экспериментально-клиническое исследование
реклама
На правах рукописи ВОРОНИНА Евгения Игоревна МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОМАХ ПРИ ПРОЯВЛЕНИИ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ В УСЛОВИЯХ ПОЛИХИМИОТЕРАПИИ (экспериментально-клиническое исследование) 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.03.02 – патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск –2014 Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ и в ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск) Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор АГЕЕВА Татьяна Августовна доктор биологических наук, профессор ЗЕНКОВА Марина Аркадьевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, зав. лабораторией структурных основ патогенеза социально значимых заболеваний ФГБУ «НЦКЭМ» СО РАМН ПОТАПОВА Оксана Валентиновна доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ ВТОРУШИН Сергей Владимирович Ведущая организация: ФГБУ "Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии" СО РАМН Защита состоится «____»__________2014 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; (383) 333- 64-56) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН и на сайте (http://centercem.ru/) Автореферат разослан «____»__________2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Пальчикова Н.А. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Основным методом лечения гемобластозов является многокурсовая полихимиотерапия, что определяет особую важность мониторирования и оценки изменяющихся под воздействием цитостатиков молекулярно-биологических характеристик именно данного вида опухолей и приближает к основной идее персонализированной медицины – индивидуализации подходов диагностики и лечения злокачественных опухолей (Jain K.K. 1998, 2002,2003,2009; Foussard C. et al., 2005; Bosly A. et al., 2008). Это делает необходимым понимание процессов опухолевой прогрессии после химиолучевого воздействия (Hanahan D. et al., 2000). Полученные сведения помогут оптимизировать схемы лечения каждого пациента индивидуально и сделают возможным проведение более успешной таргетной терапии гемобластозов (Miura K. et al., 2011). Существует ряд проблем, не позволяющих полноценно и эффективно использовать химиотерапию: развитие опухолевой прогрессии в результате накопления мутаций и генетической нестабильности, отбор клонов с максимальными возможностями к пролиферации, развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) (Блохин Д.Ю., 2009; Foulds L., 1969). Все эти качества опухолевой клетки направлены на выживание и рост неоплазмы и нередко в ней включается сразу несколько механизмов защиты от воздействия химиотерапии. Отдельные свойства опухоли прогрессируют независимо друг от друга, а непредсказуемость количества и качества вторичных мутаций делают эту прогрессию уникальной и индивидуальной для каждой опухоли, что требует определения исходного и меняющегося под воздействием лечения генотипа каждого злокачественного новообразования. Кроме того, существенным недостатком противоопухолевых препаратов является их токсическое воздействие на органы и ткани. Все цитостатики подвергаются биотрансформации в печени с помощью системы микросомальных оксигеназ и в результате образуются токсические метаболиты, которые вызывают развитие гепатотоксичности и повреждение гепатоцитов. Это в свою очередь является фактором ограничивающим проведение многократных курсов полихимиотерапии (Казюлин А.Н., 2012; Donepudi I., 2012; Amacher D.E., 2013). Степень разработанности темы исследования. В научной литературе приводится крайне мало данных об изменениях в ткани печени при проведении многократных курсов терапии цитостатиками, это обстоятельство делает необходимым изучение морфологических изменений ткани печени в условиях цитотоксической нагрузки, а так же изменений уровней ферментных систем, отвечающих за метаболизм ксенобиотиков. Кроме того, большой проблемой является моделирование схем лечения опухолей в эксперименте на животных, приближающееся по продолжительности курсов полихимиотерапии у пациентов, что существенно ограничивает исследование процессов, формирующихся в опухоли под воздействием химиотерапии. Вышеизложенные обстоятельства указывают на очевидную недостаточность данных по обсуждаемой проблеме опухолевой прогрессии под воздействием цитостатиков и необходимость уточнения существующих сведений, что и определило цель и задачи настоящего исследования. Цель исследования: изучить молекулярно-клеточные и патоморфологические особенности проявлений опухолевой прогрессии в злокачественных лимфомах в условиях полихимиотерапии: в эксперименте на резистентной лимфоме мышей RLS и в опухолевой ткани пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой. Задачи исследования: 1. На экспериментальной модели лимфомы мышей RLS исследовать динамику роста опухоли и соотнести её с показателями уровней некрозов и апоптозов в ткани опухоли под воздействием курсов полихимиотерапии. 2. Исследовать экспрессию генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости и инициации программы апоптоза, в клетках опухоли мышей RLS без лечения и после проведения курсов полихимиотерапии. 3. Иммуногистохимическим методом изучить динамику изменения экспрессии Ki-67, р53, caspase 3, bcl2 и Р-гликопротеина в клетках опухоли RLS под воздействием курсов полихимиотерапии. 4. Провести патоморфологическое изучение структурных изменений в печени мышей с лимфомой RLS и изучить экспрессию цитохрома P450 в гепатоцитах в динамике курсов полихимиотерапии. 5. Исследовать морфологические и молекулярно-биологические особенности проявлений опухолевой прогрессии в диффузной В-крупноклеточной лимфоме у пациентов до и после проведения многократных курсов полихимиотерапии. Научная новизна исследования Впервые разработана оптимальная доза имплантирования опухолевых клеток резистентной лимфомы мышей RLS, позволяющая провести четырехкратное введение комплекса цитостатиков, что сделало возможным изучить спектр молекулярно-биологических изменений, происходящих в изначально резистентной к химиотерапии опухоли RLS поэтапно, после каждого из 4-х курсов химиотерапии. Впервые в резистентной лимфоме RLS на фоне четырехкратного введения комплекса цитостатиков установлено изменение экспрессии ключевых генов, регулирующих апоптоз и участвующих в формировании МЛУ, что в совокупности с данными о динамике экспрессии соответствующих белков позволило сделать вывод об особенностях опухолевой прогрессии изначально резистентной к цитостатикам опухоли RLS. Впервые в лимфоме RLS после четырехкратного воздействия цитостатиков установлено нарушение процессов апоптоза, которые характеризовались повышением количества клеток, экспрессирующих белок bcl-2, снижением количества р53-позитивных клеток при невысоком числе клеток, синтезирующих каспазу 3 в течение всех 4 курсов полихимиотерапии. Впервые показано, что пролиферативная активность опухолевых клеток RLS до лечения и на этапах полихимиотерапии нарастает в совокупности с увеличением количества опухолевых клеток, экспрессирующих Р-гликопротеин, участвующий в формировании множественной лекарственной устойчивости. Впервые у животных с лимфомой RLS исследована динамика нарастания структурных изменений в паренхиме печени на фоне воздействия опухолевого процесса и 4 курсов полихимиотерапии, а так же впервые на основании изменений количества гепатоцитов, экспрессирующих цитохром Р450, показано «истощение» системы микросомального окисления в зависимости от нагрузки цитостатиками и нарастания деструктивных изменений паренхимы печени. Впервые у пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой на основании исследования уровней экспрессии ряда белков, характеризующих опухолевую прогрессию (Ki67, bcl-2, р53, Р-гликопротеин), установлены изменения молекулярных характеристик опухолевых лимфомных клеток под воздействием многократных курсов полихимиотерапии в процессе лечения заболевания в сравнении с впервые диагностированной диффузной Вкрупноклеточной лимфомой. Научно-практическая значимость работы Полученные новые данные дополняют сведения о молекулярно-клеточных механизмах формирования опухолевой прогрессии и множественной лекарственной устойчивости в изначально резистентных к химиопрепаратам опухолях под воздействием многократных курсов полихимиотерапии, что зачастую наблюдают в клинике у пациентов с агрессивными формами лимфом. Данное исследование продемонстрировало особенности структурных изменений в печени при проведении многокурсовой химиотерапии свидетельствующих об «истощении» системы цитохрома Р450 в течение курсов введения цитостатиков, что сопряжено с нарушениями метаболизма цитостатиков и, как следствие, снижению их воздействия на опухолевую ткань, что следует учитывать в процессе длительного лечения онкологических больных химиопрепаратами. Основные положения, выносимые на защиту: 1. На фоне многократных введений комплекса цитостатических препаратов животным с лимфомой RLS, которая характеризуется изначально лекарственно-резистентным фенотипом, продолжала нарастать степень злокачественности опухоли, как отражение опухолевой прогрессии. Это выражалось в нарушениях механизмов гибели опухолевых клеток апоптозом, усилении множественной лекарственной устойчивости, наращивании пролиферативной активности опухолевых клеток. В итоге наблюдали снижении чувствительности опухоли к цитостатикам и прогрессирующий рост опухолевого узла на фоне курсов химиотерапии. 2. В условиях влияния опухолевого процесса и проведения многокурсовой полихимиотерапии нарастают деструктивные изменения в паренхиме печени животных и происходит «истощение» синтеза цитохрома Р450 в гепатоцитах, что снижает чувствительность опухоли к цитостатикам и повышает токсическую нагрузку на организм. 3. Проведение многократных курсов полихимиотерапии пациентам с диффузной Вкрупноклеточной лимфомой в процессе лечения заболевания приводит к изменениям молекулярных характеристик лимфомных клеток, отражающих опухолевую прогрессию: в леченой опухоли в сравнении с первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомой происходит блок процессов апоптоза и активация множественной лекарственной устойчивости, что способствует прогрессированию опухолевого процесса у пациентов, снижает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, способствует увеличению опухолевой массы, повышению токсической нагрузки. Степень достоверности и апробация результатов исследования. Материалы исследования представлены на ежегодной конкурс-конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2010, 2012), на всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые медицине» (Самара, 2011), межвузовской научной студенческой конференции «Интеллектуальный потенциал Сибири» (Новосибирск, 2012), первой всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине ХХI века» (Москва, 2012), на научно-практической конференции патологоанатомов ДВФО посвященной 100-летию со дня рождения профессора А.И. Зеленского «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Хабаровск, 2012), на научно-практической конференции Южного Урала (Челябинск, 2014). Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую деятельность на кафедрах патологической анатомии и гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ и в научно-исследовательскую деятельность лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения РАН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2– в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций материалов диссертационных исследований, 1 статья в зарубежном издании. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками и содержит 3 таблицы. Библиографический указатель содержит 185 источников, из которых 45 отечественных и 140 зарубежных работ. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Лабораторные животные. В данной работе были использованы 14-16-недельные мыши-самцы линии CBA/LacSto из вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в соответствии с правилами принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург,1986) в стандартных условиях: при обычном световом режиме, в пластиковых боксах со стандартным пищевым рационом и имели свободный доступ к воде и пище. Протокол Экспериментов был согласован с комитетом по этике Новосибирского государственного медицинского университета (протокол № 41 от 16.02.2012). Опухолевая модель. В лаборатории нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН совместно с сотрудниками лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦГ СО РАН была разработана модель лимфоидной опухоли RLS, имеющая фенотип множественной лекарственной устойчивости, сформированная путем многократного перевивания рецидивов этой опухоли, возникающих после воздействия низких доз циклофосфана при постепенном их повышении (от 10 до 200 мг/кг) и характеризовался пониженной чувствительностью к действию циклофосфана (Каледин В.И. и др., 2006). По морфологическим характеристикам и особенностям течения опухоль RLS соответствует агрессивным В-клеточным лимфоидным опухолям, к которым относится ДВККЛ у людей, а также опухолям, которые уже подвергались воздействию цитостатиков. Эксперимент № 1. На первом этапе эксперимента целью было изучить выживаемость животных с перевитой в разных дозах опухолью RLS без воздействия ПХТ. Опухолевые клетки RLS в концентрации 5 × 104 клеток/мл в 0,3 мл физиологического раствора были пересажены внутрибрюшинно экспериментальным животным. На десятый день развития опухоли физиологический раствор (0,5мл) был введен внутрибрюшинно животным и собран вместе с асцитом (0,5-0,8 мл) с помощью шприца. Далее полученную асцитную жидкость разбавляли до 5 мл PBS-буфером (фосфатный солевой буфер) и центрифугировали с 3 мл среды Lymphocyte Separation Medium (LSM) при 1500 об/мин в течение 15 минут, фракцию мононуклеарных клеток, находящуюся на границе раздела LSM и супернатанта, переносили в чистую пробирку с 5-7 мл фосфатного буфера PBS, суспендировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Клеточный осадок подсчитывали с помощью камеры Горяева и перевивали нужное количество экспериментальным животным. Животные были поделены на четыре группы, 5 мышей в каждой, которым была перевита внутримышечно в правое бедро лимфома RLS. В первой группе животным перевили суспензию клеток опухоли RLS в 0,1 мл физиологического раствора по 100 тыс. кл/мл, во второй группе - 80 тыс. кл/мл, третей группе 50 тыс. кл/мл, четвертой по 20 тыс кл/мл, оценивая динамику роста опухолевого узла. Эксперимент № 2. Целью второго этапа явилось проведение животным с перевитой опухолью RLS многократных курсов химиотерапии. Мышей делили на две группы, в первой группе 80 животных, во второй 20. Животным обеих групп внутримышечно в правое бедро трансплантировали суспензию клеток опухоли RLS в физиологическом растворе (2х105 кл/мл). На 7-е сутки роста опухоли первой группе животных вводили комбинацию цитостатиков, аналогичную схеме CHOP для лечения гемобластозов, второй группе лекарственные препараты не вводили (контроль). Препараты вводили в дозировках, соответствующих 1/5 ЛД50: циклофосфан – 50 мг/кг массы тела, доксорубицин – 4мг/кг и винкристин – 0,1 мг/кг однократно в хвостовую вену, преднизолон – 5 мг/кг - внутрибрюшинно. На 7 сутки после проведения 1 курса ПХТ часть животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Далее животное препарировали, отделяли верхний пласт опухолевой ткани и помещали его в физиологический раствор для приготовления первичной культуры. Оставшимся животным из 1 группы через 7 суток проводили 2 курс ПХТ, часть животных выводили из эксперимента для последующего приготовления первичной культуры. Оставшимся животным по той же схеме через каждые 7 суток проводили последовательно 3 и 4 курсы ПХТ. Забор материала для гистологического исследования проводили на 1-е, 3-и, 7-е сутки после каждого курса ПХТ, после проведения 4 курса - забор материала производили только на 1-е сутки. Забор материала для проведения молекулярно-биологического исследования производили на 7-е сутки после каждого курса ПХТ, после проведения 4 курса - материал забран на 1-ые сутки. Во второй экспериментальной группе наблюдали развитие и прогрессирование опухолевого процесса без лечения, забор материала для морфологического и молекулярнобиологического исследования проводили на тех же сроках, что и в первой группе. В результате продолжительность эксперимента составила 30 суток, в течение которых удалось провести максимально 4-е курса ПХТ. Оценка эффективности ПХТ и динамика роста опухоли. Динамику роста перевитой опухоли оценивали проводя замеры пораженной конечности при помощи штангенциркуля: полученные три взаимно перпендикулярные размера перемножали и получали объем опухоли (см3). Регулярно проводили взвешивание животных, чтобы оценить токсическое действие опухоли и химиотерапии на организм животных. Клиническая часть. Лимфатические узлы с опухолевым ростом НХЛ выбрали из архивного материала от пациентов Городского гематологического центра МБУЗ НСО ГКБ №2 г. Новосибирска (гл. врач д.м.н. Шпагина Л.А.). В исследование были отобраны гистологические блоки лимфатических узлов случаев неспецифицированного варианта нодальной диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) (WHO classification lymphoid tumor, 2008), относящейся к НХЛ с агрессивным характером течения. Были сформированы 2 группы пациентов: 1 группа - операционно-биопсийный материал лимфатических узлов 30 пациентов с первично выявленной ДВККЛ (средний возраст пациентов составил 52,3±3,7) и 2 группа - гистологические материалы лимфатических узлов с рецидивом ДВККЛ - по аутопсийному материалу от 20 пациентов с ДВККЛ, перенесших от 16 до 24 курсов ПХТ суммарно и умерших в стационаре на этапе лечения очередного рецидива данного заболевания (средний возраст пациентов 57,1±2,9). Морфологические методы, используемые в работе Гистологическое исследование: ткань опухоли и органы экспериментальных животных фиксировали в 10% забуференном формалине (Biovitrum, Россия) в течение 3-6 дней, далее для гистологической проводки вырезали фрагменты опухоли и органов толщиной 3-5 мм. Затем производили обезвоживание материала в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле, заключали в парафин. Далее на ротационном микротоме изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Для проведения гистологического исследования архивный материал лимфатических узлов пациентов с опухолью перезаливали в парафин Leica, пропитывали в парафине в течение 1 часа при 56оС, формировали новые блоки, из которых на микротоме изготавливали срезы толщиной 3- 5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Дополнительно на предметные стекла, покрытые адгезивом, помещали срезы для иммуногистохимического исследования. Иммуноморфологическое исследование: выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководствах по иммуногистохимическим исследованиям (Buchwalow I., 2010; Dabbs J., 2010; Петров С.В., 2012), рекомендациями фирм-производителей антител. Для окрашивания тканей животных использовали антитела: Ki-67 (клон SP6), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; BCL-2 (клон SP66), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; Cytochrome P450 (2D6), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия; Caspase 3 (клон ab4051), rabbit polyclonal, «Thermo Scientific», USA; р53 (клон SP5), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; P-glycoprotein antibody (клон С219), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия. Для окрашивания лимфатических узлов пациентов с ДВККЛ использовали антитела: Ki67 (клон MIB1) mouse monoclonal, «DAKO» Дания; BCL-2 (клон 124), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; р53 (клон DO-7), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; P-glycoprotein antibody (клон С219), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия. Оценка полученного иммуногистохимического исследования проводилась полуколичественным методом. При исследовании препаратов окрашенных антителами, рассчитывали индекс мечения (ИМ) – отношение числа позитивно окрашенных клеточных структур на 100 опухолевых клеток. Морфометрическое исследование: проводили, используя основные принципы стереологии и морфометрии (Автандилов Г.Г., 1990). Определение уровня экспрессии генов mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53 с помощью метода ОТ-ПЦР Из первичной культуры опухолевых клеток RLS выделяли суммарную клеточную РНК с помощью стандартной SDS/фенольной экстракции. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически, сохранность выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в 1%-ой агарозе. кДНК синтезировали с использованием выделенной суммарной клеточной РНК, рандомизированного гексануклеотидного праймера и обратной транскриптазы M-MLV. Далее проводили амплификацию с парами праймеров к генам mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53 и β-актину, выбранных с использованием программы OLIGOS и синтезированных в технологической лаборатории ИХБФМ СО РАН. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 8%-ом полиакриламидном геле. Полученные изображения полос обрабатывали с помощью компьютерной денситометрии (Gel-Pro Analyzer 4.0). Статистический анализ. Полученные цифровые данные были подвергнуты статистическому анализу с использованием прикладных программ OriginPro 5.5., Microsoft Office Excel 2010 и пакета статистических программ Statistica v. 7.0 (StatSoft Inc., USA). Показатели исследования были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. В случае нормального распределения значений применяли tкритерий Стьюдента и дисперсионный анализ с использованием метода множественных сравнений. Результаты представлены в виде M±m, где M– средняя арифметическая величина, m – стандартная ошибка средней (Гланц С., 1999; Банержи А., 2007). Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95% (р< 0,05). РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Модель экспериментальной лимфосаркомы мышей RLS. Оценка опухолевой прогрессии у экспериментальных животных в зависимости от количества курсов ПХТ В результате первого эксперимента была обоснована доза имплантации опухоли – 20 тыс. кл., когда опухоль росла относительно медленно, что обеспечивало максимальную продолжительность жизни животных. Установленная динамика роста опухоли дала возможность провести несколько курсов введения комплекса цитостатиков на мышахопухоленосителях, что максимально приближено к клинической картине у пациентов с гемобластозами. Гистологическое строение перевиваемой лимфомы RLS и морфологические особенности ткани опухоли в зависимости от числа курсов ПХТ Макроскопически в бедре формировался округло-овальный опухолевый узел, бело- розового цвета, который микроскопически был построен из крайне полиморфных крупных атипичных лимфоидных клеток с узким ободком цитоплазмы. Ядра клеток с большим количеством патологических митозов, встречалось большое количество клеток в состоянии апоптотического распада. Опухоль росла инвазивно и разрушала окружающие мышцы бедра, наблюдали метастазы опухолевых клеток в печень, почки и легкие, ткани передней брюшной стенки, у одного животного метастазы выявлены в перикарде. Влияние ПХТ на динамику роста лимфомы мышей RLS и продолжительность жизни животных с опухолью У всех животных на 7-е сутки после трансплантации опухолевых клеток в бедре формировался солидный опухолевый узел, достигавший среднего объема около 0,16 см3, далее размеры узла поступательно увеличивались, несмотря на повторяющиеся курсы ПХТ. У животных с перевитой опухолью в группе без воздействия ПХТ, начало гибели животных отмечали на 18-е сутки после трансплантации опухолевых клеток и их средняя продолжительность жизни составила 26,6 суток. В группе животных-опухоленосителей с проведением 4-х последовательных курсов ПХТ с интервалом в 7 дней гибель животных начиналась к 25-м суткам после трансплантации опухоли их средняя продолжительность жизни составила 28 суток. Максимальный размер опухолевого узла достигал 4±0,26 см в группе животных с опухолью без лечения и 1,6±0,15 см в группе животных получавших лечение цитостатиками. Отсутствие редукции опухоли RLS на фоне введений комплекса цитостатиков потребовало уточнения механизмов прогрессирования опухолевого процесса в изначально резистентной опухоли. Определение уровня экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках опухоли RLS после воздействия нескольких курсов ПХТ Было установлено, что по сравнению с опухолью без лечения, после воздействия четырех курсов ПХТ в клетках опухоли RLS повысилась экспрессия генов mdr1b (в 1,8 раза) и bcl-2 (в 1,3 раза), уровень экспрессии гена mdr1a снижался в 1,2 раза, а экспрессия гена р53 различалась по курсам ПХТ и к 4 курсу произошло снижение показателя почти в 2 раза (рис.1). Повышение уровня экспрессии гена mdr1b, свидетельствует, что МЛУ продолжает нарастать в опухоли RLS с селекцией еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток. Полученные результаты динамики экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, вызвали интерес сравнить эти данные с уровнем кодируемых этими генами белков. bcl-2/b-актин bcl-2 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 RLS ПХТ1 ПХТ2 ПХТ3 ПХТ4 Рис.1 Уровни экспрессии генов mdr1a, mdr1b, bcl-2 и p53 в клетках опухоли RLS без лечения и в опухоли RLS после проведения четырех курсов ПХТ. Результаты исследования индекса мечения окрашенных Ki-67 опухолевых клеток в лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения ПХТ Проведение 4 курсов ПХТ сопровождалось увеличением экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках RLS: до проведения ПХТ индекс мечения составил 34,0 ± 0,95, после проведения 1 курса ПХТ он возрос на 17,6 % и составил 40,0± 1,37, затем продолжал повышаться и к 4 курсу ПХТ возрос до 51,0±1,13%. Даже на фоне курсов ПХТ изначально резистентная к цитостатикам лимфома RLS продемонстрировала опухолевую прогрессию за счет интенсификации пролиферативного режима, что предполагает возможное формирование вторичных мутаций генома, обеспечивающих выживание опухолевых клеток. Уровень некрозов и апоптозов в экспериментальной лимфоме RLS без лечения и после курсов ПХТ В группе животных с перевитой опухолью RLS, но без проведения химиотерапии появление некрозов было зафиксировано к 7-м суткам роста опухоли, когда объемная плотность некрозов составила 2,5%, к 14-м суткам доля некрозов в опухоли увеличилась до 9%. В динамике роста опухоли RLS на фоне проведения курсов ПХТ объемная плотность некрозов также нарастала. Появление некрозов отмечали на 3-и сутки после первого курса ПХТ - доля их была невелика и составила в среднем около 1%. После 2 курса ПХТ некрозы были зафиксированы уже через 1 сутки (8,7±1,92), к 3-м суткам объемная плотность некрозов составляла уже 18,0±3,41, достигнув показателя 22,0±3,95 к 7-м суткам. Третье введение комплекса цитостатиков индуцировало некротические процессы более интенсивно- они занимали до 20% ткани опухоли через 1 сут и этот показатель существенно не изменялся через 3 и 7 суток после 3 курсов ПХТ и был на таком же уровне уже через 1 сутки после 4 курса ПХТ. При оценке выраженности процессов апоптоза в опухолевой ткани было установлено: в опухоли до лечения на 7-е сутки роста RLS численная плотность апоптозов составляла 1,2±0,10, а к 14 суткам отмечали снижение показателя до 0,96±0,10 (на 20%). В опухоли животных после проведения курсов ПХТ отмечали возрастание показателя численной плотности клеток опухоли в состоянии апоптоза - к 7 суткам после 1-го курса ПХТ он повысился почти в 2 раза (1,01±0,1) по сравнению с 1 сутками и далее наблюдали незначительное увеличение численной плотности апоптозов в опухоли с каждым последующим курсом химиотерапии. После 3 курса ПХТ уровень апоптозов составил через 1-и сутки 1,2±0,09, через 3-е и 7суток показатель оставался на этом же уровне, а через 1 сутки после проведения 4 курса ПХТ имел максимальное значение - 1,3±0,1. Численная плотность апоптозов в опухоли также нарастала незначительно на фоне нестабильной динамики экспрессии гена р53. При этом отмечали возрастание пролиферативной активности опухоли и прогрессирующий рост размеров опухолевого узла. В связи с отмеченными сложными особенностями молекулярных характеристик опухоли RLS в динамике 4 курсов ПХТ было целесообразным оценить уровень экспрессии каспазы 3 в клетках лимфомы RLS до лечения и после введения комплекса цитостатиков. Результаты исследования индекса мечения окрашенных caspase 3 опухолевых клеток в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ В результате исследования было отмечено незначительное изменение ИМ caspase 3 на фоне 4-х курсов ПХТ. В группе животных с опухолью без ПХТ 12,6±0,32% опухолевых клеток экспрессировали данный белок, что отражает имеющийся уровень спонтанного апоптоза в опухоли в результате грубых генетических аномалий и ишемии. В группе животных после проведения 1 курса ПХТ ИМ возрос незначительно – на 7,1 % и составил 13,5±0,32%, после 2го курса ПХТ – 15,7±0,35%. После проведения 3-го и 4-го курсов ПХТ уровень экспрессии опухолевыми клетками каспазы 3 существенно не менялся и составил 16,0±0,32% и 15,8±0,33% соответственно. Таким образом, было установлено, что при имеющемся в опухоли RLS без лечения невысоком уровне экспрессии каспазы 3 повторяющиеся курсы введения комплекса цитостатиков против ожидаемого приводили к несущественному увеличению экспрессии эффекторной каспазы. Это обстоятельство в совокупности с выявленным повышением экспрессии антиапоптотического гена bcl-2 (в 1,3 раза) и снижение уровня экспрессии гена р53 (почти в 2 раза к 4-му курсу ПХТ) свидетельствует о том, что в опухоли RLS цитостатики индуцируют апоптотическую гибель опухолевых лимфоидных клеток очень незначительно. Из полученных результатов можно предположить, что изначально резистентная к цитостатикам опухоль RLS прогрессирует по крайне неблагоприятному сценарию: процессы апоптоза, которые должны индуцироваться введением комплекса цитостатиков, нарушены, параллельно отмечено повышение пролиферативной активности клеток RLS. По-видимому, на фоне курсов ПХТ происходит клональная селекция клеток, имеющих механизмы выживания, и накопление дополнительных генетических мутаций, что в итоге обусловливает развитие преимущественно спонтанного, а не лекарственно-индуцированного апоптоза и некроза. Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Р-гликопротеин опухолевых клеток экспериментальной лимфомы мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ В группе животных без ПХТ 31,1±1,37% опухолевых клеток экспрессировали ргликопротеин, что в совокупности с изначально высоким уровнем экспрессии гена mdr1b в RLS свидетельствует об первично имеющейся индукции процессов МЛУ в данной агрессивной лимфоидной опухоли. У животных, получивших 4-х кратное введение цитостатиков, уровень ИМ Р-гликопротеина в опухолевых клетках поступательно увеличивался: составил 49,0±1,10% после проведения 1-го курса ПХТ, 56,2±1,15% – после 2-го курса ПХТ, а после 3-го и 4-го курса - 62,0±1,17% и 64,7±1,05% соответственно. В группах экспериментальных животных и в опухолевых клетках пациентов наблюдали значительное нарастание экспрессии данного белка в динамике ПХТ, что может подтверждать высказанное предположение о проявлении в клетках опухоли RLS эволюционно выработанного механизма, защищающего от повреждающих агентов. В связи с вышесказанным представило интерес оценить структурно-функциональные изменения в печени на фоне повышения злокачественности опухоли, индукции процессов МЛУ и снижения чувствительности к цитостатикам, т.к. именно в ней происходит метаболизм химических веществ. Структурные изменения ткани печени и результаты исследования индекса мечения окрашенных на цитохром P450 гепатоцитов у животных с RLS до лечения и после проведения курсов ПХТ В печени у животных с ростом перевитой в бедро лимфомы RLS было нарушено балочное строение ткани, определялись внутридольковые очаговые некрозы разного размера (от моноцеллюлярных до очаговых). Дистрофия гепатоцитов имела характер белковой (вакуольной или гидропической), в синусоидах встречались лимфоциты, единичные нейтрофилы, макрофаги. У большей части животных в ткани печени, преимущественно периваскулярно вокруг центральной вены, обнаруживали метастазы ткани опухоли. В группе животных, которым провели 4 курса ПХТ, отмечали нарастание деструктивных изменений в ткани печени. Так после проведения 4-го курса ПХТ объемная плотность некрозов гепатоцитов увеличилась в 1,6 раза по сравнению с показателем после 1 курса ПХТ и почти в 3,5 раза - по сравнению показателем в группе животных с лимфомой RLS без лечения. Доля дистрофических изменений гепатоцитов так же нарастала: на 1-е сутки после проведения 1 курса ПХТ показатель составил 23,0±0,55, а на этот же срок после проведения 4го курса химиотерапии - 34,84±0,85, т.е. произошло увеличение объемной плотности гепатоцитов в состоянии дистрофии в 1,5 раза. Количество двуядерных гепатоцитов, которые отражают регенераторный потенциал печени, снижалось от курса к курсу проведения химиотерапии, от значения 2,2±0,16 до лечения, до значения 1,1±0,08 после 4-х курсов ПХТ, что свидетельствует о снижении активности репаративных процессов в органе на фоне нарастания лекарственной устойчивости опухоли и нарушения синтеза ДНК в гепатоцитах цитостатиками. Также изменение метаболизма цитостатиков и их распределения могло происходить за счет гиперэкспрессии белкового продукта гена MDR1 - трансмембранного белка Ргликопротеина, который обладает функцией выведения ксенобиотиков из клетки во внеклеточную среду. Таким образом, активация данного механизма могла привести к циркуляции в системном кровотоке высоких концентраций химиопрепаратов, а, соответственно, повреждению токсическими веществами органов и тканей. Кроме того, развитие злокачественного опухолевого процесса сопровождается развитием тканевой гипоксии, в результате которой замедляется биотрансформация ксенобиотиков, а также повышается выраженность их токсических эффектов и снижается терапевтическая эффективность. Ключевую роль в трансформации ксенобиотиков играет система Р450- зависимых монооксигеназ, изучение показателей активности которых в клинике, позволит учитывать особенности трансформации экзогенных субстратов организмом каждого пациента индивидуально. У животных с RLS до лечения цитохром Р450-позитивные клетки в печени определялись преимущественно в центральных отделах дольки в виде очаговых скоплений, ИМ составил 19,9±1,36. Далее на фоне последовательных курсов ПХТ он начинал снижаться от курса к курсу. После 1-го курса ПХТ ИМ составил 11,0±0,86, после второго курса - 7,0±0,56. После третьего и четвертого курсов введения цитостатиков уровень экспрессии цитохрома P450 продолжал снижаться и достиг 2,0±0,25% и 1,7±0,16% соответственно. Т.о. количество цитохром Р450-позитивных клеток снизилось почти в 11 раз после проведения 4-ого курса ПХТ по сравнению с опухолевыми животными, которые не получали цитостатики. Исследование опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы у пациентов в процессе полихимиотерапии: сравнительная молекулярно-клеточная характеристика опухоли у пациентов до лечения и после курсов химиотерапии по поводу рецидивов Полученные данные об изменении основных биологических характеристик клеток опухоли мышей RLS под воздействием повторяющихся курсов введения комплекса цитостатиков вызвали интерес соотнести с происходящими изменениями в злокачественных формах НХЛ у пациентов с первично выявленной ДВККЛ и у пациентов с рецидивом данного заболевания на фоне многократных курсов ПХТ. Оценивая ИМ окрашенных ядер опухолевых клеток антителами к Ki-67 было выявлено, что в группе пациентов с первично диагностированной ДВККЛ уровень пролиферативной активности опухолевых клеток изначально был высоким и составил 56,3 ± 1,5%, что отражает высокую агрессивность данного варианта НХЛ. В опухоли онкобольных, перенесших многокурсовую ПХТ и умерших при очередном рецидиве болезни, уровень пролиферативной активности опухоли снижался в 1,5 раза, несмотря на очевидное прогрессирование заболевания с вовлечением в опухолевый процесс мультилокализаций. Учитывая, что у умерших пациентов данный показатель оценивали непосредственно на этапе лечения ДВККЛ цитостатиками, можно предположить, что снижение уровня экспрессии Ki-67 отражает долю «выживших» пролиферирующих опухолевых клеток, являющихся наиболее устойчивыми к антибластомным средствам. ИМ онкопротеина BCL2 изначально был достаточно высоким у пациентов с первично возникшей опухолью - 47,4±2,4 %, а у пациентов с рецидивами после полученного цитостатического лечения отмечали дополнительное нарастание этого показателя в 1,7 раза, ИМ p53 так же повышался у пациентов перенесших рецидивы заболевания и многократные курсы ПХТ - показатель увеличился в 2,3 раза по сравнению с аналогичным показателем в группе больных с первично возникшей опухолью. Оценка ИМ р-гликопротеина установила, что 22,1 ±0,58% опухолевых клеток пациентов с впервые выявленной ДБККЛ экспрессировали данный белок, у пациентов с рецидивами, получивших терапию цитостатиками, показатель возрос в 1,7 раза и составил 36,6±1,1%. Таким образом, наблюдали значительное нарастание экспрессии Р-гликопротеина в опухолевых клетках пациентов после проведения курсов лечения цитостатиками, что может свидетельствовать о проявлении опухолевыми клетками эволюционно выработанного механизма защиты от повреждающих агентов, в данном случае - это воздействие комплекса химиотерапевтических препаратов. В результате цитостатики «выбрасываются» из опухолевых клеток, тем самым снижается эффективность лечения и усиливается токсическая нагрузка на органы и ткани. Полученные данные свидетельствуют о том, что проведение противоопухолевого лечения комплексом цитостатиков изменяет молекулярный «портрет» ДВККЛ – опухолевая ткань приобретает негативные характеристики, отражающие опухолевую прогрессию. ВЫВОДЫ 1. На модели резистентной к цитостатикам лимфомы RLS мышей показано, что опухолевый узел на фоне проведения 4 курсов полихимиотерапии рос медленнее по сравнению с группой животных с опухолью RLS не получавших ПХТ, при этом регрессии опухолевого узла не было отмечено ни на одном курсе химиотерапии. Прогрессирующее увеличение размеров опухолевого узла от курса к курсу сопровождалось следующими молекулярноклеточными и патоморфологическими изменениями, в совокупности отражающими приспособление опухолевых клеток к химиотерапевтическому воздействию: а) численная плотность апоптозов опухолевых клеток нарастала незначительно, что в совокупности с невысоким количеством клеток, экспрессирующих каспазу 3, отражает сформировавшееся нарушение проапоптотической функции гена р53; б) в опухоли на фоне введения комплекса цитостатиков происходило нарастание объемной плотности некрозов, достигающее максимальных значений после 4 курса полихимиотерапии (20%); в) проведение полихимиотерапии сопровождалось постепенным увеличением количества Ki-67-позитивных клеток RLS в сравнении с показателем в опухоли до лечения, что коррелировало с интенсивным ростом опухоли на фоне химиотерапии. 2. В опухоли RLS при проведении химиотерапии происходила селекция еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток, что проявлялось в повышении экспрессии генов mdr1b и bcl-2, а экспрессия гена р53 была нестабильной и снижалась 1,8 раза после последнего курса химиотерапии, что подтверждает сформировавшийся блок процесса апоптоза в опухоли. 3. Количество Р-гликопротеин экспрессирующих клеток в резистентной лимфоме RLS нарастало в динамике полихимиотерапии, что наряду с увеличением экспрессии гена mdr1b подтверждает усиление МЛУ, как одного из компонентов опухолевой прогрессии. 4. На фоне 4 курсов полихимиотерапии в ткани печени животных с лимфомой RLS по сравнению с показателями у животных-опухоленосителей без лечения отмечали нарастание деструктивных изменений (суммарно объемной плотности некрозов и дистрофий гепатоцитов), поступательное уменьшение в 2 раза доли двуядерных гепатоцитов и существенное снижение количества гепатоцитов, содержащих цитохром Р450 (в 11 раз), что в совокупности свидетельствует об истощении ферментных систем на фоне метаболизма цитостатиков и нарастании деструктивных изменений в гепатоцитах. 5. Проведение многократных курсов полихимиотерапии пациентам с ДВККЛ в процессе лечения заболевания приводит к изменениям молекулярных характеристик опухолевых лимфомных клеток, отражающих опухолевую прогрессию: в опухоли после лечения по сравнению с первичными ДВККЛ происходит нарушение процессов апоптоза и усиление множественной лекарственной устойчивости, что проявляется увеличением количества клеток, экспрессирующих белки bcl-2 и р53, нарастанием количества Р-гликопротеин экспрессирующих клеток. Эти молекулярные изменения, даже на фоне снижения количества Ki-67-позитивных клеток, способствуют снижению чувствительности опухолевых клеток к полихимиотерапии, заболевания. повышению общей токсической нагрузки и прогрессированию СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Варианты опухолевой прогрессии в исходно фенотипически различных экспериментальных лимфосаркомах / Е.И. Воронина, А.В. Сенькова, Т.А. Агеева, М.А. Зенкова // Бюллетень сибирской медицины. – 2013. – Т.33. – С. 5-9. (Из списка ВАК). 2. Influence of polychemotherapy on the morphology of metastases and kidney of resistant RLSbearing mice / E.V. Zonov, E.I. Voronina , M.A. Zenkova, T.A. Ageeva , E.I. Ryabchikova // Experimental Oncology. – 2013. – 35 (1). – P.30–36. 3. Экспериментальная модель лекарственно-устойчивой опухоли RLS для проведения многократных курсов химиотерапии [Электронный ресурс] / Е.И.Воронина, А.В. Сенькова, Т.А. Агеева, М.А. Зенкова // Медицина и образование в Сибири: сетевое научное издание. – 2014. – № 1. – Режим доступа: http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=1265 (Из списка ВАК). 4. Воронина, Е.И. Изучение феномена прогрессирования множественной лекарственной устойчивости на циклофосфомид-устойчивой перевиваемой лимфосаркоме мышей RLS / Е.И. Воронина // Авиценна 2010: Материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых – Новосибирск, 2010. – С. 213-215. 5. Воронина, Е.И. Опухолевая прогрессия в перевиваемой лимфосаркоме RLS с фенотипом лекарственной устойчивости при многократных курсах полихимиотерапии / Е.И. Воронина, Т.А. Агеева, М.А. Зенкова // Аспирантские чтения – 2011: Материалы докладов Всероссийской конференции с международным участием «Молодые учѐные – медицине» – Самара, 2011. – С. 200-203. 6. Воронина, Е.И. Варианты опухолевой прогрессии в исходно фенотипически различных экспериментальных лимфосаркомах / Е.И. Воронина, А.В. Сенькова // Авиценна 2012: Материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых – Новосибирск, 2012. – С. 318-319. 7. Варианты опухолевой прогрессии в исходно фенотипически различных экспериментальных лимфосаркомах / Е.И. Воронина, А.В.Сенькова, Т.А. Агеева, М.А. Зенкова // Актуальные вопросы патологической анатомии: Сборник материалов III- научнопрактической конференции патологоанатомов ДВФО посвященной 100-летию со дня рождения А.И. Зеленского – Хабаровск, 2012. – С. 286-288. 8. Воронина, фенотипически Е.И. Цитостатически различных индуцированная экспериментальных опухолевая лимфосаркомах / Е.И. прогрессия в Воронина // Интеллектуальный потенциал Сибири: Материалы межвузовской студенческой конференции – Новосибирск, 2012. – С. 13-14. 9. Особенности формирования механизмов множественной лекарственной устойчивости в опухолях с изначально резистентным фенотипом / Е.И. Воронина, А.В. Сенькова, Т.А. Агеева, М.А. Зенкова // Первая Всероссийская научная конференция молодых учёных-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века»: Материалы конференции. – Москва, 2012. –С.319-320. 10. Воронина Е.И. Сравнительная молекулярная характеристика диффузной Вкрупноклеточной лимфомы у пациентов до лечения и после развития рецидива заболевания / Е.И. Воронина, Т.А. Агеева // Актуальные вопросы патологоанатомической практики: Материалы научно-практической патологоанатомической конференции Южного Урала с участием патологоанатомов других регионов России и СНГ, посвященной 30-летию основания Челябинского областного патологоанатомического бюро – Челябинск, 2014. – С.14-16. Список сокращений: ДВККЛ – диффузная В-крупноклеточная лимфома ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИМ – индекс мечения МЛУ – множественная лекарственная устойчивость мРНК – матричная РНК НХЛ – неходжкинская лимфома ОТ – обратная транскрипция ПААГ – полиакриламидный гель ПХТ – полихимиотерапия ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота CHOP – схема полихимиотерапии, содержащая циклофосфан, винкристин, доксорубицин, преднизолон LSM – среда для отделения лимфоцитов MDR – множественная лекарственная устойчивость PBS – буфер фосфатный RLS – резистентная лимфосаркома Соискатель Воронина Е.И.