Дата: 26.09.2014

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ
ЖИВОТНЫХ»
(ФГБУ «ВНИИЗЖ»)
Перевод № 7122
Автор(ы):
Заглавие:
Перевод
заглавия:
Carmina Gallardo1, Edward Okoth2, Virginia Pelayo1,
Raquel Anchuelo2, Elena Martín1, Alicia Simón1, Alicia
Llorente1, Raquel Nieto1, Alejandro Soler1, Raquel
Martín1, Marisa Arias1 and Richard P. Bishop2
African swine fever viruses with two different genotypes, both of
which occur in domestic pigs, are associated with ticks and adult
warthogs, respectively, at a single geographical site
Вирусы африканской чумы свиней с двумя
различными генотипами, каждый из которых
встречается
у
домашних
свиней,
ассоциируются с клещами и взрослыми
бородавочниками, соответственно, на одной
географической территории
Источник: Journal of General Virology. – 2011. – Vol. 92.
- P. 432-444
Переводчик: Павелко Н.Э.
Редактор:
Дата: 26.09.2014
Владимир
Роль традиционного лесного цикла вируса Африканской чумы свиней (АЧС) не до конца
выяснена в эндемических областях Восточной Африки. Поэтому, мы анализировали
инфекционный статус по АЧС с использованием образцов, отобранных от 51 свободно
обитающих бородавочников (Phacocherus africanus) и 1576 клещей вида Ornithodorus
porcinus, отобранных из 26 отдельных друг от друга мест обитания бородавочника на
скотоводческой ферме в Кении. при проведении данного исследования были
протестированы образцы от 83 домашних свиней без клинических симптомов,
происходящих из определенных мест обитаний в которых в последнее время не
регистрировались вспышки АЧС. Все образцы были отобраны из областей центральной
Кении, в которых вспышки АЧС регистрировались раннее. Инфекция вирусом АЧС была
подтверждена у 22 % клещей O.porcinus, собранных в пулы, у 3.22 % образцов сыворотки
взрослых особей бородавочника и у 49 % образцов сыворотки домашних свиней с
помощью ПЦР на основе гена р72. Все сыворотки бородавочника оказались
положительными на наличие антител к вирусу АЧС при проведении исследования ИФА
(ELISA), но, антител к вирусу АЧС у домашних свиней не обнаружили. Изоляты вируса от
двадцати клещей вида O.porcinus, 12 домашних свиней, и трех бородавочников были
генотипированы по четырем полиморфным локусам. Изоляты вируса АЧС от клещей и от
домашних свиней были сгруппированы в кластеры в X генотипе р72. Но, вирусы АЧС,
генотипированные напрямую из сыворотки бородавочника, из того же региона что и
изоляты от клещей, принадлежали IX генотипу белка р72 и были генетически схожи с
вирусами, вызвавшими недавние вспышки АЧС в Кении и Уганде. В данной статье
впервые представлены данные о сосуществовании различных генотипов вируса АЧС в
местах обитания бородавочника, ассоциированными с клещами и взрослых диких особей
бородавочника. Данные из текущих и предыдущих исследований позволяют
предположить перенос вирусов хотя бы двух разных генотипов р72, от диких свиней –
домашним в Восточной Африке.
Введение
Африканская чума свиней (АЧС) это летальная геморрагическая болезнь домашних
свиней, наносящая серьезные социально-экономические убытки и пагубно влияющая на
жизнедеятельность владельцев свиней в эндемических странах Африки. Болезнь также
отрицательно влияет на региональную и международную торговлю и на пищевую
безопасность. Поскольку в данный момент не существует вакцины, убой и карантин
являются единственными методами борьбы. Вирус АЧС, возбудитель болезни АЧС,
состоит из линейной двухцепочечной молекулы ДНК длиной 170-193 тысяч пар
оснований, кодирующей от 151 до 167 генов, в зависимости от конкретного изолята
(Сhapman et al., 2008; de Villiers et al., 2010). Вирус АЧС – это единственный
представитель семейства Asfarviridae, род Asfivirus и единственный известный ДНКарбовирус (Dixon et al., 2000, 2005). Эпидемиология вируса, распространение, патология,
экономическое влияние и стратегии борьбы были ранее всестороннее рассмотрены
(Costard et al., 2009).
АЧС впервые была описана в Африке как возбудитель болезни, вызывающий летальное
заболевание домашних свиней в Кении (Montgomery, 1921) и впоследствии в 1928г. в
Южной Африке (De Kock , et al., 1940). Связь между бородавочниками (Phacochoerus
africanus), домашними свиньями, и наличием вируса у Ornihodorus porcinus клещей в
местах обитания свиней, была также впервые обнаружена в Кении и впоследствии
замечена в Южной Африке (Plowright et al., 1969; последующий обзор Penrith et al., 2004a;
Penrith, 2009). АЧС впервые привлекла всеобщее международное внимание в 1957г., когда
она была занесена в Португалию из Западной Африки, и впоследствии распространилась в
Европу и в регионы Латинской Америки в период с 1957 по 1990гг.. В настоящее время,
АЧС остается эндемичной в Европе и Сардинии (Италия), а также на Кавказе и в
Российской Федерации, с последующим недавним заносом в Грузию в 2007г. Вирус,
ответственный за АЧС на Кавказе группируется в кластеры в юго-восточном африканском
p 72 генотипе II (Rowlands et al., 2008). В Африке, большое распространение болезни было
замечено в 1994г. и болезнь сейчас является эндемической в более чем 20 странах
Африки, расположенных ниже Сахары (Penrith, 2009).
Эпидемиология АЧС сложна и вирус АЧС сохраняется в Восточной и Южной Африке в
течение неопределенного периода времени, в давнем лесном цикле, включающем мягких
клещей (вид Ornithodorus) с клинически здоровыми инфицированными бородавочниками,
кустарниковыми свиньями и красными кистеухими свиньями, (Potamochoerus spp.), хотя
роль последнего хозяина не полностью определена (Haresnape et al., 1988; kleiboeker &
Scoles 2001; Bastos et al., 2009). Были описаны два дополнительных цикла в эндемических
областях, а именно цикл домашняя свинья-клещ, без участия бородавочника, и цикл
домашняя свинья-свинья, в котором вирус персистирует у домашних свиней в отсутствие
позвоночных или беспозвоночных хозяев (Penrith et al., 2004a; Jori & Bastos, 2009). В
некоторых регионах Юго-Восточной Африки существуют данные о том, что болезнь
может стать эндемической у популяции домашних свиней которые уже стали
устойчивыми к патогенному воздействию АЧС (Penrith et al., 2004b). В Западной Африке
передача вируса происходит без вовлечения лесных животных-хозяев, и большинство
вспышек связаны с передвижением инфицированных свиней или свиной продукции. Эти
разные эпидемиологические паттерны передачи могут быть связаны с генетической
вариабельностью, наблюдаемой у восточных и южных африканских изолятов вируса
АЧС, которые включают 22 определенных генотипа I p72, в отличии от западноафриканских изолятов вируса АЧС, которые классифицируются как единичный генотипы
I p72 (Lubisi et al., 2005, 2007; Boshoff et al., 2007; Gallardo et al., 2009a).
С момента сообщений в 1921г., в Кении произошли неоднократные вспышки болезни,
вызванные вирусом АЧС. Официальная зарегистрированная вспышка АЧС в Кении
произошла в 2001году в области Тхика (рис. 1). Гораздо позже, в 2006г. вспышка АЧС
была зарегистрирована на границе Кении с Угандой и распространилась в центральную
Кению в соседние регионы города Найроби в 2007г. Предварительный молекулярный
анализ показал, что вспышки 2006-2007 гг. были возможно связаны с
межгосударственными передвижениями домашних свиней или свиных продуктов между
Угандой и Кенией, без данных о прямом вовлечении лесного цикла (Gallardo et al., 2009a).
Точная информация относительно значимости лесного цикла для распространения
болезни в Кении, и других регионах восточной Африки не была опубликована. В
настоящее время, информация о сосуществовании домашних и лесных циклов передачи
базируется на исследованиях, проведенных в Малави и Мозамбике (Haresnape et al., 1985,
1988; Haresnape & Mamu, 1986; Penrith et al., 2004a).
Для того чтобы изучить возможную роль лесного цикла в передаче болезни в Восточной
Африке, мы публикуем результаты исследования, проведенного в центральной части
Кении. Данные показывают, что АЧС присутствует у серонегативных домашних свиней,
клещей, которые скапливаются в местах обитания бородавочников и серопозитивных
взрослых особей бородавочников. Для того чтобы создать базу последовательностей,
способную более точно оценить происхождение прошлых и будущих вспышек АЧС в
регионе, мы генотипировали изоляты вируса АЧС, полученных в данном исследовании.
Стратегия генотипирования включала в себя начальное частичное секвенирование гена
p72 для того чтобы классифицировать изоляты вируса АЧС относительно 22 в настоящее
время известных генотипов (Bolshoff et al., 2007). Для усиления резолюции были
секвенированы дополнительные локусы, особенно E183L и CP204L области генов,
кодирующие белки p54 и p30 (Gallardo et al., 2009a; Rowlands et al., 2008). Центральная
вариабельная область (ЦВО) в открытой рамке считывания B602L, которая оказалась
самым подходящим локусом для дифференциации близкородственных изолятов и
идентификации вируса подгруппы в p72 (Bastos et al., 2004; Nix et al., 2006; Lubisi et al.,
2005, 2007; Phologane et al., 2005; Gallardo et al., 2009a; Owolodun et al., 2010), была также
секвенирована. Эти исследования представляют первый детальный молекулярный анализ
роли лесного цикла, включающего бородавочников, клещей O. porcinus и домашних
свиней в эпидемиологии АЧС в Восточной Африке.
рис. 1 Карта Кении, показывающая местоположение изучаемых территорий. Особые места в
центральной части Кении выделены разными цветами.
Результаты
Клиническое и аутопическое исследование свиней
Клиническая проверка 83 домашних свиней на бойне Farmer’s Choice Nairobi выявила
клинические признаки АЧС. Дальнейшее патологоанатомическое исследование туш
показало, что поражений, характерных для болезни, не обнаружено. Эти результаты
показали, что у животных не было болезни.
Обнаружение с использованием ПЦР в собранных в полевых
условиях ДНК вируса АЧС
Обнаружение ДНК вируса АЧС у клещей. Для обнаружения ДНК вируса АЧС
использовали 72 отдельных клеща и 213 объединенных в пулы клещей, которые
представляли собой репрезентативные образцы клещей на разных стадиях развития,
собранные во время каждого из трех различных проботборов. Клещи были первоначально
обследованы посредством ПЦР с использованием праймеров РРА 1/2 (Aguero et al., 2003).
Доля положительных образцов (клещей) составляла 14 % (41 из общего количества
проанализированных 285 объединенных в пулы клещей и индивидуальных клещей).
Отрицательные или положительные результаты, полученные первоначальным
скринингом, были подтверждены посредством дополнительного специального ПЦР теста
для клещей (Basto et al., 2006). Первоначальные ампликоны были также
проанализированы посредством использования гнездовой ПЦР для максимального
увеличения возможности обнаружения клещей с низким уровнем инфекции вирусом АЧС.
При использовании этого метода процнт пулов клещей, содержащих вирс, увеличился до
22 % (62/285), как результат ампликонов, продуцированных из 21 клеща, которые
первоначально считались негативными, благодаря использованию единичного праймера
ПЦР (Таблица I).
Обнаружение ДНК вируса АЧС у домашних свиней и
бородавочников
Из 83 сывороток домашних свиней, собранных на бойне Farmer’s Choice Nairobi в 2005г.,
41 (49%) сыворотка оказалась позитивной по АЧС при использовании ПЦР на основе p72
гена, с последующим расщеплением BsmAI (n=20 Kamiti; n=14 Uplands and n=7 Nandi).
Для обнаружения ДНК вируса АЧС в пробах бородавочников, был проведен тест ПЦР на
51 пар образцов цельной крови и сыворотки. Наличие ДНК вируса АЧС было
подтверждено в трех сывороточных образцах от взрослых бородавочников (6 %), все они
были первоначально отобраны в августе 2008г. (Таблица 2).
Выделение вируса АЧС из положительных в ПЦР полевых
проб клещей, бородавочников и домашних свиней
Были предприняты попытки выделить вирус АЧС методом инокуляции клеток,
полученных из 62 экстрактов клещей, положительных в гнездовой ПЦР, 41
положительной по рзультатам ПЦР домашней свиньи и 3 положительных по результатам
ПЦР бородавочника в макрофаги периферической крови (МПК). После одного или трех
пассажей в клетках МПК были выделены двадцать изолятов вируса АЧС от клещей и 24
изолята вируса от АЧС домашних свиней с гемадсорбционным паттерном, типичным для
вирусов АЧС. Для изолятов вируса АЧС от клещей, средний титр вируса был между 106 и
1012 50 % гемадсорбирующих доз, тогда как для вируса АЧС от домашних свиней
максимальный полученный титр был 104HAD50. После трех пассажей от клещей, которые
были отрицательными в первоначальной ПЦР, но положительными при использовании
гнездовой ПЦР вирус не был выделен. Вирус не может быть выделен после трех пассажей
в ПЦР-положительных сывороточных образцах от бородавочников. Не были выделены
не-гемадсорбирующие штаммы вируса АЧС ни от клещей, ни от домашних свиней.
Обнаружение антител к вирусу АЧС, с использованием
предписанного МЭБ серологического теста
Среди 83 сывороточных проб от домашних свиней, отобранных в центральных областях
Кении в 2005г., обнаружение антител к вирусу АЧС, используя предписанный МЭБ ИФА
и иммуноблоттинг выявило, что ни один из них не был положительным. В то же время,
все из 51 сывороточной пробы от бородавочника были положительными на антитела к
вирусу АЧС.
Таблица 1. Анализ инфекции вирусом АЧС на различных стадиях развития
клещей O.porcinus из Kapiti Plains Estates, отобранных в 2005г., 2008г. и
2009г.
Стадия
развития
N1-N3
N4-N5
Взрослые
особи
Общее
коли
чество

Количе
ство
отоб
ранных
клещей
Диагностическая ПЦР
(Aguero et al., 2003)
Специфиче
ская для
клещей
ПЦР (Basto
et al., 2006)
Количество
протестирован
ных пулов
Количеств
о положи
тельных
(%)
891
485
200
116
80
89
15(13)
9(11)
17(19)
Резу
льта
ты
выде
лени
я
виру
са
Ко Коли
Коли
лич чество че
ест поло
ство
во жите
поло
про льных жи
тес (%)
тель
тир
ных
ова
(%)*
нн
ых
пул
ов
116 19(16) 7(37)
80 18(22) 4(22)
89 25(28) 9(36)
1576
285/59
41(14)
285 62(22)
20(32)
*Процент положительных выделений вируса, относящийся к количеству выделений вируса
в отношении общего количества положительных клещей, по результатам специфической
для клещей ПЦР, описанной Basto et al. (2006) для каждой группы.
Таблица 2. Анализ вирусной инфекции АЧС у домашних свиней и
бородавочников в образцах, собранных в центральной Кении в 2005г., 2008г.
и 2009г., соответственно
Происхо
Город/
Дата
Происх Колич
Геном
Обнару
Обнару
ждение
Farmer’s
Choice
Nairobi
slaugher
House
округ
Июль Домаш
2005 няя
свинья
23
ное
обнару
жние
АЧС
посред
стом
ПЦР
Количе
ство
полож
ительн
ых (%)
7(30)
Камити Июль Домаш
2005 няя
свинья
30
20(67)
14(70)
0(0)
Ап
лендс
30
14(47)
3(21)
0(0)
83
41(49)
24(59)
0(0)
Нанди
проб
отбо
ра
ождени ество
е видов отобра
нных
образц
ов
крови
Июль Домаш
2005 няя
свинья
Общее
количе
ство
местных
домаш
них
свиней
Kapiti
Plains
Estates
жение
выделе
ния
вируса
АЧС*
жение
антител
к АЧС
Коли
чество
положи
тельны
х (%)*
7(100)
Количес
тво
положи
тельны
х (%)
0(0)
Мача
кос
Ав
густ
2008
P. afri
canus
12
3(25)
0(0)
51(100)
Мача
кос
Март P. afri
2009 canus
39
0(0)
0(0)
51(100)
Общее
количе
ство
бородаво
чников
51
3(6)
0(0)
100(100)
* Процент положительных выделений вируса относящйся к количеству выделений вируса в
отношении общего количества положительных домашних свиней или бородавочников по
результатам ПЦР, описанной Aguero et al. (2003) для каждой группы.
Молекулярная характеристика вируса АЧС
Для генотипирования были отобрани 20 гемадсорбирующих изолятов вируса АЧС от
клещей (Tk), 12 гемадсорбирующих изолятов вируса АЧС от домашних свиней (DP) и три
образца сыворотки бородавочника (WH), которые были положительными по АЧС.
(Таблица 3). Для того чтобы классифицировать изоляты из Кении, описанные в этом
исследовании и отнести их к 22 генотипам белка р72, известным в настоящее время
(Boshoff et al., 2007), последовательности, полученные после амплификации Стерминального конца белка гена вируса р72 сравнили с 276 последовательностями из
ГенБанка, включающего представителей каждого из 22 генотипов гена р72.
Оба дерева, построенных методом присоединения соседа, построенных с помощью
алгоритма ((UPGMA) = метод кластеризации с арифметическим средним) и методом
минимальной эволюции деревьев (МЕ), которые показывали одинаковую филогению р72,
в соответствии с которой кенийские изоляты вируса АЧС, выделенные у клещей и у
домашних свиней были классифицированы как Х генотип р72 которые включает в себя
вирусы из Руанды, Бурунди и Кении. Напротив, три вируса АЧС, выделенные у взрослой
особи бородавочника принадлежали к IX генотипу р72. Этот генотип ранее был
идентифицирован у изолятов от домашних свиней, связанных с недавними вспышками
болезни. IX генотип включает в себя 15 изолятов из Западной и Восточной Уганды (UGA 
1/95, Ug03H1-3, Ug03Р4-6, UGA2003/1, Ug07.Wak1-4, Ug07.Mukono и Ug07.F7-8) из
вспышек в 1995, 2003 и 2007гг. (Bastos et al., 2003; Gallardo et al., 2009a; CISA, unpublished
data) и 11 изолятов из Западной и Центральной Кении (Ken06B1-5, Ken06.Bus, Ken06.Kis,
Ken07Eld1-2, ken07.Nak и Ken07.Kia), полученные от свиней, связанных со вспышками в
2006-2007гг. (Gallardo et al., 2009a) (Рис. 2).
Недавние исследования показали важность секвенирования генов р54 и р30, для
увеличения разрешающей способности метода типирования вирусов АЧС (Gallardo et al.,
2009a; Rowlands et al., 2008). Сравнительный анализ последовательностей
полноразмерных генов р54 и р30 продемонстрировал результаты, схожие с теми, которые
были получены при использовании гена р72; их схожесть заключалась в том, что вируса
АЧС бородавочников группировались в кластеры отдельно от тех вирусов, которые были
выделены у клещей и домашних свиней. Последовательности гена вируса от
бородавочника были идентичными по 478 bp С-терминальному р72 гену, 558 bp
полноразмерному гену р54 и 567 bp полноразмерному гену р30. Однако повышенная
гетерогенность была замечена и у изолятов вируса АЧС от домашних свиней и,особенно,
от клещей. Эта гетерогенность была самой высокой у гена р54, по которой полученные от
клещей изоляты вируса АЧС были сгруппированы в шесть дискретных монофилетических
групп (рис. 3). Секвенирование р54 показало что высокая вариабельность, обнаруженная в
этом белке была связана с наличием двух групп аминокислотных повторов, RPATD и
RPVAMN (Irusta et al., 1996; Nix et al., 2006), которые начинаются с aa 106. Эти повторы
изменяются в ряде изолятов вируса АЧС от клещей, которые были охарактеризованы
(данные не указаны).
Таблица 3. Кенийские изоляты вируса АЧС, отобранные с целью
генотипирования, полученные от клещей (Tk) и домашних свиней (DP) после
изоляции вируса и бородавочников (WH) чьи нуклеотидные
последовательности были определены на четырех локусах прямо из образцов
сыворотки
Название
изолята
Источник
(округ)
Дата
Вид-хозяина
проб
отбора
Июль Клещ(O.porcinus
2005
porcinus)
Гено
тип
р72
X
Номер гена
р72 в Генбанке
Ken05/Tk1
Kapiti
Plains
Estates
(Machakos)
Ken05/Tk2
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745254
Ken05/Tk3
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745255
Ken05/Tk4
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745256
Ken05/Tk5
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745257
Ken05/Tk6
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745258
Ken05/Tk7
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745259
HM745253
Ken05/Tk8
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745260
Ken05/Tk9
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745261
Ken05/Tk
10
Kapiti
Июль
Plains
2005
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745262
Ken05.DPk Farmer’s
2
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Kamiti)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745263
Ken05.DPk Farmer’s
16
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Kamiti)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745264
Ken05.DPk Farmer’s
18
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Kamiti)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745265
Ken05.DPk Farmer’s
21
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Kamiti)
Июль
2005
Местная
домашняя
свинья
X
HM745266
Ken05.DPk Farmer’s
27
Choice
Nairobi
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745267
slaughter
house
(Kamiti)
Ken05.DPN Farmer’s
2
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Nandi)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745268
Ken05.DPN Farmer’s
15
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Nandi)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745269
Ken05.DPN Farmer’s
23
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Nandi)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745270
Ken05.DPU Farmer’s
1
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Uplands)
Июль
2005
Местная
домашняя
свинья
X
HM745271
Ken05.DPU Farmer’s
2
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Uplands)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745272
Ken05.DPU Farmer’s
11
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Uplands)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745273
Ken05.DPU Farmer’s
22
Choice
Nairobi
slaughter
house
(Uplands)
Июль
2005
Домашняя
свинья
X
HM745274
Ken08WH/
4
Kapiti
Август Бородавочник
Plains
2008
(P. africanus)
Estates
(Machakos)
IX
HM745285
Ken08WH/
5
Kapiti
Август Бородавочник
Plains
2008
(P. africanus)
Estates
(Machakos)
IX
HM745286
Ken08WH/
8
Kapiti
Август Бородавочник
Plains
2008
(P. africanus)
Estates
(Machakos)
IX
HM745287
Ken08Tk.2/ Kapiti
Август Клещ(O.porcinus X
1
Plains
2008
porcinus)
Estates
(Machakos)
HM745275
Ken08Tk.2/ Kapiti
Август Клещ(O.porcinus X
3
Plains
2008
porcinus)
Estates
(Machakos)
HM745276
Ken09Tk.1
3/1
Kapiti
Март
Plains
2009
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745277
Ken09Tk.1
3/2
Kapiti
Март
Plains
2009
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745278
Ken09Tk.1
5/4
Kapiti
Plains
Estates
Март
2009
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745279
(Machakos)
Ken09Tk.1
5/6
Kapiti
Март
Plains
2009
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745280
Ken09Tk.1
9/2
Kapiti
Март
Plains
2009
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745281
Ken09Tk.1
9/7
Kapiti
Март
Plains
2009
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745282
Ken09Tk.1
9/11
Kapiti
Март
Plains
2009
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745283
Ken09Tk.2
0/5
Kapiti
Март
Plains
2009
Estates
(Machakos)
Клещ(O.porcinus X
porcinus)
HM745284
рис. 2 Филогенетическое поддерево, основанное на С-терминальном конце р72 белка 20
Кенийских клещей (, Tk), 12 домашних свиней (, DP), и трех бородавочников (▼, WH). Вирусы
АЧС охарактеризованные в данном исследовании, показывают генетическое родство с другими
вирусами АЧС, принадлежащими к генотипам IX и X генотипа гена р72 вируса АЧС. Дерево из
276 таксонов было построено с помощью метода ME (минимальной эволюции) применяемого
после первоначального метода NJ (метод ближайшего связывания). Доля деревьев-репликатов, в
которых ассоциированные таксоны, сгруппированные в кластеры с помощью анализа бутстреп
(1000 репликатов) была примыкающей к узловым точкам. Робаcтность дерева, построенного с
помощью метода минимальной эволюции (ME) тестировали, используя алгоритм Close-NeighbourInterchange (CNI) на уровне поиска 1.
рис.3 Сравнительные филогенетические деревья С-терминального конца гена р72 (Р72),
полноразмерного гена р54 (Р54) и полноразмерного гена р30 (Р30), продуцированные с
использованием последовательностей от 36 выделенных изолятов вируса АЧС из Кении,
рассмотрены в данном исследовании. Выводы об истории эволюции были сделаны с
использованием метода минимальной эволюции (ME). Филогенетические деревья вычерчены в
масштабе с длиной ветвей в одних и тех же единицах, таких как длина эволюционных расстояний,
используемых для создания филогенетического дерева. Алгоритм метода NJ применяли для
продуцирования первичных деревьев с использованием 1000 репликатов. Бутстреп-значения  50
% указаны рядом с узловой точкой.  Обозначает выделенные у клещей вирусы АЧС; ,
обозначает выделенные у домашней свиней вирусы АЧС и ▼, обозначает выделенные у
бородавочника вирусы, охарактеризованные в данном исследовании.
Анализ последовательностей тандемных повторов (TRS) внутри CVR B602L гена
продемонстрировал обеспечение самой высокой степени разрешающей дискриминации
изолятов вируса АЧС, разграничивая близкородственными изоляты вируса АЧС,
отнесенные к одному генотипу р72 и обеспечивая данные, которые помогают точно
установить источник вспышки.
Амплификация CVR продуцировала ампликоны длиной приблизительно 170 пар
оснований у домашних свиней и клещей Кенийских изолятов, тогда как установленный
размер изолятов вируса АЧС бородавочников был около 350 bp (данные не указаны). Эти
продукты ПЦР были легированы в вектор pGEMT-Easy и 10 отдельных клонов каждого
фрагмента были в произвольном порядке выбраны для анализа CVR-последовательностей
для обнаружения внутрииндивидуальной вариабельности. CVR-произведенные клоны
демонстрируют почти 100 % схожесть. Минимальную гетерогенность, связанную с
уникальной аминокислотной мутацией, наблюдали у 2 из 10 клонов, отобранных у
Ken09Tk.20/5 изолята вируса АЧС кенийского от клеща. Преобладающие
последовательности были выбраны в целях субтипирования. Анализ CVRпоследовательностей привел к идентификации 22 различных типов аминокислотных
тетрамеров присутствующих в трех вирусах кенийских бородавочников. Этим различным
последовательностям присвоены цифровые коды в соответствии с раннее описанной
системой (Nix et al., 2006) и показаны в Таблице 4. Как и в случае других генов,
последовательности CVR, идентифицированные в вирусах кенийского бородавочника,
были отнесены к CVR подгруппе XXIV. CVR подгруппа XXIV, к которой относятся
выделенные вирусы кенийского бородавочника и также изоляты из Уганды (UGA95/1,
Ug03H1-3, Ug03P4-6, Ug07.Wak1-4, Ug07Mukono и Ug07.F7-8) и изоляты из Кении
(Ken06B1-5, Ken06.Bus, Ken06Kis Ken07Eld1-2, Ken07.Nak и Ken07.Kia), которые связаны
с недавними вспышками болезни. Когда тетрамерные повторы, находящиеся в гене
B602L, из трех проб кенийских бородавочников сравнивали с вирусами, включенными в
CVR подгруппу XXIV (Nix et al., 2006; Gallardo et al., 2009a), вирусные
последовательности от кенийских бородавочников, полученные в 2008 году, были
идентичны там, которые были получены из вирусов, связанных со второй вспышкой АЧС
среди домашних свиней, которая произошла в Западной Кении в 2006 году (Ken06.Bus) и
для всех изолятов из последующих вспышек в Кении и Уганде в 2007 году (Gallardo et al.,
2009a; CISA, неопубликованные данные).
Количество аминокислотных тетрамерных повторов среди изолятов вируса АЧС клещей
варьировало между 8 и 9, а 20 изолятов от клещей, у которых была определена
последовательность CVR, к 4 подгруппам с тетрамерным повтором строем, могут быть
отнесены к близкородственным CVR подгруппе XXV, описанной Nix et al., (2006),
которая также содержит вирус UGA95/3 (GenBank accession no. AM259420). Наиболее
распространенная последовательность тетрамерных повторов AABNAaBBA (смотри
Таблицу 4) была идентифицирована у высокого процента клещевых изолятов и кенийских
изолятов от домашних свиней, так что оба могут быть отнесены к CVR подгруппе XXVa.
Изолят вируса АЧС Ken09Tk.20/5 был классифицирован в отдельную дискретную
подгруппу (XXVb), представляющую незначительное изменение в связи с отсутствием
отдельного внутреннего тетрамерного повтора типа «а» (CVST). Оставшиеся изоляты
вируса АЧС Ken05Tk/3-6 и Ken05Tk/2-8 (CVR подгрупп XXVc и XXVd, соответственно)
содержащим уникальный паттерн тетрамерные повторы AANAaBBA и BNAANABAA
которого нет у других охарактеризованных изолятов (Таблица 4).
Обсуждение
В данном исследовании мы обнаружили существенную разницу у сложных локусов в
генотипе вирусов, которые значимы на разных фазах лесного цикла бородавочник-клещ
вируса АЧС, предполагая что переносы хотя бы двух различных вирусов в домашних
свиней происходило в лесном цикле бородавочник-клещ в Восточной Африке. Также
возможно, хотя менее вероятно, что один или более из этих вирусов могли быть переданы
от домашних свиней бородавочникам. Вирусы обоих p72 генотипов IX и X, находятся в
параллели скотоводческой фермы Kapiti Plains у взрослых особей бородавочников и
клещей, соответственно. Анализ последовательностей С-терминального конца гена p72
(Bastos et al., 2003) позволил поместить изоляты вируса АЧС домашних свиней и
кенийских клещей (Kapiti) в генотип X, связанный с лесным циклом генотипа, который
включает вирусы, выделенные у домашних и диких свиней, и членистоногого клещапереносчика из Руанды, Бурунди, Танзании и Кении. Вирус АЧС генотипа Х исторически
был связан с АЧС у домашних свиней в Кении в 1950 году (Zsak et al., 2005; de Villiers et
al., 2010), но в этом исследовании были только изолированы от клещей и клинически
здоровых домашних свиней, что позволят предположить наличие эволюции сниженной
вирулентности вируса. Как ни странно, учитывая тот факт, что текущая парадигма
лесного цикла клещ-бородавочник поддерживается в первую очередь взаимодействием
клещей и новорожденных бородавочников в местах обитания, генотипы вирусов у клещей
и взрослых особей бородавочников отличаются. Генотип p72 выделенных изолятов от
клеща Kapiti был тип Х, тогда как три вируса АЧС, выделенные у бородавочников,
которые были генотипированы прямой амплификацией при помощи ПЦР из образцов
сыворотки, были отнесены к другому генотипу р72, номер IX. Этот генотип также
содержит изоляты вируса, связанные с недавними вспышками АЧС в Уганде и Кении в
период между 2003 и 2007гг. (Gallardo et al., 2009a). Однако современная теория позволяет
предположить что прямая передача вируса АЧС от взрослых особей бородавочника
домашним свиньям маловероятен (Thomson, 1985; пересмотренный Penrith et al., 2004a;
Bastos et al., 2004). Ответ на вопрос, каким образом вирус генотипа IX поддерживается в
популяции бородавочников, остается неясным, поскольку тип p72 не был обнаружен у
клещей в 26 различных местах обитания на разных участках скотоводческих ферм, и
взрослые особи бородавочника, как правило, считаются конечным хозяином вируса АЧС
(Bastos, et al., 2009; Jori & Bastos, 2009). Однако невозможно было установить прямые
перекрестные ссылки между взятыми образцами от взрослых особей бородавочника и
клещей в этом исследовании, поскольку места обитания взрослых особей бородавочника
неизвестны. Поскольку из-за низкой виремии в крови мы только смогли изучить генотип
вирусов, выделенных у трех взрослых особей бородавочника; возможно что более
подробное исследование сможет также выявить наличие генотипа IX у взрослых особей
бородавочника. Данные полученные при использовании генов р54 и р30, соответствовали
информации по генотипированию р72, показывающей что вирусы АЧС, выделенные у
бородавочников в Центральной Кении в 2009 году, были генетически очень схожи с
другими, ответственными за вспышки в Кении и соседней Уганде в период между 2003 и
2007гг. Высокий уровень разрешения распознавания вирусов с использованием
секвенированния гена р54 был снова продемонстрирован сепарацией вирусов кенийского
клеща в 6 кластеров, по сравнению с тремя с использованием гена р72.
Таблица 4. Аминокислотная последовательность тетрамерных повторов, которая состоит из CVR гена B602L,
идентифицированного в вирусах, принадлежащих к IX генотипу р72 и Х генотипу р72 А, CAST; a, CVST; B, CADT, CADI; N,
NVDT. Пунктиры показывают пробелы, набранные вручную для того чтобы визуализировать сходство между
последовательностями. Последовательности, продуцированные в этом исследовании, обозначены жирным шрифтом.
Изолят
Страна
CVR аминокислотная
последовательность
Уганда
Гено
тип
р72
IX
Ug03H.1
Количе
ство
повторов
AAABNABBNABB—aaBBNABNaBA 23
Подгр
уппа
CVR
XXIV
Номер гена
р72 в
Генбанке
FJ174339
Ug03P.4
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aaBBNABNaBA 23
FJ174342
Ken06.B1
Кения
IX
AAABNABBNABB—aaBBNABNaBA 23
FJ174329
Ken06.Bus
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
FJ174334
Ken06.Kis
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
FJ174337
Ken07.Eld1
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
FJ174335
Ken07.Eld2
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
FJ174336
Ken07.Kia
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
FJ174339
Ken07.Nak
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
FJ174338
UG07.Wak1
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
GQ477152
Ссылка
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
Gallardo et al.,
(2009a)
CISA-неопуб
ликованное
UG07.Wak2
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
GQ477153
UG07.Wak3
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
GQ477154
UG07.Wak4
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
GQ477155
UG07.Mukono
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
GQ477156
UG07.F7
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
GQ477157
UG07.F8
Уганда
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
GQ477158
Ken08WH/4
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
HM745320
Ken08WH/5
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
HM745321
Ken08WH/8
Кения
IX
AAABNABBNABB—aa-BNABNaBA
22
HM745322
UGA95/1
Уганда
IX
AAABNABBNABBNABBNABaaBBN 26
ABNaBA
HindII
Кения
X
AAA---BNAAAAAAAAAAB-A
17
Bur90/1
Бурунди X
AAA---BNAAAAAAAAAAB-A
17
AM259424.1
Bur84/2
Бурунди X
AAA---BNAAAAAAAAAAB-A
17
AM259423.1
AM259419.1
XXVI
AM259421.1
CISA-неопуб
ликованное
CISA-неопуб
ликованное
CISA-неопуб
ликованное
CISA-неопуб
ликованное
CISA-неопуб
ликованное
CISA-неопуб
ликованное
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Nix et al.
(2006)
Nix et al.
(2006)
Nix et al.
(2006)
Nix et al.
(2006)
Bur84/1
Бурунди X
AAA---BNAAAAAAAAAAB-A
17
Uga95/3
Уганда
X
AAAAAABN---------BABA
12
XXV
AM259420.1
Ken05.DPk2
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
XXVa
HM745298
Ken05.DPk16
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745299
Ken05.DPk18
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745300
Ken05.DPk21
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745301
Ken05.DPk27
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745302
Ken05.DPN2
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745303
Ken05.DPN15
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745304
Ken05.DPN23
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745305
Ken05.DPU1
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745306
Ken05.DPU2
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745307
Ken05.DPU11
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745308
Таблица 4. Продолжение
AM259422.1
Nix et al.
(2006)
Nix et al.
(2006)
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Изолят
Страна
Гено
тип р72
CVR аминокислотная
последовательность
Количе
ство
повторо
в
Подгруппа
CVR
Номер
доступа в
Генбанке
CVR
Ken05.DPU22
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745309
Ken05/Tk9
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745296
Ken05/Tk10
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745297
Ken05/Tk7
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745294
Ken05/Tk5
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745292
Ken05/Tk1
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745288
Ken05/Tk4
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745291
Ken08Tk.2/1
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745310
Ken08Tk.2/3
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745311
Ken09Tk.13/1
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745312
Ken09Tk.13/2
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745313
Ken09Tk.15/4
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745314
Ссылка
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
Ken09Tk.15/6
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745315
Ken09Tk.19/2
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745316
Ken09Tk.19/7
Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745317
Ken09Tk.19/11 Кения
X
AA----BNAa--------BBA
9
HM745318
Ken09Tk.20/5
Кения
X
AA----BNA--------BBa
8
Ken05/Tk3
Кения
X
AAA-----NAa--------BBA
9
Ken05/Tk6
Кения
X
AAA-----NAa--------BBA
9
XXVc
HM745293
Ken05/Tk2
Кения
X
------BNAANAB------AA
9
XXVd
HM745289
Ken05/Tk8
Кения
X
------BNAANAB------AA
9
XXVb
HM745319
HM745290
HM745295
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Данное
исследование
Анализ последовательностей CVR вирусов, выделенных из изолятов кенийских
бородавочников, идентифицировал 22 разлиных тетрамерных аминокислотных единиц.
Последовательность CVR, выделенная из изолятов бородавочника, была идентична шести
изолятам, связанным со второй волной инфекций, которая случилась в Западной и
Центральной Кении с октября 2006 года по январь 2007 года и в Уганде в 2007. Однако
CVR бородавочника отличалась от кенийских изолятов, выделенных во время ранней
вспышки в мае 2006 года и из вирусов Уганды из вспышек в 2003 году, которые были
идентичны в своих CVR последовательностях (Gallardo et al., 2009a). Одним объяснением,
согласующимся с распространением вируса с запада в центр Кении через домашних
свиней, является то, что та же мутация CVR имела место неоднократно и у
бородавочников, и у домашних свиней. Однако бородавочники обитают в регионах
Центральной Кении, где вспышки болезни были зафиксированы в 2007 году и также
распространились в Восточную Африку. Поэтому, нельзя исключать передачу «лесного
цикла» от бородавочника к домашним свиньям и возможную его роль в будущем
повторном возникновении спорадических вспышек, вызванных вирулентным вирусом в
данном регионе.
Высокий уровень разнообразия CVR был найден в штаммах вирусов АЧС выделенных у
кенийских клещей. Вирусы были разделены на четыре подгруппы, которые были схожи с
предыдущей указанной CVR подгруппой XXV, содержащей изолят АЧС Уганды
(Uga95/3). Это большое разнообразие логично из-за клеща, действующего главным
хозяином для
продолжительного сохранения вируса.
ПЦР выявила вирусную ДНК у 22% отдельных клещей, и отобранных клещей собранных
в пулы, до и после вспышек АЧС в Кении в течение 2006-2007гг., что указывает на то
существенная их часть имела возможность кормиться на зараженных вирусом свиньях.
Анализ гена р72 гнездовой ПЦР (Basto et al., 2006) может обнаружить большое количество
вируса ниже порога обнаружения при выделения вируса в культуре клеток. Оба варианта
ПЦР могут выявить ДНК в вирусах, которые не реплицируются и вирус был только
выделен у 31 % ПЦР-позитивных клещей или пулов клещей. Однако основываясь только
на наших данных, мы не можем быть уверенными относительно была ли получена ДНК
вируса АЧС, которую мы обнаружили у клещей, из активно реплицирующегося вируса.
Вирусы, которые были выделены у клещей, демонстрировали характерный паттерн
гемадсорбции вируса АЧС, и высокие титры вируса.
Мы показали высокое распространение вируса АЧС с р72 генотипом IX у серонегативных
домашних свиней, происходящих из некоторых мест обитания, в которых болезнь не
регистрировалась, и не проявляла клинических симптомов. Наличие вируса было
подтверждено ПЦР в приблизительно 50 % образцов от домашних свиней, с высокой
долей положительных результатов из округа Камити, около Найроби. У 30 %
положительных по результатам ПЦР домашних свиней вирус был выделен прямо из
сыворотки крови с титрами от 101 до 104 (HAD50) мл-1 , на уровне, достаточном для
заражения незараженных свиней или клещей. Антитела к вирусу АЧС не были выявлены в
тестируемых образцах сыворотки от домашних свиней с использованием предписанных
МЭБ серологических методов. Этот результат поддерживает предыдущие исследования,
подтверждая низкую инцидентность обнаруживаемых серологических ответов на вирус
АЧС (Perez-Filgueira et al., 2006; Gallardo et al., 2009b). Данные полученные при
исследовании образцов сыворотки крови бородавочника в том же регионе Кении не
подтверждают объяснение, что неудача с обнаружением антител является следствием
антигенного полиморфизма, поскольку все были положительными, при использовании тех
же серологических приемов. И это несмотря на тот факт, что бородавочники были
заражены вирусами генотипа, отличающегося от того, который был использован для
получения экстракта антигена для серодиагностики. Другое альтернативное объяснение
низкой серопозитивной реакции в Восточной Африке может заключаться в
иммуногенетике местного поголовья домашних свиней, а не в полиморфизме в
иммунодоминантных вирусных антигенах. Однако возможно, что явное отсутствие
гуморального ответа антител обуславливается фактом, что штамм, который присутствует
у бородавочника отличается от штамма домашних свиней. Также не может быть
исключено, что свиньи, у которых отбирали образцы, были заражены вирусом, и они не
успели выработать ответ антител. Необходимы дополнительные исследования для
прояснения ситуации, включая экспериментальное заражение местных пород
африканских домашних свиней и мониторинг этих двух штаммов и мониторинг
гуморального ответа антител.
Серологические результаты и результаты ПЦР, полученные на образцах бородавочника,
собранных на равнине Kapiti, были схожи с предыдущими находками в энзоотических
ареалах вируса АЧС в Южной Африке, показывают, что взрослые особи бородавочника
обычно не были заражены вирусом, но были серопозитивными, хотя вирус обычно
выделяли только из лимфатических узлов (Penrith et al., 2004a). В настоящее время
считается что новорожденные/молодые особи бородавочника становятся
инфицированными клещами Ornithodoros в местах обитания бородавочников в начале их
жизни. Вирус размножается в бородавочниках и продуцирует временную виремию,
которая достаточна для передачи неинфицированным клещам, которые сосут кровь
молодых особей бородавочников, поддерживая этим цикл (Thomson, 1985; исправленная
Penrith et al., 2004a). Более взрослые особи бородавочника возможно инфицированы на
протяжении всей жизни, но редко виремичны. Лимфатические узлы считаются наиболее
часто инфицированными тканями.
Современное понимание лесного цикла основывается главным образом на полученных в
Южной Африке данных, позволяющих предполагать что огромное количество O. porcinus,
которые заражают места обитания бородавочника, играют ключевую роль в сохранении
вируса. В то же время у взрослых особей бородавочника низкая концентрация вируса в
крови и они являются последним хозяином (Bastos et al., 2009). Механизм переноса вируса
АЧС из лесного цикла в восточные или южные регионы Африки наиболее вероятно
происходит через заражение домашних свиней инфицированными клещами, поскольку
прямой контакт между инфицированными бородавочниками и домашними свиньями не
приводит к данному результату в передаче вируса (Heuschele & Coggins, 1969; Thomson
1985), кроме единичного случая (Detray, 1957). Примечательно, что наше исследование
выявило то, что вирусы, находящиеся в сыворотке взрослых особей бородавочника
генетически отличались от вирусов, выявленных у клещей из мест обитания
бородавочника в том же регионе, но были схожи с вирусами, вызвавшими недавние
вспышки АЧС. Насколько мы можем судить, это принципиально новое наблюдение.
Обнаружение и молекулярная характеристика вируса АЧС у бородавочников, клещей и
домашних свиней, о которых мы отчитались, позволяет предположить одновременное
существование трех различных циклов передачи АЧС в Кении; (i) передача от домашней
свиньи - свинье без вовлечения клеща, ассоциируемого с недавней вспышкой в Западной
Кении; (ii) передача от домашней свиньи – бородавочнику и (iii) передача от домашней
свиньи – клещу – бородавочнику и роль лесной передачи в поддержании и возможном
повторном возникновении болезни. Наблюдение за выделением различных генотипов у
клещей и взрослых особей бородавочника удивительно и позволяет предположить, что в
будущем, что более подробный анализ вирусов,присутствующих у бородавочников и
клещей в многочисленных местах в Восточной Африке, будет необходим для лучшего
понимания природы лесного цикла передачи вируса АЧС и поддержания вируса.
Методы
Сфера исследования и сбор образцов. В июле 2005г. проводилось исследование
на АЧС у домашних свиней на бойне Farmer’s Choice Nairobi. Восемьдесят три
отобранных в произвольном порядке животных были подвергнуты рутинному
клиническому осмотру ветеринаром с отбором образцов крови из уха/яремной вены.
После убоя проводился посмертный всеобъемлющий осмотр ветеринаром с бойни
сопровождающийся отбором образцов ткани. Представленные животные были
домашними свиньями местных пород из областей, в которых не регистрировались
никакие клинические вспышки. Эти животные происходили из трех областей в Западной и
Центральной Кении: Нанди (n=23), Камити (n=30) и Uplands (n=30) (рис. 1).
Проводилось обзорное исследование на АЧС клеща и бородавочника на ферме
Международного научно-исследовательского института животноводства (ILRI) Kapiti
Plains Estate, 13000 гектаров скотоводческой фермы, находящейся в округе Мачакос в
Центральной Кении, примерно в 65 км к юго-востоку от Найроби (рис.1). Первый
проботбор клещей был проведен в июле 2005г. Было собрано 378 клещей из пяти
независимых мест обитания бородавочника. В течение 2008-2009 гг., после вспышек АЧС
в Кении в 2006г. и в 2007г., было проведено второе исследование клещей, включая
проботбор 1198 образцов из 21 независимых мест обитания бородавочника в Kapiti Plains
Округе. Дополнительно, в августе 2008 года и в марте 2009 года, 51 образец цельной
крови и сыворотки от взрослых особей бородавочника, которые принадлежали
установленному поголовью в количестве 150 животных были также отобраны на
скотоводческой ферме. Все клещи были идентифицированы как мягкие клещи вида O.
porcinus.
Подготовка проб клещей. Отобранные клещи были классифицированы в
соответствии со стадией развития: 891 маленьких нимф (нимфальные стадии 1-3, N1-N3),
большие нимфы (стадии 4 и 5, N4-N5) и взрослые особи (и мужские и женские особи). По
следующей идентификации, клещи, в количестве 1576 особей из 26 отдельных мест
обитания бородавочника были сортированы по группам включающим взрослых особей
клещей (72 отдельных клеща и 17 клещей собранных в пулы), маленьких нимф (116
клещей собранных в пулы) и больших нимф (80 клещей собранных в пулы) которые были
измельчены в фарфоровых чашках с 1.5 мл холодным фосфатно-солевым буферным
раствором (PSB) с добавлением 0.1 % антибиотика (сульфат гентамицина).
Суспензии
были очищены центрифугированием (5000 g, 5 мин. 4С) и надосадочную жидкость
оставили храниться при температуре - 70 С до следующего использования.
Обнаружение ДНК вируса АЧС у отобранных в полевых
условиях клещей и в образцах млекопитающих с
использованием ПЦР
Обнаружение ДНК вируса АЧС у отобранных в полевых условия клещей проводилось с
использованием ранее описанных протоколов (Aguero et al., 2003). Вкратце, ДНК
экстрагировали из 200 мкл. каждой надосадочной жидкости из клеща, 83 сыворотки из
домашних свиней, 51 сыворотки от бородавочника и 51 образца крови бородавочника и
получили в конечном объеме 50 мкл. с использованием набора High Pure Viral Nucleic
Acid kit (Roche) в соответствии с инструкций производителя. ПЦР с использованием
диагностических праймеров PPA1/PPA2, которые продуцируют ампликон длиной 257 пар
нуклеотидных оснований внутри гена, кодирующего белок р72 (Aguero et al., 2003) была
использована для подтверждения наличия ДНК вируса АЧС. Продукты ПЦР разделили на
фракции по размеру посредством электрофореза с использованием 2 % агарозного геля и
специфичность ампликонов была подтверждена методом BsmAI расщепления
рестриктазой
(Aguero et al. 2003). Для того чтобы исключить вероятность ложноотрицательных
результатов, в связи с присутствием ингибиторов ПЦР в образцах ДНК, очищенных от
надосадочной жидкости у клещей, положительные и отрицательные в ПЦР клещи были
анализированы более чувствительной гнездовой ПЦР (Basto et al., 2006), основанно на
альтернативных праймерах из VP72 гена обозначенным 72 ARs/72 ARas. Эти праймеры
были использованы в сочетании с внутренними праймерами 72Ns/72Nas для увеличения
вероятности обнаружения небольших количеств ДНК вируса АЧС в образцах клещей.
Выделение вируса и титрование. Выделение вируса и титрование были
проведены с использованием реакции гемадсорбции с незначительными модификациями
(Malmquist & Hay, 1960). Вкратце, мононуклеары периферической крови (PBMs) были
посеяны в 96-луночный титровальный микропланшет для культур тканей (200 мкл.;
300000 клеток на лунку) в гомологичной сыворотке свиней и инкубированы при
относительной влажности около 95 % с наличием 5 % CO2 при 37C. Трехдневные
культуры заразили ПЦР-положительными образцами, отобранными в полевых условиях (4
лунки на образец; 20 мкл. посевного материала на лунку). После инокуляции был
добавлен 1% препарат гомологичных красных кровяных клеток в забуференном
физиологическом растворе в каждую лунку и был инкубирован при температуре 37C.
Слой клеток в планшетах изучался на наличие реакции гемадсорбции на протяжении 6
дней. Три раза образцы подвергали «слепым» пассажам. Выделение вируса в клетках
PBM, демонстрирующих цитопатогенное действие (ЦПА) и/или реакцию гемадсорбции,
было подтверждено ПЦР с использованием праймеров PPA1/2 (Aguero et al., 2003) и
рестрикционного анализа фермента NdeI (CISA, неопубликованные данные). Титрование
проводили с использованием реакции гемадсорбции, включая инокуляцию предельных
разведений надосадочной жидкости из положительных результатов по гемадсорбции
собранных в полевых условиях образцов в PBM. Титры были установлены с
использованием метода Reed&Muench (1938) и выражены как HAD50 на образец.
Обнаружение антител против вируса АЧС в образцах
сыворотки, собранной в полевых условиях. Протестировали образцы
сывороток, отобранных от 83 домашних свиней и образцы сывороток, отобранных в
полевых условиях от 51 бородавочника с использованием прдписанных МЭБ тестов (OIE,
2008). Это включало в себя непрямой иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) и анализ
методом иммуноблоттинга, с использованием антигена который представляет собой лизат
стабильных клеток обезьяны, инфицированных испанским изолятом E70MS48 вируса
АЧС и с использованием белка-А, коньюгированного с пероксидазой хрена в качестве
гена репортера (OIE, 2008).
Молекулярная характеристика вируса АЧС.
ПЦР-амплификация и
нуклеотидное секвенирование: для генетической характеристики, ПЦР проводили с
использованием нуклеиновой кислоты, выделенной из образца, содержащего вируса АЧС,
с использованием специфических праймеров для амплификации четырех независимых
областей генома вируса АЧС: (i
были амплифицированы с использованием праймеров р72-U/D (Bastos et al., 2003); (ii)
полноразмерный ген р54, кодирующий белок VP54, был амплифицирован с
использованием праймеров PPA89/722 (Gallardo et al., 2009a); (iii) ) полноразмерный ген
р30, кодирующий белок VP30, был амплифицирован с использованием праймеров p30R/F
(Rowlands et al., 2008); (iv) пары праймеров ORF9L-F/9L-R были использованы для
амплификации CVR внутри гена B602L (Nix et al., 2006). Последовательности генов р72,
р54 и р30 определяли посредством прямого секвенирования амплифицированных
продуктов ПЦР. Ампликоны CVR заранее предсказанного размера были получены и
очищены посредством экстракции в геле Qiaex (Qiagen) и клонированы в вектор pGEMTEasy в соответствии с инструкцией производителя. Десять клонов из каждого образца
были секвенированы с использованием праймеров, специфичных для вектора pGEMTEasy (SP6/T7) с использованием автоматизированного анализатора ДНК 3730 (Applied
Biosystems).
Анализ полученных данных проводили с использованием Chromas
(www.technelysium.com.au), BioEdit (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit.html) и clustal_x версии
1.83 (clustal.org). Для TSR анализов, включающих нуклеотидную последовательнось CVR,
и расшифрованные в аминокислотные последовательности были вручную выравнены со
вставленными гэпами в целях оптимизации выравнивания. Для филогенетического
анализа в MEGA версии 4 использовалось два различных набора данных (Tamura et al.,
2007): (i) данные о р72 гене, включающие 276 таксонов, в которых последовательности
вирусов из Кении, полученные в этом исследовании сравнили с последовательностями
вирусов АЧС из Генбанка; (ii) сравнительные данные генов р54-р30-р72 включающие 36
таксонов, относящихся к вирусам АЧС из Кении, характеризованным в этом
исследовании. Деревья, построенные методом ближайшего связывания (NJ) и методом
минимальной эволюции (МЕ) для генов р72, р54 и р30 были сконструированы с помощью
дистанционной нуклеотидной подстановочной модели, обеспечиваемой программой в
MEGA pv4.0. Для того чтобы установить степень статической достоверности для каждой
узловой точки в полученных деревьях, данные были проверены 1000 раз с помощью
метода бутстрепа.
Библиография
1. Aguero, M., Fernandez, J., Romero, L., Sanchez Mascaraque, C., Arias, M. &
Sanchez-Vizcaino, J. M. (2003). Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of
African swine fever virus in clinical samples. J Clin Microbiol 41, 4431–4434.
2. Basto, A. P., Nix, R. J., Boinas, F., Mendes, S., Silva, M. J., Cartaxeiro, C., Portugal,
R. S., Leitao, A., Dixon, L. K. & other authors (2006). Kinetics of African swine fever
virus infection in Ornithodoros erraticus ticks. J Gen Virol 87, 1863–1871.
3. Bastos, A. D., Penrith, M. L., Cruciere, C., Edrich, J. L., Hutchings, G., Roger, F.,
Couacy-Hymann, E. & Thomson, G. R. (2003). Genotyping field strains of African
swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Arch Virol 148, 693–706.
4. Bastos, A. D., Penrith, M. L., Macome, F., Pinto, F. & Thomson, G. R. (2004). Cocirculation of two genetically distinct viruses in an outbreak of African swine fever in
Mozambique: no evidence for individual co-infection. Vet Microbiol 103, 169–182.
5. Bastos, A. D., Arnot, L. F., Jacquier, M. D. & Maree, S. (2009). A host speciesinformative internal control for molecular assessment of African swine fever virus
infection rates in the African sylvatic cycle Ornithodoros vector. Med Vet Entomol 23,
399–409.
6. Boshoff, C. I., Bastos, A. D., Gerber, L. J. & Vosloo, W. (2007). Genetic
characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973–
1999). Vet Microbiol 121, 45–55.
7. Chapman, D. A., Tcherepanov, V., Upton, C. & Dixon, L. K. (2008). Comparison of the
genome sequences of non-pathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates. J
Gen Virol 89, 397–408.
8. Costard, S., Wieland, B., de Glanville, W., Jori, F., Rowlands, R., Vosloo, W., Roger,
F., Pfeiffer, D. U. & Dixon, L. K. (2009). African swine fever: how can global spread be
prevented? Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 364, 2683–2696.
9. De Kock, G., Robinson, E. M. & Keppel, J. J. G. (1940). Swine fever in South Africa.
Onderstepoort J Vet Res 14, 31–93.
10. de Villiers, E. P., Gallardo, C., Arias, M., da Silva, M., Upton, C., Martin, R. & Bishop,
R. P. (2010). Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome
sequences. Virology 400, 128–136.
11. Detray, D. E. (1957). African swine fever in warthogs (Phacochoerus aethiopicus). J Am
Vet Med Assoc 130, 537–540.
12. Dixon, L. K., Costa, J. V., Escribano, J. M., Rock, D. L., Vinuela, E. & Wilkinson, P. J.
(2000). Family Asfarviridae. In Virus Taxonomy, 7th Report of the ICTV, pp. 159–165.
Edited by Van Regenmortel, M. H. V., Fauquel, C. M. & Bishop, D. H. L.. San Diego. :
Academic Press.
13. Dixon, L. K., Escribano, J. M., Martins, C., Rock, D. L., Salas, M. L. & Wilkinson, P.
J. (2005). Asfarviridae. In Virus Taxonomy, VIIIth Report of the ICTV, pp. 135–143.
Edited by Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U. & Ball, L. A..
London. : Elsevier/Academic Press.
14. Gallardo, C., Mwaengo, D. M., Macharia, J. M., Arias, M., Taracha, E. A., Soler, A.,
Okoth, E., Martin, E., Kasiti, J. & other authors (2009a). Enhanced discrimination of
African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and
pB602L (CVR) genes. Virus Genes 38, 85–95.
15. Gallardo, C., Reis, A. L., Kalema-Zikusoka, G., Malta, J., Soler, A., Blanco, E.,
Parkhouse, R. M. & Leitao, A. (2009b). Recombinant antigen targets for serodiagnosis
of African swine fever. Clin Vaccine Immunol 16, 1012–1020.
16. Haresnape, J. M. & Mamu, F. D. (1986). The distribution of ticks of the Ornithodoros
moubata complex (Ixodoidea: Argasidae) in Malawi, and its relation to African swine
fever epizootiology. J Hyg (Lond) 96, 535–544.
17. Haresnape, J. M., Lungu, S. A. & Mamu, F. D. (1985). A four-year survey of African
swine fever in Malawi. J Hyg (Lond) 95, 309–323.
18. Haresnape, J. M., Wilkinson, P. J. & Mellor, P. S. (1988). Isolation of African swine
fever virus from ticks of the Ornithodoros moubata complex (Ixodoidea: Argasidae)
collected within the African swine fever enzootic area of Malawi. Epidemiol Infect 101,
173–185.
19. Heuschele, W. P. & Coggins, L. (1969). Epizootiology of African swine fever virus in
warthogs. Bull Epizoot Dis Afr 17, 179–183.
20. Irusta, P. M., Borca, M. V., Kutish, G. F., Lu, Z., Caler, E., Carrillo, C. & Rock, D. L.,
(1996). Amino acid tandem repeats within a late viral gene define the central variable
region of African swine fever virus. Virology 220, 20–27.
21. Jori, F. & Bastos, A. D. (2009). Role of wild suids in the epidemiology of African swine
fever. EcoHealth 6, 296–310.
22. Kleiboeker, S. B. & Scoles, G. A. (2001). Pathogenesis of African swine fever virus in
Ornithodoros ticks. Anim Health Res Rev 2, 121–128.
23. Lubisi, B. A., Bastos, A. D., Dwarka, R. M. & Vosloo, W. (2005). Molecular
epidemiology of African swine fever in East Africa. Arch Virol 150, 2439–2452.
24. Lubisi, B. A., Bastos, A. D., Dwarka, R. M. & Vosloo, W. (2007). Intra-genotypic
resolution of African swine fever viruses from an East African domestic pig cycle: a
combined p72-CVR approach. Virus Genes 35, 729–735.
25. Malmquist, W. A. & Hay, D. (1960). Hemadsorption and cytopathic effect produced by
African Swine Fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures. Am J Vet Res
21, 104–108.
26. Montgomery, R. E. (1921). A form of swine fever occurring in British East Africa (Kenya
Colony). J Comp Pathol 34, 159–191.
27. Nix, R. J., Gallardo, C., Hutchings, G., Blanco, E. & Dixon, L. K. (2006). Molecular
epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome
regions. Arch Virol 151, 2475–2494.
28. OIE (2008). Chapter 2.8.1. African swine fever. In Manual of diagnostic tests and
vaccines for terrestrial animals 2008. Office International des Epizooties, Paris, France.
http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/2.08.01_ASF.pdf.
29. Oura, C. A., Powell, P. P., Anderson, E. & Parkhouse, R. M. (1998). The pathogenesis
of African swine fever in the resistant bushpig. J Gen Virol 79, 1439–1443.
30. Owolodun, O. A., Bastos, A. D., Antiabong, J. F., Ogedengbe, M. E., Ekong, P. S. &
Yakubu, B. (2010). Molecular characterisation of African swine fever viruses from
Nigeria (2003–2006) recovers multiple virus variants and reaffirms CVR epidemiological
utility. Virus Genes 41, 361–368.
31. Penrith, M. L. (2009). African swine fever. Onderstepoort J Vet Res 76, 91–95.
32. Penrith, M. L., Thomson, G. R. & Bastos, A. D. S. (2004a). African swine fever. In
Infectious Diseases of Livestock with Special Reference to Southern Africa, pp. 1088–
1119. Edited by Coetzer, J. A. W. & Tustin, R. C.. Cape Town, South Africa. : Oxford
University Press.
33. Penrith, M. L., Thomson, G. R., Bastos, A. D., Phiri, O. C., Lubisi, B. A., Du Plessis, E.
C., Macome, F., Pinto, F., Botha, B. & other authors (2004b). An investigation into
natural resistance to African swine fever in domestic pigs from an endemic area in
southern Africa. Rev Sci Tech 23, 965–977.
34. Perez-Filgueira, D. M., Gonzalez-Camacho, F., Gallardo, C., Resino-Talavan, P.,
Blanco, E., Gomez-Casado, E., Alonso, C. & Escribano, J. M. (2006). Optimization and
validation of recombinant serological tests for African Swine Fever diagnosis based on
detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae. J Clin Microbiol 44,
3114–3121.
35. Phologane, S. B., Bastos, A. D. & Penrith, M. L. (2005). Intra- and inter-genotypic size
variation in the central variable region of the 9RL open reading frame of diverse African
swine fever viruses. Virus Genes 31, 357–360.
36. Plowright, W., Parker, J. & Peirce, M. A. (1969). African swine fever virus in ticks
(Ornithodoros moubata, murray) collected from animal burrows in Tanzania. Nature
221, 1071–1073.
37. Reed, L. J. & Muench, H. (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints.
Am J Hyg 27, 493–497.
38. Rowlands, R. J., Michaud, V., Heath, L., Hutchings, G., Oura, C., Vosloo, W., Dwarka,
R., Onashvili, T., Albina, E. & other authors (2008). African swine fever virus isolate,
Georgia, 2007. Emerg Infect Dis 14, 1870–1874.
39. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. & Kumar, S. (2007). mega4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (mega) software version 4.0. Mol Biol Evol 24, 1596–1599.
40. Thomson, G. R. (1985). The epidemiology of African swine fever: the role of free-living
hosts in Africa. Onderstepoort J Vet Res 52, 201–209.
41. Wilkinson, P. J., Pegram, R. G., Perry, B. D., Lemche, J. & Schels, H. F. (1988). The
distribution of African swine fever virus isolated from Ornithodoros moubata in Zambia.
Epidemiol Infect 101, 547–564.
42. Zsak, L., Borca, M. V., Risatti, G. R., Zsak, A., French, R. A., Lu, Z., Kutish, G. F.,
Neilan, J. G., Callahan, J. D. & other authors (2005). Preclinical diagnosis of African
swine fever in contact-exposed swine by a real-time PCR assay. J Clin Microbiol 43,
112–119.