастания у вПСПб и вПСПм. Г. Время полуспада (T50) у вПСПм и вПСПб значимо не различалось. Поскольку потенциал покоя у клеток-КР больше -60 мВ, а порог активации потенциал управляемых Na каналов равен -45 мВ, то и быстрые и медленные входы способны генерировать ПД. Однако, из-за более высокой вероятности высвобождения везикул в медленных синапсах можно ожидать более быстрое истощение при повышении частоты стимуляции, нежели в быстрых синапсах. Для проверки этой гипотезы мы убрали QX-314 из внутрипипеточного раствора и определяли эффек19 тивность синаптической передачи (Эффективность = количество стимулов / количество ПД) при разных частотах стимуляции. Рис.7. Зависимая от частоты стимуляции эффективность синаптической передачи. А. Примеры записей, демонстрирующих паттерн генерации ПД клетками-КР в ответ на стимуляцию быстрых (сверху) и медленных (снизу) входов с частотой 1 Гц. Б. Примеры записей, демонстрирующих паттерн генерации ПД клетками-КР в ответ на стимуляцию быстрых (сверху) и медленных (снизу) входов с частотой 5 Гц. В. Эффективность генерации ПД при стимуляции с частотой 0,1 Гц у быстрых и медленных входов значимо не различается. Г. Эффективность генерации ПД в ответ на стимуляцию в 1 Гц у быстрых входов значимо больше, чем у медленных. (*** - р < 0,001). Д. Эффективность генерации ПД в ответ на стимуляцию в 5 Гц у быстрых входов значимо больше, чем у медленных. (*** - р < 0,001). Примечание: Эффективность = кол-во. ПД / кол-во. стимулов При частоте стимуляции 0,1 Гц, оба входа были одинаково эффективны в передаче сигналов на клетки-КР (эффективность для быстрых связей 76 ± 3 % (n = 9) и 20 для медленных связей 72 ± 4 % (n = 6); р > 0,9; рис.7 В). При стимуляции в 1 Гц эффективность быстрых входов была значимо больше, чем медленных (эффективность для быстрых связей 65 ± 6 % (n = 9) и для медленных связей 31 ± 5 % (n = 6); р < 0,001; рис.7 А, Г). При 5 Гц выраженность различий только усилилась (эффективность для быстрых связей 51 ± 5 % (n = 9) и для медленных связей 7 ± 2 % (n = 6); р < 0,001; рис.7 Б, Д). Основываясь на полученных данных, мы заключили, что быстрые и медленные входы одинаково эффективны в передаче ПД, приходящих с низкой частотой, в то время как высокочастотные сигналы способны обрабатываться только быстрыми входами. Заключение Наши результаты показали, что клетки-КР получают два типа ГАМКэргических входов с разной частотно зависимой эффективностью синаптической передачи сигналов. В настоящее время нет детальных данных о входах на клетки-КР. В маргинальной зоне коры описано временное сплетение ГАМК-эргических нервных волокон (Lauder J.M. и др. 1986), образованное: аксонами нейронов маргинальной зоны (Marin-Padilla M., 1998), аксонами нейронов подпластинки (Voigt T. и др. 2001) и внешними проекциями из zona incerta вентрального таламуса (Lin C.S. и др. 1990). Нейроны маргинальной зоны не проецируются на клетки-КР (Soda T. и др. 2003). Стимуляция в подпластинке приводит к возникновению вПСТм, следовательно, медленные входы образованы проекциями из подпластинки. Быстро нарастающие вПСТ возникали только при стимуляции в маргинальной зоне. Zona incerta вентрального таламуса на ранних стадиях развития обладает повышенной метаболической активностью (Nicolelis M.A. и др. 2000), поэтому нейроны, проецирующие в маргинальную зону коры, демонстрируют высокую частоту спонтанных ПД и самопроизвольные высокочастотные вспышки электрической активности (Dammerman R.S. и др. 2000). Поскольку быстрые входы на клетках-КР способны обрабатывать сигналы с высокочастотным паттерном, мы полагаем, что они образованы обрезанными аксонами из Zona incerta. Однако, проверить гипотезу невозможно, так как нельзя получить целые проекции из zona incerta в маргинальную зону коры в срезах (Dammerman R.S. и др. 2000). 21 Клетки-КР выполняют ключевую роль в регуляции кортикогенеза. Они продуцируют рилин, ответственный за стратификацию кортикальной пластинки, и одновременно являются частью временной нейронной сети, обеспечивающей синаптогенез в коре. ГАМК для клеток-КР является единственным возбуждающим медиатором, поэтому электрическая активность этих клеток определяется активностью их ГАМК-эргических входов. Интенсивность синаптогенеза в нейронных сетях зависит от электрической активности нейронов (Chattopadhyaya B. и др. 2004). Поскольку клетки-КР являются элементами созревающей нейронной сети в коре (Radnikow G. и др. 2002), то источники входов на эти клетки, т.е. подпластинка и zona incerta, могут регулировать синаптогенез в коре. Если предположить, что продукция рилина зависит от электрической активности клеток-КР (например, через Са+2), то входы на клетки-КР могут регулировать не только синаптогенез, но и клеточную миграцию. Блокада ГАМК-эргических связей в маргинальной зоне бикукулином приводит к нарушению клеточной миграции in vitro и кортикальным мальформациям у крыс in vivo (Heck N. и др. 2007). Поскольку таламо-кортикальные проекции приходят в развивающуюся кору прежде чем она созреет (Molliver M.E. и др. 1973), то клетки-КР, через непосредственные входы из таламуса или опосредованно через подпластинку, могут синхронизировать развитие коры и таламуса. 1. Выводы: На дендритах клеток Кахаля-Ретциуса располагаются две популяции разных синапсов, генерирующие постсинаптические токи с разной кинетикой нарастания. Популяция постсинаптических токов с быстрой кинетикой нарастания по сравнению с постсинаптическими токами с медленной кинетикой нарастания характеризуются более высокой амплитудой и большим шумом на фазе спада. Кинетика спада у разных типов постсинаптических токов не различается. 2. Разные популяции синапсов на клетках Кахаля-Ретциуса образованы разными аксональными проекциями. Популяция синапсов, генерирующая постсинаптические токи с медленной кинетикой нарастания (медленные синапсы), образована проекциями ГАМК-эргических интернейронов подпластинки. Другая группа синапсов, с быстрой кинетикой нарастания (быстрые синапсы), предположи22 тельно образована аксонами ГАМК-эргических нейронов из Zona Incerta вентрального таламуса. 3. Постсинаптические токи, генерируемые разными синаптическими популяциями на клетках Кахаля-Ретциуса, различаются своей чувствительностью к золпидему. Это свидетельствует о том, что разные синапсы экспрессируют разные ГАМКА рецепторы. В медленных синапсах экспрессируются ГАМКА рецепторы, содержащие 1 и возможно 2 / 3 субъединицы, в то время как ГАМКА рецепторы в быстрых синапсах содержат только 2 / 3 субъединицы. Постсинаптические рецепторы в медленных синапсах находятся ближе к состоянию насыщения по сравнению с быстрыми синапсами. 4. На основании анализа ответов на высокочастотную стимуляцию мы заключили, что быстрые синапсы характеризуются большей вероятность высвобождения везикул, но меньшей квантовой амплитудой, по сравнению с медленными синапсами. Размер пула везикул, готовых к высвобождению, не различается в разных группах синапсов. 5. Медленные входы обладают меньшей чувствительностью к внеклеточной ГАМК, по сравнению с быстрыми входами. 6. Быстрые и медленные входы одинаково эффективны при передаче потенциалов действия, приходящих с низкой частотой. Высокочастотные сигналы способны обрабатываться только быстрыми входами. Практические рекомендации Основные положения и выводы данной диссертационной работы целесообразно использовать в научно-исследовательской работе научных подразделений, изучающих развитие головного мозга и осуществляющих поиск веществ для фармакологической коррекции кортикогенеза, лечения и профилактики кортикальных мальформаций. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Dvorzhak A, Myakhar O, Kamkin A, Kirmse K, Kirischuk S. Postsynaptically different inhibitory postsynaptic currents in Cajal-Retzius cells in the developing neocortex. Neuroreport. 2008; Aug. 6;19(12):1213-6. 23 2. Dvorzhak A., Kirmse K., Grantyn R. & Kirischuk S. Cajal-Retzius cells in the mouse neocortex receive two types of pre- and postsynaptically distinct GABAergic inputs. 6th Forum European Neuroscience, Geneva, Switzerland. FENS 2008; Abstr., Vol.4, 213.12. 3. Myakhar O., Dvorzhak A., Kirischuk S. Postsynaptic characterization of two GABAergic inputs to Cajal-Retzius cells in the mouse neocortex. 6th Forum European Neuroscience, Geneva, Switzerland. FENS 2008; Abstr., Vol.4, 011.17. 4. Kirmse K, Dvorzhak A, Henneberger C, Grantyn R, Kirischuk S. Cajal Retzius cells in the mouse neocortex receive two types of pre- and postsynaptically distinct GABAergic inputs. J. Physiol. 2007; Dec. 15;585(Pt 3):881-95. Список сокращений CV – вариация Pr – вероятность высвобождения медиатора Q – квантовый выброс RRP – размер везикулярного пула, готового к высвобождению ГАМК – гамма-аминомасляная кислота Клетки-КР – клетки Кахаля-Ретциуса ПД – потенциал действия ПО - парное отношение СО - стандартное отклонение СОС - стандартная ошибка среднего ПСТ - постсинаптические токи минПСТ – миниатюрные ПСТ минПСТм – минПСТ с медленной кинетикой нарастания минПСТб – минПСТ с быстрой кинетикой нарастания вПСТ – вызванные ПСТ вПСТм – вПСТ с медленной кинетикой нарастания вПСТб – вПСТ с быстрой кинетикой нарастания вПСТ1 – амплитуда вПСТ на первый ответ при парной стимуляции вПСТ2 – амплитуда вПСТ на второй ответ при парной стимуляции вПСП - вызванные постсинаптические потенциалы вПСПм – вПСП с медленной кинетикой нарастания вПСПб – вПСП с быстрой кинетикой нарастания 24
