пузаков михаил васильевич - Институт цитологии и генетики СО
реклама
На правах рукописи УДК 575.16 ПУЗАКОВ МИХАИЛ ВАСИЛЬЕВИЧ ОЦЕНКА ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ СЛИЯНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И СПЛЕНОЦИТОВ МЫШИ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2007 Работа выполнена в Лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич Томский государственный университет, НИИ биологии и биофизики, г. Томск кандидат биологических наук, Шевченко Александр Игоревич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва Защита диссертации состоится 19 сентября 2007 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «____» августа 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Одной из фундаментальных проблем генетики развития является изучение плюрипотентности – способности клеток к дифференцировке в различные клеточные типы in vitro и in vivo, которая характерна для клеток эмбриона на ранних стадиях развития и эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК). То, какими механизмами осуществляется контроль над сохранением и утратой этого свойства в процессе дифференцировки клеток, к настоящему времени остается во многом неясным. С этим вопросом связана также не менее важная проблема, касающаяся эпигенетических изменений генома, происходящих при дифференцировке клеток, и возможности репрограммирования генома дифференцированных клеток взрослых животных. Долгое время считалось, что эмбриональные клетки очень рано теряют плюрипотентность, однако было показано, что пересадка ядер дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, в энуклеированные ооциты не препятствует нормальному развитию организма (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998). Таким образом, было установлено, что ядра дифференцированных клеток способны репрограммироваться и даже обеспечить полное развитие организма. Метод переноса ядер в последнее время широко применяется в клонировании млекопитающих и является очень эффективным способом репрограммирования ядер дифференцированных клеток. Однако существует альтернативный, не менее эффективный, экспериментальный подход к репрограммированию генома дифференцированных клеток, основанный на использовании высокого потенциала эмбриональных стволовых клеток, при их слиянии с дифференцированными клетками (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001). В настоящее время ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются «связующим звеном» в исследованиях in vitro и in vivo. При культивировании ЭСК сохраняют плюрипотентные свойства в течение длительного времени, однако индукция дифференцировки in vitro приводит к образованию в культуре различных клеточных типов, соответствующих трем зародышевым листкам эмбриона. Более того, ЭСК, при введении в бластоцисту, принимают участие в образовании большинства органов и тканей химерных животных, в том числе и гонад (Tam, Rossant, 2003). Культуры ЭСК широко используются для изучения функции гена и для создания трансгенных животных, для исследования ранних этапов дифференцировки и сохранения плюрипотентности. Для изучения плюрипотентности клеток применяют разносторонние методы. Для гисто- и иммуногистохимического анализа плюрипотентности используют маркеры, характерные для клеток ВКМ: активность щелочной фосфатазы и поверхностные антигены. Способность участвовать в формировании органов и тканей химерного животного (Tam, Rossant, 2003), а также в формировании тератом (Wobus et al., 1984) и эмбриоидных телец (Rastan, Robertson, 1985), является наиболее адекватным свидетельством высокого потенциала исследуемых клеток. По наличию экспрессии таких генов 1 как Oct4, Sox2 и Nanog, «генов плюрипотентности», можно также оценить, являются ли клетки плюрипотентными. Клеточные гибриды, получаемые слиянием ЭСК с дифференцированными клетками, представляют уникальную экспериментальную модель, в которой гомологи с разным онтогенетическим статусом находятся в одном ядре. Гибридные клетки такого типа сохраняют плюрипотентные свойства на достаточно высоком уровне и, что очень важно, гены дифференцированного партнера репрограммируются в результате взаимодействия с геномом ЭСК (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Do, Schöler, 2004). Одним из несомненных достоинств такой модельной системы является возможность создания набора гибридных клеток с разным соотношением родительских хромосом. То есть открывается возможность оценить роль индивидуальных хромосом в поддержании плюрипотентности и исследовать способность отдельных хромосом к репрограммированию. И хотя в большинстве работ гибридные клетки имеют около- или тетраплоидный кариотип (Tada et al., 2001, 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005), полного описания состава хромосом проведено не было. Используемые в данной работе межвидовые клеточные гибриды серии НМС, полученные от слияния ЭСК Mus musculus и спленоцитов близкого вида мыши M. caroli (Серов и др., 2003), имеют целый ряд преимуществ, наиболее важным из которых является детально описанный хромосомный состав (Matveeva et al., 2005; Пристяжнюк и др., 2005). Результаты подсчета хромосом показали, что их количество варьирует в широких пределах, как внутри каждого клона, так и между клонами – от околодиплоидного до околотетраплоидного. В большинстве клонов среднее число хромосом было существенно ниже тетраплоидного, что указывает на сегрегацию хромосом, имевшую место в период от момента слияния клеток до момента цитогенетического анализа. Цитогенетический и микросателлитный анализ продемонстрировали сохранение всех маркеров хромосом M. musculus и значительное разнообразие по содержанию хромосом M. caroli – от нескольких до полного диплоидного соответствия. Более того, некоторые гибридные клоны, будучи тетраплоидными, содержали одну или несколько хромосом соматического партнера вследствие «скрытой» сегрегации (Пристяжнюк и др., 2005). Другое преимущество гибридных клонов серии HMC состоит в том, что использование в клеточной гибридизации разных, но близкородственных видов, облегчило поиск генетических различий в кодирующих участках генов и позволило нам надежно маркировать аллельные варианты разного родительского происхождения. Благодаря используемой нами экспериментальной модели появилась возможность для более полной оценки плюрипотентности и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом и присутствием хромосом соматического партнера. 2 Цель и задачи работы Цель работы заключалась в оценке плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши M. musculus и спленоцитов M. caroli. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Оценить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток in vitro с помощью маркеров, характерных для недифференцированных клеток: активности щелочной фосфатазы и эмбрионального поверхностного антигена ЕСМА-7. 2. Сравнить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток в экспериментах in vivo – получение химерных животных, с последующей оценкой вклада гибридных клеток в формирование тканей и органов химер. 3. Изучить в клонах межвидовых гибридных клеток экспрессию генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности. 4. Сравнить экспрессию родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках и, тем самым, оценить способность к репрограммированию генома дифференцированных клеток взрослого животного. 5. Оценить активность Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro. Научная новизна работы. 1. Впервые проведено комплексное исследование плюрипотентности межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток мышей M. musculus линии 129/Ola и спленоцитов M. caroli. Для оценки плюрипотентности использовали молекулярные, гисто- и иммуногистохимические маркеры, а также тест на получение химерных животных. Показано, что уровень плюрипотентности в гибридных клетках типа ЭСК-спленоцит мало зависим или полностью независим от числа хромосом соматического партнера в гибридном кариотипе, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. 2. В данной работе впервые описаны химерные животные, полученные микроинъекционным способом с использованием межвидовых клеточных гибридов серии НМС. Показано сохранение хромосом соматического партнера в потомках гибридных клеток при развитии химерного организма. 3. В гибридных клетках серии НМС впервые проведен анализ активности Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, и показано отсутствие предпочтительной инактивации Х-хромосом при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro. Положения, выносимые на защиту. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток M. musculus со спленоцитами взрослой самки M. caroli, показано присутствие активности щелочной фосфатазы и эмбрионального антигена ЕСМА-7 (маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам) и «маркеров плюрипотентности» Nanog и Oct4. Показана реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla M. caroli, неактивных в геноме спленоцитов. Анализ экспрессии 3 генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дифференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Х-хромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю». Установлено, что клоны гибридных клеток, содержащие единичные хромосомы M. caroli и клоны с высоким содержанием хромосом M. caroli, способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных. Полученные данные свидетельствуют о сохранении плюрипотентности у гибридных клеток серии НМС на уровне сходным с ЭСК и, более того, о доминировании этого свойства у клеточных гибридов такого типа. Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы способствуют расширению знаний о процессах поддержания плюрипотентности и репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в НГУ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 93 страницах, содержит 16 рисунков и 8 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы культуры клеток: ЭСК, линии НМ-1 (ГФРТ-; ХУ); 20 первичных ГАТ-резистентных клонов межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных от слияния ЭСК линии НМ-1 мыши M. musculus и спленоцитов мыши M. caroli (ГФРТ+; ХХ) (Серов и др., 2003). Кроме того, в работе использовали 2 субклона гибридного клона НМС15. Культивирование клеток проводили по методу описанному ранее (Matveeva et al., 1998, 2005). Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы проводилось согласно методу описанному ранее (Pain et al., 1996). Для оценки активности щелочной фосфатазы на окрашенных препаратах подсчитывалось число колоний клеток различного типа: состоящие из окрашенных клеток (АР+), из неокрашенных клеток (АР–) и как из окрашенных, так и неокрашенных клеток (АРсм), общая выборка составляла 500-700 колоний. Затем подсчитывалась доля колоний каждого типа. Иммуногистохимическое выявление экспрессии ECMA7 (Baribault H., Kemler R., 1989). Для получения эмбриоидных телец in vitro культуру клеток трипсинизировали и суспендировали стандартным способом. Клеточную суспензию высевали на обработанные 1% агарозой чашки в ростовую среду, не содержащую LIF (Robertson, 1997; Matveeva et al., 1998). Эмбриоидные тельца брали в анализ на 9-12 сутки. Для получения химерных животных 10-20 ЭСК или гибридных клеток инъецировали в реципиентные бластоцисты мышей линии C57Bl/J6. Инъецированные бластоцисты трансплантировали реципиентным псевдобеременным самкам F1 (C57Dl/J6 x CBA-Lac) (Matveeva et al., 1998). Вклад ЭСК и гибридных клеток в ткани химерных животных оценивали с помощью биохимического выявления аллельных вариантов глюкозофосфатизомеразы (ГФИ) (DeLorenzo, Ruddle, 1969). 4 Выделение ДНК из клеток проводили с помощью DNAzol согласно рекомендациям производителя (Life Technology, USA), из эмбриоидных телец ДНК выделяли с использованием Trizol Reagent (Life Technology, USA) согласно рекомендациям производителя и из тканей животных – фенол-хлороформным методом (Маниатис и др., 1984). Тотальную РНК из клеток, эмбриоидных телец, а также из тканей взрослых мышей выделяли с использованием Trizol Reagent (Life Technology, USA) согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали набор реактивов Reverse Transcription System (Promega, USA) по методу производителя. Реакционная смесь ПЦР объемом 25 мкл содержала ПЦР буфер (65 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16 мМ (NH4)2SO4 и 0,01% Tween 20), 1,5-3,0 мМ MgCl2 (табл. 1), 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотида (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), по 1 мкМ обоих праймеров (табл. 1), 0,5 ед. Taq ДНК полимеразы и 50-500 нг ДНК. Условия ПЦР включали исходную денатурацию геномной ДНК в течение 3 мин при 95°С, 30 циклов амплификации (денатурация 30 сек при 95°С, отжиг праймеров 15-30 сек при Т указанной в таблице 1, элонгация 20 сек при 72°С), элонгация в течение 3 мин при 72°С. Для электрофоретического разделения фрагментов ДНК использовали 3% агарозный гель. Рестрикционный анализ проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл содержащей 17 мкл раствора амплифицированной ДНК, 100 мкг/мл BSA, 2 мкл десятикратного буфера для соответствующей рестриктазы и 5 ед. фермента. Использовали эндонуклеазы рестрикции PstI, DraI, HinfI (СибЭнзим, Россия) и HhaI (Promega, USA). Смесь инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Таблица 1. Праймеры и условия ПЦР для оценки экспрессии в ЭСК и гибридных клетках, а так же анализа химерных животных. Длина Т Ген/ Последовательность праймера, MgCl2, фрагмента, отжига, маркер от 5’ к 3’ мМ пн °С ACGCACGATTTCCCTCTCAGC Actb 460 2,0 58 GGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCC CTCGAACCACATCCTTCTCT Oct4 312 2,0 58 GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC ATCTAAGACAAAATACATCATTCCG Xist 250 3,0 55 CTTGGACTTAGCTCAGGTTTTGTGTC GTTCATGCAGATGGCAGAGC Gla 318 2,5 58 CAGTGACAACCATCAAATTTTAGC GTGGTTGAAGACTAGCAATGG Nanog 462 2,5 55 CCAGATGTTGCGTAAGTCTC CACAGAGTAGTTCAGGAATAATTCC Nanog 148 2.5 55 CTTCGGGGAGGACTTTCTG CCCAACGCTTTCCTAGTGGA Gla 255 1,5 58 TGCAAGGCACAACCACGC GGACAACCCATCAACAACACTT Catsper1 131 2,5 55 GGTGACTGAACGGCGCAAT CCTCCCACAGTTCCTCATGT D9Mit181 2,4 59 CTGGTCTGGCCTCAGGTG 5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка плюрипотентности клеточных гибридов с помощью маркеров недифференцированного состояния клеток. Для первичной оценки плюрипотентности клонов серии НМС мы использовали маркеры недифференцированного состояния клеток, такие как: ферментативная активность щелочной фосфатазы (Wobus et al., 1984) и эмбриональный поверхностный антиген ЕСМА-7 (Baribault, Kemler, 1989). Гистохимический анализ гибридных клеток показал, что клоны по доле АР+ колоний можно разделить на три условные группы. Первая, в которой более 70% АР+ колоний, вторая – 30-70%, и третья – менее 30%. При этом доля АР+ колоний в ЭСК линии НМ-1 составляла около 90%. 6 клонов были иммуногистохимически проанализированы на наличие экспрессии ЕСМА7. У всех клонов выявлено присутствие этого маркера. На основании этих данных можно предположить, что все клоны сохраняют плюрипотентность, однако часть из них имеет большую склонность к дифференцировке. Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на химеризм. Для тестов на химеризм были взяты контрастные по содержанию хромосом соматического партнера и общему количеству хромосом клоны гибридных клеток НМС15, НМС29 и субклоны НМС15-1, НМС15-4. У клона НМС15 и его субклонов общий набор хромосом варьирует от триплоидного до тетраплоидного, а количество хромосом M. caroli – от 1 до 3 (Matveeva et al., 2005; Vasilkova et al., 2007), тогда как клон НМС29 содержит 80% клеток с диплоидным и околодиплоидным набором хромосом и 13 хромосом M. caroli (Matveeva et al., 2005). Нами были получены химерные животные: от клеток клона НСМ15 – две химерные самки, от клеток клона НСМ29 – один химерный самец, от клеток субклона НМС15-1 – две самки и три самца и от клеток субклона НМС15-4 – самка и шесть самцов. Общая доля химерных животных для клонов немногим отличалась от таковой для контрольной линии ЭСК НМ-1. По окраске шерсти вклад клеток клона НСМ15 оценивался как 30% и 50%. Вклад потомков субклона НМС15-1 по окраске шерсти составлял 5%, тогда как у субклона НМС15-4 этот показатель варьировал в интервале от 5% до 30%. Вклад клеток клона НСМ29 по окраске шерсти оценивался как 5%. Для анализа вклада гибридных клеток в зародышевый путь были проведены скрещивания химерных животных с мышами линии C57Bl/J6 и CBA-Lac. В результате этих скрещиваний от каждого химерного животного было получено 4-5 полноценных потомств, однако не было получено ни одного потомка с фенотипом 129/Ola и с фенотипом агути (А.Н. Голубица, А.И. Железова, личное сообщение). Вклад ЭСК линии НМ-1 потомков ЭСК по окраске шерсти достигал 50%, однако от этих химер также не было получено потомков с фенотипом 129/Ola и с фенотипом агути (А.Н. Голубица, А.И. Железова, личное сообщение). 6 органы и ткани НМС15 #9, ♀ семенник или яичник селезенка почка печень сердце мозг легкое толстая кишка тонкая кишка глаз Таблица 2. Анализ вклада гибридных клеток в ткани химерных животных гибридные клоны серии HMC НМС15-1 НМС15-4 номер химеры #21, ♀ #22, ♂ #24, ♀ #25, ♂ #11, ♂ #12, ♂ #13, ♂ #14, ♂ #15, ♂ НМС29 #16, ♂ #3, ♂ + - + - - + нт + + + + - + + + + + + + - + - + - + + - + + + - + - + - + + - + + + + + - + + + - + нт - - - - + + - + скелетная + мускулатура + + + + кожа "+" - присутствие маркера донорских клеток "-" - отсутствие маркера донорских клеток "нт" - анализ не проводился. + - + + нт + + + + - + + + - + - + + - + + + + + + + + + + + + + - - В таблице 2 представлены суммарные результаты анализа вклада клеток линии НМ-1 и гибридов серии НМС в различные ткани и органы химерных животных. Этот вклад оценивали с помощью нескольких маркеров. Благодаря тому, что линия мышей 129/Ola (клетки НМ-1) и линия C57Bl/J6 (реципиентная линия мышей) имеют разные изоформы ГФИ, стало возможным выявлять вклад донорских клеток в органы химерных животных с помощью электрофоретического разделения в крахмальном геле. В связи с различной длиной микросателлита D9Mit181 маркирующего хромосому 9 у линии мышей 129/Ola и линии C57Bl/J6, мы так же могли качественно показать вклад клеток в органы химер. Однако оба эти маркера выявляют присутствие потомков гибридных клеток только по наличию генома ЭСК НМ-1, тогда как используемые видоспецифичные маркеры хромосомы 19 (ген Catsper1) и Х-хромосомы (ген Gla) выявляют присутствие генетического материала мыши M. caroli. По данным, полученным Баттулиным Н.Р. последовательности фрагментов гена Gla мыши M. caroli (GenBank Ac. No. DQ218140) и M. musculus, а так же последовательности фрагментов гена Catsper1 M. caroli (GenBank Ac. No. DQ021499) и M. musculus имеют различия. На основе этих различий были созданы праймеры, которые позволили селективно амплифицировать фрагмент размером 255 пн гена Gla M. caroli и фрагмент размером 132 пн гена Catsper1 M. caroli. Рис. 1. Вклад потомков клеточных гибридов в органы и ткани химерных животных. А - химера #9 (донор клеток клон НМС15): 1 - семенники; 2 - селезенка; 3 почка; 4 - печень; 5 - сердце; 6 - контроль, линия мышей С57Bl/J; 7 - контроль, линия клеток НМ-1; 8 - икроножная мышца; 9 – головной мозг. Б - химера #3 (донор клеток клон НМС29): 1 - семенники; 2 - селезенка; 3 - почка; 4 - печень; 5 – контроль, линия клеток НМ-1; 6 – контроль, линия мышей С57Bl/J; 7 - сердце; 8 - мозг; 9 - кишечник; 10 - скелетная мускулатура (икроножная мышца). Для химеры, полученной с участием клеток клона НМС15, с помощью микросателлита D9Mit181 показан вклад во все органы, при этом выявлялся только продукт, специфичный для родительской линии клеток НМ-1. По результатам электрофоретического анализа аллельных вариантов ГФИ присутствие потомков клеток клона НМС15 выявлено во всех исследованных органах химерного животного (рис. 1, А). По визуальной оценке, вклад 8 гибридных клеток примерно равен вкладу клеток реципиентного эмбриона. Анализ химеры с помощью маркера Х-хромосомы M. caroli гена Gla не выявил присутствие этого маркера ни в одном органе. Можно предположить, что это животное образовалось с участием клеток НМ-1, которые в некотором количестве могли сохраниться в исходном клоне НМС15 при селективных условиях за счет кооперативного эффекта (Hooper et al., 1982). Соответственно, высокий вклад потомков клеток гибридного клона НМС15 в формирование химерного животного можно также объяснить участием НМ-1 клеток. Субклоны НМС15-1 и НМС15-4, также как и исходный клон НМС15, имели околотетраплоидный набор хромосом (И.Е. Пристяжнюк, личное сообщение), и содержали 2 и 1 гомеолога M. caroli, соответственно, а также небольшую долю околодиплоидных клеток. Однако происхождение субклонов НМС15-1 и НМС15-4 из единичных клеток клона НМС15 полностью исключало присутствие в них клеток родительской линии НМ-1, то есть все клетки субклонов имеют гибридное происхождение. У всех полученных химерных животных вклад потомков клеток субклонов по окраске шерсти (5-15%) значительно снизился в сравнении с контрольной линией ЭСК и с исходным клоном НМС15 (30-50%). Вклад в органы и ткани потомков клеток субклона НМС15-4 по биохимическому и молекулярным маркерам оказался также несколько меньше (не был выявлен вклад в селезенку, печень, легкие) по сравнению с контрольной линией ЭСК и с исходным клоном НМС15 (табл. 2). Тем не менее, клетки субклона НМС15-4 дают вклад во все три зародышевых листка, но со сниженным вкладом в производные энтодермы. Вклад субклона НМС15-1 в формировании химер по тем же оценкам оказался более снижен относительно НМС15-4. Для химер, полученных с участием клеток субклона НМС15-1, показан вклад гибридных клеток в формирование лишь 5-ти органов. Такое снижение химеризма возможно связано не только с присутствием хромосом M. caroli и гибридным происхождением клеток, но и с селекцией в процессе развития в пользу диплоидных клеток ВКМ реципиентной бластоцисты по отношению к клеткам субклонов с высокой плоидностью (Everett, West, 1996, 1998). Вклад потомков клеток гибридного клона НМС29 был ограничен по сравнению с родительской линией НМ-1, с клоном НМС15 и с субклоном НМС15-4. По результатам электрофоретического разделения ГФИ вклад выявлен только в нескольких органах: семенник, сердце, мозг, кишечник (рис. 1, Б), а ПЦР анализ с видоспецифичными маркерами показал вклад в 7-ми из 12-ти органов (табл. 2). Возможно, что наличие большого количества хромосом мыши M. caroli ограничивает потенциал клеток клона НМС29, что проявляется как снижение химеризма по окраске шерсти и по вкладу в отдельные ткани. Однако если оценивать по закладкам, то потомки клеток клона НМС29 дают вклад во все три зародышевых листка, хотя вклад в производные энтодермы очень низкий (табл. 2). Особо следует отметить, что, несмотря на выявленное присутствие потомков гибридных клеток в гонадах, их прохождение через зародышевый путь установлено не было, так как не было получено потомства химерных животных 9 с генами от донорских клеток. Возможно, это связано с накопленными хромосомными перестройками у ЭСК линии НМ-1 в процессе пассирования, или с несбалансированностью набора хромосом у клонов НМС15 и НМС29, и субклонов НМС15-1 и НМС15-4. Данные о вкладе клеток клонов в формирование органов химер свидетельствуют о том, что гибридные клетки сохраняют плюрипотентность. Важным отличием данной работы от предшествующих является то, что был проведен частичный анализ хромосомного состава химерных животных, полученных из эмбриональных гибридных клеток. Для корректной оценки потенциала гибридных клеток необходимо быть уверенным, что химерные животные произошли именно из клеток, имеющих хромосомы соматического партнера. Нами показано, что маркеры, по крайней мере, 2-х хромосом соматического партнера не элиминируются. Это свидетельствует о том, что в процессе развития химерного животного, когда снимается селективное давление факторов использованных при получении гибридных клеток (ГАТ), и в то же время включаются механизмы клеточной селекции связанные с несбалансированностью генома гибридных клеток или повышенной плоидностью, доля потомков клеточных гибридов с хромосомами соматического партнера достаточно велика. В целом, полученные данные о вкладе гибридных клеток в формировании химер показали, что клоны с разным числом хромосом соматического партнера (спленоцитов), от 1-3 в клоне НМС15 и его субклонах до 13 хромосом в клоне НМС29, имеют сходный уровень плюрипотентности, который, в свою очередь, сопоставим с таковым родительских клеток НМ-1. Эти данные свидетельствуют о том, что плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Следует также отметить, что этот вывод получил подтверждение в недавних исследованиях в лаборатории генетики развития, где удалось получить серию химерных животных в опытах по инъекции гибридных клеток типа ЭСКфибробласт (Е.А. Кизилова, личное сообщение) и имевших околотетраплоидный кариотип. Более того, микросателлитный анализ показал, что все хромосомы фибробластного происхождения присутствовали в гибридных клетках ЭСКфибробласт (А.А. Круглова, личное сообщение). Анализ экспрессии «генов плюрипотентности» Oct4 и Nanog в гибридных клетках. Еще одним способом оценки плюрипотентности является анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog. Эти гены активны только в раннем эмбриональном развитии и являются ключевыми в поддержании плюрипотентных свойств, наличие их экспрессии свидетельствует о сохранении плюрипотентности в гибридных клетках. Анализ экспрессии гена Oct4 показал, что во всех клонах серии HMC выявляются транскрипты этого гена, хотя следует отметить, что в клонах НМС6 и НМС44 уровень его экспрессии низкий. Анализ экспрессии другого молекулярного маркера «плюрипотентности» – гена Nanog показал, что во всех клонах серии НМС присутствуют его транскрипты. Однако в клоне НМС6 уровень экспрессии этого гена заметно снижен. 10 Предполагаемое снижение уровня экспрессии генов Oct4 и Nanog в некоторых клонах согласуется с их повышенной склонностью к дифференцировке, так что, по-видимому, большинство клеток этих клонов находится на начальных этапах дифференцировки и лишь небольшая доля клеток обладает плюрипотентными свойствами и экспрессирует Oct4 и Nanog. Сравнение экспрессии родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках. Для дискриминации транскриптов аллелей генов Oct4, Nanog и Gla, экспрессирующиеся в ЭСК и в спленоцитах альтернативным образом, был использован рестрикционный полиморфизм между аллелями родительских видов. При сравнении последовательностей фрагментов генов Oct4 (GenBank Ac. No. DQ250732), Nanog (GenBank Ac. No. DQ250731) и Gla (GenBank Ac. No. DQ218140) M. caroli с гомологичными последовательностями M. musculus были выявлены видоспецифичные сайты рестрикции (рис. 2) (по данным, полученным Н.Р. Баттулиным). Рис. 2. Различия аллелей генов Oct4, Nanog, Gla и Xist мышей M. caroli и M. musculus. Рис. 3. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Oct4 в ЭСК НМ-1 и гибридных клетках серии НМС. L – маркер с шагом 100 нп. На рис. 3 представлены продукты амплификации кДНК гена Oct4 клеточных гибридов после обработки ферментом PstI. Фрагмент размером 312 пн соответствует аллелю M. musculus, тогда как фрагмент 254 пн 11 соответствует аллелю M. caroli. Выявлено, что в 12 клонах содержащих хромосому 17 M. caroli наблюдается экспрессия аллеля соматического партнера. На рис. 4 представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Nanog в клонах НМС. Фрагмент размером 148 пн маркирует транскрипт аллеля M. caroli, тогда как фрагмент 101 пн аллель M. musculus. Из приведенной иллюстрации видно, что во всех клонах гибридных клеток содержащих хромосому 6 M. caroli имеет место экспрессия аллеля соматического партнера гена Nanog. Рис. 4. Результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Nanog в гибридных клетках серии НМС и ЭСК НМ-1. Присутствие ПЦР продукта размером 101 пн маркирует транскрипт аллеля M. musculus, а 148 пн экспрессию аллеля M. caroli. (рисунок предоставлен студентом-дипломником НГУ Н.Р. Баттулиным) Рис. 5. Результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Gla в гибридных клетках серии НМС и ЭСК НМ-1. Присутствие ПЦР продукта размером 220 пн маркирует транскрипт аллеля M. musculus, а 174 пн экспрессию аллеля M. caroli. (рисунок предоставлен студентом-дипломником НГУ Н.Р. Баттулиным) 12 На рис. 5 представлена электрофореграмма продуктов амплификации кДНК гена Gla клеточных гибридов после обработки ферментом HinfI. Фрагмент размером 220 пн маркирует транскрипты аллеля M. musculus, фрагмент 174 пн - аллеля M. caroli. Проведенный анализ показал присутствие транскриптов аллеля M. caroli гена Gla во всех исследованных клонах. Поскольку гены Oct4, Nanog и Gla были неактивны в геноме спленоцитов, то перечисленные выше факты свидетельствуют об их реактивации. Важно отметить, что даже в клоне HMC6, в котором, по-видимому, уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog снижен по сравнению и с остальными клонами, и родительской линией ЭСК HM-1, выявляются транскрипты M. caroli Oct4 и Nanog. На основании полученных данных можно предположить, что при взаимодействии с геномом ЭСК генома дифференцированной клетки (спленоцит) происходит его репрограммирование. Инактивация Х-хромосомы при индуцированной in vitro дифференцировке гибридных клонов серии HMC. Инактивация Х-хромосом у естественных гибридов F1, полученных от скрещивания M. musculus с M. caroli, происходит случайным и равновероятным способом, то есть количество клеток с активной Х-хромосомой M. musculus и M. caroli примерно одинаково (Chapman, Shows, 1976). Известно, что в гибридных клетках, полученных слиянием ЭСК генотипа ХУ с соматическими клетками генотипа ХХ или ХУ, Х-хромосомы находятся в активном состоянии (Matveeva et al., 1998; Tada et al. 2001). Также известно, что гибридные клетки, так же как и ЭСК, способны образовывать in vitro эмбриоидные тельца (ЭТ), в которых активно происходят процессы дифференцировки, включая инактивацию одной из Х-хромосом (Rastan, Robertson, 1985; Matveeva et al., 1998). При слиянии клеток НМ-1 M. musculus генотипа ХУ со спленоцитами взрослой самки M. caroli в гибридной клетке ожидается присутствие 3-х Х-хромосом, две из которых принадлежат M. caroli и одна M. musculus. Однако анализ соотношения родительских Х-хромосом в клонах гибридных клеток (Пузаков и др., 2007) с помощью «двуцветной» гибридизации in situ, показал, что в большинстве изученных клонов клетки содержали две Х-хромосомы, одну M. musculus и другую M. caroli. Учитывая эти данные, мы отобрали 5 гибридных клонов, в которых содержание двух родительских Х-хромосом в большинстве клеток было близким к 1:1, и индуцировали их дифференцировку in vitro. Такой подход позволяет выяснить случайно или неслучайно происходит инактивация Х-хромосом, различавшихся своим онтогенетическим статусом до момента образования гибридных клеток. Для того чтобы охарактеризовать процесс инактивации Х-хромосом в ЭТ мы использовали два маркерных гена Gla и Xist, первый является маркером активной Х-хромосомы, (активен только ЭСК (Adler et al., 1977), в спленоцитах он неактивен (Freeman et al., 1998)), тогда как второй является не только маркером неактивной Х-хромосомы, но ключевым элементом самого процесса инактивации. Для дискриминации транскриптов родительских аллелей генов Gla и Xist был использован обнаруженный Баттулиным Н.Р. рестрикционный 13 полиморфизм между M. musculus и M. caroli (рис. 2). Аллели гена Gla у M. musculus и M. caroli (GenBank Ac. No. DQ218140) различаются наличием сайта для эндонуклеазы рестрикции HinfI у M. caroli. Аллель гена Xist (GenBank Ac. No. DQ218138) M. caroli отличается от M. musculus наличием сайта для эндонуклеазы рестрикции DraI у M. musculus. Предложенный метод является более масштабным тестом для оценки репрограммирования, нежели реактивация отдельных генов, поскольку инактивация хотя и оценивается на уровне отдельных генов, но характеризует состояние целой хромосомы. Анализ транскрипции родительских аллелей генов Xist и Gla проводился в эмбриоидных тельцах ЕВ1, ЕВ28, ЕВ29, ЕВ41 и ЕВ56, полученных из суспензионных культур гибридных клонов НМС1, НМС28, НМС29, НМС41 и НМС56, соответственно (рис. 6, 7). На рис. 6 представлены результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Xist в ЭТ. Показано, что экспрессия гена Xist обнаруживается во всех ЭТ и существенно выше, чем в клетках НМ-1. Обработка ферментом DraI продуктов амплификации с кДНК гена Xist выявила экспрессию обоих аллелей этого гена во всех исследованных ЭТ. Судя по визуальной оценке, соотношение транскриптов обоих аллелей соответствует примерно 1:1, без признаков преобладания какого-либо из них. Рис. 6. Экспрессия аллелей M. caroli и M. musculus гена Xist в ЭТ: EB1, EB28, EB29, EB41, EB56, образовавшихся из клеток клонов НМС1, НМС28, НМС29-3, НМС41 и НМС56 и из ЭСК НМ-1. "-" – без обработки ПЦР продуктов рестриктазой DraI; "+" – после обработки ПЦР продуктов рестриктазой DraI; L100 – маркер с шагом 100 пн. Присутствие ПЦР продукта размером 250 пн маркирует транскрипт аллеля M. caroli, а 153 пн – аллеля M. musculus. Рис. 7. Результаты ОТ-ПЦР-анализа транскрипции аллелей гена Gla в гибридных клонах НМС1, НМС28, НМС29-3, НМС41 и НМС46 и в ЭТ (EB1, EB28, EB29, EB41), образовавшиеся из клеток этих клонов. Присутствие ПЦР продукта размером 220 пн маркирует активность аллеля M. musculus, а 174 пн экспрессию аллеля M. caroli; фрагмент 98 пн образуется при обработке HinfI ПЦР продуктов обоих аллелей. L100 – молекулярный маркер с шагом 100 пн. 14 При анализе экспрессии гена Gla транскрипты этого гена были обнаружены в пяти исследованных клонах гибридных клеток, в ЭТ, полученных из них, и в ЭСК, тогда как в спленоцитах они отсутствовали (рис. 7). Обработка продуктов ОТ-ПЦР эндонуклеазой рестрикции HinfI показала, что и в исследованных гибридных клетках и в полученных из них ЭТ наблюдается высокая активность обоих родительских аллелей гена Gla и (по визуальной оценке) примерно в равном соотношении. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о случайной инактивации Х-хромосом M. musculus и M. caroli в гибридных клетках, несмотря на первоначальные эпигенетические различия родительских хромосом, при индуцированной дифференцировке in vitro. Предположительно это может быть результатом «стирания» эпигенетических различий под действием факторов генома плюрипотентного партнера. ВЫВОДЫ 1. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток M. musculus со спленоцитами взрослой самки M. caroli, показано присутствие маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам: активность щелочной фосфатазы и присутствие эмбрионального антигена ЕСМА7. По активности щелочной фосфатазы выявлены межклональные различия, возможно обусловленные присутствием разного числа хромосом соматического партнера. 2. Установлено, что клон гибридных клеток, содержащий единичные хромосомы M. caroli, и клон с высоким содержанием хромосом M. caroli способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных, что является свидетельством сохранения ими плюрипотентности и, более того, доминирования этого свойства у гибридных клеток. 3. В клонах гибридных клеток показана экспрессия генов-маркеров плюрипотентности Nanog и Oct4 и реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla M. caroli, неактивных в геноме спленоцитов. 4. Анализ экспрессии генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дифференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Х-хромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю». 5. Полученные данные свидетельствуют, что клоны гибридных клеток серии НМС сохраняют плюрипотентные свойства на уровне сходным с ЭСК, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Однако в некоторых клонах, такие как НМС6 и НМС44, имеются признаки снижения их потенциала и повышенная склонность к дифференцировке. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках. // Онтогенез, 2003, Т. 34, № 3, С. 216-227. 15 2. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Темирова С.А., Матвеева Н.М., Сердюкова Н.А., Графодатский А.С., Серов О.Л. Анализ экспрессии родительских аллелей Xist и Gla в межвидовых эмбриональных гибридных клетках в условиях индуцированной in vitro инактивации Х-хромосом. // Онтогенез, 2007, Т. 38, № 2, С. 1-8. 3. Vasilkova A.A., Kizilova H.A., Puzakov M.V., Shilov A.G., Zhelezova A.I., Golubitsa A.N., Battulin N.R., Vedernikov V.E., Menzorov A.G., Matveeva N.M., Serov O.L. Dominant manifestation of pluripotency in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes. // Mol. Reprod. Dev., 2007, V. 74, № 8, P. 941-951. 4. Серегин А.В., Пузаков М.В., Мензоров А.Г. Сегрегация хромосом во внутривидовых и межвидовых клеточных гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток мыши и анализ их плюрипотентности. // Материалы XL Международной научной студенческой конференции, Биология. Новосиб. гос. университет., Новосибирск, 2002, С. 101103. 5. Пузаков М.В., Кизилова Е.А. Разработка метода количественной оценки плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток и их гибридов в условиях in vitro. // III международная научная конференция молодых ученых и студентов, Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Алматы, 2003, С. 186187. 6. Пузаков М.В., Кизилова Е.А., Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Мензоров А.Г., Василькова А.В., Серов О.Л. In vitro-анализ плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши. // Цитология, 2003, Т. 45, № 9, С. 917-918. 7. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Петракова О.С., Темирова С.А., Пузаков М.В. «Онтогенетическая память» родительских хромосом в гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов взрослого животного. // Цитология, 2003, Т. 45, № 9, С. 926. 8. Пузаков М.В., Василькова А.А., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Сравнение плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши. // Труды 3-го съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004, Т.2, С.403. 9. Матвеева Н.М., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В., Мензоров А.Г., Василькова А.А., Голубица А.Н., Железова А.И., Темирова С.А., Серов О.Л. Эмбриональные стволовые гибридные клетки – модель для изучения контроля плюрипотентности в условиях in vitro. // Материалы Международного симпозиума, Санкт-Петербург. Цитология, 2004, Т.46, № 10, С.927. 10. Баттулин Н.Р., Пузаков М.В. Анализ экспрессии родительских аллелей генов Nanog, Oct4, Gla, Xist и Lmna в межвидовых гибридных клетках. // Материалы XLIV Международной научной студенческой конференции, Биология, Новосиб. гос. университет, Новосибирск, 2006, С. 112. 16 11. Василькова А.А., Кизилова Е.А., Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Шилов А.Г., Железова А.И., Голубица А.Н., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Полное доминирование эмбрионального генома в гибридных клетках индуцирует восстановление потенций (репрограммирование) дифференцированных клеток. // Материалы международной конференции «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине», Новосибирск, 2006, С. 16. 12. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р. и Серов О.Л. Изучение репрограммирования Х-хромосом спленоцитов в геноме эмбриональных гибридных клеток. // Цитология, 2006, Т. 48, № 9. С. 795. 13. Мензоров А.Г., Ведерников В.Е., Пузаков М.В., Василькова А.А., Шилов А.Г., Кизилова Е.А., Серов О.Л. Сохранение маркеров хромосом соматического партнера в геноме внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клеток мыши в условиях дифференцировки in vivo. // Цитология, 2006, Т. 48, № 9. С. 780-781.
