ДНК полимераза I - у меня есть мечта
реклама
3. Дисциплина «Молекулярная биология» 1.Опишите схематично вторичную структуру ДНК. Правила Э. Чаргаффа. Модель ДНК Дж. Уотсона и Ф. Крика. 2.Раскройте структуру вилки репликации: события на ведущей и отстающей нитях. Полунепрерывный синтез и фрагменты Оказаки. Участие в репликации вспомогательных белков (SSB, хеликазы, праймазы, лигазы). 3.Объясните механизм репликации концов линейных хромосом эукариот с помощью теломеразы. 4.Охарактеризуйте структуру лактозного оперона и механизм его регуляции с помощью белков репрессоров и активаторов. 5.Охарактеризуйте процессинг рРНК и тРНК. Аутосплайсинг. 6.Охарактеризуйте ДНК-транспозоны эукариот: структура, механизм перемещения, представители. 7.Критически оцените ДНК-полимеразы E. coli: размеры, субъединичный состав, ферментативные активности и участие в процессах репликации и репарации. 8.Критически оцените основные свойства генетического кода. 9.Опишите схематично аминоацилирование тРНК: механизм действия аминоацил-тРНКсинтетаз. 10.Опишите механизм общей (гомологичной) рекомбинации. 1. Опишите схематично вторичную структуру ДНК. Правила Э. Чаргаффа. Модель ДНК Дж. Уотсона и Ф. Крика. Вторичная стр-ра ДНК представляет собой две параллельные неразветвленные полинуклеотидные цепи, закрученные вокруг общей оси в двойную спираль. Такая пространственная стр-ра удерживается множеством водородных связей, образуемых азотистыми основаниями, направленными внутрь спирали. Водородные связи возникают м\у пуриновым основанием одной цепи и пиримидиновым основанием другой цепи. Эти основания составляют комплементарные пары. Обр-ние водородных связей м\у комплементарными парами оснований обусловлено их пространственным соответствием. Пиримидиновое основание комплементарно пуриновому основанию: Водородные связи м\у другими парами оснований не позволяют им разместиться в структуре двойной спирали. ТИМИН (Т) комплементарен АДЕНИНУ (А), ЦИТОЗИН (Ц) комплементарен ГУАНИНУ (Г). М\у собой соседние нуклеотиды соединены в цепи фосфодиэфирной связью, образованной 3’-гидроксильной (3’-ОН) и 5’-фосфатной группами (5’-РО3). Это св-во обуславливает наличие полярности в ДНК, т. е. противоположной направленности, а именно 5’- и 3’-концов: 5’-концу одной нити соответствует 3’-конец второй нити. Комплементарность оснований определяет комплементарность цепей в молекулах ДНК. Комплементарность полинуклеотидных цепей служит химической основой главной функции ДНК – хранения и передачи наследственных признаков. Способность ДНК не только хранить, но и исп-ть генетическую инф-цию опред-ся следующими ее св-ми: - молекулы ДНК способны к репликации (удвоению), т.е. могут обеспечить возможность синтеза других молекул ДНК, идентичных исходным, поскольку последовательность оснований в одной из цепей двойной спирали контролирует их расположение в другой цепи. - молекулы ДНК могут направлять совершенно точным и определенным образом синтез белков, специфичных для организмов данного вида. В формировании вторичной структуры ДНК участвуют следующие типы взаимодействий: - водородные связи между комплементарными основаниями (две между аденином и тимином, три — между гуанином и цитозином); - стэкинг-взаимодействия; - электростатические взаимодействия; - Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия. В зависимости от внешних условий параметры двойной спирали ДНК могут меняться, причём иногда существенно. Правоспиральные ДНК со случайной нуклеотидной последовательностью можно грубо разделить на два семейства — А и В, главное отличие между которыми — конформация дезоксирибозы. К В-семейству также относятся С- и Dформы ДНК. Нативная ДНК в клетке находится в В-форме. Признак АВZ-форма форма форма Спираль правая правая Левая Количество пар оснований на виток 11 10 12 Шаг спирали 28,6 Å 33,6 Å 45 Å Диаметр спирали 23 Å 20 Å 18 Å Угол между плоскостями оснований и 70° 90° 100° осью спирали Конформация гликозидной связи анти анти анти (у пиримидина), син (у пурина) Конформация дезоксирибозы С3’С2’С2’-эндо (у пиримидина), С3’эндо эндо эндо (у пурина) Правила Чаргаффа (1950 г): 1. Пур = Пир или Пур / Пир = 1. 2. А = Т или А/Т = 1. 3. Г = Ц или Г/Ц = 1. 4. Г + Т = А + Ц или Г + Т / А + Ц = 1. 5. В ДНК различных источников соотношение нуклеотидов: либо (А+Т)>(Г+Ц) – АТ-тип ДНК, либо (Г+Ц)>(А+Т)- ГЦ-тип ДНК Работы Чаргаффа послужили основой для создания научной теории о строении молекулы ДНК. Впервые структуру ДНК описали Джеймс Уотсон и Френсис Крик в 1953 году. Они проанализировали четкую рентгеннограмму ДНК, полученную Розалиндой Франклин и морисом Уилкинсоном, и предложили двуспиральную модель молекулы ДНК, которая в основном оказалась правильной. По теории Уотсона и Крика молекула ДНК имеет вид двойной спирали в пространстве, которая представляет вторичную структуру ДНК. Характеристики двойной спирали: 1. Двойная спираль - это 2 полинуклеотидные цепи, обвивающие друг друга. 2. Эти полинуклеотидные цепи ДНК - антипараллельны. 3. Азотистые основания располагаются внутри спирали, а остатки сахара и фосфорной кислоты снаружи. 4. Азотистые основания соединяются друг с другом по принципу комплементарности 5. Последовательность нуклеотидов одной цепи автоматически определяет последовательность нуклеотидов комплементарной цепи. 6. Диаметр спирали 2 нм. 7. На один виток спирали приходится 10 пар оснований. 8. Шаг спирали (длина одного витка) = 3,4 нм 9. Расстояние между плоскостями оснований =0,34нм. 10.Между стопками азотистых оснований возникают стэкинг-взаимодействия. 2. Раскройте структуру вилки репликации: события на ведущей и отстающей нитях. Полунепрерывный синтез и фрагменты Оказаки. Участие в репликации вспомогательных белков (SSB, хеликазы, праймазы, лигазы). Репликация ДНК — процесс синтеза дочерней молекулы ДНК на матрице род-ой мол-лы ДНК (т.е. процесс удвоения ДНК). В ходе последующего деления материнской кл. каждая дочерняя кл. получает по одной копии молекулы ДНК, кот. яв-ся идентичной ДНК исходной материнской кл. Этот процесс обеспечивает точную передачу ген. инф-и. Механизмы репликации ДНК про- и эукариот сущ-но различ-ся: во втором случае синтез ведущей и отстающей цепей ДНК осущ-ют разные ДНК-полимеразы (альфа и дельта), а у E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III. Репликации осущ-ся на этапе инициации. Она начинается с сайта инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как один, так и много. Репликация ДНК у про- и эукариот протекает почти сходно, но, скорость синтеза у эу-т (100 нуклеотидов/с) ниже, чем у про-т (1000 н/с). Фрагмент ДНК от точки начала репликации до точки ее окончания образует репликон. Начавшись в точке начала (локус on), репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован. Инициация репликации осущ-ся в особых участках ДНК - ori (origin начало). Они вк-ют послед-ть, состоящую из 300 нк пар, узнаваемую специф-ми белками. ДНК в этих локусах разделяется на две цепи, при этом по обе стороны от точки начала репликации образ-ся области расхождения полинуклеотидных цепей — репликационные вилки, кот. движутся в противоположных от локуса ori направлениях. Между репликационными вилками образ-ся структура, называемая репликационным глазком, где на двух цепях материнской ДНК образуются новые полинуклеотидные цепи. С помощью геликазы, разрывающего водородные связи, ДНК расплетается в точках начала репликации. Образующиеся при этом одинарные цепи ДНК связываются специальными дестабилизирующими белками, кот. растягивают остовы цепей, делая их азотистые основания доступными для связывания с комплем-ми нк-ми, находящимися в нуклеоплазме. На каждой из цепей, образующихся в области репликационной вилки, при участии ДНКполимеразы осущ-ся синтез комплементарных цепей. В процессе синтеза репликационные вилки движутся вдоль материнской спирали в противоположных направлениях, захватывая все новые зоны. Репл-я состоит из 3 стадий: инициации (начало процесса), элонгации (собственно синтез) и терминации (окончание процесса). Инициация. Точки начала репликации имеют специф-ую послед-ть оснований - пары А-Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой послед-ю связываются несколько молекул специальных узнающих белков. Начинает действовать геликаза. Он обеспечивает расплетение двойной спирали родительской ДНК путем разрыва водородных связей между нк. После, с каждой из двух нитей связываются специальные SSB-белки. Они обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии. Механизм действия основных ферментов репликации ДНК-полимераз таков, что синтез новой полинуклеотидной цепи не может начаться с включения в нее первого нуклеотида. Синтез идет только как удлинение уже существующего полинуклеотида, который комплементарен матрице и образует с ней двуспиральный комплекс матрица-затравка. Во всех живых системах такой затравкой служит не ДНК, а короткая РНК. РНК-затравка синтезируется праймазой (РНК-полимеразой). Элонгация. Каждый нк вкл-ся в цепь лишь в случае его комплем-ти нуклеотиду, занимающему данную позицию в составе матрицы. Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух цепей растет с опережением. Первая цепь наз-ся лидирующей, а вторая – запаздывающей. Лид-я цепь образ-ся в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Запазд-я обр-ся в виде серии коротких фрагментов – по 1500 нк. Это фрагменты Оказаки. В виде фр-в Оказаки синтезируется та цепь, направление образования которой противоположно направлению движения соответ-ей репликативной вилки. Рост цепей ДНК осущ-ся ДНК-полимеразами. Удлиннение цепи ДНК происходит в направлении 5’- 3’-конец. Это означает, что новый нуклеотид будет присоед-ся к 3’-концу растущей цепи. У про-т фр-ты Оказаки содержат от 1000 до 2000 нк, у эу-т они короче (от 100 до 200 нк). Синтезу каждого фрагмента предшествует образование РНК-затравки длиной около 10 нк. Вновь образованный фрагмент с помощью ДНК-лигазы соед-ся с предшествующим фрагментом после удаления его РНК-затравки. В виду того, что от локуса ori нач-ся две реплик-е вилки, идущие в против-х направлениях, синтез лидирующих цепей идет на разных цепях материнской ДНК. (Что происходит?). ДНК-геликаза расплетает ДНК. Дестабилизирующие белки выпрямляют участок цепи ДНК. ДНК-топоизомераза разрывает фосфодиэфирную связь в одной из полинуглеотидных цепей ДНК, снимая напряжение, вызываемое расплетенисм спирали и расхождением цепей в репликационной вилке. РНК-праймаза синтезирует РНК-затравки для дочерней цепи и для каждого фр-та Оказаки. ДНК-полимераза осущ-т непрерывный синтез лидирующей цепи и синтез фр-в Оказаки отстающей цепи. ДНК-лигаза сшивает фр-ты Оказаки после удаления РНКзатравки. Терминация. Исп-ся лигаза и теломераза. В результате действия предыдущих ферментов новосинтезированная запаздывающая цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу (кроме кольцевой ДНК). «Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (фермент образует фосфодиэфирную связь). Для осущ-я реакции требуется гидролиз АТФ. ДНК-полимеразная система оставляет недореплицированными 3’-концы материнских цепей ДНК, т.е. новые цепи оказываются укороченными с 5’-концов. В каждой новой цепи фр-т Оказаки, находящейся у 5’-конца, нач-ся с короткой РНК-затравки (у 5’-конца лидирующей цепи тоже находится РНКзатравка). РНК-затравки удаляются специальной нуклеазой. Но застроиться дезоксинуклеотидами образующаяся «брешь» не может, т.к. ДНК-полимеразы не способны действовоать «с нуля», а удлиняют 3’-конец уже имеющегося полинуклеотида. Поэтому, новая цепь должна быть короче старой. Эта проблема решается при помощи теломеразы. Он удлинняет старую цепь. К 3’-концу старой (родительской) цепи теломераза последовательно пристраивает несколько сотен повторяющихся послед-тей. Удлинненная старая цепь становится способной выступать в качестве матрицы для образования еще одного фр-та Оказаки новой (укороченной) цепи. Т.о., восстанавливается длина теломерного участка. Конечным результатом репл-и яв-ся образ-е 2 мол. ДНК, нуклеотидная послед-ть которых идентична материнской. 3. Объясните механизм репликации концов линейных хромосом эукариот с помощью теломеразы. ТЕЛОМЕРЫ - специализованные концевые районы линейной хромосомной ДНК, состоящие из многократно повторяющихся коротких нуклеотидных послед-тей. Это определение неполное. В состав теломер входят многие белки, специфически связывающиеся с теломерными ДНК-повторами. Т. о., теломеры (так же, как и все другие районы хромосомы эукариот) построены из дезоксинуклеопротеидов (ДНП), т.е. комплексов ДНК с белками. Независимо друг от друга они обнаружили, что фрагментация хромосом (под действием рентгеновского облучения) и появление у них дополнительных концов ведут к хромосомным перестройкам и деградации хромосом. В сохранности оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам. Лишенные концевых теломер, хромосомы начинают сливаться с большой частотой, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям. Следовательно, естественные концы линейных хромосом защищены специальными структурами. Г. Мёллер предложил называть их теломерами (от греч. телос - конец и мерос часть). В последующие годы выяснилось, что теломеры не только предотвращают деградацию и слияние хромосом (и тем самым поддерживают целостность генома хозяйской клетки), но и, по-видимому, ответственны за прикрепление хромосом к специальной внутриядерной структуре (своеобразному скелету клеточного ядра), называемой ядерным матриксом. Т.о., теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра, и наличие специальной теломерной ДНК на концах хромосом позволяет решить проблему концевой недорепликации ДНК. Очень важная характеристика теломерных ДНК - их длина. У человека она колеблется от 2 до 20 тыс. пар оснований (т.п.о.), а у некоторых видов мышей может достигать сотен т.п.о. У многих видов двуспиральная теломерная ДНК на самом конце содержит однотяжевой "хвост". Этот однотяжевой район теломерной ДНК представлен ее G-богатой цепью и заканчивается свободной 3'-гидроксильной группой. Соответственно белки теломер принято подразделять на две группы: белки, которые связаны с однотяжевой теломерной ДНК, и белки, связанные с двутяжевой ДНК теломеры. Теломерные белки участвуют во всех функциях теломер, поддерживая их структуру и регулируя длину теломерной ДНК. Некоторые из белков, ассоциированных с двуспиральной теломерной ДНК, регулируют активность определенных генов, повышая или подавляя их экспрессию. В качестве примера можно привести дрожжевой белок Rap1p. Этот ДНК-связывающий белок принимает участие в регуляции длины теломерной ДНК. В то же время, даже будучи в составе теломеры, он участвует в активации и репрессии транскрипции. Это означает, что изменения или нарушения в структуре теломер могут затрагивать не только их собственные функции, но и экспрессию жизненно важных генов, находящихся в других районах хромосом. Кроме того, важные для поддержания общей структуры хромосом белки располагаются на ДНК, непосредственно примыкающей к теломерной (иногда ее называют субтеломерной ДНК). Проблема "концевой недорепликации ДНК" ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю цепь ДНК, прочитывают родительскую цепь в направлении от ее 3'-конца к 5'-концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении 5'→3'. В противоположном направлении синтез цепи ДНК фермент катализировать не может (рис. 1). ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера - короткой РНК-затравки, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. Но на 3'-конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и поэтому 3'концевые участки ДНК остаются однотяжевыми, а их 5'-концевые участки недореплицированными. Отсюда ясно, что каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению. Понятно, что прежде всего должна сокращаться длина теломерной ДНК. Рис. 1 – Схема возникновения недореплицированного 5’-конца линейной хромосомы и синтез на этом концевом участке теломерной ДНК с помощью теломеразы. Потеря концевых послед-тей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки. Другими словами - процесс укорочения теломер и есть тот часовой механизм, который определяет репликативный потенциал "смертной" клетки, и когда длина теломер становится угрожающе короткой, этот механизм предотвращает дальнейшее деление клетки. В нестареющих клетках (а к ним кроме раковых относятся зародышевые, стволовые и другие генеративные клетки) должна сущ-ть специализированная ферментативная система, кот. контролирует и поддерживает длину теломерной ДНК. Вскоре был выделен фермент, который с помощью механизма, отличного от механизма реакций, лежащих в основе репликации ДНК, синтезирует теломерную ДНК – теломераза. Как работает ТЕЛОМЕРАЗА Основное назначение теломеразы - синтезировать тандемно повторяющиеся сегменты ДНК, из кот. состоит G-цепь теломерной ДНК. Т.о., она относится к классу ДНК-полимераз, причем оказалось, что теломераза - это РНК-зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза. Ферменты этого класса закодированы и содержатся в ретровирусах (в вирусе иммунодефицита человека, вызывающем СПИД) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, кот. в ретровирусе представлен РНК. В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах. РНК, используемая теломеразой для синтеза теломерной ДНК в качестве матрицы, входит в состав этого фермента. В этом уникальность теломеразы: на сегодня это единственная известная РНК-содержащая обратная транскриптаза. Теломеразные РНК у разных организмов сильно различаются по длине и структуре. Теломеразы простейших содержат РНК длиной в 150-200 нуклеотидных остатков (н.о.), длина теломеразной РНК человека 450 н.о., в то время как теломераза дрожжей содержит аномально длинную РНК (около 1300 н.о.). Как и любая другая РНК клетки, теломеразная РНК обладает специфической вторичной и третичной структурой. Вторичная структура изолированной теломеразной РНК достоверно установлена только для теломераз простейших. Пространственная структура теломеразной РНК в составе ферментативного комплекса пока еще неизвестна. Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК, которые он кодирует и которым он, разумеется, комплементарен. Так как теломераза синтезирует сегменты ДНК, повторяющиеся много раз, используя только один сегмент своей РНК, она должна обладать способностью периодически (после завершения синтеза каждого повтора) перемещать (транслоцировать) матричный участок в район 3'-конца синтезируемой теломерной ДНК. Источником энергии для такого перемещения служит сама реакция синтеза цепи теломерной ДНК, т.к. дезоксинуклеозидтрифосфаты - субстраты этой реакции - высокоэнергетические вещества. На рис. 2 изображена общепринятая схема механизма синтеза теломерных повторов, катализируемого теломеразой. На первой стадии теломераза находит 3'-конец теломерной ДНК, с которым часть матричного участка теломеразной РНК образует комплементарный комплекс. При этом теломераза использует 3'-конец хромосомной ДНК в качестве праймера. Далее наступает очередь РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности теломеразы. Она обеспечивается специальной субъединицей теломеразы, которая по устройству своего каталитического центра во многом сходна с обратными транскриптазами ретровирусов и ретротранспозонов. Когда синтез ДНК-повтора заканчивается, происходит транслокация, то есть перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломерной ДНК, и весь цикл повторяется вновь. Схематичным описание механизма теломеразной реакции (рис. 2) приводит к заключению, что двумя компонентами - обратной транскриптазой и теломеразной РНК - для ее осуществления обойтись нельзя. В его составе должны быть субъединица, отвечающая за поиск и связывание 3'-конца хромосомы (и выполняющая таким образом своеобразную якорную функцию); субъединица, ответственная за транслокацию; субъединицы, связывающие продукт реакции (однотяжевую ДНК). В составе теломеразы обычно обнаруживается и белковая субъединица с нуклеазной активностью, которая отщепляет от 3'-конца теломерной ДНК один за другим несколько нуклеотидов до тех пор, пока на этом конце не окажется послед-ть, комплементарная нужному участку матричного сегмента теломеразной РНК. Эти субъединицы теломеразы, выполняющие разнообразные функции в ходе синтеза G-цепи теломерной ДНК, изображены на рис. 3, на котором приведена гипотетическая структура теломеразы дрожжей. Полный белковый состав фермента не известен до сих пор. С-цепь теломерной ДНК синтезируется с помощью обычной ДНК-полимеразы (рис. 1). Поэтому 3'-концевой участок G-цепи, на котором первоначально была РНК-затравка, в конечном итоге остается в однотяжевом состоянии (то есть в принципе он готов к тому, чтобы теломераза нарастила на нем новый повтор). 4. Охар-те стр-ру лактозного оперона и механизм его регуляции с помощью белков репрессоров и активаторов. Регуляция транскрипции у прокариот. У бактерий существуют ферменты 3-х типов: а) конститутивные, которые присутствуют в клетках в постоянных количествах, независимо от их метаболического состояния; б) индуцибельные – их количество в клетках при обычных условиях незначительно, но может увеличиваться в сотни и тысячи раз, если в культуральную среду добавлять субстраты этих ферментов; в) репрессабельные – ферменты, синтез которых в клетке прекращается при добавлении в среду конечных продуктов тех метаболических путей, где функционируют эти ферменты. На основании этих фактов и была сформулирована теория оперона. 1961 г. – Ф. Жакоб и Ж. Моно открыли механизм регуляции генетического кода на бактериях. E. coli и получил название механизма индукции-репрессии. Согласно теории французских ученых, гены прокариот в геноме группируются вместе в структурные единицы (опероны) – участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о группе функционально взаимосвязанных структурных белков, и регуляторную зону, контролирующую транскрипцию этих генов. Опероны бывают индуцибельные и репрессабельные. 1. Индуцибельные Индуктор (активатор) – небольшая молекула, которая запускает транскрипцию в результате взаимодействия с регуляторным белком – репрессором, блокирующим оператор и не дающим РНК-полимеразе транскрибировать структурные гены. Обычно исходный субстрат метаболического пути 2. Репрессабельные Корепрессор – небольшая молекула, которая запускает репрессию в результате взаимодействия с неактивным белком-репрессором, который переходит в активную форму. В его отсутствии белок-репрессор имеет низкое сродство к оператору и не мешает считыванию структурных генов. При накоплении конечного метаболита, определенное его количество связывается с белком-репрессором, который приобретает повышенное сродство к оператору и блокирует транскрипцию генов. Регулятор-конечный метаболит. Лактозный оперон (lac оперон) — кодирующий гены метаболизма лактозы. полицистронный оперон бактерий, Молочный сахар лактоза – менее ценный продукт питания, чем глюкоза, поэтому в присутствии глюкозы сбраживание лактозы является невыгодным для бактерии процессом. Однако при отсутствии глюкозы бактерия вынуждена переходить на питание лактозой. Лактозный оперон состоит из трех структурных генов, промотора, оператора и терминатора. Принимается, что в состав оперона входит также ген-регулятор, который кодирует белокрепрессор и ген, кодирующий белок CYA. Структурные гены лактозного оперона — lacZ, lacY и lacA: lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, кот. расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу. lacY кодирует β-галактозид пермеазу, мембранный транспортный белок, который переносит лактозу внутрь клетки. lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу, фермент, переносящий ацетильную группу от ацетил-КoA на бета-галактозиды. Промотор служит для присоединения РНК-полимеразы к молекуле ДНК с помощью комплекса CAP-цАМФ (CAP – специфический белок; в свободной форме является неактивным активатором; цАМФ – циклоаденозинмонофосфат – циклическая форма аденозинмонофосфорной кислоты). Оператор способен присоединять белок–репрессор (который кодируется соответствующим геном). Если репрессор присоединен к оператору, то РНК-полимераза не может двигаться вдоль молекулы ДНК и синтезировать иРНК. Терминатор служит для отсоединения РНК-полимеразы после окончания синтеза иРНК, соответствующей ферментам Z, Y, А, необходимым для усвоения лактозы. Существуют негативная и позитивная регуляция транскрипции. Негативная регуляция цАМФ образуется из АТФ ферментом аденилатциклазой. Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ. Глюкоза активирует второй и инактивирует первый фермент. Чем больше в клетке глюкозы, тем меньше цАМФ. (Глюкоза ~ 1/цАМФ; CYA (adenylate cyclase gene) - аденилатциклаза) Если в клетке имеется глюкоза, то белок CYA вступает с ней в реакцию и переходит в неактивную форму. Когда же глюкоза отсутствует в среде, то увеличивается концентрация цАМФ, который связывается с ДНК в самом начале промотора непосредственно пред сайтом связывания РНК-полимеразы и способен почти в 50 раз усиливать транскрипцию оперона. Благодаря этому механизму бактерии оптимизируют энергетические затраты, синтезируя ферменты метаболизма лактозы не постоянно, а лишь тогда, когда клетке это необходимо. Итак, глюкоза является репрессором. Позитивная регуляция. Активная форма lac-репрессора представляет собой гомотетрамер, который связывается с зоной оператора и блокирует действие РНК-полимеразы. При избытке лактозы, её молекулы связываются с субъединицами репрессора с образованием репрессор-индукторного комплекса, в котором индуктор (лактоза) выступает в роли аллостерического регулятора, изменяющего конформацию белка-репрессора, что ведёт к инактивации последнего. У инактивированного репрессора резко снижается сродство к зоне оператора, в результате чего репрессор отсоединяется от промотора, открывая «вход» для РНК-полимеразы. Вслед за этим начинается транскрипция оперона, а затем и синтез ферментов, метаболизирующих лактозу. Другими словами, если в клетке имеется лактоза, то она взаимодействует с белком– репрессором и превращает его в неактивную форму. Белок–репрессор, связанный с лактозой, не может присоединиться к оператору и не преграждает путь РНК-полимеразе. Итак, лактоза является индуктором. 5. Процессинг первичных транскриптов эукариотических генов. Зрелые молекулы рРНК и тРНК образуются у прокариот и эукариот в результате эндо- и экзонуклеазных воздействий на их предшественники. У эукариот в некоторых случаях вырезаются интроны из пре-рРНК и пре-тРНК Гены рРНК и тРНК образуют транскрипционный блок Спейсер – это участок ДНК между генами РНКазы- ферменты, которые разрезают молекулы РНК Молекулы 5S, 16S и 23S рРНК синтезируются в составе общего первичного транскрипта. В спейсерных участках между генами 16S и 23S рРНК расположены гены тРНК РНКаза III участвует в процессинге пре- рРНК у бактерий, В процессинге пре- тРНК у бактерий участвует РНКаза P и РНКаза D РНКаза Р является рибозимом, т.к. содержит собственную РНК, которая обладает эндонуклеазной активностью. Этапы процессинга тРНК прокариот: Модификация 5’ – конца - РНКаза Р Модификацию 3’ – конца осуществляет РНКаза D Модификация некоторых азотистых оснований и формирование зрелой структуры тРНК Этапы процессинга тРНК дрожжей (эукариоты) Удаление интрона Вырезание 5’ конца (лидер) Удаление УУ с 3’конца Присоединение ССА к 3’концу -тРНК Модификация азотистых оснований Процессинг рРНК эукариот Транскрипционный блок содержит гены 18S ; 5,8S; 28S - рРНК, разделенные спейсерами три зрелые молекулы рРНК образуются при расщеплении спейсеров эдонуклеазой Некоторые эукариоты содержат интрон в 28S пре- рРНК, который вырезается (аутосплайсинг) и образуется 26S рРНК 6. Охарактеризуйте ДНК-транспозоны эукариот: структура, механизм перемещения, представители. Отдельные фрагменты ДНК, имеющие специальную структурную организацию, могут перемещаться в геноме как в пределах одной хромосомы, так и между хромосомамиподвижные элементы. Подвижные элементы включают от тысячи до десятков тысяч нуклеотидных пар ДНК. Перемещения осуществляются либо путем вырезания элемента из одного места и встраивания его в другое, либо путем образования копии подвижного элемента, внедряющейся в новое место, тогда как родительская копия остается на прежнем месте. В последнем случае будет происходить размножение подвижных элементов, увеличение их числа в геноме. В некоторых случаях подвижный элемент, покидая хромосому, оставляет след своего былого присутствия, локально изменяя нуклеотидную последовательность ДНК. Подвижные элементы, встраиваясь в гены или окрестности генов, вызывают мутации. Транспозоны - семейства повторяющихся элементов ДНК размером от 1 до 20 тыс. п.н., облад. способностью перемещаться в геноме из одного сайта хромосомы в другой сегмент хромосомы или плазмиду. Транспозоны имеются у бактерий, растений и животных. Транспозоны перемещаются с участием комплекса белков, обеспечивающего активность фермента транспозазы, которая узнает элемент и обеспечивает его перенос на новое место. Транспозоны ограничены с двух сторон инвертированными повторами. Инвертир. повторы необх-мы для перемещения элемента, к-рое осуществляется благодаря их сближению друг с другом и узнаванию транспозазами. Инвертир. повторы сближаются и точно отрезаются от соседних участков ДНК хозяина. вырезанию элемента способствует дополнит. сверхспирализация ДНК, обеспечивающая изгибы двойной спирали и сближение отдельных ее участков. Вырезанный транспозон внедряется в район вносимого транспозазой разрыва в молекуле-мишени и сшивается с ДНК хозяина в новом месте. Разрыв и зашивание осуществляются транспозазой и вспомогательными белками. Транспозаза может кодироваться как самим подвижным элементом, который будет перемещаться, так и другой копией элемента, локализованной в том же геноме в отдалении. Брешь в ДНК, оставляемая после вырезания транспозона, может залечиваться - застраиваться с участием гомологичного участка, н-р сестринской, только что редуплицированной молекулы ДНК. Осуществляются комплементарные взаимодействия нитей в гомологичных участках ДНК, соседствующих с транспозоном, затем происходит достройка - синтез комплементарных нитей, после чего образовавшаяся структура разрезается, а участки новосинтезированной ДНК, содержащие материал ДНК транспозона, сшиваются с флангами. В итоге залечивается дырка на месте вырезанного транспозона, а число копий транспозона увеличивается на одну копию. У бактерий обнаружены 2 класса подвижных генов, различающихся по длине и сложности организации: 1) инсерционные последовательности, или IS-элементы, имеющие длину около 1 тыс. п.н. и содержащие только ген, отвечающий за их перемещение 2) элементы длиной от 3 до 20 тыс. п.н., которые кроме гена транспозазы содержат ряд дополнительных генов, отвечающих за устойчивость бактерий к антибиотикам, тяжелым металлам и др. токсическим веществам. Транспозоны могут участвовать в горизонтальном переносе генов; они служат весьма эффективными векторами для искусственного переноса генов и мутагенеза. Бактериальные транспозоны обозначаются буквами Tn, за которыми следует номер типа. Однако, не все транспозоны имеют симметричную структуру. Ту-элементы у дрожжей. Организация транспозона Ту – Он ограничен на концах длинными концевыми повторами (LTR) или дельта (δ). Элементы дельта на 70% состоят из AT последовательностей. Каждый из них имеет промотор и последовательность, опознаваемую ферментами транспозиции. Ту-элемент имеет длину 5,9 т.п.н. и кодирует единственную мРНК длиной 5700 н, старт транскрипции которой находится в промоторе элемента дельты. Матричная РНК имеет открытые рамки считывания, т.е. рамку, начинающуюся со стартового кодона и кончающуюся терминирующим кодоном. Эти две рамки называют ТуА, ТуВ. Генетических маркеров у этого транспозона нет, поэтому следить за его перемещениями трудно. Транспозоны млекопитающих. У млекопитающих в составе генома обнаружено несколько классов умеренно повторенных последовательностей: SINE (short interspersed nuclear sequences) и LINE (long interspersed nuclear sequences). Элементы SINE - это фрагменты длиной 100-300 п.н., чередующиеся с уникальными последовательностями от 1 ООО до 2000 п.н. длиной. Элементы LINE имеют длину более 5 т.п.н., они чередуются с уникальными последовательностями до 35 т.п.н. длиной. Как SINE, так и LINE представлены семействами, состоящими из одинаковых элементов. В геноме человека SINE широко представлено семейством элементов Alu. Члены этого семейства имеют длину 300п.н. и повторены от 300000 до 500000 раз в геноме. Около 3% генома человека приходится на долю этих повторов. 7.Критически оцените ДНК-полимеразы E. coli: размеры, субъединичный состав, ферментативные активности и участие в процессах репликации и репарации. E. coli имеет три ДНК-полимеразы: ДНК полимераза I (pol I). Действует на запаздывающей цепи для удаления РНК-праймеров и дорепликации очищенных мест ДНК. ДНК полимераза II (pol II). Участвует исключительно в процессе репарации ДНК ДНК полимераза III (pol III). Основной фермент репликации ДНК. ДНК pol I – единственная ДНК-полимераза, которая имеет дополнительно 5 ′ 3′ экзонуклеазную активность для удаления РНК-праймера, т.е. продвигаясь вперед, «съедать» нуклеотиды. У Е. coli есть три ДНК- полимеразы — I, II и III (названия даны в порядке их открытия). ДНК-полимераза I — была выделена А. Корнбергом и сотр. в 1958 г. Это одиночный полипептид (мол. масса 109 000 Да) с мультифункциональными активностями, хорошо связывается с одноцепочечной Д Н К или с зонами разрыва фосфодиэфирных связей в биспиральной Д НК . Она обладает ДНК-полимеразной активностью, а также осуществляет гидролиз фосфодиэфирных связей как в одной цепи ДНК, так и на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3'-конца цепи (3'5'-экзонуклеаза). Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5'-конца дуплексной Д Н К в направлении к 3'-концу (5'-3'-экзонуклеаза). Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидной цепи ДНК-полимеразы I. При обработке фермента трипсином полипептидная цепь расщепляется на большой и малый фрагменты. Большой, Сконцевой фрагмент («фрагмент Кленова») сохраняет ДНК-иолимеразную и 3'- 5'экзонуклеазную активности; малый, N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'экзонуклеазной активностью. ДНК-полимераза I и присущие ей экзонуклеазные активности играют большую роль в репликации и репарации хромосомной Д НК Е. coli. Экзонуклеазная активность 3'-5' обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем ДНК-полимеразу I, то при репликации генома часто происходят мутации — замены оснований. Экзонуклеазная активность 5'- 3' осуществляет разрушение праймера, необходимого для синтеза фрагментов Оказаки. В клетке Е. coli имеется несколько сотен молекул ДНК-полимеразы I. В целом ДНКполимераза I имеет большее отношение к созреванию реплицирующейся Д Н К , чем непосредственно к полимеразным процессам в репликативной вилке. ДНК-полимераза II (мол. масса 90 кДа) — представлена одной полипептидной цепью, обладающей полимеразной и 3'-5'-экзонуклеазной активностями. Она плохо соединяется с одноцепочечными ДНК, но лучше работает с биспиральной ДНК, имеющей одноцепочечные бреши длиной в несколько десятков нуклеотидов, обладает лишь 10%-й ДНК-полимеразной активностью по сравнению с ДНК-полимеразой I. Предполагают, что основной функцией ДНК-полимеразы II является достраивание поврежденных участков в молекуле ДНК, т.е. репарация ДНК. ДНК-полимераза III (мол. масса 103 кДа) — играет главную роль в репликации ДНК у Е. coli. В каждой клетке содержится только 10—20 копий фермента, приблизительно столько же, сколько репликативных вилок. ДНК-полимераза I I I является основным компонентом мультиферментного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза I I I состоит из десяти типов субъединиц (α, β,γ, δ, δ’, ε, θ, τ, χ, ψ). Репликацию проводит полная форма фермента — холофермент, содержащий все субъединицы. Холофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, в связи с чем для репликации отстающей цепи необходимо участие Д Н К - полимеразы I. Полимеразную реакцию осуществляет каталитический кор из α, ε, θ - субъединиц, в котором α -субъединина обладает полимеразной активностью, ε -субъединица — 3'-5'-экзонук-леазной активностью, функция θ -субъединицы пока неясна. Помимо субъединиц, составляющих полимеразный кор, ДНК-полимераза III-холофермент содержит еще семь субъединиц (β,γ, δ, δ’, τ, χ, ψ). Эти полипептиды существуют во множестве копий, являются рсгуляторными и усиливают действие каталитического ядра (кора) ДНК-полимеразы I I I . Отличительная черта холофермента ДНК-полимеразы I I I — исключительно высокая процессивность. Мерой процессивности является длина фрагмента вновь синтезированной макромолекул ы , которую комплекс (или индивидуальные ферменты) способен образовывать в одном цикле, не диссоциируя от матрицы. Установлено, что холофермент ДНК-полимеразы I I I синтезирует ведущую цепь Д НК длиной в 50000 нуклеотидов со скоростью более 500 нуклеотидов в секунду в одном цикле, ни разу не диссоциируя от ДНКматрицы. 8 Критически оцените основные свойства генетического кода. Генетический код — способ кодирования аминокислотной последовательности белков при помощи последовательности нуклеотидов. Как только в 1953 г. появилась знаменитая двойная спираль Уотсона и Крика, сразу же возник вопрос: как эта запись прочитывается и используется в клетке? В 1954 году Георгий Гамов сформулировал проблему генетического кода, т.е. задолго до открытия самой мРНК. Размышляя над тем, как линейная последовательность 4-х различных нуклеотидов может определить последовательность 20 разных аминокислот в белке, Гамов предположил, что генетически код является триплетным. Он же поставил вопрос и о других свойствах генетического кода: 1.Триплетность. Одну аминокислоту кодирует последовательность из трех нуклеотидов, названная триплетом, или кодоном. 2. Вырожденность. Каждая аминокислота зашифрована более чем одним кодоном. Исключение составляют аминокислоты метионин и триптофан. Каждая из них кодируется только одним триплетом. Для кодирования 20 аминокислот используется 61 комбинация нуклеотидов. Триплет АУГ, кодирующий метионин, называют стартовым. С него начинается синтез белка. Три кодона (УАА, УАГ, УГА) несут информацию о прекращении синтеза белка. Их называют триплетами терминации. 3. Универсальность. Одни и те же триплеты кодируют одинаковые аминокислоты. 4. Однозначность. Каждый триплет кодирует только одну аминокислоту. Исключение составляет кодон AUG. У прокариот в первой позиции (заглавная буква) он кодирует формилметионин, а в любой другой - метионин. 5. Колинеарность – совпадение последовательностей аминокислот в синтезируемой молекуле белка с последовательностью триплетов в и–РНК. 6. Непрерывность — между триплетами нет знаков препинания, то есть информация считывается непрерывно. 7. Неперекрываемость — один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух или более триплетов. 8*. Однонаправленность – текст читается только в направлении 5’→3’. 9. Опишите схематично аминоацилирование тРНК: механизм действия аминоацилтРНК-синтетаз. Для трансляции четырехбуквенного языка ДНК и мРНК в 20-ти аминокислотный язык белков необходимы тРНК и ферменты, называемые аминоацил-тРНК-синтетазы. Чтобы принять участие в белковом синтезе молекула тРНК должна: 1) химически связаться с аминокислотой посредством высокоэнергетичной связи , т.е. должна быть образована аминоацил-тРНК (рис.35-1). 2) Затем антикодон этой аминоацил-тРНК связывается с кодоном в мРНК так, чтобы активированная аминокислота могла быть присоединена к растущей полипептидной цепи (рис.35-2). Определение: аминоацилирование - это образование связи между аминокислотой и tPHК. Аминоацилирование: аминокислота + АТФ → аминоацил-АМФ + PPi — АТФ активирует аминокислоту аминоацил-AMФ + тРНК → аминоацил-тРНК + АМФ — активированная аминокислота соединяется с соответствующей тРНК Суммарное уравнение двух реакций: аминокислота + тРНК + АТФ → аминоацил-тРНК + АМФ + PPi- Сначала в активном центре синтетазы связываются соответствующая аминокислота и АТФ. Из трёх фосфатных групп АТФ две отщепляются, образуя молекулу пирофосфата (PPi), а на их место становится аминокислота. Образованное соединение (аминоацил-аденилат) состоит из ковалентно связанных высокоэнергетической связью аминокислотного остатка и АМФ. Энергии, содержащейся в этой связи, хватает на все дальнейшие этапы, необходимые для того, чтобы аминокислотный остаток занял своё место в полипептидной цепи (то есть в белке). Аминоацил-аденилаты нестабильны и легко гидролизуются, если диссоциируют из активного центра синтетазы. Когда аминоацил-аденилат сформирован, с активным центром синтетазы связывается 3'-конец тРНК, антикодон которой соответствует активируемой этой синтетазой аминокислоте. Происходит перенос аминокислотного остатка с аминоациладенилата на 2'- либо 3'-ОН группу рибозы, входящей в состав последнего на 3'-конце аденина тРНК. Таким образом синтезируется аминоацил-тРНК, то есть тРНК несущая ковалентно присоединённый аминокислотный остаток. От аминоацил-аденилата при этом остаётся только АМФ. И аминоацил-тРНК, и АМФ освобождаются активным центром. В бактериальных кдетках обнаружено около 40 различных тРНК и приблизительно 50-100 тРНК в клетках растений и животных. Таким образом, число тРНК в большинстве клеток с одной стороны превышает число аминокислот, используемых в синтезе,а с другой стороны, отличается от числа кодонов для аминокислот (61) в генетическом коде. Следовательно, многие аминокислоты могут присоединяться более, чем к одно тРНК (это объясняет, почему число тРНК больше, чем число аминокислот). Обе стадии аминоацетилирования осуществляются ферментом аминоацил-tРНК-синтетазой (APC-азой, кодазой). Существует 20 вариантов кодаз (по числу аминокислот). У каждой кодазы 3 центра опознавания. Каждая АРС-аза узнает третичную структуру tРНК. Определение: tРНК, имеющие разную первичную, но одинаковую третичную структуру, акцептируют одну и ту же аминокислоту и называются изоакцепторными tРНК. 10. Опишите механизм общей (гомологичной) рекомбинации. Генетическая рекомбинация-процессы, приводящие к перераспределению нуклеотидных последовательностей в геномах. Эти процессы лежат в основе генетической изменчивости, позволяющей организмам приспосабливаться к окружающей среде. Доказательства обмена генами между хромосомами были впервые получены Т.Х.Морганом в 1919 году. Генетическую рекомбинацию подразделяют на 2 класса: общую рекомбинацию и сайтспецифичную. В ходе обшей рекомб-и обмен ген. материалом происходит м/у гомолог. нуклеотидными последовательностями ДНК, чаше всего м/у 2 копиями одной и той же хромосомы. (пример такого рода рекомб-и — это обмен участками гомолог. хромосом в процессе мейоза.). У прокариот, не обладающих мейозом, тем не менее также наблюдается общая рекомбинация, приуроченная к митотическому делению. В процессе рекомбинации у Е. coli принимают участие несколько белков, обеспечивающих поиск и гомологичную рекомбинацию послед-й ДНК. Белок RecBCD присоединяется к двойной спирали ДНК и движется вдоль молекулы, осущяя ее расплетание в поиске сайта рекомб-и. Этот белок дей-т как хеликаза, расплетая двойную спираль ДНК и перемешается вдоль нее со скоростью 300 нуклеотидов в сек. пока не обнаружит консенсусную восьмиуклеотидную последовательность в сайте рекомб-и. Затем белок RecBCD, действуя как нуклеаза, осуществляет разрыв в одной из цепей ДНК, в результате чего высвобождается одноцепочечный участок ДНК, который может провзаимодть с комплементарным участком др. молекулы ДНК. Для комплементарного взаимод-я высвободившийся участок одной из цепей ДНК, называемый «ус», поддерживается в вытянутом состоянии с помощью SSB-белка. В ходе рекомб-и SSB-белок действует в комплексе с белком RecA. Белки RecBCD и RecA также обладают ДНК-зависимой АТРазной активностью. Так же как SSB-белок, белок RecA присоединяется к взаимод-м цепям ДНК в виде групп молекул (кластеров), и совокупное действие этих 2х белков создает условие для эффективной рекомб-и. В точке рекомб-и возникает гетеродуплексное (ступенчатое) соединение молекул ДНК, кот-е может включать взаимод-е нескольких тысяч пар оснований. Затем происходит разрыв в др. цепи ДНК, создающий предпосылки для рекомб-и с перекрещиванием цепей. При этом возникает характерная крестообразная структура, предложенная Р. Холидеем в 1964 г., разрыв и сшивание кот-й завершает общую рекомб-ю в отсутствие кроссинговера. Точности разрыва и воссоединения оказываются столь высоки, что ни один нуклеотид не утрачивается и не добавляется, и вместе с тем молекулы ДНК обмениваются значительными по размерам участками, а содержащие их клетки обновляют свой генетический потенциал. Т. О., у эукариот в результате ген. рекомбинации с кроссинговером осущ-ся перемещение из хромосомы в хромосому больших гомолог. последовательностей, однако общая последовательность расположения генов в хромосоме не нарушается. Сайт-специфическая рекомбинация не требует гомологии ДНК. В обмен вступают короткие специфические нуклеотидные последовательности ДНК. При этом изменяется распределение нуклеотидных послед-ей в геноме.