Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий

На правах рукописи
СУВОРОВ НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ
Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку
лейкозных клеточных линий
14.00.36 – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2007
Работа выполнена в Институте биоорганической химии имени академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор Михайлова А.А.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Ярилин А.А.
доктор биологических наук, профессор Стенина М.А.
Ведущая организация:
ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН
Защита диссертации состоится « 29 » _мая_ 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском
университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, дом 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета
Автореферат разослан «14» апреля 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
Кандидат медицинских наук
Кузнецова Т.Е.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Известно, что нарушение процессов пролиферации и дифференцировки клеток в
костном мозге приводит к развитию тяжелых, а часто и неизлечимых заболеваний. К
таким заболеваниям относятся различные типы лейкозов, в частности острые нелимфобластные (ОЛ или ОНЛЛ) и хронические (ХЛ). Это объясняет важность проблемы
поиска новых дифференцировочных факторов, особенно эндогенной природы, которые могли бы быть использованы в комплексной противолейкозной терапии.
ОЛ встречаются в разных странах с частотой от 2 до 4 на 100 000 населения в
год. У детей лейкозы являются наиболее частым злокачественным новообразованием
(38-40%), они обуславливают высокую летальность, уступая первое место среди причин смертности у детей старше 2 лет лишь травмам. Частота лейкозов у детей составляет 3.2-4.4 на 100 000. У взрослых на долю ОНЛЛ приходится 80% среди всех острых
лейкозов. Заболеваемость ОНЛЛ увеличивается с возрастом, достигая частоты 10-15
на 100 000 в год в популяции старше 65 лет. ОЛЛ составляют лишь 20% среди всех
острых лейкозов взрослых. Мужчины и женщины заболевают с равной частотой.
[Liesner RJ, Goldstone AH., 1997] В настоящий момент основой терапии всех ОНЛЛ,
кроме варианта М3 (острый промиелоцитарный лейкоз), является сочетание различных методов химиотерапии.
Наряду с химиотерапией, приводящей к гибели опухолевых бластов, получает
развитие терапия, вызывающая дифференцировку незрелых опухолевых клеток. Однако, следует отметить, что таких препаратов в настоящее время сравнительно мало.
Так, терапия острого промиелоцитарного лейкоза основана на применении производных витамина А (ATRA) и As2O3, вызывающих созревание лейкозных клеток. Ведутся активные исследования других соединений, потенциально способных к их использованию в клинике – это производные витамина D, Е, сАМР, препараты на основе цитокинов и др. Однако, применение дифференцировочной терапии и противоопухолевых препаратов часто сопровождается развитием побочных реакций. В связи с этим
возрастает потребность в препаратах, применение которых в комплексной терапии
лейкозов останавливает рост опухолевых клеток, вызывает их дифференцировку и в
тоже время оказывает минимальный побочный эффект.
В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р.В.
Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга –
миелопептиды (МП) (Petrov R.V., Mikhailova A.A., 1972,). МП синтезируются клетка-
ми костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами
или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть
использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Среди выделенных
МП имеются два пептида, обладающие способностью индуцировать терминальную
дифференцировку клеток линий миелобластного и эритробластного лейкозов HL-60 и
К-562. МП-4 и МП-6 увеличивают уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD14, CD38 и CD44, снижают уровень пролиферации бластных клеток, вызывают
характерные морфологические изменения. Это указывает на перспективу использования их в комплексной терапии лейкозов, однако, остаются неясными вопросы относительно механизма их действия на опухолевые клетки.
2. Цели и задачи
Целью данной работы является изучение дифференцировочной активности миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и K-562 и анализ
возможных механизмов действия этих пептидов.
В рамках данной работы решались следующие задачи
1. Изучить дифференцировочные свойства миелопептидов МП-4 и МП-6 на модели
лейкозных клеточных линий HL-60 и К-562 по различным показателям дифференцировочного процесса;
2. Исследовать характер связывания МП-4 с клетками линии HL-60 и оценить возможность его проникновения внутрь клетки;
3. Определить влияние МП-4 на активацию/ингибирование компонентов системы
МАР – киназ в клетках линии HL-60;
4. Изучить роль ионов Са2+ в индукции дифференцировки клеток HL-60 под влиянием МП-4.
Научная новизна
В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование дифференцировочной активности пептидов костномозгового происхождения миелопептидов
МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и К-562 и выявление некоторых механизмов их действия.
4
Установлено, что клетки миело- и эритролейкоза человека под влиянием миелопептидов останавливают свой рост, экспрессируют на своей поверхности ряд дифференцировочных маркеров. Морфологический анализ клеток линии HL-60 выявил достоверное увеличение количества клеток, которые приобрели характерные черты зрелых форм – моноцитов и макрофагов. Показано что под влиянием МП-4 и МП-6 увеличивается функциональная активность клеток линии К-562, что говорит об их созревании.
Впервые показано вовлечение в процесс дифференцировки различных сигнальных путей - компонентов системы МАР киназ – ERK, JNK, p38 как в общей, так и в
фосфорилированной форме. Инкубация HL-60 клеток с МП-4 в течение 72 часов сопровождалась увеличением амплитуды Са2+ ответов на формил пептид, что свидетельствует об изменении состояния дифференцировки этих клеток. В то же время, изменение базального уровня Са2+ в клетках HL-60 под влиянием МП-4 было незначительным и недостоверным, что показывает, что этот пептид практически не влияет на
данный жизненно важный показатель.
В работе установлен факт специфического связывания МП-4 с поверхностью
клеток HL-60, построена кривая полного насыщения для МП-4, рассчитана Kd
=1,3x10-9М. Методом конфокальной микроскопии с использованием ФИТЦ-меченого
МП-4 показано проникновение этого пептида в клетку и его локализация в околоядерной области.
Практическая значимость
Результаты, полученные в данной работе, представляют интерес не только для
фундаментальной науки, но и для возможного использования их в медицине. В настоящее время терапия лейкозов с помощью дифференцировочных агентов является одним из наиболее перспективных направлений в лечении данного вида опухолевых заболеваний.
Понимание механизмов дифференцировочного действия МП-4 и МП-6 на клетки лейкозных линий необходимо для разработки наиболее эффективных методов терапии острых миелобластных лейкозов. Результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых лекарственных средств, вызывающих дифференцировку опухолевых клеток и направленно действующих на определенные компоненты сигнального каскада в опухолевой клетке.
Материалы диссертации доложены: на 5-ом конгрессе РААКИ «Современные
проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на
5
седьмом чтении, посвященном памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004),
на 2-ом всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004), на
международной летней школе для студентов, аспирантов и молодых ученых «Многогранные способы применения специфической иммунотерапии» (Дубровник, 2004,
Хорватия), на международном семинаре «Иммунология для онкологов» (Аскона, 2005,
Швейцария), на 15-й конференции по протеин-киназам «Пространственная и временная регуляция сигнализации» (Осло, 2006, Норвегия).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на _____ страницах машинописного текста, включая ____ таблиц и ____ рисунков. Список цитируемой литературы содержит 141 ссылку.
Материалы и методы.
Пептиды МП-4 и МП-6 были синтезированы методом классической пептидной
химии в ФГУ Российском Кардиологическом Научно-Производственном Комплексе
Росздрава (Москва). ФИТЦ-меченый МП-4 синтезирован в лаборатории медиаторов
иммунной системы ИБХ РАН.
Культивирование клеток.
Культивирование клеток линии HL-60 (миелобластный лейкоз человека) и К-562
(эритробластный лейкоз) проводили в стандартной среде RPMI-1640 (ICN, США), содержащей 7% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO, Англия), 20мМ HEPESбуфер (Flow Laboratories, Англия), 2мМ L-глутамина Flow Laboratories, Англия) и 50
мкг/мл гентамицина (Брынцалов Ферейн, Россия). Клетки культивировали в полистироловых флаконах в СО2-инкубаторе при температуре 37оС во влажной атмосфере и
5% СО2. Клетки поддерживались в логарифмической фазе роста. МП-4 и МП-6 добавляли к клеткам в различной концентрации и инкубировали в течении 72 часов.
Оценка пролиферативного ответа клеток линии HL-60 и К-562.
Клетки лейкозных клеточных линий культивировали в атмосфере 5% СО2 при
37С в 24-х луночном планшете в количестве 50 тысяч клеток на лунку в объеме 1 мл
в течении 72 часов. После чего клетки переносили в 96-ти луночный планшет в объеме
200 мкл на лунку и добавляли 3Н-тимидин (Радиевый институт им. В.Г. Хлопнева) –
5мк Ки/мл на 4 часа. После окончания инкубации планшет охлаждали до -28С, чтобы
разрушить мембраны клеток. Содержимое каждой лунки при помощи харвестера переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа. Фильтры помещали в от6
дельные флаконы со сцинтилятом и ставили на счет. Измерение проводили на жидкостном сцинтиляционном счетчике (LKB, Sweden). Для количественной оценки реакции использовали абсолютную величину включения радиоактивной метки (число импульсов в минуту).
Морфологический анализ.
Морфологию клеток HL-60 определяли на 8 сутки ведения культуры (после
3 сут. воздействия миелопептидов). Готовили мазки клеток на покровных стеклах,
фиксировали метанолом в течение 5 мин. и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Подсчет промоноцитов, моноцитов и макрофагов проводили под иммерсией
на микроскопе Leitz (Германия).
Цитофлуориметрический анализ.
Действие МП-4 на фенотип клеток изучали по изменению уровня экспрессии антигенов зрелых клеточных форм – CD14 [Bufler P, Stiegler G, et al., 1995] и CD38
[Malavasi Fabio, Funaro Ada, et al., 1994] - для клеток линии HL-60 и CD44 [Mallinson
G., Soo KS, et al., 1995] - для клеток линии К-562. В качестве контролей использовали
известные факторы терминальной дифференцировки клеток ФМА (форболмиристил
ацетат) и ДМСО (диметилсульфоксид) соответственно. Клетки, взятые в логарифмической фазе роста (3 сут), культивировали в 24-луночных планшетах в стандартной
среде RPMI-1640 в присутствии МП-4 (дозы от 10; 1; и 0,1 мкг/мл) 3-ое суток, затем
заменяли среду на свежую и продолжали культивирование без МП-4 еще 3 суток.
Суспензии клеток отмывали в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% фетальной
сыворотки. Отмытые клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера и во все пробы (кроме контроля) добавляли ФИТЦ-меченые моноклональные антитела (мАТ) в количествах, рекомендованных фирмой-изготовителем. Инкубация с мАТ проходила в течение 40 минут на льду. Далее суспензии клеток дважды отмывали буфером и проводили анализ флуоресценции окрашенных клеток на лазерном проточном цитофлуориметре EPICS "ELITE" (Coulter Electronics Inc., США) [Дамбаева С.В., Мазуров Д.В., и
др., 2002].
Определение гемоглобина в клетках линии К-562 (бензидиновый тест).
Функциональную активность клеток К-562 оценивали в бензидиновом тесте.
Суспензии клеток К-562 отмывали дважды, затем к осадкам добавляли по 350 мкл деионизованной Н2О (проводили гемолиз), пробы встряхивали на шейкере и сразу же
центрифугировали. Для измерения использовали надосадочные жидкости, содержащие гемоглобин. Реакцию проводили, исходя из следующих количеств реагентов: 150
7
мкл бензидина, 150 мкл Н2О2 и 150 мкл анализируемого раствора. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Beckman при длине волны =610 нм.
Определение уровня апоптоза в культуре клеток линии HL-60.
Клетки линии HL-60 культивировали в 24-х луночном планшете в СО2инкубаторе с пересевом 1 раз за 2 суток. Исходная концентрация клеток составляла
2.105/мл. Для изучения индуцирующего влияния МП-4 на апоптоз, клетки после пересева инкубировали в течение суток, МП-4 добавляли в фазе экспоненциального роста
клеток. Оценка количества клеток, вступивших в апоптоз, проводилась цитофлуориметрическим методом на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США)
по общепринятой методике. [Telford W.G., King L.E. et al.,1994] После окончания инкубации с МП-4, клетки переводили в РМ-16/HEPES, на холоду фиксировали в EtOH
(70%, 40С), дважды отмывали в РМ-16/HEPES (300 g, 10 мин, 40С). Затем клетки ресуспендировали в растворе для окрашивания ДНК (РМ-16, содержащий 20 мкг/мл PI и
1 мг/мл РНКазы). Регистрировали флуоресценцию не менее 1.104 клеток. На гистограммах апоптотические клетки дифференцировали от живых по более низкой интенсивности флуоресценции.
Определение уровня внутриклеточного [Ca2+]I в клетках линии HL-60.
Для измерения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ ([Ca2+]i), клетки HL-60
прокрашивали флуоресцентным красителем. Для этого 1 мкл Fura-2AM (1 мМ) добавляли к 2 мл суспензии клеток в среде Хенкса (10-12х106 клеток) в кварцевой термостатируемой кювете с тефлоновой магнитной мешалкой. Суспензию инкубировали в течение 30 мин при температуре 37оС. Затем краситель отмывали 2 раза центрифугированием (5 мин при 700 g). Отмытые клетки доводили до концентрации 1х106 клеток на
мл. Каждая проба содержала 2 мл суспензии клеток. Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 (ex 340 нм и 380 нм, em 505 нм).
Уровень [Ca2+]i определяли как описано в работе [Grynkiewicz G., Poenie P, et al.,
1985]. Fmax и Fmin измеряли при использовании дигитонина (100 мкМ) и EGTA (10
мМ).
Определение активности MAP-киназ в клетках линии HL-60.
Методом иммуноферментного анализа ELISA проводили измерение активности компонентов общей и фосфорилированной формы MAP-киназ – ERK, JNK и p38.
В эксперименте использовали клетки линии HL-60, проинкубированные с МП-4 или
МП-6 в различных концентрациях в течение 72 часов и контрольные клетки. Измерение проводили в соответствии с инструкцией, прилагавшейся к каждому набору ELISA.
8
Определение связывания МП-4 с клетками HL-60.
Цитофлуориметрический анализ
Клетки отмывали центрифугированием (2 раза при 1000 об/мин 3-5 мин. и готовили суспензию клеток 1х106/мл в PBS - буфере (ICN, USA), содержащим 1% ЭТС.
Образцы (200.000 клеток на образец) инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в концентрациях
10-7 - 10-11 М в течение 40 мин на холоду (+40С). После этого надосадочную жидкость
отделяли центрифугированием (1000 об/мин 5-7 мин), далее клетки дважды промывали буфером, ресуспендировали и анализировали свечение на проточном цитофлуориметре EPICS-5 (Coulter Electronics Inc., USA). При изучении конкурентного вытеснения метки, предварительно отмытые от среды клетки линии HL-60 в PBS, содержащие
1% ЭТС, инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в концентрации 10 нМ (40 мин, +40С). Далее
образцы инкубировали с немечеными МП-4 или МП-3 в концентрациях от 10 до 100
нМ в течение 40 мин (+40С). После второй инкубации клетки дважды отмывали центрифугированием (1000 об/мин, 5-7 мин) и анализировали в проточном цитофлуориметре.
Определение способности МП-4 проникать внутрь клетки.
1. Методом цитофлуориметрического анализа.
Клетки линии HL-60, собранные в количестве 0,5-106 инкубировали с ФИТЦ-МП4 в течение 40 минут в присутствии различных ингибиторов метаболизма и эндоцитоза, таких как низкая температура, азид натрия, хлорид аммония, нокодазол. Непосредственно перед измерением флуоресценции к суспензии клеток добавлялся 5 мкл 1М
раствора дитионита натрия, для того, чтобы погасить флуоресценцию с поверхности
клетки. [Drin G, Cottin S, et al., 2003]. Флуоресценцию измеряли на проточном цитофлуориметре EPICS-5 (Coulter Electronics Inc., USA).
2. Методом конфокальной микроскопии.
Для определения способности МП-4 проникать внутрь клетки использовали метод конфокальной микроскопии. Клетки линии HL-60 рассаживали в 96-луночные
планшеты по 100000 клеток в 100 мкл на лунку в стандартной среде для культивирования, содержащей 10% ЭТС. Далее к клеткам добавляли ФИТЦ-МП-4 в концентрации 1 нМ и инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре 37оС в атмосфере 5%
СО2 в течение 10, 30 и 40 мин. Из клеток, инкубированных 10 мин, сразу готовили образцы на стеклах для просмотра в микроскопе Carl Zeiss (Germany) под объективом
Plan-Neofluar 100x/1.3 oil Ph 3. Клетки, инкубированные в течение 30 и 40 мин, перед
приготовлением образцов для микроскопии сначала отмывали центрифугированием
9
(10 мин, 1000 об/мин). Кроме этого, готовили образцы клеток HL-60, которые наблюдали под микроскопом сразу после добавления ФИТЦ-МП-4 (1 мин).
Результаты исследований
1. Влияние МП-4 и МП -6 на дифференцировку клеток линии HL-60
Способность МП-4 и МП-6 индуцировать дифференцировку клеток линии HL60 изучали по нескольким параметрам, характеризующим дифференцировочный процесс: по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток, по изменению морфологии клеток, по
изменению уровня экспрессии дифференцировочных антигенов, по изменению функциональной активности клеток.
1.1. Влияние МП-4 и МП-6 на синтез ДНК в клеточной линии HL-60.
Влияние МП-4 и МП-6 на метаболизм клеток линии HL-60 определяли по
включению 3Н-тимидина в ДНК клеток. В качестве положительного контроля был
взят РМА в стандартной концентрации 10 нг/мл. В табл. 1 результаты представлены в
имп/мин,  10-3 и в процентах от контроля.
Концентрации агентов, добавляемых к клеткам HL-60, мкг/мл
Включение [3Н] тимидина
Таблица 1. Влияние
МП-4 и
имп/мин  10-3
% от контроля
6,0  0,9
100
включение
2,6  0,2**
43
тимидина
МП-4 10
4,3+0,9
71
МП-4 5
4,2+0,9
70
МП-4 1
2,7+0,4
44
МП-6 50
4,2  1,0*
69
МП-6 10
4,6  0,2**
76
МП-6 1
6,2  0,7
103
4,5  0,3**
75
контроль
РМА (10 нг/мл)
МП-6 0,1
МП-6 на
3
в
Н-
ДНК
клеток линии HL-60.
*-р<0,05; **-р<0,01
Из таблицы 1 видно, что действие форболового эфира (положительный контроль) приводило к подавлению синтеза ДНК в клетках до 43% от контрольного уровня. Оптимальный эффект МП-4 проявился при концентрации пептида 1 мкг/мл. При
данной концентрации происходило снижение синтеза ДНК до 44% по сравнению с
контролем. Влияние МП-6 на клетки HL-60 в концентрациях от 50 до 0,1 мкг/мл также
вызывало снижение уровня синтеза ДНК: при дозах пептида 100, 50, 10 и 0,1 мкг/мл
наблюдалось подавление до 68, 69, 76 и 75% от контроля соответственно. При меньших концентрациях МП-6 от (0,01 до 0,0001 мкг/мл) эффект был недостоверным.
10
1.2. Влияние МП-4 и МП-6 на морфологию клеток линии HL-60.
Для количественного определения зрелых клеток после воздействия МП-4 был
использован метод визуальной оценки - подсчета клеток в мазках. Морфологический
анализ показал (табл. 2), что при всех использованных концентрациях МП-4 – 10; 1; и
0,1 мкг/мл наблюдалось увеличение количества моноцитов в 2,6; 2,8 и 2,1 раза соответственно. Эти показатели даже превышали эффект действия РМА, использованного
в качестве положительного контроля – он увеличивал количество моноцитов всего в
1,5 раза. Количество макрофагов при всех использованных концентрациях МП-4 увеличивалось в среднем в 2 – 2,5 раза. Следовательно, под влиянием МП-4 в клеточной
линии НL-60 появляются зрелые моноциты/макрофаги, т.е. индуцируется дифференцировочный процесс.
Промоноциты Моноциты
Макрофаги
Табл.2
Увеличение
Контроль
81,0+1,0
16,3+1,5
2,7+0,6
количества
РМА, 10 нг/мл
68,5+8,1*
24,5+3,5**
7,0+1,0*
клеток в клеточной
МП-4, 10 мкг/мл
50,3+8,1**
42,3+6,7**
7,4+1,5**
МП-4, 1 мкг/мл
49,7+1,5***
45,0+3,6***
5,3+1,3*
МП-4, 0,1 мкг/мл
57,5+3,8***
34,8+3,8**
7,7+0,6*
зрелых
линии HL-60 под влиянием МП-4.
* - р<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.
Результаты количественного анализа различных типов клеток в культуре HL60 под влиянием МП-6 представлены в таблице 3. Были исследованы три дозы МП-6
(10; 1 и 0,1 мкг/мл). Наблюдалось увеличение количества моноцитов в 1,5, 1,4 и 1,3
раза по сравнению с контролем, а макрофагов − в 3,1, 2,4 и 2,6 раза соответственно.
Промоноциты
Контроль
81,01,0
РМА, 10 нг/мл
68,58,1*
МП-6, 10 мкг/мл
67,50,7***
МП-6, 1 мкг/мл
71,01,4**
71,53,5*
МП-6, 0,1 мкг/мл
Моноциты
16,31,5
24,53,5**
24,01,4*
22,50,7*
21,52,1*
Макрофаги
2,70,6
7,01,0*
8,50,7**
6,50,7**
7,01,4*
Таблица 3. Увеличение количества зрелых клеток в клеточной линии HL-60 под
влиянием МП-6.
* - р<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001
1.3.Экспрессия дифференцировочных антигенов на поверхности клеток линии
HL-60 под влиянием МП-4 и МП-6
В данном исследовании определяли уровни экспрессии клеточных маркеров,
свойственных зрелым клеточным формам. CD14 и CD38 экспрессируются на моноци-
11
тах и макрофагах и являются признаком дифференцировки этих клеток. [Yalcintepe L,
Albeniz I, et al., 2005].
На рис 1. представлены результаты цитометрического анализа клеток линии HL60 под действием МП-4. Уровень спонтанной дифференцировки в клетках линии НL60 очень невысок: процент CD14 и CD38 позитивных клеток в контроле составляет
2,8% и 2,5% соответственно.
Рис.1
Увеличение
экспрессии CD14 и
CD38 на
клетках
линии HL-60 под
действием МП-4.
РМА увеличивает экспрессию маркеров CD14 и CD38 в 10 и в 14,5 раз по сравнению с контролем. МП-4 в дозе 1 мкг/мл также увеличивает экспрессию антигенов
CD14 и CD38 в 8 и 7 раз соответственно.
Изменение экспрессии CD14 и CD38 на клетках линии HL-60 под влиянием МП-6
концентрация МП-6, мкг/мл
показано на рис.2.
200
182
175
149
150
125
100
161
135
112
123
100
88
100
Рис. 2. Увеличение экспрессия
и CD14 на поверхности
клеток HL-60 под действием
69
75
CD38
МП-6.
50
25
0
k
10
1
0,1
0,01
k
10
1
0,1
0,01
CD 38
CD 14
уровень экспрессии маркеров в % от контроля
Действие МП-6 исследовали в диапазоне концентраций: от 10 до 0,01 мкг/мл.
Было показано, что наиболее выраженным эффектом обладали дозы МП-6 10; 0,1 и
0,01 мкг/мл: они увеличивали синтез CD38 до 182, 135 и 123% от контроля соответственно, а экспрессию CD14 − до 112, 149 и 161%.
12
1.4. Влияние МП-4 на апоптоз клеток линии HL-60
МП-4, добавленный к клеткам HL-60 в концентрации 1мкг/мл, оптимальной для
индукции дифференцировки, значительно увеличивает количество клеток, находящихся в апоптозе. (Рис.3)
% апоптотических клеток
50
40
Рис.3 Влияние МП-4 на апоптоз
30
клеток линии HL-60
20
10
0
-10
-20
0
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10
Концентрация МП-4, мкг/мл
Поскольку конечным этапом дифференцировки клеток является апоптоз, то увеличение количества апоптотических клеток в культуре свидетельствует о появлении
большего количества зрелых клеток под влиянием МП-4.
Таким образом, по различным параметрам показано, что МП-4 и МП-6 являются
дифференцировочными факторами для клеток линии HL-60. Данные пептиды снижают пролиферацию, увеличивая количество зрелых клеток, несущих маркеры дифференцировки CD14 и CD38, повышают процент морфологически зрелых форм и увеличивают количество апоптотических клеток.
2. Влияние МП-4 и МП -6 на дифференцировку клеток линии K-562
Одной из задач исследования было определение дифференцировочной активности МП-4 и МП-6 не только на клетках линии HL-60, но и влияние этих пептидов на
клетки другой лейкозной линии К-562. При этом использовалась часть методов, применяемых для оценки влияния пептидов на клетки HL-60.
2.1. Влияние МП-4 и МП-6 на пролиферацию клеточной линии К-562
Пролиферацию клеток линии К-562 под действием МП-4 также определяли по
влиянию на синтез ДНК в клетке. Так концентрации пептида; 50; 0,1; 0,01 и 0,001 приводили к подавлению синтеза ДНК до, 81, 42, 76 и 72% от исходного уровня соответственно. Это действие сопоставимо с эффектом положительного контроля ДМСО (подавление до 67% от исходного уровня), а МП-4 в дозе 0,1 мкг/мл обладал даже более
сильным эффектом подавления синтеза ДНК по сравнению с ДМСО (табл. 4)
13
Концентрации агентов, добавляемых к клеткам К-562, мкг/мл
Включение [3Н] тимидина
Таблица 4.
имп/мин  10-3
% от контроля
Снижение
про-
4,4  0,2
100
лиферации
кле-
ДМСО (0,5 %)
2,9  0,2***
67
ток
под
ДМСО (0,1 %)
3,8  0,3*
88
влиянием МП-4
МП-4 50
3,5  0,3**
81
МП-4 10
4,2  0,3
96
МП-4 1
4,4  0,6
101
МП-4 0,1
1,8  0,04***
42
МП-4 0,01
3,3  0,3***
76
 (контроль)
К-562
*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001
Изменение метаболизма в клетках линии К-562 под влиянием МП-6, также оценивали по включению радиоактивной метки 3Н-тимидина в ДНК клеток. Как видно из
таблицы 5, МП-6 обладал достоверным подавляющим эффектом на синтез ДНК в широком диапазоне концентраций (от 100 до 0,01 мкг/мл). Эффект всех использованных
доз был соизмеримым с действием положительного контроля − ДМСО, который подавлял синтез ДНК до 77% от контрольного уровня: так для концентраций 100; 50; 10;
1; 0,1 и 0,01 мкг/мл наблюдалось снижение уровня синтеза ДНК до 82, 69, 71, 79, 73 и
83% от исходного уровня соответственно.
Концентрации агентов, добавляемых к клеткам К-562, мкг/мл
Включение [3Н] тимидина
имп/мин  10-
% от контроля
Таблица 5. Снижение
пролиферации кле-
3
 (контроль)
7,5  0,09
100
ток К-562 под влия-
ДМСО (0,5 %)
5,7  0,3*
77
нием МП-6.
МП-6 100
6,1  0,4*
82
МП-6 50
5,2  0,2**
69
МП-6 10
5,3  0,5*
71
МП-6 1
5,9  0,5*
79
МП-6 0,1
5,5  0,3**
73
МП-6 0,01
6,2  0,2*
83
*-р<0,05; **-р<0,01
Таким образом, МП-4 и МП-6 вызывают снижение синтеза ДНК в клетках линии К-562 до уровня, сопоставимого с таковым известного индуктора дифференци14
ровки ДМСО, что свидетельствует о дифференцировочном действии этих двух пептидов и на клетки эритробластного лейкоза.
2.2. Экспрессия дифференцировочных антигенов на поверхности клеток линии
К-562 под влиянием МП-4 и МП-6
В данном исследовании определяли изменение уровня экспрессии CD44, являющегося маркером зрелых эритроцитов, под влиянием МП-4 и МП-6. [Telen MJ, 1995]
Проведенный нами цитометрический анализ с использованием моноклональных антител CD-44 (маркер зрелых эритроцитов) показал (рис. 4), что под влиянием
МП-4 количество клеток, несущих данный антиген, увеличивается в 2,75 раза по сравнению с контролем. Этот показатель выше, чем под влиянием ДМСО, который увеличивает процент зрелых клеток в данном тесте в 2 раза.
Рис. 4. Изменение
экспрессии
CD44 на клетках
К-562 под действием МП-4
Влияние МП-6 на экспрессию CD44 на поверхности клеток линии К-562 показано на рис.5. Можно видеть, что МП-6 почти в два раза увеличивает процент клеток, несущих на своей поверхности антиген CD44
197
Рис 5. Экспрессия CD44 на поверхно-
180
Экспрессия CD44 в % от
контрольного уровня
сти
189
клеток К-562 под действием МП-6
153
139
135
100
90
45
0
контроль
50
10
1
0,1
Концентрация МП-6, мкг/мл
2.3. Изменение количества синтезированного клетками К-562 гемоглобина под влияние
Поскольку клетки линии К-562 являются бластами и не способны синтезировать
гемоглобин, изучалась способность МП-4 и МП-6 влиять на созревание клеток этой
линии до зрелых форм по проявлению этими клетками их функциональной активности. Способность синтезировать гемоглобин является признаком не только зрелых, но
15
и функционально активных клеток, поскольку только такие клетки способны доставлять кислород к органам и тканям.
Как видно из рис.6, под влиянием МП-4 происходит повышение содержания
гемоглобина по сравнению с контролем в 1.6 – 1.8 раза. Эти изменения синтеза гемоглобина наблюдались при всех использованных концентрациях МП-4.
ДМСО (0,5%)
118
МП-4 (0,01)
100
МП-4 (100)
ную активность клеток К-562. Бензидиновый тест.
126
162
182
МП-4 (0,1)
Рис.6 Влияние МП-4 на функциональ-
контроль
173
МП-4 (50)
182
176
МП-4 (1)
МП-4 (10)
Концентрация МП-4, мкг/мл;
Диметилсульфоксид (ДМСО), % от объема.
На круговой диаграмме представлены результаты одного из пяти экспериментов
по влиянию МП-6 на синтез гемоглобина клетками К-562. (Рис. 7)
ДМСО (0,5%)
контроль
100
МП-6 (100)
97
Бензидиновый тест
128
57
МП-6 (0,1)
Влияние МП-6 на функцио-
нальную активность клеток К-562.
118
МП-6
(0,01)
Рис 7.
МП-6 (50)
99
122
98
Концентрация МП-6, мкг/мл;
МП-6 (1)
Диметилсульфоксид (ДМСО), % от
объема.
МП-6
(10)
Для высоких доз МП-6 (100; 50; 10 и 1 мкг/мл) не было обнаружено увеличения
синтеза гемоглобина по сравнению с контролем. При этом низкие дозы МП-6 (0,1;
0,01; и 0,001 мкг/мл) вызывали достоверно значимое увеличение синтеза гемоглобина,
сравнимое с действием DMSO (118% в сравнении с контролем).
Таким образом, МП-6, как и МП-4 является дифференцировочным фактором клеток линии К-562.Под действием этих пептидов происходит снижение пролиферации и
дифференцировка клеток линии К-562, повышается процент клеток, несущих маркер
16
дифференцировки CDD44, увеличивается количество зрелых, функционально активных клеток, способных синтезировать гемоглобин.
3. Изучение некоторых механизмов дифференцировочного действия МП-4 на
клетках линии HL-60.
3.1. Определение параметров связывания МП-4 с клетками HL-60
С помощью проточной цитометрии установлено, что ФИТЦ-МП-4 связывается с
клетками линии HL-60 в широком диапазоне концентраций 10-7-10-11 М. Связывание
описывается кривой насыщения, имеющей дозозависимый характер с выходом на плато при 12 нМ..
Рис. 8 Связывание ФИТЦМП-4 с клетками НL-60.
Анализ взаимодействия ФИТЦ-МП-4 с клетками НL-60 в координатах Лаинуивера-Берка позволил рассчитать константу диссоциации, равную 1.3 нМ (рис.8) ,
что характерно для рецепторов высокой аффиности.
Для оценки специфичности связывания МП-4 с клетками линии HL-60 были
проведены эксперименты по вытеснению ФИТЦ-МП-4 избыточным количеством немеченого МП-4 и миелопептидами с другими аминокислотными последовательностями – МП-3 (Leu-Val-Cys-Tyr-Pro-Gln) или МП-6 (Val-Asp-Pro-Pro) (рис. 9).
% связаннго ФИТЦ-МП-4
120
100
3
Рис.9 Анализ специфичности
80
2
связывания ФИТЦ-МП-4 с
клетками НL-60
60
1
40
20
0
0
19,6
39,4
MП-4, нM
59
17
Как видно из рисунка 9, введение избытка немеченого МП-4 в инкубационную
смесь приводит к дозозависимому снижению интенсивности флуоресценции, т.е. к вытеснению ФИТЦ-МП-4 с сайтов связывания на клетках-мишенях (рис.9 кривая 1). В то
же время, введение избытка немеченых пептидов с другой аминокислотной последовательностью, МП-3 или МП-6, не приводит к такому результату (рис.9, кривые 2 и 3).
Насыщение и обратимый характер связывания при избытке немеченого пептида той
же аминокислотной последовательности и отсутствие вытеснения другими немечеными пептидами позволяют утверждать, что ФИТЦ -МП-4 специфически связывается с
поверхностными рецепторами клеток миелобластного лейкоза HL-60. Факт того, что
МП-6 не вытеснят ФИТЦ-МП-4, говорит о том, что МП-4 и МП-6 имеют различные
сайты связывания на клеточной поверхности и, вероятно, различные пути дифференцировочного действия.
3.2 Проникновение МП-4 внутрь клеток линии HL-60
С помощью конфокальной микроскопии было показано, что ФИТЦ-МП-4 не
только специфически связывается с поверхностью клеток HL-60, но и проникает в цитоплазму этих клеток. Установлено проникновение пептида внутрь клетки и его локализация вокруг клеточного ядра. (Рис.10)
Клетки НL-60 просматривали в микроскопе через различные промежутки времени после добавления к ним ФИТЦ-МП-4 и фотографировали. Было показано, что
через 1 мин. после инкубации клеток HL-60 с ФИТЦ-МП-4 меченый пептид проникает
в межклеточное пространство (рис 10, а), а уже через 10 мин. (рис.10, б) практически
полностью находится на поверхности клеток. Через 30 мин. после начала инкубации
ФИТЦ-МП-4 обнаруживается в цитоплазме (рис. 10, в), а через 40 мин. (рис.10, г) меченый пептид локализуется вокруг клеточного ядра.
1 мин
10 мин
Рис.10 Проникновение ФИТЦ-МП-4 внутрь клетки. Стрелками показано положение пептида через
1, 10, 30, 40 мин.
а
б
40 мин
в
30 мин
г
18
3.3. Исследование характера проникновения МП-4 внутрь клеток HL-60
Проникновение ФИТЦ-меченого МП-4 исследовали также с помощью проточной цитофлуориметрии. [Drin G, Cottin S, et al., 2003]. В наших экспериментах уровень
флуоресценции клеток, инкубировавшихся с ФИТЦ-МП-4 при 370С в присутствии
азида натрия, вызывающего истощение АТФ, хлорида аммония, нейтрализующего
кислый рН лизосом, нокодазола, ингибирующего полимеризацию микротрубочек, не
отличался от флуоресценции клеток, инкубировавшихся при 370С при погашенной
флуоресценции с поверхности. (Рис 11) Инкубация клеток с меченым пептидом при
40С блокировала проникновение пептида внутрь клетки и, следовательно, приводила к
уменьшению флуоресценции по сравнению с клетками, инкубировавшимися при 370С
Рис.11. Исследование
характера
проникновения
ФИТЦ-МП-4 в клетки линии
HL-60. Цифрами показано
действие 1 – 40С, 2 – 370С, 3
– NH4Cl*, 4- 370С*, 5 – нокодазол*, 6- NaN3*,*–при тушении флуоресценции с поверхности
Эти данные
свидетельствуют о том, что проникновение меченого пептида
внутрь клетки носит энергонезависимый характер, не зависящий от температуры и не
связанный с эндоцитозом.
3.4. Участие ионов Са2+ в реализации дифференцировочной активности МП-4
Важную роль в регуляции процесса дифференцировки играет изменение внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция [Са2+]i. [Santella L, Ercolano E, et
al., 2005]Особенно важно контролировать изменение базального уровня [Са2+]i при
длительном действии некоторых агентов, индуцирующих дифференцировку клеток. В
связи с этим, необходимо было изучить Са2+ ответы недифференцированных промиелоцитов линии HL-60 на стандартные агенты и сравнить их с ответами клеток HL-60,
подвергнутых воздействию миелопептида МП-4.
3.4.1 Ca2+ ответы в недифференцированных клетках HL-60
На рис. 12 показано влияние последовательных добавок стандартного активатора фагоцитов – fMLP к клеточной суспензии. В концентрациях 1-3 мкМ этот агент
не влиял на недифференцированные HL-60 клетки. В то же время, увеличение концентрации fMLP до 10 мкМ вызывало достоверный Са2+ ответ. Последующая обработка
19
этих клеток высокими концентрациями fMLP приводила к монотонному увеличению
[Ca2+]i . Добавление к клеткам необратимого ингибитора Са2+-АТРазы эндоплазматического ретикулума (SERCA) – тапсигаргина (500 нМ) сопровождалось характерным
высоко амплитудным ростом [Ca2+]i , который обусловлен двумя взаимосвязанными
процессами: выходом ионов Са2+ из внутриклеточного депо и транспортом Са2+ по
кальциевым SOC каналам, регулируемым содержанием Са2+ в депо (SOC – store operated channels). Эти данные позволяют предположить, что в плазматических мембранах
недифференцированных HL-60 клеток либо содержится незначительное количество
рецепторов для fMLP, либо сродство этих рецепторов для данного агента невелико.
Рис.12 Изменение Са2+ ответа в недифференцированных клетках HL-60
под влиянием стандартных агентов.
Цифрами показано последовательное
добавление 1-5 – 10 мкМ fMLP, 6 –
500 нМ тапсигаргина, 7 – 0,5 мкМ
миконазола, 8 – 0,1 мкМ иономицина.
3.4.2. Ca2+ ответы в клетках HL-60, инкубированных с МП-4
На рис.13 представлены результаты экспериментов, поставленных по аналогичной схеме на HL-60 клетках, подвергшихся воздействию МП-4 в течение 72 часов.
Необходимо особо отметить, что Ca2+ ответ на fMLP наблюдался уже при концентрации 0,5 мкМ и был выраженным при конечных концентрациях от 1-7 мкМ.
Рис.13 Изменение Са2+ ответа в клетках HL-60, инкубированных с МП-4 (10
мкг/мл) в течение 72 часов под влиянием стандартных агентов.
Цифрами показано последовательное
добавление 1 – 1мкМ fMLP; 2 – 2 мкМ
fMLP; 3 - 4 мкМ fMLP; 4- 500 нМ
тапсигаргина; 5,6 - 0,5 мкМ миконазола; 7,8 - 0,1 мкМ иономицина.
20
На основании этих результатов можно заключить, что МП-4 выступает в качестве эффективного дифференцировочного фактора, который приводит к резкому усилению Са2+ ответа на существенно более низкие концентрации fMLP.
3.4.3. Изменение базального уровня [Ca2+]i под влиянием МП-4
Многие дифференцировочные агенты увеличивают такой жизненно важный показатель клеток, как базальный уровень [Ca2+]I, что вызывает серьезные побочные эффекты при использовании их в клинике. В связи с этим особое внимание было уделено
изменению базального уровня [Ca2+]i под действием МП-4. Обработка недифференцированных HL-60 клеток МП-4 (10-80 мкг/мл) не изменяла базальный уровень [Ca2+]i .
Аналогичные результаты были получены на HL-60 клетках, прединкубированных с
МП-4 (10 мкг/мл). (Рис.14)
[Ca2+]i, нМ
350
5
Недифференцированные
клетки
Клетки, инкубированные с
МП-4 в течение 72 часов
300
250
4
Рис.14 Влияние прединкубации с МП-4 на
базальный уровень [Са2+]i и Са2+ ответы в
клетках HL-60.
1 – базальный уровень[Са2+]i в контрольных клетках; 2 – базальный уровень [Са2+]i
в клетках, прединкубированных с МП-4
200
(10
мкг/мл)
в
течение
72
часов;3–
базальный уровень [Са ]i в контрольных
2+
150
1
100
2
3
клетках при добавлении МП-4 (10-80
мкг/мл), 4–Са2+ ответ в контрольных клетках под действием 50 мкМ fMLP; 5–Са2+
ответ в клетках, прединкубированных с
50
МП-4 под действием 7мкМ fMLP.
0
Таким образом, было показано, что в клетках HL-60, инкубированных в течение
длительного времени с МП-4, базальный уровень [Ca2+]i оставался практически неизменным, что выгодно отличает МП-4 от других дифференцировочных агентов, таких
как витамин D3.
3.5. Измерение активности компонентов системы MAP-киназ в клетках линии
HL-60 под влиянием МП-4 и МП-6
Для раскрытия некоторых механизмов дифференцировочного действия МП-4 и
МП-6 исследовали влияние этих пептидов на активацию/ингибирование компонентов
одной из важных систем внутриклеточной сигнализации – МАР-киназ. С помощью
иммуноферментного анализа ELISA установлено, что МП-4 и МП-6 вызывают изме21
нение функционального состояния различных компонентов системы МАР-киназ в
клетках линии HL-60.
3.5.1. Изменение активности компонентов системы МАР-киназ под влиянием МП-4.
На рис.15 показано, что МП-4 вызывает ингибирование ERK-киназы как в общей, так и в фосфорилированной форме на 49% и 33,6% соответственно. При этом
наблюдается активация общей и ингибирование фосфорилированной формы JNKкиназы на 20,2% и 11,9% соответственно, и ингибирование общей формы р38-киназы
на 28,8%.
Рис.15. Изменение активности компо-
30
ненты системы МАР-киназ под влияни% от контроля
15
ем MП-4 1 мкг/мл.
0
total ERK
-15
phospho
ERK
total JNK
phospho
JNK
total p38
Показано 1)ингибирование общей и
фосфорилированной форм ERKкиназы; 2) ингибирование фосфорили-
-30
рованной формы JNK –киназы; 3) ин-45
гибирование общей формы р38-киназы.
-60
3.5.2. Изменение активности компонентов системы МАР-киназ под действием МП-6
МП-6 вызывает активацию фосфорилированной формы белка ERK на 26,1% и
активацию как общей, так и фосфорилированной формы JNK на 55,7 % и 42,8%. Как и
МП-4, МП-6 вызывает ингибирование уровня общей формы р38-киназы на 12,7%.
(Рис.16)
Рис. 16. Изменение активности ком-
%от контроля
60
поненты системы МАР-киназ под
45
влиянием MП-6 1 мкг/мл. Показано
30
1)ингибирование общей и активация
15
фосфорилированной
total ERK
-30
ERK-
киназы; 2) активация общей и фос-
0
-15
форм
phospho
ERK
total JNK
phospho
JNK
total p38
форилированной
формы
JNK
–
киназы; 3) ингибирование общей
формы р38-киназы.
-45
Таким образом, процесс дифференцировки клеток под действием МП-4 приводит к ингибированию фосфорилированных форм ERK-, JNK – киназ, вызывает снижение уровня общего белка р38, что свидетельствует о влиянии пептида на данные внут22
риклеточные пути. С другой стороны, МП-6 вызывая активацию ERK- и JNK-киназы,
приводит к ингибированию уровня общего белка р38. Этот факт подтверждает различные пути дифференцировочного действия этих пептидов, поскольку они имеют
различные сайты связывания на клетках линии HL-60.
Выводы:
1. МП-4 и МП-6 являются факторами клеточной дифференцировки. Они индуцируют терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий HL-60 и К562, что показано по различным показателям: снижению пролиферации, появлению морфологически зрелых клеток, экспрессии дифференцировочных антигенов на клеточной поверхности, проявлению функциональной активности клеток.
2. МП-4 специфически связывается с клетками линии HL-60 (Kd = 1,3 нМ). Затем
пептид проникает внутрь клетки и локализуется вокруг клеточного ядра.
3. Проникновение пептида внутрь клетки является энергонезависимым, тепмературозависимым процессом, не связанным с эндоцитозом.
4. Дифференцировка клеток линии HL-60 под влиянием МП-4 сопровождается
увеличением амплитуды Са2+ ответов, при этом МП-4 практически не влияет на
базальный уровень свободных ионов Са2+ в клетке, что выгодно отличает его от
ряда других дифференцировочных агентов и указывает на возможность его
применения в клинике.
5. МП-4 вызывает ингибирование JNK-киназы и ERK-киназы, а также подавляет
активность общей формы белка р38, что свидетельствует о влиянии пептида на
данные внутриклеточные пути.
6. МП-6 не вытесняет ФИТЦ-МП-4 из мест специфического связывания на поверхности клеток HL-60. Ингибируя активность общей формы р38, МП-6, в отличие от МП-4, вызывает активацию как ERK, так и JNK-киназы. Эти данные
указывают на различие в механизмах дифференцировочного действия МП-4 и
МП-6.
Практические рекомендации. Результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых лекарственных средств, вызывающих дифференцировку
опухолевых клеток и направленно действующих на определенные компоненты сигнального каскада в опухолевой клетке.
23
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Кирилина Е.А., Хайдуков С.В., Калюжная М.В., Попова С.С., Суворов Н.И.,
Михайлова А.А. //Миелопептиды, влияющие на дифференцировку лейкозных
клеток.// РААКИ, 5-й Конгресс, Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, тезисы докладов, 12-14 ноября 2002, т. 2, с. 227.
2. Кирилина Е.А., Гурьянов С.А., Суворов Н.И., Попова С.С., Хайдуков С.В., Михайлова
А.А.
//Дифференцировка
клеток
миелобластного
(HL-60)
и
эритробластного (К-562) лейкозов под влиянием миелопептида-4 и миелопептида-6.// Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, 2003, Москва, тезисы стендовых сообщений, с. 73.
3. Suvorov N.I., Popova S.S., Holodenko I.V., Gur’yanov S.A., Efremov M.A. Specific
binding of myelopeptide-4 with the cells of the HL-60 human leukemia cell line. International Journal on Immunorehabilitation, may 2004, V.6, № 2, 236
4. Суворов Н.И., Попова С.С., Холоденко И.В., Гурьянов С.А., Ефремов М.А.
Специфическое связывание миелопептида МП-4 с клетками лейкозной линии
HL-60. Тезисы VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова,
Москва, 2004, с. 38.
5. Суворов Н.И., Попова С.С., Холоденко И.В., Гурьянов С.А., Ефремов М.А.
Специфическое связывание миелопептида МП-4 с клетками лейкозной линии
HL-60. Аллергология и иммунология, 2004, том 5, № 1, с. 104.
6. Кирилина Е.А., Суворов Н.И, Попова С.С., и др. Индукция дифференцировки в
лейкозных клеточных линиях под влиянием миелопептида-4, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005, том 140 №11, с 565-570.
7. Асташкин Е.И., Суворов Н.И., Михайлова А.А., Грачев С.В., Изменение Сa2+
ответа на формилпептид в клетках миелолейкоза HL-60 при индукции их дифференцировки миелопептидом МП-4, ДАН, 2006, т.408, №3, с. 418-421.
8. Suvorov N, Astashkin E, Mikhailova A, Ca2+ and MAPK signaling in HL-60 cells
during differentiation by myelopeptide MP-4, 15th protein kinase meeting «Spatial
and Temporal Regulation of Signalling», 2006, Oslo, p.61.
9. Гурьянов С.А., Кирилина Е.А., Хайдуков С.В., Суворов Н.И., Молотковская
И.М., Михайлова А.А. Специфическое связывание и проникновение внутрь
клетки-мишени флуоресцентно меченного миелопептида-4, обладающего дифференцировочной активностью. Биоорганическая химия 2006, т.32, № 6, с. 1-5.
24
Суворов Николай Иванович
«Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку
лейкозных клеточных линий»
14.00.36 – аллергология и иммунология
медицинские науки
Д 208.072.05
117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1
Предполагаемая дата защиты –
мая 2007
Выставлено на сайт –
На правах рукописи
СУВОРОВ НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ
Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку
лейкозных клеточных линий
14.00.36 – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2007
25