УДК 577 ПОЛУЧЕНИЕ БИОТИНИЛИРОВАННОГО IN VIVO
реклама
УДК 577 ПОЛУЧЕНИЕ БИОТИНИЛИРОВАННОГО IN VIVO ФОТОПРОТЕИНА ОБЕЛИНА ПРИ ЭКСПРЕССИИ В E.COLI. М.Д. Ларионова Научный руководитель – к.б.н. С.В Маркова Сибирский федеральный университет Производные Са+2-регулируемого фотопротеина обелина, включая его биотинилированные формы, применяются в качестве биолюминесцентных меток в ряде аналитических приложений. Биотин-авидиновая система основана на высоком сродстве биотина к белку авидину. Эта система широко применяется в медицине и биологии для проведения иммуноферментных анализов (как альтернатива радио-изотопному анализу), очистки белков, иммобилизации, а также для высокочувствительной детекции различных белковых молекул. Химическое биотинилирование белков in vitro имеет ряд недостатков: процесс приводит к инактивации белков (фотопротеин обелин при биотинилировании теряет до 30% своей биолюминесцентной активности), продукт реакции является гетерогенной фракцией, что предполагает дополнительную очистку полученного модифицированного белка от побочных продуктов, кроме того, невозможно проконтролировать количество добавляемого биотина на молекулу белка. Существует альтернатива химическому биотинилированию – ферментативное биотинилирование in vivo. Методы in vivo предназначены для направленного присоединения биотина к специфическому акцепторному сайту – короткой последовательности, генно-инженерно слитой с рекомбинантным белком. Биотинилирование в живых клетках – достаточно редкая модификация. В клетках E. coli биотинилируется только один белок – биотин-карбоксил переносящий белок (ВССР), который является субъединицей ацетил-СоА-синтетазы. Ферментом, отвечающим за присоединение биотина к белкам, является биотин-протеин лигаза (BPL). BPL катализирует пост-трансляционное формирование амидной связи между карбоксильной группой биотина и ε-аминогруппой специфического лизинового остатка целевого белка. Наиболее изученным из биотин-протеин лигаз является многофункциональный белок BirA из E. coli, который также действует еще и как транскрипционный репрессор биотин-синтазного оперона (bio). BPL в E. coli (ген birA) является мономерным белком массой 35,5 кДа, и это единственный белок (BirA protein) из BPL-множества с известной структурой. BirA E. coli - это ассиметричный белок, состоящий из трех доменов (Рис.1). Рис.1. Строение многофункционального белка BirA E. coli. I - N-терминальный ДНК-связанный домен, действующий как репрессор биотин-синтазного оперона, II центральный каталитический домен, III С-терминальный домен. В центральном домене – молекула биотина (изображена желтым). При определении субстратной специфичности биотин-лигазы из Е.coli методами фагового дисплея был получен ряд искусственных пептидов, эффективно биотинилируемых in vivo. Ранее в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН две из полученных последовательностей были проверены при создании экспрессионной конструкции для биотинилирования обелина in vivo при экспрессии в E. coli. К сожалению, только 10-15% рекомбинантного обелина оказывалось биотинилированным. Предположительно, это было связано с малым количеством молекул внутриклеточной биотин-лигазы в E. coli, которая не успевает биотинилировать синтезируемый в больших количествах рекомбинантный обелин, количество которого может достигать ~70% от тотального количества клеточных белков. Предполагается, что включение гена биотин-лигазы в разрабатываемую экспрессионную конструкцию позволит более эффективно биотинилировать in vivo рекомбинантные белки. Ген birA был амплифицирован из полностью расшифрованного на сегодняшний день генома E. coli. Ген биотин-лигазы был помещен в экспрессионную систему рЕТ сразу за геном обелина через трансляционное ATGA стоп-старт перекрывание, которое обеспечивает меньший уровень экспрессии нижестоящего белка, это перекрывание реализовано в геноме E. coli. К гену обелина с N-конца был присоединен искусственный биотин-акцепторный пептид №91, являющийся субстратом для биотинпротеин лигазы. ДНК-связывающий домен в BirA, являющийся репрессором биотинсинтазного оперона, был удален для улучшения экспрессионных характеристик полученного штамма-продуцента. Итак, были получены 2 конструкции, экспрессирующие рекомбинантные белки: pET19b-Bio91-OL-ATGA-birA включающая полноразмерный ген биотин-лигазы и pET19b-Bio91-OL-ATGA-Bcl-birA, включающая ген биотин-лигазы без 63 аминокислот, кодирующих ДНК-связывающий домен (в место, где находился домен, введен рестрикционный сайт Bcl). Полученные экспрессионные системы были проверены секвенированием. Для экспрессии полученных рекомбинантных белков был использован штамм E.coli BL21Gold. С момента индукции раствором ИПТГ клетки выращивались при 30˚С с одновременным внесением в состав среды биотина. Экспрессируемые рекомбинантные белки пакуются клетками в виде неактивных и нерастворимых агрегатов (телец включения). Целевой апобелок экстрагировали из телец включения в раствор 6М мочевины и хроматографировали полученный раствор на колонке SepharoseFF в градиенте концентрации ацетата натрия. Далее рекомбинантные белки переводили в активный фотопротеиновый комплекс взаимодействием с избытком целентеразина в восстанавливающих условиях. Раствор заряженных белков хроматографировали на колонке MоnoQ в градиенте концентрации хлорида натрия. Динамика очистки рекомбинантных белков продемонстрирована на рисунке 2. Bio91OL-ATGA-Bcl-birA Bio91OL-ATGA-birA Рис. 2. SDS-ПААГ-электрофорез белковых образцов, полученных при выделении рекомбинантного биотинилированного обелина из клеток E.coli : 1,2 - тотальные клеточные белки до и после индукции соответственно; 3 - тела включения индуцированных клеток в 6М мочевине; 4 - биотинилированный апообелин после ионнообменной хроматографии в мочевине, 5 – обессоленный путем гель-фильтрации апобелок, 6 – биотинилированный активный фотопротеин обелин после ионообменной хроматографии, 7 – маркер молекулярного веса. Молекулярная масса белков соответствует теоретической – 24,97 kDa. Были проведены измерения биолюминесцентной активности полученных рекомбинантных белков. Оказалось, что их активность сопоставима с активностью обелина дикого типа, это означает, что биотин-акцепторный пептид не оказывает влияния на конформационную структуру обелина. На рисунке 3 продемонстрирована схема и результаты модельного твердофазного биолюминесцентного анализа, который подтверждает наличие присоединенных молекул биотина к обелину. Вместо авидина был использован стрептавидин – аналог авидина из бактерий Streptomyces avidinii. Bio91OL-ATGA-birA Bio91OL-ATGA-Bcl-birA Bio-OLwt – химически биотинилированный обелин Рис.3.Модельный твердофазный биолюминесцентный анализ биотинилированных белков. Контроль химически биотинилированный обелин Очевидно, что метка включается в стрептавидин-биотиновый комплекс, формирующийся на поверхности лунок, и позволяет определять сорбированный BSAбиотин из растворов с концентрациями от 2 нг/мл до 30 нг/мл для рекомбинантных белков, и с концентрациями от 2 нг/мл до 60 нг/мл для химически биотинилированного контроля. Величина биолюминесцентного сигнала прямо пропорциональна концентрации растворов BSA-биотин. Как говорилось ранее, биолюминесцентный сигнал при химическом биотинилировании белка снижается, что и продемонстрировано на графике. В ходе данной работы были получены следущие результаты: 1.Сконструированы генно-инженерные конструкции для суперпродукции биотинилированного in vivo обелина в клетках E.coli., с использованием в конструкциях гена биотин-протеин лигазы, присоединенной к гену обелина через трансляционное стоп-старт перекрывание, и использованием пептида №91 в качестве биотин-акцепторного сайта (23 аминокислотных остатка). 2.Получены штаммы-продуценты E.coli рекомбинантных белков. 3.Подобраны оптимальные условия для биотинилирования in vivo при выращивании клеток, продуцирующих рекомбинантные белки. 4.Полученные производные обелина (Bio91OL-ATGA-birA, Bio91OL-ATGA-BclbirA) были выделены из клеток E.coli; получены практически гомогенные белковые препараты. 5.Определены основные биологические свойства: полученные фьюжин-белки обладали как биолюминесцентной активностью, сопоставимой с активностью обелина дикого типа, так и характеризовались способностью связываться со стрептавидином, что подтверждало присутствие в рекомбинантном белке молекулы биотина. 6.Продемонстрирована возможность использования полученных биотинилированных производных в модельном твердофазном биолюминесцентном анализе. Полученные метки позволяют определять сорбированный BSA-биотин из растворов с концентрациями от 2 нг/мл до 30 нг/мл. Данная работа проводилась на базе лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.