Методичка для студентов (занятие 10)

Тема занятия: Красители. Классификация. Приготовление. Артефакты.
Тинкториальные свойства клеточных структур. Оценка качества цитологического
препарата. Стандартная световая микроскопия фиксированных, окрашенных
мазков. Распространенные методы окраски цитологических препаратов. Экспресс –
методы окраски цитологических препаратов. Цитохимические методы исследование,
цель, назначение. Цитохимические реакции.
Цель: Изучить использование различных видов окраски для выявления клеточных
структур клетки.
Перечень знаний и практических навыков:
1. Знать классификацию красителей.
2. Иметь представление о технике приготовления красителей.
3. Знать распространенные методы окраски цитологических препаратов.
4. Владеть навыками микроскопиификсированных, окрашенных мазков.
5. Уметь оценивать качество цитологического препарата.
6. Знать основные цитохимические методы исследований.
Красители,
используемые
в
цитологической
классифицировать по следующим критериям:
диагностики,
можно
I. По происхождению:
1. Естественные – к которым относятся краски растительного и животного
происхождения.
2. Искусственные (полученные при помощи химического синтеза).
Краской растительного происхождения является гематоксилин, который
добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении.
К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из
насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др.
В настоящее время большинство красок готовят синтетически.
II. По химическому составу:
1. Кислые – кислоты и кислые соли (эозин, кислый фуксин).
2. Основные – основные соли (гематоксилин, азур 2, кармин).
3. Нейтральные – смесь двух красителей: основного (азур 2) и кислого (эозин).
В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель
гематоксилин, который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель –
эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избирательное сродство
структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и
физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями,
называются оксифильными, а окрашивающиеся основными –базофильными. Например,
цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток – окрашиваются
базофильно.Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители,
являются нейтрофильными (гетерофильными).
4. Индифферентные красители (судан III, судан IV).
5.Флюорохромы. Группа красителей, способных флюоресцировать при той или
иной длине волны возбуждающего света. Несмотря на то, что мы выделили эти красители
в самостоятельную группу, большинство из них следовало бы отнести к
цитоплазматическим или, реже, к ядерным красителям.Так, например, флюоресцеин,
поглощая свет с длиной волны 420-490 нм, излучает свет с длиной волны 520-540 нм. При
этом объекты, окрашенные флюоресцеином в люминесцентном микроскопе, светятся
зеленым светом.
III.По способности окрашивать определенныецитологическиеструктуры (по
тинкториальным свойствам):
1. Ядерные (окрашивание ядра). Представляют собой едва ли не самую
многочисленную группу красителей вообще. Основная цель обработки данными
веществами состоит в том, чтобы выявить материал, близкий к ДНК или РНК. По
механизму окрашивания ядерные красители делят на две группы, принципиально
отличающиеся друг от друга. Это основные красители и протравные красители.
Применение основных красителей (все они являются «катионными») основано на
образовании соединений типа солей в присутствии ДНК или РНК. К ним относятся:
- Азокрасители (янус зеленый В, бисмарк коричневый).
- Сафранины (сафранин Т, сафранин А, сафранин О,феносафранин).
- Оксазиновые красители (бриллиантовый крезиловый синий, крезиловыйпрочный
фиолетовый).
-Тиазины (тионин;азуры С, А, В;метиленовыйсиний;толуидиновый синий).
- Трифенилметановые (парарозанилин, кристаллический фиолетовый, метиловый
фиолетовый, метиловый зеленый, альциановый синий).
В основу методик применения протравных красителей легла способность ряда
соединений образовывать ярко окрашенные лаки с ионами металлов - лития, железа,
хрома. В эту группу входятгематоксилин, кармин (карминовая кислота), ализаринцианин,
ализарин, бразиллин, галлоцианин и т.д.
В зависимости от того, ион какого металла входит в состав протравного реагента,
конечный цвет окраски может меняться от красного до зеленоваточерного.
2. Цитоплазматические (окрашивающие цитоплазмы). Эта группа красителей
представлена большей частью сульфоновыми и карбоновыми кислотами, которые в
тканях прочно связываются с белками и в результате окрашивают большинство
внеядерных структур. К ним относятся: эозин, пикрофуксин, аурамин О, эритрозин, конго
красный и т.д.
Цитоплазматические красители в сочетании с фосфорновольфрамовой кислотой,
фосфорномолибденовой кислотой могут окрашивать специфические структуры клеток и
тканей, например, коллаген. В большинстве методик цитоплазматические красители
используются для контраста после окраски ядерными красителями. Несколько реже
прибегают к такому свойству цитоплазматических красителей, как способность
окрашивать живые клетки без нарушения функций последних (так называемые витальные
красители); в таких методиках применяют очень большие разведения красителей - от
1:1000 до 1:20000.
3. Специальные, окрашивающие избирательно определенных структур клеток –
суданШ (окрашивает жир в оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемый ею жир
окрашиватся в черный цвет).
Метахромазия– свойство клеток и тканей окрашиваться в цветовой тон,
отличающийся от цвета самого красителя, а также свойство изменённых клеток и тканей
окрашиваться в иной цвет по сравнению с нормальными клетками и тканями.
Обусловлена полимеризацией молекул красителя под влиянием свободных
отрицательных зарядов клеток или ткани. Отмечается при патологии соединительной
ткани, опухолевом росте, некробиотических изменениях и в ряде других случаев.
Световая микроскопия
Микроскопирование — основной метод изучения клеток. Современные
микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические системы,
обладающие высокой разрешающей способностью и позволяющие изучать очень тонкие
детали строения клеток. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть в
микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d0). В основном оно
зависит от длины световой волны λ, и эта зависимость приближенно выражается
формулой d0 = λ / 2. Таким образом, чем меньше длина световой волны, тем меньше
разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам структуры можно видеть в препарате
(т.е. выше «разрешение» микроскопа). Понятие «увеличение микроскопа» относится к его
оптической системе и выражается в произведении увеличений объектива и окуляра.
Однако «разрешение» микроскопа зависит от характеристик объектива и не зависит от
окуляра.
Для изучения цитологических препаратов чаще применяют обычные световые
микроскопы различных марок, когда в качестве источника освещения используют
естественный или искусственный свет. Минимальная длина волны видимой части спектра
света соответствует примерно 0,4 мкм (фиолетовый спектр). Следовательно, для обычного
светового микроскопа разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм, а общее
увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) достигает 2000
раз.
Устройство светового микроскопа:
В микроскоп входят 3 системы: -оптическая,
- осветительная,
- механическая.
1.Оптическая система включает объектив и окуляр.
а) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и
непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название).
Обычные увеличения объектива:
х8, х20, х40 (сухие объективы), х90 (иммерсионный объектив).
При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового
(иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.
б) Окуляр (3) вставляется в тубус сверху. Применяются окуляры с увеличением:
х7, х10, х15.
в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива
и окуляра, например: (х20)• (х10) = 200 раз.
г) Таким образом, функция оптической системы -формирование увеличенного
изображения препарата на сетчатке глаза наблюдателя.
2.Осветительная система - источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.
а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне
микроскопа (пример - обычная настольная лампа).
б) Зеркало (5) собирает лучи от источника и направляет их на препарат снизу.
Одна поверхность зеркала - плоская, вторая - вогнутая; последняя используется при
искусственном освещении.
в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате.
Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку
лучей.
г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок
с отверстием посередине.Она ограничивает световой поток, падающий на препарат.При
использовании объективов с большим увеличением отверстие диафрагмы следует
уменьшить - для ослабления сферической аберрации.
3. Механическая система - тубус (2), штатив (8), колонка (9) и предметный столик
(10).
а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты.
Они поднимают и опускают тубус для фокусировки изображения объекта на
сетчатке глаза наблюдателя.
В итоге, световые лучи проходят следующий путь:
источник света (4) зеркало (5) конденсор (6) диафрагма (7) препарат
объектив (1) тубус (2) окуляр (3).
Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть
достаточно тонким.Заметим также, что микроскоп даёт перевёрнутое изображение
объекта.
Для получения правильной информации необходимо последовательное
микроскопическое изучение всего цитологического мазка. Обзор цитологической картины
проводят под малым увеличением (х10), детализацию выбранных объектов – под
увеличением (х20, х40); далее микроскопическое изучение мазка выполняется под
иммерсионным объективом (х90, х100). Вначале проводят систематическое изучение
полей зрения по краю мазка. Затем мазок исследуют методом «систематического
перекрестного двухразового шага», который позволяет практически без пропуска изучить
каждый миллиметр площади препарата.
Подсобными методами является фазово-контрастная и люминесцентная
микроскопия с использованием флюорохрома, которая применяется преимущественно
при массовых профилактических осмотрах женщин. Люминесцентный метод позволяет
видеть клетки и различать их по цвету свечения, возникшего под влиянием флюорохрома,
фазово-контрастный – рассмотреть особенность клеток, не прибегая к фиксации и окраске
(в нативном состоянии) даже с иммерсионной системой. Оба метода не требуют много
времени на подготовку препарата, однако и не сокращают срока его исследования и не
всегда дают возможность уточнить диагноз. Метод нативного препарата при световом
микроскопе в цитологическом исследовании играет ориентировочную роль и
используется в общем клинико-лабораторном анализе.
Оценка качества окрашенного цитологического препарата.
Качественное окрашивание позволяет правильно идентифицировать клеточные
элементы мазка и оценить их особенности при микроскопии.
Хороший качественно окрашенный мазок должен:
- равномерно окрашиваться;
- не содержать артефакты (рыхлые скопления краски) и сморщенные клетки;
- иметьв достаточном количестве равномерно распределенные клетки (все участки
мазка должны хорошо просматриваться и не содержать "толстые участки", содержащие
непросматриваемые (плохо просматриваемые) скопления или комплексы клеток);
-окрашивать элективноструктуры цитоплазмы, ядра, ядерного хроматина, ядрышек.
В основе окрашивания клеток лежат физико-химические процессы (диффузия,
адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в
микроструктурах.
При применении любой методики окрашивание мазка важно точно соблюдать
последовательность процедур приготовления растворов и временные промежутки в
течение процесса окрашивания.
Существующие в продаже партии красителя имеют различную интенсивность
окраски. Это обязывает опытным путём установить оптимальные концентрации
(разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, который
устанавливает при окрашивании серии препаратов растворами с различной концентрацией
красителя, меняя длительность его воздействия. При приготовлении растворов
необходимо учитывать рН воды: она должна быть нейтральной (рН 6,8 – 7, 2) что
обеспечивается использованием буферных растворов.
Рекомендуемые методы окрашивания цитологических мазков: азур – эозиновый, по
Романовскому – Гимзе, Лейшману, Маю–Грюнвальду, Паппенгейму; гематоксилин –
эозиновый, метод Папаниколау.
Самым распространённом методом окраски является окраска гематоксилинэозином. Сочетает в себе основной и кислый красители, поэтому позволяет выявить почти
все клетки и многие неклеточные структуры (ядра приобретают сине-фиолетовый цвет,
цитоплазма – желтовато-розовый цвет). Гематоксилин сам по себе не является красящим
веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению (по
методу Эрлиха, Майеру, Караци –калийными квасцами), в результате чего он
превращается в красящее вещество – гематеин (сине-фиолетовый краситель). При этом на
окисление гематоксилина требуется от 10 дней до 2 - 3 недель. Этот процесс ускоряют с
помощью солей алюминия, хрома, железа и др.
• Квасцовый гематоксилин Майера приготовляют следующим образом: в литре
дистиллированной воды растворяют 1 г гематоксилина, 0,2 г йодновато-кислого натрия
(KaJ03) и 50 г калийных квасцов. Затем добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г
кристаллической лимонной кислоты. Раствор годен для немедленного употребления и
долгое время хорошо сохраняется. Препарат красят в течение 5 – 10 минут, после чего 10
минут промывают в проточной воде.
• Квасцовый гематоксилин по Эрлиху. Для приготовления красителя 2 г
гематоксилина растворяют в 100 см3 96-градусного спирта и добавляют 100 см3 воды, 100
см3 химически чистого глицерина, 3 г калийных квасцов и 10 см3 уксусной кислоты.
Краситель должен «созревать» примерно 14 дней. Раствор сохраняет свою
красящую силу долгое время. Если вместо гематоксилина взять 0,25 – 0,5 ггемагина, то
краситель пригоден к употреблению тотчас же после изготовления. Окрашивание
производят так же, как и гематоксилином Майера. Ядра окрашиваются в темно-синий
цвет.
• Квасцовый гематоксилин по Караци. Гематоксилина – 0,5 г, калийных квасцов – 25г,
нодноватокислого калия КГО3 – 0,01 г, глицерина – 100 см3, дистиллированной воды – 400
см3.
Преимуществом гематоксилиз-эозиновых красителей является выраженное
окрашивание ядер с атипией, в связи с чем этот метод хорошо использовать для
исследования мазков при скрининге.
Окраска азур – эозиновыми красителями.
Метод окрашивания по Романовскому (азур-эозиновой смесью) в разных
лабораториях используется в разных модификациях – по Паппенгейму (Май-ГрюнвельдуГимзе), Лейшману, Романовскому-Гимзе и т.д. Преимущество метода является четкое
прокрашивание ядер, вследствие чего хорошо просматриваются структуры хроматина, а
также бактериальная флора и простейшие.
Окраска по Романовскому-Гимзе.Краситель состоит из щелочной части (азур II ярко-синий цвет), и кислой части (эозин - розово-красный цвет).
В настоящее время используется готовый краситель Романовского-Гимзе, из
которого перед началом работы готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1
млдистиллированной воды.
Высохший фиксированный мазок помещается в кювету с рабочим раствором
краски на 25-40 минут (конкретное время устанавливается опытным путем для каждой
партии красителя).Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма
клеток – в голубой, ядра –в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма
приобретает голубой цвет, а ядра – красно-фиолетовый.Результаты окрашивания мазков
крови:
 Ядра клеток – красно-фиолетовые.
 Эозинофильные гранулы – красновато-коричневые.
 Базофильные гранулы – синие.
 Нейтрофильные гранулы – фиолетовые.
 Цитоплазма лимфоцитов – голубая.
 Эритроциты – бледно-красные.
 Тромбоциты – наружная часть синяя (более светлая); внутренняя – фиолетовая
(более темная).
Окраска по Маю-Грюнвальду.Данный метод очень удобен для визуализации
гранулоцитов.Для окрашивания применяется готовый раствор эозин-метиленового синего
по Маю-Грюнвальду. Мазок без предварительной фиксации заливают красителем, через 5
минут промывают и высушивают.
 Лимфоциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: голубая.
Моноциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: серо-голубая.
 Гранулоциты – ядра: сине-фиолетовые; гранулы: красные, фиолетовые, темносиние (зависит от типа).
 Тромбоциты– наружная часть голубая; внутренняя – фиолетовая.
 Эритроциты– розовые.

Окраска по Паппенгейму. Представляет собой комбинацию двух предыдущих
методов.Сухие нефиксированные мазки помещаются в кювету с раствором МаяГрюнвальда на 3 – 5минут. После этого контейнер с мазками ополаскивается
дистиллированной водой, после чего мазки помещаются в кювету с разведенным
раствором Романовского-Гимзы на 20 – 30минут. После этого мазки промываются
проточной водой и высушиваются.
 Ядра клеток – красно-фиолетовые.
 Цитоплазма лимфоидных клеток – светло-синяя.
 Лимфоидная азурная грануляция – ярко-синяя.
 Миелоидная азурная грануляция – фиолетовая.
 Нейтрофильные гранулы – светло-фиолетовые.
 Эозинофильные гранулы – красные, красно-коричневые.
 Базофильные гранулы – темно-фиолетовые, черные.
 Эритроциты – розовые (полихроматофильные эритроциты - синеватые).
 ТельцаЖолли – красновато-фиолетовые.
 Тельца Ауэра – ярко-красные.
Методика окраски по Лейшману.Высушенные на воздухе препараты заливают
краской Лейшмана на 3 мин., при этом препарат одновременно фиксируется. После этого
промывают водопроводной водой и заливают азур - эозиновой смесью (40 мл 0, 1% азура
II и 30 мл 0,1% эозина К) на 15 – 20 мин. Затем промывают водопроводной водой,
высушивают на воздухе и микроскопируют. используется для выявления малярийных
плазмодиев.
Экспресс – методы окраски цитологических препаратов.
Окраски по Алексееву. Ответ дается уже через 5– 10 минут. Метод Алексеева
предусматривает ускоренную обработку цитологических препаратов азурэозиновыми
смесями по принципу Романовского с целью получения привычной цитологической
картины.Методика приготовления препаратов.
Обработка препаратов может производиться двумя способами:
1. Предметные стекла с высохшими на воздухе препаратами в количестве 3 –
5штук, укладывают на полочку для окраски отпечатками или мазками кверху. Глазной
пипеткой на каждый препарат наносят раствор краски Романовского–Гимзы в количестве
5 – 8капель. Краска должна покрыть весь мазок или отпечаток. В таком состоянии
препарат оставляют на 60 секунд, в течение которых он фиксируется метанолом,
входящим в состав краски, и частично окрашиваются его элементы. Затем к краске на
предметных стеклах добавляют 10 – 16 капель нейтральной дистиллированной воды,
нагретой до 50 – 60° и покачиванием смешивают краску с водой. Препарат оставляют на
l– 2минуты. Затем струей нейтральной дистиллированной воды из колбы-промывалки, не
сливая, омывают краску с препарата. Остаток воды сливают и препарат
просушиваютфильтровальной бумагой. Окрашенный препарат просматривают под
микроскопом сначала с малым увеличением, а при нахождении подозрительных мест
переходят на иммерсионный объектив. Остальные мазки оставляют залитыми краской на
3 – 5минут на тот случай, если первый препарат окажется бледно окрашенным. Первым
обычно красится самый тонкий из препаратов, так как он быстрее пропитывается и
сушится.
Окраска по этому методу тканевых и опухолевых клеток и лейкоцитов почти не
отличается от окраски их в препаратах, обрабатываемых обычными цитологическими
методами. При этом четко выделяется структура ядер, хорошо видны нуклеолы,
зернистость и включения протоплазмы. Эритроциты частично гемолизируются, что
облегчает исследование.
2. Приготовляют 0,4% раствор сухой краски Лейшмана в метаноле (метиловый
спирт). Для ускорения растворения краски ее можно в закрытом флаконе поместить в
водяную баню при 60° на 1 час, помешивая. При охлаждении краску следует
профильтровать. Раствор стоек. Препараты укладывают на полочку для окраски,
покрывают нетолстым слоем раствора краски Лейшмана (12 – 15 капель на каждый
препарат) и оставляют их на 20 – 30 секунд. Затем, не сливая краски Лейшмана со стекла,
добавляют к ней раствор краски Романовского–Гимзына нейтральной дистиллированной
воде (1,6 капли на 1 мл воды), нагретый до 50 – 60°, в количестве, способном удержаться
на стекле. Первый препарат смывают через 2 – 3 минуты, остальные – докрашивают.
Препарат высушивают фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом.
Микроскопическая картина при этом способе окраски более яркая, чем при первом.
Эритроциты сохраняются. Особенно четко выступают темные нуклеолы на нежно
окрашенных ядрах. Дистиллированная вода для разведения краски и смывания ее с
препаратов должна иметь рН 6,8 – 7,0.
Окраски по Папаниколау.
Метод окрашивания по Папаниколау
являетсянаилучшим для гинекологических мазков, так как этот метод полихромный, он
позволяет оценить степень созревания цитоплазмы (от сине-зеленого цвета в незрелых
клетках до розового в клетках со зрелой цитоплазмой и оранжевого в клетках с
ороговением), благодаря влажной фиксации хорошо сохраняются ядра, клеточная
мембрана и структура хроматина. Ответ дается через 15– 20 минут.
Необходимые реактивы:
1. Смесь Никифорова.
2. Спирт 95, 90, 80, 70 и 50°.
3. Гематоксилин Гарриса.
4. 0,25%-ный раствор соляной кислоты.
5. Краска оранжевая Г.
6. Краска (ЕА-36).
7. Абсолютный спирт.
8. Ксилол.
9. Канадский бальзам.
Приготовление гематоксилина Гарриса:
1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20 г калийных квацов
растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 ч оба раствора
соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. Раствор нагревают до
кипения, остужают и через 24 ч фильтруют.
Приготовление раствора краски оранжевая Г:
К 100 мл 0,5%-ного спиртового раствора оранжевой краски Г добавляют 0,015 г
фосфорно-вольфрамовой кислоты.
Приготовление составной краски (ЕА-36):
45 мл 0,5%-ного спиртового раствора светлой зеленой, 10 мл 0,5%-ного спиртового
раствора бисмаркбраун, 45 мл 0,5%-ного спиртового раствора эозина желтоватого (водо- и
спирторастворимого), 0,2 г фосфорновольфрамовой кислоты, капля насыщенного водного
раствора углекислого лития.
Ход окраски:
Мазки после фиксации проводят последовательно через сосуды, содержащие 80, 70
и 50° спирты и дистиллированную воду. Затем 6 мин гематоксилином Гарриса, осторожно
споласкивают дистиллированной водой и погружают (6 раз) в 0,25%-ный раствор соляной
кислоты. Далее на 6 минут кладут в сосуд с проточной водопроводной водой и обмывают
дистиллированной водой. Затем проводят через 50, 70, 80 и 95° спирты. Обезвоженные
таким образом препараты окрашивают в течение 1,5 мин краской оранжевой Г,
споласкивают в двух сменах 95° спирта и красят в течение 1,5 мин составной краской
(ЕА-36). Мазки отмывают от избытка краски в трех сменах 95° спирта. Далее препараты
просветляют проведением через абсолютный спирт, через смесь абсолютного спирта и
ксилола в равных объемах и, наконец, через ксилол, после чего заключают в канадский
бальзам.
К полихромным методам окраски так же относят метод Шорра (или его
модификациюМ. Г. Арсеньевой (1963) и др.), позволяющий дифференцировать клетки на
эозинофильные (красные) и базофильные (синие), и монохромные методы (окраска
гематоксилином и эозином или гематоксилином и фуксином).Фиксация препарата
производилась в метиловом спирте (15 минут). Окрашивание препаратов производилось
гематоксилином-эозином. Фиксированные мазки окрашивались водным раствором
гематоксилина до получения бледно-фиолетового окрашивания (7 – 10 минут). После
промывания проточной водой мазки вновь окрашивались 1%-ным водным раствором
эозина в течение 0,5 мин, промывались проточной водой и высушивались.При
полихромном методе поверхностные клетки окрашиваются в красный или синезеленый цвет, промежуточные и парабазальные – в сине-зеленый, базальные – в темносиний.
Цитохимические методы основаны на специфической химической цветной
реакции между химическим реактивом и определённым компонентом клетки для
определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных
реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и
характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ).
При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой
результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени
интенсивности специфической окраски (средний цитохимический коэффициент - СЦК).
В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной
реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++).
Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного
вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой
интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов,
сумма этих произведений составляет условные единицы.Например, при исследовании
активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60
клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 - специфическая окраска была слабой
(+) и в 5 - более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной
фосфатазы
в
нейтрофилах
в
таком
случае
составит
(60х0)+(35х1)+(5х2)/100=0+35+10/100=0,45 ед.
ШИК-реакция или PAS-реакция (для выявления гликогена).
Реактив - Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют
аббревиатуру ШИК – шифф-йодная кислота). Под влиянием периодата калия гликоген
окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом
Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется
вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о
количестве гликогена в клетках.
Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИКположительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины,
гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со
слюной или диастазой.
В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в
виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого
количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате
костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах
и мегакариоцитах.
Обнаружение гликогена методом Мак-Мануса.
Метод
Мак-Мануса
выявляет
вещества
углеводной
природы
(гликозаминогликанов, гликопротеидов, гликогена и др.) в цитологических препаратах.
Метод основывается на образовании диальдегидов, которые определяют с помощью
реактива Шиффа под воздействием окислителя (йодной кислотой). В клеткахгликоген
обнаруживается в виде вишнево-красных гранул.
Методы выявление ферментов:
1. Оксидазы - ферменты, катализирующие окислительные процессы молекулярным
кислородом. Среди них особое значение имеет миелопероксидаза (МП).
Миелопероксидаза – является лизосомальным ферментом, катализирующим в
присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется
преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и
является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках
гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента повышается по
мере созревания клеток. Однако, по мере дифференцировки их в зрелые клетки,
активность фермента снижается. В клетках миелопероксидаза участвует в реакциях
разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность
фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других)
по методу Грэхема–Кнолля или его модификаций. Реакция используется главным образом
с целью диагностики острых лейкозов.
2. Фосфатазы входят в состав гидролаз. Эти ферменты широко распространены в
клетках человека и животных. Они участвуют в обменных процессах с жирами,
полисахаридами и нуклеопротеидами. К ним относятся такие ферменты как кислая
фосфатаза и щелочная фосфатазы.
Кислая фосфатаза (КФ) – катализирует освобождение фосфата из спиртовых или
фенольных моноэфиров при кислой рН среды. Кислые фосфатазы локализованы в
лизосомах и цитохимически выявляются благодаря образованию окрашенных участков
красного цвета в местах гидролиза субстрата. В качестве субстрата могут быть
использованы нафтол-AS-фосфат, а-нафтилфосфат натрия, нафтол-А8-О-фосфат и др.
Кислая фосфатаза присутствует в большинстве клеток крови и костного мозга. В
гранулоцитах, моноцитах, эозинофилах и базофилах она выявляется, начиная с незрелых
клеток этих рядов, где ее активность наиболее высокая.
Щелочная фосфатаза (ЩФ) –это фермент, которыйспособен освобождать фосфат,
катализируя отщепление фосфатных групп из фосфомоноэфиров в щелочной среде и
принимает участие в обмене липидов и нуклеиновых кислот. Содержится исключительно
в зрелых нейтрофилах. В периферической крови активность щелочной фосфатазы
значительно выше, чем в клетках костного мозга. Фермент выявляется в виде желтокоричневых гранул в цитоплазме.
3.Неспецифическиеэстеразы (НЭ) также относятся к гидролазам. Эти ферменты
способны гидролизовать простые эфиры N-свободных спиртов жирных кислот. Это
весьма неоднородная группа энзимов, названия которых обусловлены субстратом,
который они гидролизуют. Получено более 9 изоферментов НЭ. Фракции 1, 2, 7, 8, 9
выявляются при использовании нафтол-АБ-О-хлорацетата и представляют активность
хлорацетатэстеразы, которая присутствует в гранулоцитах. Фракции 3, 4, 5, 6
взаимодействуют с эфирами α-нафтилацетата и представляют собою НЭ, выявляемые в
моноцитах, плазматических клетках и тромбоцитах. Наибольший интерес для гематологов
представляют
хлорацетатэстераза,
α-нафтилацетатэстераза,
кислая
αнафтилацетатэстераза. Неспецифическиеэстеразы являются лизосомальными ферментами.
α-Нафтилацетатэстераза(αНАЭ) обнаруживается во всех миелоидных клетках, но
наибольшая ее активность определяется в моноцитах. В клетках эритроидного ряда в
норме она не определяется.
Кислаянафтилацетатэстераза– это фермент, локализующийся в лизосомальных
гранулах. Его активность выявляется в реакции с α-нафтилацетатом в кислой среде при рН
5,8. Она характерна для Т-хелперов. Кроме того, она выявляется в клетках моноцитарного
ряда.
Хлорацетатэстеразу (ХАЭ) называют гранулоцитарной. Как и миелопероксидаза, она
является маркером нейтрофилов. Активность фермента выявляется в виде гранул синего
цвета.
Сдвоенную реакцию на ХАЭ и αНАЭ проводят последовательно на одном мазке.
Это позволяет разделить клетки гранулоцитарной и моноцитарной линий, что имеет
значение при диагностике миеломоноцитарного лейкоза.
Реакция Браше.Метод служит для выявления РНК. Используется реактив из смеси
двух красителей:метилового зелёного и пиронина.Пиронин специфически окрашивает
РНК в красный цвет.Поэтому на препарате ядрышки (в составе ядра) и рибосомбогатые
участки цитоплазмы имеют красный цвет.Другие структуры ядра (помимо ядрышек) зелёные.
Реакция Фёльгена.Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив
Шиффа).ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет.
Цитохимическое исследование липидов.Липиды локализуются в цитоплазме
клеток главным образом в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в
нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран.
Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ,
растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черныйсудан и др.). Для выявления
нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет.
Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Красители. Классификация красителей.
2. Тинкториальные свойства клеточных структур. Метахромазия.
3. Группа основных или ядерных красителей, понятие «базофилии».
4. Кислые красители – цитоплазматические, понятие «ацидофилии».
5. Нейтральные красители. Индифферентные красители.
6. Приготовление красителей.
7. Оценка качества цитологического препарата. Артефакты.
8. Стандартная световая микроскопия фиксированных, окрашенных мазков.
Разрешающая способность светового микроскопа.
9. Распространенные методы окраски цитологических препаратов.
10. Окраска гематоксилин-эозиновыми красителями. Виды гематоксилиновых
красителей.
11. Окраска азур-эозиновыми красителями.
12. Техника окраски по Романовскому-Гимзе.
13. Метод Паппенгейма.
14. Окраска по Лейшману.
15. Экспресс – методы окраски цитологических препаратов: окраски по Алексееву.
16. Полихромная окраскапо Папаниколау.
17. Полихромный метод окраски поШорру.
18. Цитохимические методы исследование, цель, назначение, материалы..
19. ШИК-реакция.
20. Методы выявление ферментов, оценки их активности.
21. Методы выявления ДНК по Фельгену.
22. Метод выявления РНК по Браше.
23. Обнаружение гликогена по методу Мак Мануса.
24. Метод обнаружения липидов.